KR101134088B1

KR101134088B1 - 피부자극 예측 평가방법 및 평가키트

Info

Publication number: KR101134088B1
Application number: KR1020100011034A
Authority: KR
Inventors: 김성진; 박종성; 정용연
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2012-04-13
Also published as: KR20110091276A

Abstract

본 발명은 피부자극 평가방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 기존의 시험방법과 달리 신경계에서 유래한 세포를 대상으로 세포막을 통한 이온전위의 차이를 patch clamp기술로 측정하여 피부 민감성과 자극성을 표현함으로써 기존의 피부자극실험을 대체하거나 보완할 수 있는 새로운 피부자극 예측평가방법 및 평가키트에 관한 것이다.

Description

피부자극 예측 평가방법 및 평가키트{Predictive assessment method of Skin irritation and assessment kits for the same}

피부는 신체의 가장 넓은 기관이며, 이의 외관은 개개인의 자신감과 삶의 질에 지대한 영향을 미친다. 실제로, 오랫동안 지속되는 개인의 첫인상은 종종 개개인의 시각적 외모(얼굴 생김새, 머리색 등)에 의해 주어진다. 소비자는 그들의 피부 상태(예: 여드름, 건선, 잔주름 및 주름살)를 치료하고, 피부 건강(예: 건성의 벗겨지는 피부; 지성 피부)을 개선하고, 피부 기미를 가리기 위하여 피부 케어(skin care) 제품을 사용한다. 이러한 다양한 피부 상태의 치료의 속도와 효능을 개선하기 위한 새로운 제품을 개발하고자 대단히 많은 연구가 계속되어왔으며, 이 결과 수많은 새로운 피부 케어 제형이 개발되었는데, 이들 제품의 상용화를 위해서는 개발된 피부케어제품이 피부에 미치는 자극의 정도가 평가될 필요가 있다.

일반적으로 자극 또는 염증의 측정을 위해 존재하는 모델에 대한 두 개의 주요 방법, 즉 시험관내 또는 생체내 측정법이 알려져 있다. 문헌[참조: 'Strategies for the assessment of acute skin irritation potential', Robinson et al., J. Pharmacol. Toxic al., 1999]은 현재 시험관내 피부 노화 및 자극 시험 방법론에 대한 개관을 휼륭히 제공하고 있고, 대표적인 피부 노화 및 자극 시험 방법론은US-A-6,020,148에 기술되어 있는데, 이 문헌은 국소 피부 케어 제품의 눈 또는 피부 자극을 측정하기 위한 시험관내 방법의 사용을 기술하고 있다. 즉 눈 또는 피부 자극은, 피부 케어 제품의 적용 후, 모델 세포 배양계의 생존력을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 이러한 기법을 사용하여, 시간에 따라 모니터될 수 있는 상이한 최종 마커를 측정할 수 있다. 또 다른 방법이 EP-A-0,497,39에 기술되어 있으며, 이 문헌은 세포독성 및 예비-염증 말기를 통한 계면활성제의 자극을 평가하기 위해 각질세포 및 섬유모세포의 사람 피부 공동-배양을 포함하는 시험관내 모델의 사용을 기술한다. 또한, 기존의 시험관내 측정법은 세포에 자극물질을 처리하고 세포생존율이나 세포막 손상에 관련된 지표를 측정하는 전통적이고 고루한 방법에 의존하고 있을 뿐만 아니라 사용되는 세포또한 주로 각질세포나 섬유모세포 혹은 이와 같은 세포에서 유래한 불멸세포주를 사용한다. 따라서 이들 방법이 잠재적 자극 또는 다른 임상적 안전성 문제에 관한 직접적 정보를 제공하지만, 이러한 시험관내 방법이 사람 피부에 의해 나타나는 염증 및 자극을 정확히 나타내지는 못한다.

또한, 피부 케어 제품의 임상적 안전성을 평가하는데 생체내 방법이 사용되어 왔는데, 생체내 방법의 예로는: 제품 패칭 후 홍반의 평가와 함께, 4 시간 패치 시험[참고문헌: Robinson, et al., review or Robinson et al., in Contact Dermatitis, 1998, 'Application of a 4-h human patch test method for comparative and investigative assessment of skin irritation']; 24시간 패치 노출 후 IL-1α 및 에이코사노이드를 측정하기 위한 흡입 물집 유체의 사용[참고문헌: Muller-Decker et al., in Toxicology and Applied Pharmacology, 1998. 'Arachidonic Acid Metabolism in Primary Irritant Dermatitis Produced by Patch Testing of Human Skin with Surfactants']; 급성 피부 자극에서 에이코사노이드 및 사이토킨 수준을 측정하기 위해서 테이프 박피 및 캡사이신의 사용[참고문헌: Reilly and Green, in Acta. Derm. Venereol., 1999, 'Eicosanoid and Cytokine Levels in Acute Skin Irritation in Response to Tape Stripping and Capsaicin']; 및 직접 생체피부표면에 전극센서를 부착하여 자극물질을 처리하고 전도성을 결정함으로써 피부의 반응성 및/또는 과민성의 생체내 분석 및 비침습적 특성화를 위한 방법[국내특허 공개번호 제2005-63781호]를 포함한다. 그런데 이들 방법은 사람 모델을사용하는 반면, 이들은 진행 동안 과도한 사용 조건 또는 높은 수준의 침해성을 내포하고, 이는 임상 평가 도구로서 이들의 유용성을 제한한다.

한편, 현재 화장품이나 의약품의 안전성시험에서 동물시험을 규제하고 있으며(2000년 초반이후 유럽/ 최근에는 미국에서도 규제 움직임이 있음), 따라서 in vitro toxicity 혹은 irritation test의 대체시험법에 대한 연구가 진행되고 있다. 특히 화장품 개발분야에서 Loreal같은 회사는 아직도 대체시험개발에 막대한 자금을 투자하고 있으며 P&G같은 다국적 생활용품기업도 마찬가지인 상황이다.

따라서, 동물시험을 하지 않으면서도 생체 내에 나타나는 염증 및 자극을 비교적 정확히 예측할 수 있는 새로운 피부자극평가방법에 대한 필요성이 대두되었다.

본 발명자는 상기와 같은 종래 기술의 제반 단점과 문제점을 해결하기 위해 노력한 결과 세포막에서 유발되는 이온전위를 측정하는 기술인 패치클램프 방법(patch clamp)을 통해 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신경계의 세포 그 자체를 대상으로 삼아 직접 전기적 흥분성의 지표를 측정하여 피부자극유발여부를 예측할 수 있는 피부자극 예측평가방법 및 평가키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신경계의 세포 그 자체를 대상으로 삼아 직접 전기적 흥분성의 지표를 측정함으로써 동물시험을 하지 않으면서도 생체 내에 나타나는 염증 및 자극을 비교적 정확히 예측할 수 있는 피부자극 예측평가방법 및 평가키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신경세포의 억제와 흥분신호에 관여하는 특정한 이온들의 전위차를 측정하여 자극물질의 신경흥분작용을 예측함으로써 잠재적 자극물질의 발굴하고 in vivo상에서 객관화할 수 있는 피부자극 예측평가방법 및 평가키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 생체유래 신경세포에 측정대상물질을 처리하는 단계; 상기 신경세포의 세포막 이온전위를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 이온전위를 통해 상기 측정대상물질의 자극유발여부를 확인하는 단계를 포함하는 피부자극예측평가방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 생체유래 신경세포는 구심성 감각신경세포 또는 뉴런이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 세포막 이온전위를 측정하는 단계는 whole-cell patch clamp 방법으로 포타슘 전류 및 소디움 전류 중 하나 이상을 측정하여 기록한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 측정대상물질의 자극유발여부를 확인하는 단계는 상기 포타슘 전류의 억제 특성 및 상기 소디움 전류의 증가 특성 중 하나 이상이 나타나면 피부자극 예상물질로 간주한다.

또한, 본 발명은 생체유래 신경세포; 및 상기 신경세포의 세포막 이온전위를 측정하는 미세전류측정수단을 포함하는 피부자극예측평가키트를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 미세전류측정수단은 whole-cell patch clamp 방법을 수행할 수 있는 장치이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 생체 유래 신경세포에 측정대상물질이 처리되면 상기 미세전류측정수단이 포타슘전류 및 소디움 전류 중 하나 이상을 측정하여 기록한다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 갖는다.

먼저, 본 발명의 피부자극 예측평가방법 및 평가키트에 의하면 신경계의 세포 그 자체를 대상으로 삼아 직접 전기적 흥분성의 지표를 측정하여 피부자극유발여부를 예측할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부자극 예측평가방법 및 평가키트에 의하면 신경계의 세포 그 자체를 대상으로 삼아 직접 전기적 흥분성의 지표를 측정함으로써 동물시험을 하지 않으면서도 생체 내에 나타나는 염증 및 자극을 비교적 정확히 예측할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부자극 예측평가방법 및 평가키트에 의하면 신경세포의 억제와 흥분신호에 관여하는 특정한 이온들의 전위차를 측정하여 자극물질의 신경흥분작용을 예측함으로써 잠재적 자극물질의 발굴하고 in vivo상에서 객관화할 수 있다.

도 1은 세포막 이온전위를 whole-cell patch clamp 방법으로 측정하기 위한 개략적인 모식도,
도 2는 SLS가 내측 전정핵 뉴론의 포타슘 전류에 미치는 영향을 나타낸 그래프,
도 3은 SLS가 내측 전정핵 뉴론의 소디움 전류에 미치는 영향을 나타낸 그래프,
도 4는 SLS가 척수후근절 뉴론의 소디움 전류에 미치는 영향을 나타낸 그래프.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면에 도시된 바람직한 실시예를 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

도 1은 세포막 이온전위를 whole-cell patch clamp 방법으로 측정하기 위한 개략적인 모식도이고, 도 2는 SLS가 내측 전정핵 뉴론의 포타슘 전류에 미치는 영향을 나타낸 그래프이며, 도 3은 SLS가 내측 전정핵 뉴론의 소디움 전류에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 도 4는 SLS가 척수후근절 뉴론의 소디움 전류에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

먼저, 본 발명은 세포막 이온전위의 차이가 신경세포의 전기적 흥분도를 반영하는 생체지표인데 착안하여 신경계에서 유래한 세포를 대상으로 측정대상물질을 처리한 후 세포막을 통한 이온전위의 차이를 측정하여 피부 자극유발 여부를 예측할 수 있는 것에 그 기술적 특징이 있다.

즉, 신경세포는 이온 전류에 의하여 신경 활성이 결정되는데, 신경세포 활성의 지표인 활동전위의 탈분극과정은 소디움 전류에 의하여 이루어지고, 재분극 반응은 포타슘전류에 의하여 이루어지므로, 포타슘전류와 소디움 전류 중 하나 이상을 측정함으로써 피부자극 반응을 관찰할 때 이를 in vitro상에서 객관화할 수 있었기 때문이다.

본 발명의 피부자극예측평가방법은 생체유래 신경세포에 측정대상물질을 처리하는 단계; 상기 신경세포의 세포막 이온전위를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 이온전위를 통해 상기 측정대상물질의 자극유발여부를 확인하는 단계를 포함한다.

여기서, 생체유래 신경세포는 구심성 감각신경세포 또는 뉴런일 수 있는데, 특히 내측 전정핵 신경세포(medial vestibular nuclear neuron)와 척수후근 신경절(dorsal root ganglion neuron)을 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 세포막 이온전위는 측정대상물질 처리 전후에 측정되는데, 특히 측정물질 처리 후에는 도 1에 도시된 바와 같은 whole-cell patch clamp 방법으로 포타슘 전류 및 소디움 전류 중 하나 이상을 측정하여 기록하는 것이 바람직하다. 이 때 측정 결과값과 측정대상물질 처리 전의 측정값을 비교하여 포타슘 전류의 억제 특성 및 상기 소디움 전류의 증가 특성 중 하나 이상이 나타나면 피부자극 예상물질로 간주할 수 있다.

본 발명의 피부자극예측평가키트는 생체유래 신경세포; 및 상기 신경세포의 세포막 이온전위를 측정하는 미세전류측정수단을 포함하는데, 미세전류측정수단은 세포막의 이온전위를 측정할 수 있기만 하면 제한되지는 않지만 whole-cell patch clamp 방법을 수행할 수 있는 장치인 것이 바람직하다.

실시예

1. 신경세포의 분리

생후 14-16일 사이의 Sprague-Dawley 흰쥐에서 Kay와 Wong의 방법에 의하여 내측 전정핵 뉴론을 분리하였다. 흰쥐를 ether로 마취한 후, 두피 및 두개골을 제거하고 전정핵이 위치하는 뇌간과 소뇌 부위를 적출하였다. 적출한 조직은 95% O₂/ 5% CO₂로 포화된 인공 뇌척수액(4℃)에 보관하고, 뇌조직 절편기(Vibroslice, WPI, New Haven, CT, USA)를 사용하여 400 ㎛의 두께로 관상면으로 절단하여 내측 전정핵이 포함된 뇌절편(brain slice)을 만들었다. 뇌절편은 실온의 배양 용액에서 1시간 이상 배양한 다음 단백 분해효소인 pronase(Sigma Co.)와 thermolysin(Sigma Co.)을 이용하여 각각 0.2 mg/㎖ 농도에서 효소처리 과정을 거쳤다. 효소처리가 끝난 절편은 다시 실온의 배양액 속에서 배양하면서 내측 전정핵 부위는 흰쥐 brain atlas를 참조하여 21G 주사침으로 천공하여 얻었고 이를 inverted microscope 위의 용기(bath)에 옮긴 후 작은 피펫을 이용하여 단일 세포로 분리하였다.

이 때, 배양 용액(단위; mM)은 124 NaCl, 5 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 1.3 MgSO₄, 2.4 CaCl₂, 10 Glucose, 24 NaHCO₃ 등으로 구성되었으며, 전류 고정법에 사용한 세포외 용액 (mM)은 124 NaCl, 5 KCl, 1.3 MgSO₄, 26 NaHCO₃, 2.5 CaCl₂, 1 NaH₂PO₄, 11 Glucose, pH 7.4로 하였고, 세포내 용액(mM)은 122.5 K⁺-gluconate, 17.5 KCl, 8 NaCl, 10 HEPES, 0.2 EGTA(ethylene glycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'- tetraacetic acid), 4 Mg-ATP이며 pH는 7.3으로 하였다. 이온 전류를 기록하기 위한 막전압 고정법에 사용한 세포외 용액(mM)은 140 Choline-Cl, 3 KCl, 2 MgCl₂, 2 CaCl₂, 10 HEPES, 30 Glucose, pH 7.4로 하였고, 세포내 용액(mM)은 140 KCl, 1 MgCl₂, 0.1 CaCl₂, 10 HEPES, 1 EGTA(ethyleneglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid), 4 Mg-ATP이며 pH는 7.3으로 하였다.

2. 측정대상물질 처리된 세포막 이온전위 측정

분리된 세포 즉 전정핵 뉴런이 용기의 바닥에 가라앉아 안정화된 다음에 공지된 방법으로 세포 전류를 측정하여 기록하였다.

3. 측정대상물질 처리

측정대상물질로는 비누, 샴푸, 세정제, 치약 등에서 통상적으로 사용되는 계면활성제인 Sodium lauryl sulfate (SLS)를 선정하였고, 분리된 세포에 대한 SLS 투여는 중력을 이용한 관류장치를 이용하여 용기내 용액을 순환시켰다. 본 실시예에서 사용한 SLS는 Sigma사(St. Louis, MO, 미국) 제품이다.

4. 측정대상물질 처리 후 세포막 이온전위 측정

SLS가 처리된 분리 전정핵 뉴런에서 Hamil 등의 whole-cell patch clamp 방법을 이용하여 포타슘 및 소디움 전류를 기록하였다. 기록용 전극은 미세 유리 전극 제조기(Narishige, 일본)와 microforge(Narishige, 일본)를 이용하여 저항이 3-5 megaohm이 되도록 제작하였다. 막전류 및 전압고정과 막전압 및 전류의 측정은 Axopatch 200B patch clamp amplifier(Axon, Foster City, CA, USA)를 이용하며 Digidata 1200B(Axon, Foster City, CA, USA) interface를 통하여 컴퓨터와 연결하였다. 막전류 및 전압 조절과 실험결과 얻어진 포타슘 전류의 기록 및 자료 분석은 pClamp 8 software(Axon, Foster City, CA, 미국)를 사용하였으며, 전류는 10 kHz로 여과하며, series resistance는 Axopatch 200B patch clamp amplifier의 series resistance compensation circuit를 이용하여 보상하였다. 실험측정치는 Student's t-test로 통계학적 분석을 시행하고 p<0.05를 유의성의 기준으로 삼았으며 평균ㅁ표준오차(standard error)로 표시하였다.

5. 측정대상물질의 자극유발여부 확인

신경세포의 포타슘 전류는 신경세포의 흥분성 조절에 주요한 역할을 하는데, 일반적으로 포타슘 전류가 억제되면 신경세포의 흥분성은 증가하고, 반대로 포타슘 전류가 증가되면 신경세포의 흥분성은 감소되는 것으로 알려져 있다.

본 실시예와 같이 내측 전정핵 뉴론의 포타슘 전류에 미치는 SLS의 효과를 살펴본 결과 후술하는 실험예에서 명백하듯이 SLS는 농도 의존적으로 이 뉴론의 포타슘 전류를 억제시킴을 알 수 있었다.

또한, 신경세포에서 소디움 전류는 탈분극 과정에 관여하는 등 신경세포의 활동성에 중요한 역할을 하고 있는데, 후술하는 실험예에서 명백하듯이 SLS처리시 명확한 소디움 전류 증가를 보인 점을 확인할 수 있었다.

따라서, 신경세포를 대상으로 측정대상물질 처리 전후에 측정된 세포막 이온전위값을 비교하여 포타슘 전류의 억제 특성 및 상기 소디움 전류의 증가 특성 중 하나 이상이 나타나면 피부자극 예상물질로 간주할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 1

SLS가 내측 전정핵 뉴론의 포타슘 전류에 미치는 영향을 확인하고자 voltage clamp mode 하에서 포타슘 전류를 기록한 후 SLS의 효과를 관찰하였다. 유지전압을 -70 mV로 하고 10 mV 간격으로 -60 mV에서 +40 mV 까지 단계적으로 탈분극펄스를 매 10초마다 400 msec 동안 자극하였다.

총 12예에서 10 μM SLS를 세포외액에 첨가하여 관류 시켰을 때, 포타슘 전류는 대조군(6400ㅁ 307 pA)에 비하여 감소(6020ㅁ 106 pA)하였으나 통계학적 의의는 없었다. 그러나 도 2에 도시된 바와 같이 20 μM과 40 μM SLS에 의하여서는 각각 4500ㅁ 213 pA, (p<0.05), 3200ㅁ179 pA, (p<0.05)로 의의 있게 감소하였음을 알 수 있다. 이 때, A는 control currents이고, B, 10 μM이며, C는 20 μM이고, D는 40 μM이며, E는 subtraction C from A이다.

실험예 2

SLS가 내측 전정핵 뉴론의 소디움 전류에 미치는 영향을 확인하고자 voltage clamp mode 하에서 소디움 전류를 기록한 후 SLS의 효과를 관찰하였다. 유지전압을 -70 mV로 하고 10 mV 간격으로 -60 mV에서 +40 mV 까지 단계적으로 탈분극펄스를 매 10초마다 400 msec 동안 자극하였다.

총 8예에서 10 μM SLS를 세포외액에 첨가하여 관류 시켰을 때, 도 3에 도시된 바와 같이 소디움 전류는 1390ㅁ167 pA에서 1980ㅁ334 pA(p<0.05)로 의의 있게 증가하였음을 알 수 있다. 이 때 A는 control currents; B는 10 μM이다

실험예 3

말초에서 발생한 구심성 신경신호가 척수로 전달되기 전 단계인 척수후근절 뉴론을 분리하여 SLS가 이들 뉴론의 소디움 전류에 미치는 영향을 확인하였다. 총 9예에서 10 μM SLS를 세포외액에 첨가하여 관류 시켰을 때, 도 4에 도시된 바와 같이 소디움 전류는 2310ㅁ 222 pA에서 3040ㅁ 309 pA(p<0.05)로 의의 있게 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이 때 A는 control currents; B는 10 μM이다.

이상의 실험결과들은 내측 전정핵 뉴론이나 척수 후근절 뉴론이 SLS에 대하여 반응을 보이는 것을 증거한다. 즉, 내측 전정핵 뉴론의 포타슘 전류에 미치는 SLS의 효과를 관찰한 결과, SLS는 농도 의존적으로 뉴론의 포타슘 전류를 억제시킴을 볼 수 있고, 이는 농도에 따른 세포반응을 객관화시켜 피부자극반응으로 응용할 수 있는 점을 보여주고 있기 때문이다. 또한 내측 전정핵 뉴론과 척수후근절 뉴론에서 소디움 전류에 대한 반응은 농도 의존적인 반응은 아니고 반응의 유무를 판별할 수 있는 한 가지 농도에서의 명확한 소디움 전류 증가를 보이는 것을 알 수 있었다.

또한, 구체적인 실시예로 제시하지는 않았지만 다양한 신경세포, 그리고 다양한 이온전류(예를 들면 포타슘 전류와 소디움 전류 이외에 calcium 전류, Chloride 전류 등)를 대상으로 측정대상물질의 처리전후 측정값을 비교하여 피부자극유발 여부의 예측이 가능할 것이다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims

생체유래 신경세포에 측정대상물질을 처리하는 단계;
상기 신경세포의 세포막 이온전위를 측정하는 단계; 및
상기 측정된 이온전위를 통해 상기 측정대상물질의 자극유발여부를 확인하는 단계를 포함하는데,
상기 세포막 이온전위를 측정하는 단계는 whole-cell patch clamp 방법으로 포타슘 전류 및 소디움 전류 중 하나 이상을 측정하여 기록하는 것을 특징으로 하는 피부자극예측평가방법.
제 1 항에 있어서,
상기 생체유래 신경세포는 구심성 감각신경세포 또는 뉴런인 것을 특징으로 하는 피부자극예측평가방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 측정대상물질의 자극유발여부를 확인하는 단계는 상기 포타슘 전류의 억제 특성 및 상기 소디움 전류의 증가 특성 중 하나 이상이 나타나면 피부자극 예상물질로 간주하는 것을 특징으로 하는 피부자극예측평가방법.
생체유래 신경세포; 및
상기 신경세포의 세포막 이온전위를 측정하는 미세전류측정수단을 포함하는데,
상기 미세전류측정수단은 whole-cell patch clamp 방법을 수행할 수 있는 장치인 것을 특징으로 하는 피부자극예측평가키트.
제 5 항에 있어서,
상기 생체유래 신경세포는 구심성 감각신경세포 또는 뉴런인 것을 특징으로 하는 피부자극예측평가키트.
삭제
생체유래 신경세포; 및
상기 신경세포의 세포막 이온전위를 측정하는 미세전류측정수단을 포함하는데,
상기 생체 유래 신경세포에 측정대상물질이 처리되면 상기 미세전류측정수단이 포타슘전류 및 소디움 전류 중 하나 이상을 측정하여 기록하는 것을 특징으로 하는 피부자극예측평가키트.