CN101194022A - 通过胶带剥离获得的皮肤样品中的皮肤蛋白质的直接分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种测定通过胶带剥离获得的皮肤量的方法。在本发明的一个方面，本发明提供了一种直接测定通过胶带剥离获得的皮肤中蛋白质的方法，以将获得的蛋白质测量值与相应的皮肤胆固醇测量值进行组合，来鉴定有动脉粥样硬化危险的个体以及有发生动脉粥样硬化和与高胆固醇水平有关或由于其引起的类似疾病之危险的个体。另外，本发明还能够比较性测量胶带剥离获得的皮肤量，该量不仅仅依赖于获得样品的面积。此外，在本发明的一个方面，本发明的方法能根据获得的皮肤的相对量比较皮肤胆固醇的相对水平。

Description

通过胶带剥离获得的皮肤样品中的皮肤蛋白质的直接分析
本文所用的各部分的标题是用于组织目的，而并不用于以任何方式限定所述的主题。
技术领域
本发明涉及测定通过胶带剥离获得的皮肤量的方法。更具体的说，本发明涉及直接分析通过胶带剥离获得的皮肤样品中蛋白质的方法，用于确定反映取下皮肤量的蛋白质量的测量值。另外，本发明的一个方面涉及一种直接分析胶带剥离获得的皮肤样品中蛋白质的方法，以将获得的蛋白质测量值与相应的皮肤胆固醇测量值进行组合，来鉴定有动脉粥样硬化危险的个体、以及有发生动脉粥样硬化和与高胆固醇水平有关或由于其引起的类似疾病之危险的个体。
介绍
如所述，本发明的一个方面涉及一种直接分析通过胶带剥离获得的皮肤样品中蛋白质的方法，以将获得的蛋白质测量值和相应的皮肤胆固醇测量值进行组合，来鉴定有动脉粥样硬化危险的个体、以及有发生动脉粥样硬化和与高胆固醇水平有关或由于其引起的类似疾病之危险的个体。许多研究已显示，动脉粥样硬化及其并发症，如心脏病发作和休克，在几乎世界上所有的国家都是发病和死亡的主要原因。
成本合算的预防动脉粥样硬化就需要确定一个人是否有患动脉粥样硬化的风险，从而采取治疗措施并改变其生活方式。确定哪些人属于高风险人群虽然是期望的目标，但要选择确定一个人是否有患病风险的最佳方法却是困难的。
一种确定一个人是否有患动脉粥样硬化风险的被广泛使用的方法是测定静脉血浆中的总胆固醇水平(Consensus Conference on Lowering Blood Cholesterol toPrevent Heart Disease，JAMA，1985，253，第2080页)。如果患者的胆固醇水平超过240mg/dL，那么这个患者就被认为有高风险，最近有人提议将此阈值降低到更低的水平。
然而，单纯凭总胆固醇指标无法精确地预测患者的患病风险。更好的预测方法是分析血浆脂蛋白；尤其有利的是测定低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇水平(Total and High Density Lipoprotein Cholesterol in the Serum and Risk ofMortality，British Medical Journal，1985，290，第1239-1243页)。
利用上述方法虽然有其优点，但是这种方法需要在禁食一段时间后采集血液样本。而且，采血令人不舒服，有感染的风险，分析血浆脂蛋白和胆固醇水平复杂而昂贵。另外，研究表明，血浆分析并不能完整反映胆固醇在动脉壁和其他组织内的累积过程。在许多情况下，血浆胆固醇水平和完整的脂质检测(lipid profile)都与动脉粥样硬化的严重程度无关。
胆固醇水平的升高既发生在组织内，也发生在血浆中，研究表明组织胆固醇在动脉粥样硬化的发展中起主导作用。现已证实，组织(包括皮肤)以与动脉壁相同的方式累积胆固醇，研究表明动脉壁和皮肤内的胆固醇含量呈密切相关关系。例如，从冻干的皮肤样本中提取胆固醇，利用传统的化学和生物化学技术测定(Nikitin Y.P.，Gordienko I.A.，Dolgov A.V.，Filimonova T.A.″Cholesterol content in the skinand its correlation with lipid quotient in the serum in normals and in patients withischemic cardiac disease″，Cardiology，1987，II，第10期，第48-5l页)。这种方法虽然有用，但是很复杂，用于大规模的人群筛选时是很痛苦的。
美国专利No.4,458,686描述了一种在皮肤之下或其表面上直接定量测定血液中各种化合物的方法。该方法的根据是利用电化学方法，如通过极谱分析法，测定氧浓度的变化。如果使用的是不会透过皮肤扩散的非挥发性物质，就需要在皮肤下植入酶以影响皮肤表面氧的变化。该专利还公开了使用胆固醇氧化酶通过该方法定量测定胆固醇含量的可能性。由于该方法需要复杂的设备和操作过程，因而需要高技能的人员来完成测定，从而限制了该方法用于筛选大量的人群。
皮肤胆固醇含量的测定可用于确定动脉粥样硬化的严重程度，通过标准的实验室分析方法分析皮肤活检样品就可以完成。但是，在采集皮肤样品时是很痛苦的，并且采样点有感染的风险。另外，该方法还有一个缺点，那就是较厚的皮肤标本包括几层皮肤，有最外面的角质层、表皮和真皮。由于真皮层是高度血管化的，因此皮肤活检样品含有血管和血管成分。还可能含有汗腺和皮脂腺及其所包含的分泌物。另外，真皮下就是皮下脂肪，皮下脂肪也可能污染标本。因此，皮肤活检标本成分复杂，在分析皮肤的胆固醇含量时会得到不真实的数据。
美国专利No.5,489,510描述了一种视觉判断皮肤胆固醇含量的非侵入性方法，该方法使用了一种含有特异性胆固醇结合组分的试剂和一种含有指示剂组分的试剂，后者可根据是否存在与皮肤胆固醇结合的组分来显示可见的颜色变化。该方法克服了以前方法的许多缺点，满足了简单的群体筛选以鉴定个体是否具有动脉粥样硬化风险的目标。该方法可在手掌皮肤上直接测定，虽然简单而快捷，但是需要所有接受检测的人都要到进行检测的医生办公室或诊所去检测。这也会限制进行大规模筛选。
现在已经有方法可以测定皮肤的溶剂直接提取物中角质层的脂质(包括胆固醇)摩尔比例，(Norlen L.等，J.Invest.Dermatology 72-77，112，1999)。高效液相色谱(HPLC)和气液色谱与质谱联用可用于分离和分析脂质。这种分析方法很复杂，而且更重要的是，使用有腐蚀性且刺激的有机溶剂系统提取人皮肤对于常规的测定方法来说是不切实际的。
利用胶带剥离方法来确定皮肤角质层的脂质组成见A.Weerheim和M.Ponec(Arch.Dermatol.Res.，191-199，293，2001)的描述。在该研究中，在用胶带粘贴皮肤再剥离后用溶剂从角质层提取脂质，其中包括胆固醇。所得到的脂质提取物通过高效薄层色谱分离。该方法是很费力的。需要三种连续的溶剂系统来完成脂质的分离，需要用染色和焦化方法使组分显色，还需要通过密度测定来确定脂质的相对含量。该方法不是一种适于大样本的胆固醇含量的简单快速测定方法。
提供用于测定皮肤上胆固醇的简单高通量分析的装置是一种用于皮肤采样的粘胶带装置，它和其使用的新方法公开于申请人共同待批的美国专利申请(公开号US-2005-0272112-A1)，其内容在此完整引入以供参考。该申请公开的方法可用于从许多个体获得许多皮肤样品，从而能确定各个体的皮肤胆固醇水平并确定其动脉粥样硬化和相关心血管疾病的风险。该专利申请的胶带剥离装置和方法提供了一种简单和成本合算的风险评估分析法，它能用于大规模筛选。
用粘胶带通过胶带剥离获得的皮肤样品中总胆固醇量与胶带样本的大小有关。因此，为了比较个体之间的皮肤胆固醇水平，必须分析和比较相同大小的样本。这是通过使用一种胶带剥离装置实现的，该装置能够实现在皮肤上贴上粘胶带以获得样品时，获得具有固定面积的胶带片。一些获得的胶带可用于皮肤胆固醇分析。例如，通过将粘胶带重复贴在皮肤上，使其沾满皮肤，得到来自不同个体的具有稳定大小的皮肤样本。然后从装置上切下具有固定大小的小“检测片(dipstick)”或“圆片(disk)”，得到用于分析的具有稳定面积的皮肤样本。
然而，在个体之间使用沾满皮肤的固定面积的胶带比较皮肤胆固醇水平并不一定能确保比较的皮肤量是相似的。当从不同个体取样时，在各胶带上留下的皮肤总量可能是不同的。通过将皮肤胆固醇量与标准化的皮肤量联系起来，可更好地比较来自不同个体的皮肤胆固醇水平。
例如，用胶带剥离装置分析测定皮肤胆固醇的一个用途是为了申请人寿保险的个人。测试保险申请人的风险系数(例如年龄、抽烟状态、血压等)是常规做法，能根据测试结果确定保险费用。由于皮肤胆固醇是患有或发生动脉粥样硬化或相似疾病的风险系数，其值可影响保险费，样本可以经过处理，以支持结果。因此，需要确保获得足够分析皮肤胆固醇的皮肤样本，从而分辨出故意少取样，以产生较低皮肤胆固醇水平的“欺骗者”。因此，对于该用途，需要测量得到的用于皮肤胆固醇分析的皮肤量，以确保获得了足够的样本，并能比较个体之间的皮肤胆固醇水平，以评估风险状态。
发明内容
本发明提供了一种测定通过胶带剥离获得的皮肤量的方法。在本发明的一个方面，本发明提供了一种直接测定通过胶带剥离获得的皮肤中蛋白质的方法，以将获得的蛋白质测量值与相应的皮肤胆固醇测量值进行组合，来鉴定有动脉粥样硬化危险的个体以及有发生动脉粥样硬化和与高胆固醇水平有关或由于其引起的类似疾病之危险的个体。
另外，本发明还能够比较性测量胶带剥离获得的皮肤量，该量不仅仅依赖于获得样品的面积。此外，在本发明的一个方面，本发明的方法能根据获得的皮肤的相对量比较皮肤胆固醇的相对水平。
还理想的是，测定通过胶带剥离获得的皮肤样本量的方法应当是简单而成本节约的，适合高通量处理，但和其它方法相容，根据本发明的一个方面，这些方法例如但不限于通过胶带剥离获得的皮肤样本中皮肤胆固醇的分析。
特别是，本发明包括测定胶带剥离获得的皮肤量的方法，包括：
a)提供包括背衬件的胶带，其中该胶带至少有一面涂有医用胶粘剂；
b)将胶带放置到皮肤的指定区域，使胶带粘贴到该指定皮肤区域；
c)从皮肤的指定区域剥离下胶带，得到代表皮肤外角质层的样品，该样本粘附到胶带上，从而带有暴露的皮肤组分；
d)将蛋白染料加到样本的预选表面区域上，使蛋白染料与其保持接触一段时间，足以导致所述染料与存在于暴露的皮肤组分中的蛋白质结合；和
e)测定暴露的皮肤组分中染色的蛋白质，以确定指示获得的皮肤量的蛋白质量的测量值。
蛋白染料可选自阴离子和酸性染料。本发明的一个实施例中，蛋白染料是Ponceau S染色剂。本发明的另一个实施例中，蛋白染料是考马斯蓝。
另外，可测定暴露的皮肤组分中染色蛋白质的强度，以测定蛋白质量的测量值。在一个实施例中，可用分光光度法测定染色的蛋白质，以测定蛋白质量的测量值。
在另一个实施例中，将蛋白质量的测量值与预定的阈值水平比较。如果测得的蛋白质量低于预定的阈值，可弃去样本。
另外，在本发明的另一个方面，背衬件可由聚酯制成。
在本发明的另一个方面，医用胶粘剂可以是例如，但不限于，压敏胶粘剂；丙烯酸基胶粘剂；合成橡胶弹性体胶粘剂；聚硅氧烷(silicone)基胶粘剂；或包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
此外，本发明还包括了用于实施上述方法的试剂盒。该试剂盒包含：
-胶带；和
-蛋白质染料的来源。
蛋白染料可选自阴离子和酸性染料。本发明的一个实施例中，蛋白染料是Ponceau S染色剂。本发明的另一个实施例中，蛋白染料是考马斯蓝。
另外，在本发明的另一个方面，背衬件可由聚酯制成。
在本发明的另一个方面，医用胶粘剂可以是例如，但不限于，压敏胶粘剂；丙烯酸基胶粘剂；合成橡胶弹性体胶粘剂；聚硅氧烷基胶粘剂；或包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
另外，在本发明的另一个方面，胶粘剂由一个可闭合的装置携带，所述可闭合的装置包括一个携带胶粘剂的采样件和一个能与采样件啮合并使胶粘剂保持在装置内的闭合件。当闭合件与采样件啮合时，胶粘剂被密封在装置内。
至少闭合件或采样件可带有边框(peripheral rim)，闭合件或采样件中的另一个可带有容纳边框的边槽(peripheral groove)，从而可将胶粘剂密封在装置内。此外，闭合件可通过绞链16连接采样件。
另外，至少一部分采样件能从可闭合装置上切下，以形成检测片(dipstick)，检测片的第一端上没有胶粘剂，而第二端上有胶粘剂。在本发明的另一个方面，至少一部分采样件能从可闭合装置上切下，以形成圆片，圆片的一面上有胶粘剂。通过使用从可闭合装置切下的在一端具有胶粘剂的检测片或圆片，可确定预定或固定的胶粘剂面积。因此，在从皮肤采样后，检测片或圆片具有与确定或预定面积的胶粘剂结合的皮肤样本。
另外，在本发明的另一个方面，可闭合采样装置的采样件可具有，例如但不限于，预先切割或预先刻痕的检测片或圆盘，以预先确定胶粘剂的固定面积。
此外，本发明的一个方面提供了一种比较来自许多个体的皮肤胆固醇相对水平的方法，包括：
a)用胶带剥离获得代表皮肤外角质层的样品，分析粘附在胶粘剂上的暴露的皮肤组分，以获得个体的皮肤胆固醇水平，从而测定来自各个个体的皮肤胆固醇；
b)将蛋白染料加到样本的暴露皮肤组分的预定表面区域上，该区域与测定皮肤胆固醇的区域分开，使蛋白染料与其保持接触一段时间，足以导致所述染料与存在于暴露的皮肤组分中的蛋白质结合；
c)测定暴露的皮肤组分中染色的蛋白质，以确定指示获得的皮肤量的蛋白质量的测量值；和
d)用蛋白质量的测量值对皮肤胆固醇测量值进行标准化。
标准化可包括皮肤胆固醇测量值除以蛋白质测量值。
蛋白染料可选自阴离子和酸性染料。本发明的一个实施例中，蛋白染料是Ponceau S染色剂。本发明的另一个实施例中，蛋白染料是考马斯蓝。
另外，可测定暴露的皮肤组分中染色蛋白质的强度，以测定蛋白质量的测量值。在一个实施例中，可用分光光度法测定染色的蛋白质，以测定蛋白质量的测量值。
在另一个实施例中，将蛋白质量的测量值与预定的阈值水平比较。如果蛋白质量低于预定的阈值，可弃去样本。
另外，在本发明的另一个方面，背衬件可由聚酯制成。
在本发明的另一个方面，医用胶粘剂可以是例如，但不限于，压敏胶粘剂；丙烯酸基胶粘剂；合成橡胶弹性体胶粘剂；聚硅氧烷基胶粘剂；或包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
申请人教授的这些和其它特征如本文所述。
附图说明
本领域技术人员应理解下文所述的附图仅是为了说明。附图并不以任何方式限制申请人教授内容的范围。
图1是具有选定反射率值的特定样本的概率图，来自x1、x3和x10次剥离的样本；
图2是具有570nm光密度(OD)值的特定样本的概率图，来自x1、x3和x10次剥离的样本；
图3是实施例所使用的采样装置的俯视图；
图4是图3所述采样装置的局部图，显示的是其采样件的细节；
图5是从本发明的采样装置上切下的检测片的透视图；
图6是可用于实施例的另一种采样装置的透视图；；和
图7是从图6所述的另一种实施方式的本发明采样装置上切下的圆盘的透视图；
具体实施方式
提供用于测定皮肤上胆固醇的简单高通量分析的装置是一种用于皮肤采样的粘胶带装置，如申请人的共同待批的美国专利申请(公开号US-2005-0272112-A1)所公开，其内容在此完整引入以供参考。在本发明的一个方面，该申请公开的方法可用于从许多个体获得许多皮肤样品，从而能确定各个体的皮肤胆固醇水平并确定其动脉粥样硬化和相关心血管疾病的风险。该专利申请公开的胶带剥离装置和方法提供了一种简单和成本合算的风险评估分析法，它能用于大规模筛选。
例如，使用含有由聚酯形成的背衬件的胶带。胶带的至少一个面上涂有医用胶粘剂。本文所用的术语“医用胶粘剂”是指用于皮肤时过敏性较低且安全的胶粘剂。这种胶粘剂优选压敏胶粘剂，例如，包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体的胶粘剂。
正如大家所清楚的，现在有多种类和类型的胶粘剂。总之，适用于本发明的胶粘剂是上面所定义的、在用于皮肤采样时一般不会发生过敏反应的医用胶粘剂。发明人试验了几种类型的胶粘剂来采集皮肤样品；其中的大多数是丙烯酸基压敏胶粘剂，但是也试验了几种合成橡胶类型的弹性体胶粘剂和聚硅氧烷基胶粘剂。
发明人还发现，由苯乙烯和丁二烯或苯乙烯和异戊二烯的嵌段聚合物制成的合成橡胶胶粘剂可用于很好地实现本发明。合成橡胶胶粘剂的一个例子是基于苯乙烯和丁二烯嵌段聚合物的合成KratonTM型胶粘剂(不含胶乳)。这种胶粘剂具有良好的皮肤样品稳定性，有利于样品的运输以便于随后的分析。
可用于本发明方法中的另一类优选粘胶带是双涂层的压敏医用级胶带。这种医用级胶带的例子有3M(产品编号为#9877)和Adhesive Research，Inc.(产品编号为#8570)所出售的胶带。
发明人所试验的其他类型的一些胶带显示在附表中。一个不变的要求是使用过敏性较低的医用级胶带。
表I
    胶粘剂 胶带产品名称     供应商
    MA 27丙烯酸     AR 8570   Adhesive Research，Inc.
    MA 28丙烯酸     AR 7396   Adhesive Research，Inc.
    HY-3丙烯酸聚氨酯衬里(urethane liner)     AR 8311   Adhesive Research，Inc.
    MA 65丙烯酸     AR 8944   Adhesive Research，Inc.
    MA 61丙烯酸     AR 8890   Adhesive Research，Inc.
    丙烯酸     AR 8968   Adhesive Research，Inc.
    AS 124M丙烯酸     AR 8651   Adhesive Research，Inc.
    丙烯酸     MA 38   Adhesive Research，Inc.
    MA 31丙烯酸     MA 31   Adhesive Research，Inc.
    MA24松香增粘的聚异丁烯     MA 24A   Adhesive Research，Inc.
    橡胶溶液     MA 70   Adhesive Research，Inc.
    丙烯酸     MA 46   Adhesive Research，Inc.
    无丙烯酸     #888   3M
    聚硅氧烷芬太尼透皮贴基(Silicone Duragesic base)     N/A   Alza Corporation
    聚硅氧烷/丙烯酸     702   Scapa Group PLC
    聚硅氧烷/聚硅氧烷     705   Scapa Group PLC
应当理解的是，表1所列的粘胶带并不是穷尽性的，仅仅描述了现有的适用于本发明的几种不同粘胶带，以及本发明所属领域技术人员所熟知的其他粘胶带。
双涂层的压敏胶带通常都带有易于去掉的保护衬里。衬里可保护胶带在衬里被去掉前不会粘贴，并且可防止胶粘剂受到污染。衬里可放置在双涂层胶带的每一面，或者胶带只有一个衬里，并且胶带缠绕在其自身上，这样就可以保护两个表面。
可以使用具有不同撕离特性的衬里，这样在第一面胶粘剂暴露时第二面胶粘剂还可以得到保护。具有不同衬里的双涂层胶带特别适用于皮肤采样。去掉第一衬里后将胶带粘贴到采样装置的背衬上，同时胶带的皮肤采样面还被第二衬里覆盖。这个第二衬里可保护皮肤采样的胶粘剂区域在其被使用前不会粘贴和被污染。当需要进行皮肤采样时将第二衬里去掉。
胶带可以用到任何部位的皮肤上，但是最合适的部位是手掌的表明，因为手掌没有皮脂腺，后者的分泌物含有胆固醇，可影响本发明某些方面，尤其是涉及测定胆固醇的那些方面的检测结果。另外，手掌的皮肤易于采样。
能够获得均一量的皮肤样品用于分析是我们所期望的。使用粘胶带采样通常并且常规地只在皮肤上粘贴一次胶带。在皮肤上多次粘贴胶带可以得到更多的角质层材料。在皮肤上多粘贴一次胶带就能使胶带多粘附一些皮肤样品。继续这个过程直到胶带上沾满皮肤样品，然后胶带就变成没有粘性的了。使胶带沾满皮肤样品所需要的粘贴次数因所使用的胶粘剂类型不同而不同，但是对于最常用的粘胶带来说，胶带沾满皮肤样品所需的粘贴次数都少于10次，其中包括而不限于3到7次。在每次将胶带从皮肤上剥离下来并重新粘贴时最好将胶带粘贴到新的皮肤区域，这样可以使胶带更好更快地沾满皮肤样品。因此，为了达到均一而良好的采样目的，最好用胶带粘贴皮肤10次，每次都粘贴到新的区域。
对于本发明的要测定皮肤胆固醇的方面，胶粘剂上的皮肤样品内所存在的胆固醇的总量与所得到的皮肤样品的大小有关。另外，需要得到大小一致的皮肤样品，从而可以比较不同个体之间皮肤胆固醇的相对水平。因此，可从装置上切下检测片，以呈现胶粘剂的固定区域(例如但不限于长方形或圆形区域)，该区域上结合有通过胶带剥离获得的暴露的皮肤组分。这些检测片能够基于要分析的固定单位面积的皮肤来实现不同个体之间皮肤胆固醇水平的比较。
作为从具有大面积胶带或胶粘剂的装置切割检测片的替代手段，检测片可以是，例如但不限于，预先切割或预先刻痕的，从而能与装置方便的分离。如上所述，这种预先切割或预先刻痕的检测片可在其一端确定固定或预定面积的胶带或胶粘剂。采样后，可从装置上方便的取下这种预先切割或预先刻痕的检测片，它含有具有固定或预定面积的用于分析的皮肤样本区域。
通过下列步骤可以从不同个体上(或者从同一个体上重复采样)得到大小一致的皮肤样品。首先，如上所述，通过将胶粘剂重复粘贴到皮肤上获得皮肤样品，这样胶粘剂就会沾满皮肤样品并且变得没有粘性。胶粘剂在皮肤上粘贴约3到7次后就会沾满皮肤样品，一般来说要重复粘贴10次以确保胶粘剂沾满皮肤样品。其次，为了获得用于检测的恒定面积的皮肤样品，从皮肤采样装置上取下一个固定大小的面积(如下文实施例描述的)，将其浸到标准体积的检测试剂和指示剂中，如下文所描述的。
皮肤外角质层(stratum comeum)主要由被含有胆固醇的脂质混合物包围的富含蛋白质的角化细胞(comeocyte)组成。从结构上说，它常常被描述为“砖和灰浆”模型，其中角化细胞代表砖，周围的脂质代表灰浆(P.M.Elias，J Invest Dermatol.1983，80，44S-9S)。角质层中蛋白质量在不同个体之间是相对稳定的；因此，胶带剥离获得的皮肤样本中的蛋白质可提供对获得的皮肤量的间接测量。在本发明的一个方面，通过测定蛋白质和因而获得的皮肤样本量，可确定获得了足够的皮肤样本以用于皮肤胆固醇分析。另外，测出的皮肤胆固醇水平可与蛋白质值比较，以获得每单位蛋白水平的胆固醇值，和由此获得每单位皮肤量的胆固醇。
测定胶带剥离获得的皮肤样本中蛋白质的分析方法可使用，例如但不限于，考马斯蓝作为通用蛋白染料(例如，作为BioRadTM购得的蛋白染料)。已显示，考马斯蓝可用于定量估计固定在载体材料上的蛋白质(S.Fazekas de St.Groth等，Biochemica Et Biophysica Acta，1863，71，377-391)。考马斯蓝染料加到胶粘剂上的皮肤区域，在适当染色一段时间后，洗去过量染料。然后通过测量胶粘剂上染上蓝色的样本的色度测定被染色的皮肤蛋白的强度，该强度与蛋白质的量成正比。测定被染色的皮肤样本的相对强度(例如色度)使得通过胶带剥离从个体获得的皮肤样本的相对量可进行比较。
采用下列测量法来确定胶带剥离次数如何与获得的皮肤量关联，该皮肤量用Bio-Rad蛋白质染色测定。根据本发明的一个方面，这些测量法是用于确定获得的皮肤量不足是否会影响皮肤胆固醇测试。因此，进行分析，测定不同次数的胶带剥离获得的蛋白。具体说，志愿者的手掌经过胶带剥离一次(1)、三次(3)和十次(10)，通过在用Bio-Rad蛋白质染色试剂染色后，读取色度和610nm处的反射率获得蛋白质水平。这些蛋白质水平为获得皮肤的程度和胶带剥离的效率提供了一种量度。
在该试验中，Bio-Rad蛋白测定是在从四十五(45)个志愿者中收集的样本上进行的。每个志愿者提供用一(1)、三(3)和十(10)次剥离获得的皮肤样本。
在三个不同样本组(标为x1、x3和x10)中，发现色度和610nm处的反射率之间良好相关。在线性最小平方回归分析中，x1、x3和x10样本的R2值分别为0.961、0.978和0.959。x1剥离样本(n＝45)的平均色度值为11.07，sd1.83，CV16.3％；x3剥离样本(n＝44)的平均色度值为15.46，sd 2.32，CV17.3％；x10剥离样本(n＝44)的平均色度值为23.50，sd 1.06，CV4.6％。x1剥离样本(n＝45)的平均反射率为55.69，sd 2.95，CV5.6％；x3剥离样本(n＝44)的平均反射率为48.07，sd 3.08，CV6.4％；x10剥离样本(n＝44)的平均反射率为36.19，sd 1.48，CV4.1％。每组之间有显著的差异。
对每组中具有某反射率(610nm)值的特定样本几率进行分析，结果示于图1。该分析表明，93.2％的x10剥离样本具有＜45的反射率值，36.4％的x3剥离样本具有＜45的反射率值，而仅4.4％的x1剥离样本具有＜45的反射率值。此外，77.3％的x10剥离样本具有＜40的反射率值，11.4％的x3剥离样本具有＜40的反射率值，而仅2.2％的x1剥离样本具有＜40的反射率值。
发现使用＜45的截止值(cut-off value)作为充分剥离的可接受条件(acceptancecriterion)会排斥6.8％的10次剥离获得的样本。使用＜45的截止值作为充分剥离的可接受条件会排斥63.6％的3次剥离获得的样本和95.6％的仅1次剥离获得的样本。
虽然考马斯蓝染色法运作良好，但它需要能阅读色度值的反射分光光度计。此外，它需要分别对每个染色的样本进行读数，而皮肤胆固醇分析法可使用96孔微量滴定板，适合处理大量样本。
已开发了一种能够容易地测定皮肤样本上的蛋白质量(如需要，同时能对许多皮肤样本进行测定)的实验。另外，这种实验能用容易获得的分光光度计测定蛋白质，例如96-孔读数分光光度计，而不是单样本色度测量。这种方法是基于PonceauS染色(即与蛋白质(例如但不限于碱性氨基酸残基)结合的阴离子或酸性染料的普通种类中的一员)。
Ponceau S染料与蛋白质结合，用于组织的组织化学染色，也用作硝基纤维素结合的蛋白质的可逆膜染色(O.Salinovich和R.C.Montelaro，Anal.Biochem.1986，156，341-347)。该方法使得被染色的蛋白质在膜上变得可见，然后，在除去染料后能进一步确定蛋白质特征，而不受到任何结合的染料的影响。对于本发明进一步开发了Ponceau S法(如下文将会解释的)，显示可对胶带剥离获得的皮肤样本进行染色，在洗涤皮肤样本后，可洗脱染料，并用分光光度法定量。Ponceau S特别良好地对角蛋白进行染色，而角蛋白是胶带剥离获得的皮肤角质层中主要的蛋白质。
尽管事实上10次粘贴导致胶粘剂饱和(即丧失粘性)，结果显示不同的个体得到了不同的皮肤量。虽然个体之间有轻微不同水平的角蛋白和其它皮肤蛋白质，发明人相信，观察到的差异不是由此引起的。例如，不同个体可能在测定的蛋白质水平中有几倍的差异，但对于本发明获得的皮肤样本而言，角化细胞的蛋白质水平不出意外改变量不会这么大。发明人相信，差异更可能是由于在胶带剥离过程中获得的皮肤总量不同。从某些个体似乎在2-4次剥离后就沾满了胶粘剂，而其它需要6-8次剥离来沾满胶粘剂也暗示是这样。这提示获得了不同的皮肤量。
在本发明的一个方面，胶带剥离获得的皮肤胆固醇测量值常用于测定冠动脉疾病和相关不良血栓事件的风险，这在保险业特别有用。需对人寿保险的申请人评估各种风险系数(例如年龄、抽烟状态、血压等)，保险金基于总风险。由于皮肤胆固醇是风险系数，其值可影响保险金，样本可能经过处理，以支持结果。因此，测定蛋白质水平的进一步优点在于确保获得足够样本(即高于预定阈值)，从而分辨出故意少取样，以产生较低皮肤胆固醇水平的“欺骗者”。
为了确保获得足够的皮肤样本以测定皮肤胆固醇，确定了皮肤蛋白质的最小阈值水平。该最小阈值水平是通过分析许多皮肤样本和测定蛋白质值的分布范围确定的。准备单次胶带剥离或多次胶带剥离(包括饱和剥离，即10次胶带剥离)获得的皮肤样本的分布范围。从这些分布范围可选择一个阈值极限，从而可确定特定样本的蛋白质值是在预定人群极限范围内的可能性。理想状态下，应有一个阈值，它能使所有用10次胶带剥离的所有样本都能和用一次胶带剥离，或也可与例如三次胶带剥离获得的样本完全区分开。在实践中，分布曲线重叠，这是由于个体在胶带剥离时释放皮肤不同，完全分辨是不可能的。不过，仍可选择阈值，使得高百分数的10次胶带剥离获得的样本与大部分单次胶带剥离获得的样本区分开。
例如，选择一个基于10次胶带剥离的阈值水平是有用的，例如98％的人群具有高于该水平的值，而平均100个分析的样本中有2个样本会被作为不充分样本而被拒绝。然而，该阈值水平应当确保单次胶带剥离获得的大部分样本不具有足够蛋白质，并被拒绝。这些给出低于预定阈值水平的值的胶带剥离被认为皮肤样本不足以可靠地进行皮肤胆固醇测定。
为了确定胶带剥离次数是如何与Ponceau S蛋白染色测定的获得的皮肤量联系起来的，进行了以下实验。为了观察获得的皮肤量是如何随进行的胶带剥离次数改变的，从50个志愿者(N＝50)手掌通过一(1)、三(3)和十(10)次剥离获得皮肤样本，用Ponceau S染料溶液染色后，测定蛋白质水平。蛋白质水平是基于从被染色的皮肤样本上洗脱下来的染料的光密度读数。
分析结果，以确定值是否正常分布，并测定是否可确立截止值，以分辨用特定次数的胶带剥离获得的样本。从50个志愿者获得x1、x3、x10次剥离的样本(结果仅反映了49个样本的完整数据)。
x1剥离(n＝50)的平均光密度为0.078，平均CV13.0％；x3剥离(n＝450的平均光密度为0.131，平均CV12.3％；x10剥离(n＝49)的平均光密度为0.263，平均CV12.0％。
用Anderson-Darling或Sapiro-Wilk测试分析表明，数据有非正态分布。对每组具有光密度(OD)570nm值的特定样本的几率进行分析，示于图2。
该分析表明，98％的x10剥离样本具有＞0.1的OD570nm值，60％的x3剥离样本具有＞0.1的OD570nm值，而仅18％的x1剥离样本具有＞0.1的OD570nm值。
因此，选择＞0.1的OD的截止值作为充分剥离的可接受条件会排斥2％的10次剥离获得的样本，40％的3次剥离获得的样本和82％的仅1次剥离获得的样本。
还可用蛋白水平来标准化(normalize)皮肤胆固醇水平，该水平会随着不同皮肤样本而改变。例如，提供小皮肤样本，但具有高皮肤胆固醇水平的个人可能会给出与具有低皮肤胆固醇水平但提供大皮肤样本的个人的值相似。通过标准化到恒定蛋白质水平，可以将这两个个体区分为具有高和低胆固醇水平。标准化可涉及将胆固醇水平除以蛋白质水平的样本操作；这有效的给出了每单位蛋白质的胆固醇水平。
实施例
下列实施例会有助于进一步了解申请人公开内容的各方面，这不应被视为以任何方式限制本公开内容的范围。
采用图3所示的采样装置。采样装置一般用参考数字10表示，它是由塑料(聚丙烯)制成的，包括通过整合绞链16连接到闭合件14的采样件12。闭合件14带有边框18和四个钉20，分别锁定到采样件12的边槽22和四个孔24内。折叠绞链16使边框18和边槽22啮合、钉20与孔24啮合，从而保证装置10的两个部分闭合密封，防止灰尘和内表面被污染。闭合件14的外表面(图3和4中未显示)有平坦区用于粘贴标记和条形码，以便于样品识别。采样件12和闭合件14分别带有用于打开装置10的手柄(finger tab)26和28。
双涂层压敏医用胶带30带有牛皮纸制成的保护性剥离衬里32，是3M的产品，产品编号为#9877，胶带30被粘贴到采样件12的中央区域。剥离衬里32比粘胶带30宽，这样在衬里32的一边就形成一个不与胶带粘贴的条带32’，衬里的这个条带32’悬垂在装置的边上形成易于将衬里剥离的手柄(tab)。在使用前，捏住悬垂的手柄32’将衬里32撕下，暴露出胶带30上的胶粘剂，进行皮肤采样。
清洗供采样的手掌皮肤区域并使其干燥。将有暴露的胶粘剂的胶带30粘贴到手掌上。在采样件12的背面粘贴区域施加压力将胶带30按压到皮肤上，使其与角质层粘贴在一起。然后将装置10撕下，再粘贴到手掌的另一个区域，再次按压到皮肤上。以这种方式重复撕下装置然后粘贴到皮肤上，总共进行10次。
在完成皮肤粘贴过程以后从装置10上切下约5mm宽的小检测片40(见图5)。如图4所示，沿边槽22将采样件12邻近手柄26的一端切下。沿采样件12上模压的指导线36(如图4所示)切割三次得到5mm的检测片，切割从边上开始直到刚刚越过中心线。沿着件12上模压的指导线38跨过件12的中央进行第三次切割就可以从采样件12上切下5mm宽的检测片。检测片40包括无胶带的第一端42和带有胶带的第二端44，后者有皮肤样品粘附其上。
与从具有大面积胶带或胶粘剂的装置10上切下检测片40的模式不同，检测片40可具有预先切割或预先刻痕的指导线36和38，从而能使检测片40与装置10方便的分离。不论是切割、预先切开、或预先刻痕的检测片都可在第二端部分44确定固定或预定面积的胶带或胶粘剂。从而在采样后，从装置10上取下检测片40，它含有固定或确定面积的要分析的皮肤样本区域。
与检测片40不同，图6显示了能用于取下圆片50(如图7所示)的切割工具60。圆片50在其一个面52上带有粘附到采样装置10的粘胶带30上的皮肤样品。如图所示，当装置10处于如图所示的折叠状态(闭合)时，可用切割工具60从装置10上切下圆片。将闭合的装置放置到坚硬的表面上(图中未显示)，装置10的采样件12的外表面62朝上。将切割工具60插到圆形凹陷64上，64位于装置10的采样件12的外表面62上，然后压下切割工具60，切过塑料层和胶带30/皮肤样品。但是不要将切割工具60压得太厉害，以免切过装置10闭合件14的塑料层。
与从装置10切下圆片50不同，可预先切割或预先对圆片50进行刻痕(例如但不限于在圆形凹陷边界上)，使得圆片50能够和装置10轻易分开。然而和检测片一样，不论圆片是切割、预切割、或预先刻痕，它都确定具有固定或确定面积的胶带或胶粘剂的面52。因此，在采样后，可从装置10取下圆片50，它含有固定或确定的皮肤样本区域用于分析。
用图5的检测片40继续实施例，将要分析的检测片放置到96孔微孔板的孔中(未显示)，每孔约含150μL Ponceau S染色试剂的溶液(例如，Sigma AldrichCanada Ltd.提供的产品P7170)。在室温下使检测片在溶液中浸泡约15分钟，然后将其取出放置到微孔板的新孔中，每孔约含200μL水洗涤溶液。振荡微孔板以提高洗涤效果，约1分钟后将检测片取出放置到微孔板的新孔中，每孔约含200μL新鲜的水洗涤溶液，再振荡约1分钟。振荡洗涤第3次，第3次洗涤后，通过温和的用吸水纸(至于清洁平面上)吸水除去检测片底部残留的任何洗液液滴。
然后将检测片置于含有约150μl 0.1N氢氧化钠溶液的孔中，从检测片上洗脱结合的染色试剂。在微孔中振荡检测片约5分钟，取出检测片，通过测定溶液在550-570nm处的吸光度测定洗脱的染料量。
为了使许多样品可以被一起处理，需要将检测片40切成与标准96孔(8×12)微孔板的孔相匹配的统一形状。现有的设备可用于将试剂加入到微孔板的孔中，并且可以洗涤这些孔，有一个要求是要避免各分析步骤之间有试剂残留。利用现有的分光光度计在试验的最后一步可以直接阅读孔内的有色溶液。这是通过使用定制的固定物实现的，这些固定物将多达96个检测片保持在正确朝向和位置，从而使其适合标准96孔微量滴定板。固定物使得多达96个一组的检测片能够在分析的每一步中作为一组一起被取出置于新的孔中。然后用如上所述对于单个检测片分析相同的试剂和方法处理一组检测片。
除了上面的蛋白质测定，在本发明的一个方面，可从装置上切下另外的检测片，用于检测皮肤胆固醇量。为了测定皮肤胆固醇量，将每个检测片放置到96孔微孔板的孔中(未显示)，每孔约含100μL A-C-B试剂的溶液。该试剂是毛地黄皂苷(A)通过马来酸酐-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物(C)连接到辣根过氧化物酶(B)上的缀合物(conjugate)，浓度约为1μg/mL。在室温下使检测片在溶液中浸泡约15分钟，然后将其取出放置到微孔板的新孔中，每孔约含200μL洗涤溶液。振荡微孔板以有效洗涤，约1分钟后将检测片取出放置到微孔板的新孔中，每孔约含200μL新鲜的水洗涤溶液，再振荡约1分钟。振荡洗涤第3次，然后将检测片取出放置到约100μL底物溶液(Enhanced K-Blue试剂)中。室温下在暗处使检测片与底物溶液温育约15分钟。在此期间不断摇动微孔板。
检测片温育好以后取出。在含有底物溶液的孔中加入约100μL 1N的硫酸以终止反应，在微孔板读数分光光度计上读取所得溶液在约450nm处的光密度值，该值代表了皮肤样品中的胆固醇含量。
通过测定来自上述采样装置的蛋白质水平和皮肤胆固醇量，能够使得胆固醇测定能交叉参照不同蛋白质水平，以测定例如是否获得了足够的皮肤样本，以提供可用的皮肤胆固醇测量值。另外，可用蛋白质水平标准化皮肤胆固醇水平，例如通过将个人的胆固醇水平除以蛋白质水平。
虽然结合各实施方式描述了申请人的发明内容，并不意味着申请人的发明内容局限于这些实施方式。相反，本领域技术人员都能够理解，申请人的发明内容包括了各种替代形式、改变和等价方式。

Claims (49)

1.一种测定胶带剥离获得的皮肤量的方法，其特征在于，该方法包括：
a)提供包括背衬件的胶带，其中该胶带至少有一面涂有医用胶粘剂；
b)将胶带放置到皮肤的指定区域，使胶带粘贴到该指定皮肤区域；
c)从皮肤的指定区域剥离下胶带，得到代表皮肤外角质层的样本，该样本粘附到胶带上，从而带有暴露的皮肤组分；
d)将蛋白染料加到样本的预选表面区域上，使蛋白染料与其保持接触一段时间，足以导致所述染料与存在于暴露的皮肤组分中的蛋白质结合；和
e)测定暴露的皮肤组分中染色的蛋白质，以确定指示获得的皮肤量的蛋白质量的测量值。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白染料选自阴离子染料和酸性染料。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白染料是Ponceau S染色剂。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白染料是考马斯蓝。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，测定暴露的皮肤组分中染色蛋白质的强度，以测定蛋白质量的测量值。
6.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，用分光光度法测定染色的蛋白质，以测定蛋白质量的测量值。
7.如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，将蛋白质量的测量值与预定的阈值水平进行比较。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，如果蛋白质量低于预定的阈值，弃去样本。
9.如权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述背衬件由聚酯制成。
10.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述医用胶粘剂是压敏胶粘剂。
11.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述医用胶粘剂是丙烯酸基胶粘剂。
12.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述医用胶粘剂是合成橡胶弹性体胶粘剂。
13.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述医用胶粘剂是聚硅氧烷基胶粘剂。
14.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述医用胶粘剂包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
15.一种比较来自多个个体的皮肤胆固醇相对水平的方法，该方法包括：
a)用胶带剥离获得代表皮肤外角质层的样本，分析粘附在胶粘剂上的暴露的皮肤组分，以获得个体的皮肤胆固醇水平，从而测定来自各个个体的皮肤胆固醇；
b)将蛋白染料加到样本的暴露皮肤组分的预定表面区域上，该区域与测定皮肤胆固醇的区域分开，使蛋白染料与其保持接触一段时间，足以导致所述染料与存在于暴露的皮肤组分中的蛋白质结合；
c)测定暴露的皮肤组分中染色的蛋白质，以确定指示获得的皮肤量的蛋白质量的测量值；和
d)用蛋白质量的测量值对皮肤胆固醇测量值进行标准化。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述标准化包括皮肤胆固醇测量值除以蛋白质测量值。
17.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述蛋白染料选自阴离子染料和酸性染料。
18.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述蛋白染料是Ponceau S染色剂。
19.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述蛋白染料是考马斯蓝。
20.如权利要求15-19任一所述的方法，其特征在于，测定暴露的皮肤组分中染色蛋白质的强度，以测定蛋白质量的测量值。
21.如权利要求15-19任一所述的方法，其特征在于，用分光光度法测定染色的蛋白质，以测定蛋白质量的测量值。
22.如权利要求15-21任一所述的方法，其特征在于，将蛋白质量的测量值与预定的阈值水平比较。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，如果蛋白质量低于预定的阈值，弃去样本。
24.如权利要求15-23任一所述的方法，其特征在于，所述背衬件由聚酯制成。
25.如权利要求15-24任一所述的方法，其特征在于，所述医用胶粘剂是压敏胶粘剂。
26.如权利要求15-24任一所述的方法，其特征在于，所述医用胶粘剂是丙烯酸基胶粘剂。
27.如权利要求15-24任一所述的方法，其特征在于，所述医用胶粘剂是合成橡胶弹性体胶粘剂。
28.如权利要求15-24任一所述的方法，其特征在于，所述医用胶粘剂是聚硅氧烷基胶粘剂。
29.如权利要求15-24任一所述的方法，其特征在于，所述医用胶粘剂包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
30.用于实施权利要求1所述的方法的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：
-所述胶带；和
-所述蛋白质染料的来源。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白染料选自阴离子染料和酸性染料。
32.如权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白染料是Ponceau S染色剂。
33.如权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白染料是考马斯蓝。
34.如权利要求30-33任一所述的试剂盒，其特征在于，所述背衬件由聚酯制成。
35.如权利要求30-34任一所述的试剂盒，其特征在于，所述医用胶粘剂是压敏胶粘剂。
36.如权利要求30-34任一所述的试剂盒，其特征在于，所述医用胶粘剂是丙烯酸基胶粘剂。
37.如权利要求30-34任一所述的试剂盒，其特征在于，所述医用胶粘剂是合成橡胶弹性体胶粘剂。
38.如权利要求30-34任一所述的试剂盒，其特征在于，所述医用胶粘剂是聚硅氧烷基胶粘剂。
39.如权利要求30-34任一所述的方法，其特征在于，所述医用胶粘剂包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
40.如权利要求30-39任一所述的试剂盒，其特征在于，所述胶粘剂由一个可闭合的装置携带，所述可闭合的装置包括一个携带胶粘剂的采样件和一个能与所述采样件啮合并使胶粘剂保持在所述装置内的闭合件。
41.如权利要求40所述的试剂盒，其特征在于，当所述闭合件与所述采样件啮合时，所述胶粘剂被密封在所述装置内。
42.如权利要求41所述的试剂盒，其特征在于，至少所述闭合件或所述采样件带有边框，所述闭合件或所述采样件的另一个带有容纳所述边框的边槽，从而将所述胶粘剂密封在所述装置内。
43.如权利要求40-42任一所述的试剂盒，其特征在于，所述闭合件可通过绞链连接到所述采样件。
44.如权利要求40-43任一所述的试剂盒，其特征在于，至少一部分采样件能从可闭合装置上切下形成检测片，所述检测片的第一端上没有胶粘剂，而第二端上有胶粘剂。
45.如权利要求40-43任一所述的试剂盒，其特征在于，所述可闭合装置确定至少一个预先切割或预先刻痕的检测片，所述至少一个检测片的第一端上没有胶粘剂，而第二端上有胶粘剂。
46.如权利要求44或45所述的试剂盒，其特征在于，所述检测片的有胶粘剂的第二端确定固定或预定面积的胶粘剂。
47.如权利要求40-43任一所述的试剂盒，其特征在于，至少一部分采样件能从可闭合装置上切下形成圆片，所述圆片在其一个面上有胶粘剂。
48.如权利要求40-43任一所述的试剂盒，其特征在于，所述可闭合装置确定至少一个预先切割或预先刻痕的圆片，所述至少一个圆片在其一个面上有胶粘剂。
49.如权利要求47或48所述的试剂盒，其特征在于，所述圆片具有胶粘剂的面确定固定或预定面积的胶粘剂。
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