MX2007014304A

MX2007014304A - Ensayo directo de proteina de piel en muestras de piel removidas mediante retiro con cinta.

Info

Publication number: MX2007014304A
Application number: MX2007014304A
Authority: MX
Inventors: Peter Horsewood; Robert Zawydiwski
Original assignee: Premd Inc
Priority date: 2005-05-20
Filing date: 2006-05-19
Publication date: 2008-02-08
Also published as: US20080188387A1; EP1882040A1; AU2006246957A1; BRPI0611281A2; CA2608884A1; KR20080014052A; WO2006122430A1; EP1882040A4; CN101194022A; JP2008541100A

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo de medicion de la cantidad de piel removida por despellejamiento con cinta. En un aspecto de la invencion, la invencion proporciona un metodo para el ensayo directo de proteina en muestras de piel removidas por despellejamiento con cinta, con miras a combatir la medicion de proteina obtenida con una medicion correspondientes del colesterol en piel, para identificar a los individuos en riesgo de tener ateroesclerosis, asi como aquellos en riesgo de desarrollar ateroesclerosis y enfermedades similares asociadas con y atribuibles a los altos niveles de colesterol. Ademas, la presente invencion permite una medicion comprable de la cantidad de piel removida por el despellejamiento con cinta que no confia unicamente en el area de la muestra removida. Ademas, en un aspecto de la invencion, el metodo de esta invencion puede permitir que niveles relativos de colesterol en piel sean comparados con base en las cantidades relativas de la piel removida.

Description

ENSAYO DIRECTO DE PROTEINA DE PIEL EN MUESTRAS DE PIEL REMOVIDAS MEDIANTE RETIRO CON CINTA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para medir la cantidad de piel removida mediante retiro o despellej miento con cinta. Más particularmente, la invención pertenece a un método para el ensayo directo de la proteína en muestras de piel retiradas mediante despellejamiento con cinta para determinar una medición de la cantidad de proteína indicadora de la cantidad de piel retirada. Además, un aspecto de la invención se refiere a un método para el ensayo directo de la proteína en muestras de piel retiradas mediante despellej amiento con cinta, con miras a combinar la medición de la proteína obtenida con una medición de colesterol en piel correspondiente para identificar a los individuos en riesgo de tener ateroesclerosis así como aquellos en riesgo de desarrollar ateroesclerosis y enfermedades similares asociadas con y atribuibles a los altos niveles de colesterol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Como se mencionó, un aspecto de la invención se refiere a un método para el ensayo directo de proteína en muestras de piel retiradas mediante despellejamiento con cinta con miras a combinar una medición de la proteína obtenida, con Ref.: 187874 una medición correspondiente del colesterol en piel para identificar a los individuos en riesgo de tener ateroesclerosis, así como aquellos en riesgo de desarrollar ateroesclerosis y enfermedades similares asociadas con y atribuibles a los altos niveles de colesterol. Numerosos estudios han mostrado que la ateroesclerosis y sus complicaciones, tales como los ataques cardiacos y las apoplejías, son causas principales de morbididad y mortalidad en casi todos los países del mundo. La prevención a bajo costo de la ateroesclerosis requiere la identificación de individuos en riesgo, con lo cual se permite su tratamiento médico y cambio de estilo de vida. Una meta deseada es identificar aquellos individuos que pertenecen al grupo de alto riesgo pero existen dificultades en seleccionar los métodos óptimos para discriminar a los individuos en riesgo. Un método ampliamente utilizado para identificar los individuos en riesgo de tener ateroesclerosis está basado en la medición de los niveles de colesterol total en el plasma sanguíneo venoso (Consensus Conference on Lowering Blood Cholesterol to Prevent Heart Disease, JAMA, 1985, 253, pg. 2080) . Los pacientes son considerados como de alto riesgo si su nivel de colesterol es superior a 240 mg/dl y han existido movimientos recientes para disminuir este nivel de umbral a niveles más bajos.

No obstante, los niveles totales de colesterol únicamente no predicen de manera precisa el nivel de riesgo de un paciente. Una mejor predicción puede ser realizada mediante análisis de las lipoproteínas de plasma sanguíneo; en particular, la medición de los niveles de lipoproteína de baja densidad (LDL) y colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL), es ventajoso (Total and High Density Lipoprotein Cholesterol in the Serum and Risk of Mortality, British Medical Journal, 1985, 290, p. 1239-1243) . A pesar de su ventaja, el uso de los métodos anteriores requiere el muestreo de sangre después de un periodo de ayuno. Además, el muestreo es incómodo, existe un riesgo de infección y el análisis requerido de las lipoproteínas y colesterol plasmáticos es complicado y caro. Además, los estudios han mostrado que el análisis de plasma sanguíneo puede no reflejar completamente el proceso de acumulación de colesterol en la pared arterial y otros tejidos. En muchos casos, ni los niveles de colesterol plasmáticos ni incluso los perfiles de lípidos completos correlacionan con la severidad de la ateroesclerosis. Niveles significativos de colesterol aparecen en tejido, así como en plasma y se ha mostrado que el colesterol tisular juega un papel principal en el desarrollo de la ateroesclerosis. Los tejidos, incluyendo la piel, han sido identificados, los cuales acumulan colesterol de la misma manera que la pared arterial y los estudios han demostrado una estrecha correlación entre el contenido de colesterol en la pared arterial y la piel. Por ejemplo, el colesterol fue extraído de muestras de piel liofilizadas y medido utilizando técnicas químicas y bioquímicas tradicionales. (Nikitin Y. P., Gordienko I. A., Dolgov A. V., Filimonova T. A. "Cholesterol content in the skin and its correlation with lipid quotient in the serum in normáis and in patients with ischemic cardiac disease", Cardiology, 1987, II, No. 10, P.48-51) . Mientras que es útil, este método es demasiado complicado y doloroso para ser empleado para la selección de población a gran escala. La Patente de los Estados Unidos No. 4,458,686 describe un método para cuantificar diversos compuestos en la sangre, directamente bajo la piel o sobre su superficie. El método está basado en la medición de los cambios de la concentración de oxígeno electroquímicamente, por ejemplo, vía la polarografía . En el caso de las sustancias no volátiles que no se difunden a través de la piel, es necesario implantar enzimas bajo la piel para efectuar los cambios de oxígeno en la superficie de la piel. Esta patente también describe el potencial de utilizar tales métodos para cuantificar la cantidad de colesterol utilizando la colesterol-oxidasa. La instrumentación y los procedimientos complejos necesarios requieren los servicios de personal altamente calificado para realizar las mediciones, limitando de este modo la utilidad del método para seleccionar grandes números de personas. La determinación del contenido de colesterol en la piel da una medida del grado de ateroesclerosis y puede ser obtenida a través de análisis estándares de laboratorio de especímenes de biopsia de piel. No obstante, existe un dolor considerable involucrado en la toma de una muestra de piel y un riesgo de infección en el sitio de muestreo. Además, este método tiene otras desventajas debido a que los especímenes de piel gruesos incorporan varias capas de piel, incluyendo la capa córnea más externa (estrato córneo) , la epidermis y la dermis. Ya que la capa dérmica es altamente vascularizada, las muestras de biopsia de piel contienen vasos sanguíneos y elementos sanguíneos. Éstos pueden también contener glándulas sudoríparas y sebáceas y las secreciones contenidas en éstas. Además, la grasa subcutánea está localizada directamente bajo la dermis y puede también contaminar los especímenes. Por o tanto, los especímenes de biopsias de piel son heterogéneos y su análisis puede dar datos falsos sobre el contenido de colesterol en la piel. La Patente de los Estados Unidos No. 5,489,510 describe un método no invasivo para la identificación visual del colesterol sobre la piel utilizando un reactivo que tiene un componente específico que se enlaza al colesterol, en combinación con un reactivo que tiene un componente indicador para proporcionar un cambio de color visual correspondiente a la presencia del componente enlazado al colesterol de la piel. El método supera muchas de las objeciones de los procedimientos previos y cumple muchas de las metas deseadas requeridas para una selección en masa simple, para identificar a los individuos en riesgo de tener ateroesclerosis. El procedimiento es realizado directamente sobre la piel de la palma de la mano y, mientras que es rápido y simple, requiere que todos los individuos que van a ser probados estén presentes en el consultorio del médico o en la clínica donde es conducida la prueba. Esto por supuesto limita la selección efectiva a gran escala. Las proporciones molares de los lípidos, incluyendo colesterol, en el estrato córneo han sido determinadas sobre muestras obtenidas mediante extracción de piel con solvente, directa (Norlen L., et al. J. Invest. Dermatology 72-77 ', 112, 1999). La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC por sus siglas en ingles) y la cromatografía líquida de gas en conjunto con la espectrometría de masa fueron utilizadas para separar y analizar los lípidos. Los métodos analíticos son complejos, pero de manera más importante, el uso de sistemas de solventes orgánicos corrosivos e irritantes para extraer piel humana para determinaciones rutinarias, no son prácticos. El perfil de lípidos de la capa del estrato córneo de la piel ha sido determinado utilizando un método de retiro o despellejamiento con cinta como se describe por A. Weerheim y M. Ponec (Arch. Dermatol. Res., 191-199, 293, 2001). En este estudio, los lípidos, incluyendo el colesterol, fueron extraídos con solvente del estrato córneo después del despellejamiento de la piel con cinta. El extracto lipídico resultante fue separado mediante cromatografía de capa delgada de alta resolución. Este método es muy laborioso. Éste requiere tres sistemas de solvente consecutivos para efectuar la separación de los lípidos, un método de tinción y carbonización para visualizar los componentes y un paso de densitometría para determinar las cantidades relativas de los lípidos. El método no se presta a la determinación simple y rápida de los niveles de colesterol en grandes números de muestra . Un dispositivo que proporciona un ensayo simple de alto rendimiento para medir el colesterol en piel es un dispositivo de cinta adhesiva para muestreo en piel, y un novedoso método para su uso, como se describe en la solicitud de Patente de los Estados Unidos co-pendiente del solicitante, Publicación No. 2005-0272112-A1, los contenidos de la totalidad de la cual se incorporan por referencia en la presente. El método descrito en esta solicitud puede ser aplicado para obtener un número de muestras de piel a partir de un número de individuos, de modo que los niveles de colesterol en piel para los individuos respectivos pueden ser realizados y su riesgo para la ateroesclerosis y la enfermedad cardiovascular relacionada es determinado. Los dispositivos de retiro o despellejamiento con cinta y los métodos descritos en esta solicitud de patente proporcionan un ensayo de evaluación de riesgo, de bajo costo, simple, que es aplicable a la selección a gran escala. La cantidad total de colesterol en una muestra de piel tomada con una cinta adhesiva por despellejamiento con cinta está relacionada al tamaño de la muestra de la cinta. Por lo tanto, para comparar los niveles de colesterol en piel entre los individuos, las muestras del mismo tamaño deben ser evaluadas y comparadas. Esto es logrado mediante el uso de un dispositivo de retiro o despellejamiento con cinta que permite que piezas de cinta con un área fija sean removidas después de la aplicación de la cinta adhesiva a la piel, para obtener una muestra. Algo de la cinta retirada puede ser utilizada para un ensayo de colesterol en piel. Por ejemplo, la obtención de muestras de piel de tamaño consistente a partir de diversos individuos es lograda mediante la aplicación de la cinta adhesiva repetidamente a la piel, tal que ésta se llega a saturar con la piel. Luego, una pequeña "tira de inmersión" o "disco" que tiene un tamaño fijo, es cortada del dispositivo para dar un área constante de la muestra de piel para el ensayo. No obstante, la comparación de los niveles de colesterol en piel entre los individuos utilizando un área constante de cinta saturada con piel, no necesariamente aseguran que estén siendo comparadas cantidades similares de piel. Cantidades totales diferentes de piel pueden ser depositadas sobre cintas respectivas cuando se toman muestras de diferentes individuos. Mediante la relación del nivel de colesterol en piel a una cantidad estandarizada o normalizada de piel se podría permitir mejor la comparación de los niveles de colesterol en piel entre individuos. Por ejemplo, una aplicación de uso de un dispositivo para despellejamiento con cinta para evaluar la medición del colesterol en piel, es para individuos quienes solicitan seguros de vida. La prueba para los factores de riesgo (por ejemplo, la edad, el hábito de fumar, la presión sanguínea, etc.) en los solicitantes de seguros es una práctica estándar y permite que las primas estén basadas en los resultados de prueba. Ya que el colesterol en piel es un factor de riesgo para tener o desarrollar la ateroesclerosis y enfermedades similares, su valor podría incluir las primas de seguros, y las muestras podrían ser sometidas a manipulación para favorecer la producción de resultados. Por lo tanto, existe un requerimiento para asegurar que una muestra de piel adecuada haya sido tomada para evaluar el colesterol en piel y con esto disuadir a los "defraudadores" de que sub-muestreen deliberadamente con la intención de producir un nivel bajo de colesterol en piel. En consecuencia, para esta aplicación, existe una necesidad para medir la cantidad de piel removida para el ensayo de colesterol en piel, para asegurar que haya sido tomada una muestra suficiente y para permitir la comparación de los niveles de colesterol en piel entre individuos, para evaluar el estado de riesgo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para medir la cantidad de piel removida por despellejamiento con cinta. En un aspecto de la invención, la invención proporciona un método para el ensayo directo de la proteína en muestras de piel removidas mediante despellejamiento con cinta, con miras a combinar la medición de proteína obtenida con una medición de colesterol en piel correspondiente, para identificar los individuos en riesgo de tener ateroesclerosis, así como aquellos en riesgo de desarrollar ateroesclerosis y enfermedades similares asociadas con y atribuibles a los altos niveles de colesterol. Además, la presente invención permite una medición compartida de la cantidad de piel removida por el despellejamiento con cinta que no confía solamente en el área de la muestra removida. Además, en un aspecto de la invención, el método de esta invención puede permitir que los niveles relativos del colesterol en piel sean comparados con base en las cantidades relativas de la piel removida. Es también deseable que el método de medición de las cantidades de muestras de piel removidas por el despellejamiento con cinta deban ser simples, de bajo costo, adecuadas para el procesamiento de alto rendimiento, que sean todavía compatibles con los métodos que involucran, por ejemplo, y de acuerdo con un aspecto de la invención, pero no limitados a, el ensayo del colesterol en piel en muestras de piel removidas mediante despellejamiento con cinta. En particular, la invención comprende un método para medir la cantidad de piel removida por el despellejamiento con cinta, que comprende: a) la provisión de una cinta que tiene un miembro de respaldo recubierto sobre al menos un lado de la misma con un adhesivo médico; b) la aplicación de la cinta sobre un área seleccionada de piel para adherir la cinta al área de piel seleccionada; c) retirar la cinta del área de la piel seleccionada, para obtener una muestra representativa de una capa externa del estrato córneo de la piel, adhiriendo la muestra a la cinta para tener constituyentes de piel expuestos; d) aplicar una tinción de proteína sobre un área superficial predeterminada de la muestra, y permitir que la tinción de la proteína permanezca en contacto con ésta por un periodo de tiempo suficiente para provocar el enlace del colorante a la proteína presente en los constituyentes de piel expuestos; y e) la medición de la proteína teñida en los constituyentes de piel expuestos, para determinar una medición de la cantidad de proteína indicadora de la cantidad de piel removida. La tinción de proteína puede ser seleccionada del grupo que consiste de colorantes aniónicos y ácidos. Para una modalidad de la invención, la tinción de proteína es un reactivo de tinción de Ponceau S. Para una modalidad adicional de la invención, la tinción de proteína es Azul de Coomassie . Además, la intensidad de la proteína teñida en los constituyentes expuestos de la piel es medible para determinar una medición de la cantidad de proteína. En una modalidad, la proteína teñida puede ser medida espectrofotométricamente para determinar una medición de la cantidad de proteína. En una modalidad adicional, la medición de la cantidad de proteína es comparada a un nivel de umbral predeterminado. La muestra puede ser desechada si la cantidad de proteína medida está por debajo del umbral predeterminado. Además, en otro aspecto más de la invención, el miembro de respaldo puede ser formado de poliéster.

En un aspecto adicional de la invención, el adhesivo médico puede ser, por ejemplo, pero no limitado a, un adhesivo sensible a la presión; un adhesivo basado en acrílico; un adhesivo elastomérico de caucho sintético; un adhesivo basado en silicona; o comprende un elastómero formado de polímeros en bloque de estireno-isopreno-estireno o estireno-butadieno-estireno. Además, es contemplado también con esta invención un kit para el uso para llevar a cabo el método anteriormente mencionado. El kit comprende: la cinta; y una fuente de tinción de proteína. La tinción de proteína puede ser seleccionada del grupo que consiste de colorantes aniónicos y ácidos. Para una modalidad de la invención, la tinción de proteína es un reactivo de tinción de Ponceau S. Para una modalidad adicional de la invención, la tinción de proteína es Azul de Coomassie . Además, en otro aspecto más de la invención el miembro de respaldo puede ser formado de poliéster. En un aspecto adicional de la invención, el adhesivo médico puede ser, por ejemplo, pero no limitado a, un adhesivo sensible a la presión, un adhesivo basado en acrílico; un adhesivo de elastómero de caucho sintético; un adhesivo basado en silicona; o comprende un elastómero formado de polímeros en bloque de estireno-isopreno-estireno o estireno-butadieno-estireno. Además, en otro aspecto más de la invención, el adhesivo es llevado por un dispositivo obturable, el dispositivo obturable tiene un miembro de muestreo que lleva el adhesivo, y un miembro de cierre adaptado para acoplar el miembro de muestreo y retener el adhesivo dentro del dispositivo. El adhesivo puede ser sellado dentro del dispositivo cuando el miembro de cierre se acopla al miembro de muestreo. Al menos el miembro de cierre o el miembro de muestreo puede estar provisto con una orilla periférica, y el otro del miembro de cierre o el miembro de muestreo puede estar provisto con un canal periférico adaptado para recibir la orilla de modo que el adhesivo es sellado dentro del dispositivo. Además, el miembro de cierre u obturación puede ser conectado al miembro de muestreo por una bisagra. Además, al menos una porción del miembro de muestreo puede ser adaptada para ser cortada del dispositivo obturable para formar una tira de inmersión, la tira de inmersión tiene un primer extremo de la misma desprovista de adhesivo, y un segundo extremo de la misma con adhesivo. En otro aspecto más de la invención, al menos una porción del miembro de muestreo está adaptada para ser cortada del dispositivo obturable para formar un disco, el disco tiene el adhesivo proporcionado sobre una cara del mismo. Mediante el uso de una tira de inmersión que tiene un extremo con adhesivo, o un disco cortado del dispositivo obturable, un área predefinida y fija del adhesivo puede ser definida. Por lo tanto, después de muestrear la piel, las tiras de inmersión o los discos tienen una muestra de piel acoplada a un área definida y predefinida del adhesivo. Además, en aspectos adicionales de la invención, el miembro de muestreo del dispositivo de muestreo obturable puede tener, por ejemplo, pero no estar limitado a, tiras de inmersión o discos precortados o pre-amuescados para predefinir un área fija del adhesivo. Además, un aspecto de la invención proporciona un método para comparar los niveles relativos de colesterol en piel a partir de un número de individuos, que comprende: a) la medición del colesterol en piel de cada individuo al obtener una muestra representativa de una capa del estrato córneo externo de la piel, utilizando despellejamiento con cinta y analizando los constituyentes expuestos de la piel adheridos al adhesivo, para obtener un nivel de colesterol en piel para un individuo; b) la aplicación de una tinción de proteína sobre un área superficial predefinida de los constituyentes expuestos de la piel, de la muestra, separados de donde el colesterol en piel es medido, y permitiendo que la tinción de proteína permanezca en contacto con ésta por un periodo de tiempo suficiente para provocar el enlace del colorante a la proteína presente en los constituyentes expuestos de la piel; c) la medición de la proteína teñida en los constituyentes expuestos de la piel, para determinar una medición de la cantidad de la proteína indicadora de la cantidad de piel removida; y d) la normalización de la medición de colesterol en piel con la medición de la cantidad de proteína. La normalización puede comprender la división de la medición del colesterol en piel por la medición de proteína. La tinción de proteína puede ser seleccionada del grupo que consiste de colorantes aniónicos y ácidos. Para una modalidad de la invención, la tinción de proteína es un reactivo de tinción de Ponceau S. Para una modalidad adicional de la invención, la tinción de proteína es Azul de Coomassie . Además, la intensidad de la proteína teñida en los constituyentes expuestos de la piel es medida para determinar una medición de la cantidad de proteína. En una modalidad, la proteína teñida puede ser medida espectrofotométricamente para determinar una medición de la actividad de proteína. En una modalidad adicional, la medición de la cantidad de proteína es comparada a un nivel de umbral predeterminado. La muestra puede ser desechada si la cantidad de proteína medida está por debajo del umbral predeterminado. Además, en otro aspecto más de la invención el miembro de respaldo puede ser formado de poliéster. En un aspecto adicional de la invención, el adhesivo médico puede ser, por ejemplo, pero no limitado a, un adhesivo sensible a la presión, un adhesivo basado en acrílico; un adhesivo de elastómero de caucho sintético; un adhesivo basado en silicona; o comprende un elastómero formado de polímeros en bloque de estireno-isopreno-estireno o estireno-butadieno-estireno. Estas y otras características de las enseñanzas del solicitante son descritas en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La persona experta en la técnica entenderá que las figuras, descritas enseguida, son para fines de ilustración únicamente. Las figuras no están destinadas a limitar el alcance de las enseñanzas del solicitante de ninguna manera. La Figura 1 es una gráfica que muestra la probabilidad de una muestra particular de tener un valor de reflectancia seleccionado, tomado para xl, x3 y xlO muestras retiradas; La Figura 2 es una gráfica que muestra la probabilidad de una muestra particular de tener una densidad óptica (OD) con un valor de 570 nm tomada para xl, x3 y xlO muestras retiradas; La Figura 3 es una vista superior de un dispositivo de muestreo como se utiliza en el ejemplo; La Figura 4 es una vista fragmentaria del dispositivo de muestreo ilustrado en la Figura 3, que muestra los detalles del miembro de muestreo del mismo; La Figura 5 es una vista en perspectiva de una tira de inmersión cortada a partir del dispositivo de muestreo de esta invención; La Figura 6 es una vista en perspectiva de un dispositivo de muestreo alternativo que puede ser utilizado en el Ejemplo; y La Figura 7 es una vista en perspectiva de un disco cortado del dispositivo de muestreo de esta invención a partir de la modalidad alternativa mostrada en la Figura 6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un dispositivo que proporciona un ensayo simple, de alto rendimiento, para la medición de colesterol en piel es un dispositivo de cinta adhesiva para el muestreo de piel, como se describe en la solicitud de Patente de los Estados Unidos co-pendiente del solicitante, Publicación No. 2005-0272112-A1, los contenidos de la totalidad de la cual se incorporan por referencia en la presente. En un aspecto de la presente invención, el método descrito en esta solicitud puede ser aplicado para obtener un número de muestras de piel de un número de individuos, de modo que los niveles de colesterol en piel para los individuos respectivos pueden ser medidos y puede ser determinado su riesgo para la ateroesclerosis y enfermedad cardiovascular determinada. Los dispositivos de despellejamiento con cinta y los métodos descritos en esta solicitud de patente pueden proporcionar un ensayo de evaluación de riesgo, de bajo costo, simple que es aplicable a la selección a gran escala. Por ejemplo, se puede hacer uso de una cinta que comprende un miembro de respaldo formado de poliéster. La cinta es recubierta sobre al menos un lado de la misma con un adhesivo médico. El término "adhesivo médico" como se utiliza en la presente, se refiere a un adhesivo que es hipoalérgico y seguro para la aplicación de la piel. Tal adhesivo es preferentemente un adhesivo sensible a la presión, por ejemplo, un adhesivo que comprende un elastómero formado de polímeros en bloque de estireno-isopreno-estireno o estireno-butadieno-estireno. Como se puede apreciar, pueden existir muchas clasificaciones y tipos de adhesivo. En general, cualquier adhesivo adecuado para el uso con esta invención es un adhesivo médico como es definido anteriormente, para asegurar que no existirán en general problemas con reacciones alérgicas cuando el adhesivo sea aplicado a la piel para el muestreo. Los inventores probaron varios tipos de adhesivos para el uso en la toma de una muestra de piel; la mayor parte de éstos fueron adhesivos basados en acrílico, sensibles a la presión, pero varios adhesivos elastoméricos del tipo caucho sintético y adhesivos basados en silicona, fueron también probados. El inventor encontró también que los adhesivos de caucho sintético basados en copolímeros en bloque de estireno y butadieno o estireno e isopreno, funcionan bien para esta invención. Un ejemplo de un adhesivo de caucho sintético es un adhesivo sintético tipo KratonMR (libre de látex) basado en un copolímero en bloque de estireno y butadieno. Tal adhesivo proporcionó mejor estabilidad para las muestras de piel, para facilitar la transportación de las muestras para el análisis subsiguiente . Una cinta adhesiva preferida adicional para el uso en el método de la invención es una cinta grado médico sensible a la presión, doblemente recubierta. Los ejemplos de tal cinta grado médico son aquellos vendidos por 3M bajo el Producto #9877, o por Adhesive Research, Inc. Bajo el Producto #8570. Una lista de algunas de las otras cintas que han sido probadas por los inventores, es mostrada en la tabla siguiente. Un requerimiento que es constante es el uso de una cinta grado médico que es hipoalergénica .

TABLA 1 Se puede ofrecer que las cintas adhesivas listadas en la Tabla 1 no son exhaustivas, sino meramente ilustrativas de diferentes cintas adhesivas que son adecuadas para el uso con esta invención a la fecha actual, y que otras cintas adhesivas que serán aparentes para aquellos expertos en la técnica son contempladas por esta invención. Las cintas sensibles a la presión, doblemente recubiertas son en general disponibles con un revestimiento protector fácilmente removible. El revestimiento protege la cinta de la adherencia hasta que es retirada y mantiene el adhesivo para que no se contamine. Los revestimientos pueden ser colocados sobre cualquier lado de la cinta doblemente recubierta o la cinta puede tener un revestimiento simple y podría ser enrollada por sí misma, con lo cual se protegen ambas superficies. Los revestimientos con propiedades de liberación diferenciales pueden ser utilizados, de modo que un primer lado del adhesivo puede ser expuesto mientras que se protege la segunda superficie adhesiva. Una cinta doblemente recubierta con revestimientos diferenciales es particularmente ventajosa para el muestreo de piel. El retiro del primer revestimiento permite que la cinta sea pegada sobre el soporte de respaldo de un dispositivo de muestreo, y deja el lado de muestreo de la piel cubierto con el segundo revestimiento. Este segundo revestimiento protege al área adhesiva del muestreo de la piel para que no se adhiera, y libre de contaminación hasta que se utilice. Cuando es requerido para el muestreo de piel, el segundo revestimiento es retirado. El adhesivo puede ser aplicado sobre cualquier parte de la piel, pero la parte más adecuada es la superficie de la palma de la mano debido a que la palma no tiene glándulas sebáceas cuyas secreciones contengan colesterol que pueda afectar los resultados para ciertos aspectos de esta invención, y particularmente aquellos aspectos que involucran la medición del colesterol. Adicionalmente, la piel sobre la palma es fácilmente accesible para el muestreo. Es deseable obtener cantidades uniformes de muestras de piel para el análisis. La aplicación del adhesivo para el muestreo es típica y rutinariamente realizada utilizando una aplicación simple del adhesivo a la piel. Cantidades adicionales de material de estrato córneo pueden ser obtenidas por aplicaciones adicionales del adhesivo a la piel. Cada aplicación subsiguiente del adhesivo a la piel da como resultado que piel adicional se adhiera al adhesivo. Este proceso continúa hasta que el adhesivo se llegue a saturar con el material de piel después de lo cual éste ya no es pegajoso. El número de aplicaciones requeridas para saturar un adhesivo depende del tipo de adhesivo utilizado, pero para los adhesivos más comúnmente utilizados, la situación es lograda con menos de diez aplicaciones, por ejemplo, pero no limitada a, tres a siete aplicaciones. La aplicación de adhesivo a un área fresca de la piel para cada despellejamiento subsiguiente da como resultado una saturación de mejor y más rápida del adhesivo. Por lo tanto, para el muestreo consistente y bueno, es conveniente realizar diez aplicaciones de un adhesivo a la piel, utilizando nuevas áreas de la piel para cada aplicación. Para aquellos aspectos de la invención donde el colesterol en piel está siendo medido, la cantidad total de colesterol presente en la muestra de piel sobre el adhesivo es relacionada al tamaño de la muestra de piel obtenida. Además, un tamaño de muestra de piel consistente es requerido con el fin de comparar los niveles relativos del colesterol en piel entre los diferentes individuos. Por lo tanto, las tiras de inmersión pueden ser cortadas desde un dispositivo para presentar un área fija del adhesivo (por ejemplo, pero no limitada a, un área rectangular o circular) que tiene constituyentes de piel expuestos acoplados a éste que fueron removidos por el retiro de la cinta. Estas tiras de inmersión permiten una comparación de los niveles de colesterol en piel entre diferentes individuos, con base en un área unitaria fija de la piel que es analizada. Como una alternativa al corte de las tiras de inmersión desde un dispositivo que tiene un área grande de cinta o adhesivo, las tiras de inmersión pueden ser, por ejemplo, pero no limitadas a, pre-cortadas o pre-amuescadas para permitir la fácil separación desde el dispositivo. Tales tiras de inmersión precortadas o pre-amuescadas, como se describe anteriormente, definirán un área fija y predefinida de la cinta o adhesivo en un extremo de las mismas. Después del muestreo, tal tira de inmersión pre-cortada o pre-amuescada puede ser luego fácilmente removida del dispositivo y contener un área de muestra de piel para el análisis que es de un área fija y definida. La obtención de muestras de piel de tamaño consistente a partir de diversos individuos (o muestras repetidas del mismo individuo) es lograda por los siguientes pasos. Primeramente, como se describió previamente, la muestra de piel es tomada por la aplicación del adhesivo repetidamente a la piel, tal que ésta se llega a saturar con la piel y ya no está pegajosa. El adhesivo se llega a saturar con la piel después de aproximadamente tres a siete aplicaciones y diez aplicaciones son rutinariamente realizadas para asegurar la saturación. Enseguida, para obtener un área constante de la muestra de piel que va a ser evaluada, un área de tamaño fijo (como se volverá aparente más adelante a partir del ejemplo) del dispositivo de muestreo de piel es retirada, y sumergida en volúmenes estandarizados de reactivos detector e indicador, como se describirá también más adelante en la presente. La capa córnea externa de la piel (estrato córneo) consiste principalmente de corneocitos enriquecidos con proteína, rodeados por una mezcla de lípido que incluye colesterol. Estructuralmente, esto es a menudo descrito como un modelo de "tabiques y cemento" con los corneocitos que representan los tabiques y el lípido circundante que representa el cemento (P.M. Elias, J Invest Dermatol. 1983, 80, 44S-9S) . La cantidad de proteína en el estrato córneo es relativamente constante entre diferentes individuos; por lo tanto, la proteína en la muestra de piel removida por el despellejamiento de la cinta puede proporcionar una medición indirecta de la cantidad de piel removida. Mediante la medición de la proteína, y por lo tanto la cantidad de muestra de piel obtenida, se puede determinar entonces, para un aspecto de la invención, que una muestra de piel adecuada ha sido removida para el ensayo de colesterol en piel. Además, el nivel de colesterol en piel medido puede ser comparado con el valor de la proteína para obtener una medición del colesterol por unidad del nivel de proteína y, con esto, el colesterol por cantidad unitaria de piel. Un ensayo para medir la proteína en la muestra de piel removida por el despellejamiento de la cinta puede utilizar, por ejemplo, pero no está limitado a Azul de Coomassie como una tinción de proteína general (por ejemplo, una tinción de proteína comercialmente disponible como Bio RadMR) . Se ha mostrado que el Azul de Coomassie puede ser utilizado para la estimación cuantitativa de proteínas inmovilizadas sobre un material de soporte (S. Fazekas de St. Groth, et al. Biochimica Et Biophysica Acta, 1863, 71, 377-391) . La tinción de Coomassie es aplicada a un área de la piel sobre el adhesivo y después de un periodo de tinción adecuado se lava el exceso de tinción. La intensidad de la proteína de piel teñida es luego determinada por la medición de la cromaticidad de la muestra teñida con azul sobre el adhesivo y esta intensidad es relacionada directamente a la cantidad de proteína. La medición de la intensidad relativa (por ejemplo, la cromaticidad) de las muestras de piel teñidas permite que cantidades relativas de muestras de piel tomadas de individuos por retiro con cinta, sean comparadas. Fueron tomadas las siguientes mediciones para establecer cómo el número de retiros o despellejamiento de cinta correlacionan con la cantidad de piel removida, como se mide utilizando la tinción de proteína Bio-Rad. De acuerdo con un aspecto de la invención, estas mediciones fueron realizadas para determinar si el retiro de una cantidad inadecuada de piel puede afectar la prueba de colesterol en piel. Por lo tanto, fueron corridos ensayos para medir la proteína removida con números variables de despellejamiento con cinta. En particular, las palmas de voluntarios fueron despellejadas una (1), tres (3) y diez (10) veces y los niveles de proteína determinados por la lectura de la intensidad de color y la reflectancia a 610 nm después de la tinción con el reactivo colorante de la proteína Bio-Rad. Estos niveles de proteína proporcionaron una medida del grado de retiro de la piel y eficiencia del despellejamiento de cinta . En el experimento, fueron realizadas determinaciones de proteína Bio-Rad sobre las muestras recolectadas de cuarenta y cinco (45) voluntarios. Cada voluntario proporcionó muestras de piel tomadas utilizando uno (1) , tres (3) y diez (10) despellejamientos de cinta. Para los tres diferentes grupos de muestra (marcados xl, x3 y xlO) se encontró que existió buena correlación entre la intensidad de color y la reflectancia a 610 nm. A partir de un análisis de regresión lineal por mínimos cuadrados los valores R2 para las muestras xl, x3 y xlO fueron de 0.961, 0.978 y 0.959 respectivamente. Los valores medios de intensidad de color para las muestras retiradas xl (n = 45) fue de 11.07, sd 1.83, CV16.3%; los valores medios de intensidad de color para las muestras retiradas x3 (n = 44) fueron de 15.46, sd 2.32, CV17.3%; y los valores medios de intensidad de color para las muestras retiradas xlO (n = 44) fueron de 23.50, sd 1.06, CV4.6% . Los valores de reflectancia medios para las muestras retiradas xl (n = 45) fueron de 55.69, sd 2.95, CV5.6%; los valores de reflectancia medios para las muestras retiradas x3 (n = 44) fueron 48.07, sd 3.08, CV6.4%; y los valores de reflectancia medios para las muestras retiradas xlO (n = 44) fueron 36.19, sd 1.48, CV4.1%. Existieron diferencias significativas entre cada uno de los grupos.

Un análisis para la probabilidad de una muestra particular que tenga un cierto valor de reflectancia (610 nm) fue realizado para cada grupo y se muestran en la Figura 1. Este análisis indicó que 93.2% de las muestras retiradas xlO tuvieron un valor de reflectancia <45, 36.4% de las muestras retiradas x3 tuvo un valor de reflectancia de <45 y únicamente 4.4% de las muestras retiradas xl tuvieron un valor de reflectancia de <45. Alternativamente, 77.3% de las muestras retiradas xlO tuvieron un valor de reflectancia <40, 11.4% de las muestras retiradas x3 tuvieron un valor de reflectancia de <40 y únicamente 2.2% de las muestras retiradas xl tuvieron un valor de reflectancia de <40. Se encontró que utilizando un valor de corte de <45 como criterio de aceptación para el retiro o despellejamiento adecuado se requeriría el rechazo de 6.8% de las muestras que habían sido obtenidas utilizando despellejamientos de diez veces. Un valor de corte de <45 podría dar como resultado el rechazo de 63.6% de las muestras que habían sido obtenidas utilizando tres veces despellejamientos y el rechazo de 95.6% de las muestras que habían sido obtenidas únicamente con un despellejamiento simple. Mientras que el método de tinción con Azul de Coomassie funciona bien, éste requiere un espectrómetro de reflectancia capaz de leer valores de intensidad de color. Además, éste requiere que cada muestra teñida sea leída individualmente, mientras que el ensayo de colesterol en piel puede utilizar microplacas de 96 pozos para ser adecuado para el procesamiento de grandes números de muestras. Ha sido desarrollado un ensayo que permite que la cantidad de proteína sobre una muestra de piel sea determinada fácilmente y, sobre muchas muestras de piel simultáneamente, si se desea. Además, el ensayo permite que la proteína sea medida utilizando espectrofotómetros fácilmente disponibles, por ejemplo, espectrofotómetros de lectura de 96 pozos, en lugar de las mediciones de intensidad de color de muestras simples. Este ensayo está basado en la tinción de Ponceau S (por ejemplo, un miembro de la clase general de colorantes aniónicos o ácidos que se enlaza a las proteínas, por ejemplo, pero no limitado a, residuos de aminoácidos básicos) . La tinción de Ponceau S se enlaza a las proteínas y es utilizada en la tinción histoquímica de tejidos, y es también utilizada como una tinción de membrana reversible para proteínas enlazadas a la nitrocelulosa (O. Salinovich y R. C. Montelaro, Anal. Biochem. 1986, 156, 341-347). Este método permite que las proteínas teñidas sean visualizadas sobre membranas y posteriormente, después de que se elimina el colorante, permite que las proteínas sean caracterizadas adicionalmente sin interferencia de cualquier tinción enlazada. Para la presente invención, el método de Ponceau S es además desarrollado, como se explicará más adelante en la presente, y muestra que las muestras de piel tomadas por el despellejamiento con cinta pueden ser teñidas y, después del lavado de la muestra de piel, la tinción puede ser eluida y cuantificada espectrofotométricamente. Ponceau S tiñe la queratina particularmente bien y la queratina es la proteína principal en la capa córnea de la piel que es removida por el despellejamiento con cinta. A pesar del hecho de que diez aplicaciones dan como resultado la saturación del adhesivo (por ejemplo, la pérdida de la adhesión) , los resultados han mostrado que diferentes individuos dan diferentes cantidades de piel. Aunque los individuos pueden tener niveles ligeramente diferentes de queratina y otras proteínas en piel, los inventores creen que las diferencias observadas son improbables debido a esto. Por ejemplo, diferentes individuos pueden mostrar varios porcentajes de diferencia en los niveles de proteína medidos, pero no se esperaría que los niveles de proteína de los corneocitos variarán por esta cantidad para las muestras de piel tomadas de acuerdo con esta invención. Los inventores creen que las diferencias son más probables debido a las diferentes cantidades totales de piel que son removidas durante el despellejamiento con cinta. Esto es sugerido ya que algunos individuos parecen saturar el adhesivo únicamente después de dos a cuatro despellejamientos, mientras que otros requieren seis a ocho despellejamientos para saturar el adhesivo: esto implica que sean removidas diferentes cantidades de piel. En un aspecto de la invención, las mediciones de colesterol en piel tomadas por despellejamiento con cinta son frecuentemente utilizadas para determinar el riesgo de enfermedad de las arterias coronarias y eventos trombóticos adversos relacionados y esto encuentra uso particular en la industria de los seguros. Los individuos que buscan seguros de vida son evaluados para diversos factores de riesgo (por ejemplo, edad, condición de fumador, presión sanguínea, etc.) y las primas están basadas en el riesgo total. Ya que el colesterol en piel es un factor de riesgo, su valor podría afectar las primas de seguro y las muestras podrían ser sometidas a manipulación para favorecer la producción de resultados. Por lo tanto, ventajas adicionales de determinación de los niveles de proteína es asegurar que una muestra adecuada haya sido tomada (por ejemplo, por arriba de un umbral pre-seleccionado) y con esto disuade a los "estafadores" para que deliberadamente sub-muestreen con la intención de producir un bajo nivel de colesterol en piel. Para asegurar que una muestra de piel adecuada sea tomada para las mediciones de colesterol en piel, un nivel de umbral mínimo de la proteína en piel es establecido. El nivel de umbral es establecido por el análisis de muchas muestras de piel y la determinación del intervalo de distribución de los valores de proteína. Los intervalos de distribución para las muestras de piel tomadas con un único despellejamiento con cinta o con múltiples despellejamientos con cinta, incluyendo el despellejamiento de saturación (por ejemplo, diez despellejamientos con cinta) son preparados. A partir de estos intervalos de distribución puede ser elegido un límite de umbral de modo que puede ser determinada la probabilidad de que un valor de proteína para una muestra particular esté dentro de los límites de una población predefinida. Idealmente, existiría un valor de umbral que podría permitir que todas las muestras tomadas con diez despellejamientos con cinta sean completamente distinguidas de las muestras tomadas con un despellejamiento con cinta único, y posiblemente también de las muestras con, por ejemplo, tres despellejamientos con cinta. En la práctica efectiva las curvas de distribución se traslapan y aparecen a partir de la naturaleza de la variabilidad del individuo a la liberación de la piel sobre el despellejamiento con cinta, que no es posible la discriminación completa. No obstante, pueden ser elegidos valores de umbral que permiten un alto porcentaje de las diez muestras despellejadas con cinta, que son fácilmente distinguidas de la mayoría de las muestras tomadas con el despellejamiento con cinta simple. Por ejemplo, es útil elegir un nivel de umbral, basado en diez despellejamientos con cinta, tal que 98% de la población tienen valor por arriba del nivel, entonces en promedio dos muestras de cada cien analizadas serán rechazadas por poseer muestra insuficiente. No obstante, este nivel de umbral asegurará que la mayor parte de las muestras tomadas con un despellejamiento con cinta único no tendrá suficiente proteína y serán rechazadas. Estos despellejamientos con cinta que dan valores por debajo del valor de umbral preseleccionado son considerados como poseedores de una muestra de piel insuficiente para las determinaciones confiables del colesterol en piel. Para establecer cómo el número de despellejamientos con cinta correlaciona con la cantidad de piel removida como se mide por la tinción de proteína de Ponceau S, se emprendió el siguiente experimento. Para ver cómo la cantidad de piel removida varía con el número de despellejamientos con cinta realizados, muestras de piel fueron removidas de las palmas de 50 voluntarios (N=50) mediante despellejamiento de una (1), tres (3) y diez (10) veces y los niveles de proteína determinados después de la tinción con la solución colorante de Ponceau S. Los niveles de proteína estuvieron basados en las lecturas de densidad óptica del colorante eluido de las muestras de piel teñidas. Los resultados fueron analizados para determinar si los valores eran normalmente distribuidos y para determinar si los valores de corte pueden ser establecidos para diferenciar las muestras que fueron obtenidas utilizando un número particular de despellejamientos con cinta. Las muestras para los despellejamientos xl, x3 y xlO fueron obtenidas de 50 voluntarios (los resultados reflejan que los datos completos eran disponibles para 49 muestras únicamente) . La densidad óptica media para los despellejamientos xl (N=50) fue de 0.078 con una CV media de 13.0%, la densidad óptica media para los despellejamientos x3 (N=50) fue de 0.131 con una media de CV de 12.3%; y la densidad óptica media para los despellejamientos xlO (N=49) fue de 0.263 con una CV media de 12.0%. El análisis utilizando la prueba de Anderson-Darling o Shapiro-Wilk indicó una distribución no normal para los datos. El análisis para la probabilidad de que una muestra particular tenga una densidad óptica (OD) con un valor de 570 nm, fue realizada para cada grupo y se muestran en la Figura 2. Este análisis indicó que 98% de las muestras retiradas xlO tuvo una OD570 nm > 0.1; 60% de las muestras retiradas x3 tuvo una OD570 nm > 0.1; y únicamente 18% de las muestras retiradas xl tuvieron una OD570 > 0.1. Por lo tanto, eligiendo un valor de corte >0.1 OD como un criterio para el muestreo suficiente, dará como resultado el rechazo de 2% de las muestras retiradas xlO, 40% de las muestras retiradas x3, y 82% de las muestras retiradas xl. El nivel de proteína puede también ser utilizado para normalizar los niveles de colesterol en piel que varían como resultado de las muestras de piel variables. Por ejemplo, los individuos quienes dan una muestra de piel pequeña pero quienes tienen alto nivel de colesterol en piel pueden dar un valor de colesterol en piel que es similar a un individuo quien tiene bajos niveles de colesterol en piel, pero da una muestra de piel grande. Al normalizar a un nivel de proteína constante los dos individuos pueden ser distinguidos como poseedores de colesterol en piel alto y bajo, respectivamente. La normalización podría involucrar la manipulación simple de dividir el nivel de colesterol entre el nivel de proteína; esto da efectivamente el nivel de colesterol por unidad de proteína.

EJEMPLO Los aspectos de las enseñanzas del solicitante pueden ser comprendidos además a la luz del siguiente ejemplo, que no debe ser considerado como limitante de las presentes enseñanzas de ninguna manera. Se hizo uso de un dispositivo de muestreo como se muestra en la Figura 3. El dispositivo de muestreo, el cual es generalmente designado por el número de referencia 10, es formado de plástico (polipropileno) y comprende un miembro de muestreo 12 conectado a un miembro de cierre 14 por una bisagra integral 16. El miembro de cierre 14 tiene una orilla periférica 18 y cuatro espigas 20, adaptadas para asegurarse dentro, respectivamente, de un canal periférico 22 y cuatro orificios 24 formados en el miembro de muestreo 12. El plegamiento de la bisagra 16 provoca el acoplamiento del reborde u orilla 18 con el canal 22 y de las espigas 20 con los orificios 24, con lo cual se asegura que las dos mitades del dispositivo 10 permanezcan cerradas y selladas para prevenir el polvo y la contaminación de las superficies internas. La superficie externa (no mostrada en las Figuras 3 y 4) del miembro de cierre 14 tiene un área plana para recibir una etiqueta y tira de código de barras, para la identificación de la muestra. El miembro de muestreo 12 y el miembro de cierre 14 son respectivamente proporcionados con lengüetas 26 y 28 de dedo para abrir el dispositivo 10. Una cinta 30 grado médico sensible a la presión, doblemente recubierta que tiene un revestimiento 32 de liberación de papel Kraft protector y vendido por 3M bajo el Producto #9877 se adhirió al área central del miembro de muestreo 12. El revestimiento de liberación 32 es más ancho que la cinta adhesiva 30, con lo cual se define una tira 32' a lo largo de un borde sin la tira acoplada. Esta tira 32' del revestimiento sobresale del borde del dispositivo para formar una lengüeta para facilidad de retiro del revestimiento.

Inmediatamente antes del uso, el revestimiento 32 es removido utilizando la lengüeta 32' sobresaliente y ésta expone el adhesivo de la cinta 30 para el muestreo de la piel. El área de la piel palmar para muestreo fue limpiada y secada. La cinta 30 con el adhesivo expuesto fue aplicada sobre la palma. La cinta 30 fue presionada contra la piel mediante la aplicación de presión a la parte posterior del miembro de muestreo 12 por arriba del área adhesiva, con lo cual se provoca la adherencia de la capa del estrato córneo. El dispositivo 10 fue desprendido, reaplicado a un área de la palma y nuevamente presionado a la piel. El dispositivo fue desprendido y aplicado a la piel palmar de esta manera por un total de 10 aplicaciones. Una tira de inmersión 40 (ver Figura 5) de aproximadamente cinco mm de anchura es cortada del dispositivo 10 después de la aplicación a la piel, como sigue. Con referencia a la Figura 4, una porción extrema del miembro de muestreo 12 fue removida mediante el corte a lo largo de la porción de canal 22, que está adyacente a la lengüeta 26. Tres cortes fueron luego realizados a lo largo de las líneas de guía 36 (mostradas en la Figura 4) moldeadas en un miembro de muestreo 12, para delinear la tira de 5 mm, cortando desde el borde justo para pasar la línea central. La tira con 5 mm de anchura fue liberada del miembro de muestreo 12 mediante la realización de un tercer corte a través del centro del miembro 12, utilizando la línea guía 38 moldeada dentro del miembro 12. La tira 40 tiene una primera porción extrema 42 desprovista de la cinta y una segunda porción extrema 44 con cinta que tiene la muestra de piel adherida a ésta. Como una alternativa al corte de las tiras de inmersión 40 del dispositivo 10 que tiene un área grande de cinta o adhesivo, las tiras de inmersión 40 pueden tener líneas de guía 36 y 38 pre-cortadas o pre-amuescadas para permitir la fácil separación de las tiras de inmersión 40 desde el dispositivo 10. Las tiras de inmersión, ya sea que éstas cortadas, pre-cortadas o pre-amuescadas, definirán un área fija y predefinida de la cinta o adhesivo en la segunda porción extrema 44. Por lo tanto, después del muestreo, la tira de inmersión 40 es removida del dispositivo 10 y contiene un área de muestra de piel para el análisis que es de un área fija y definida. Como una alternativa a las tira de inmersión 40, la Figura 6 muestra una herramienta cortadora 60 que puede ser utilizada para remover un disco 50, como se ilustra en la Figura 7. El disco 50 tiene muestras de piel adheridas a la cinta adhesiva 30 desde el dispositivo de muestreo 10 sobre una cara 52 del mismo. La herramienta de corte 60 puede remover un disco del dispositivo 10 cuando el dispositivo 10 está en una posición plegada (cerrada), como se ilustra. El dispositivo cerrado es colocado sobre una superficie firme (no ilustrada) con la superficie externa 62 del miembro de muestreo 12 del dispositivo 10 de cara hacia arriba. La herramienta cortadora 60 es insertada en una depresión circular 64 que puede ser proporcionada sobre la superficie externa 62 del miembro de muestreo 12 del dispositivo 10 y la herramienta cortadora 60 es luego presionada hacia abajo para cortar a través del plástico y la cinta 30/muestra de piel. La herramienta cortadora 60 no es presionada hacia abajo no obstante, para cortar a través del plástico del miembro de cierre 14 del dispositivo 10. Como una alternativa al corte de los discos 50 desde el dispositivo 10, los discos 50 pueden ser precortados o pre-amuescados (por ejemplo, pero no limitados a, en el límite de la depresión circular) , para permitir la fácil circulación de los discos 50 desde el dispositivo 10. Como con las tiras de inmersión, no obstante, los discos, ya sea que sean cortados, pre-cortados o pre-amuescados, definirán una cara 52 de área fija y predefinida de cinta o de adhesivo. Por lo tanto, después del muestreo, el disco 50 es removido del dispositivo 10 y contiene un área de muestra de piel para el análisis que es de un área fija y definida. Continuando el Ejemplo con la tira de inmersión 40 de la Figura 5, la tira de inmersión que va a ser evaluada fue colocada en aproximadamente 150 µl de solución del reactivo de tinción Ponceau S (por ejemplo, el producto P7170 como es proporcionado por Sigma-Aldrich Canadá Ltd.) en un pozo de una placa de microtitulación de 96 pozos (no ilustrada) . La tira se dejó en la solución por aproximadamente quince minutos a temperatura ambiente, después de lo cual ésta fue retirada y colocada en un nuevo pozo de una placa de micropozos que contenía aproximadamente 200 µl de la solución de lavado con agua. La placa de micropozo fue agitada para efectuar el lavado y después de aproximadamente un minuto la tira fue retirada a un nuevo pozo que contenía aproximadamente 200 µl de solución de lavado de agua fresca nuevamente agitada por aproximadamente un minuto. El lavado con agitación fue realizado una tercera vez. Después del tercer lavado cualesquiera gotitas de la solución de lavado sobre el fondo de la tira fueron retirados mediante transferencia suave sobre un tejido de transferencia, que fue colocado sobre una superficie plana, limpia. El reactivo de tinción enlazado fue luego eluido de la tira al colocarlo dentro de un pozo que contenía 150 µl de solución de hidróxido de sodio 0.1 N. Después de la agitación de la tira en el micropozo por aproximadamente 5 minutos, la tira fue removida y la cantidad de tinción eluida determinada por la medición de la absorbancia de la solución a 550-570 nm. Para permitir que sean procesadas muchas muestras conjuntamente, se requiere que las tiras de inmersión 40 sean mantenidas en una configuración que concuerde con aquella de una microplaca estándar de 96 pozos (8 x 12). Son disponibles instrumentos que pueden surtir reactivos en estas placas y también para lavar los pozos, un requerimiento que es necesario para prevenir el arrastre del reactivo entre los pasos de ensayo. Los espectrofotómetros que pueden leer las soluciones coloreadas directamente a los pozos en el paso final del ensayo, son también fácilmente disponibles. Esto fue logrado utilizando accesorios personalizados que mantienen hasta 96 tiras de inmersión en la orientación y posición correctas, de modo que caben dentro de los pozos de una microplaca estándar de 96 pozos. Los accesorios permiten que el grupo de tiras, hasta 96, sean removidas conjuntamente como un grupo a nuevos pozos en cada paso del ensayo. El grupo de tiras es luego procesado en un procedimiento utilizando los mismos reactivos y el método como se describen anteriormente para el ensayo de tira simple. Además de la medición de proteína anterior, para un aspecto de la invención, tiras de inmersión adicionales pueden ser cortadas desde el dispositivo para determinar la cantidad de colesterol en piel. Para la medición de la cantidad de colesterol en piel las tiras de inmersión fueron cada una colocadas en aproximadamente 100 µl de solución de un reactivo A-C-B en pozos de una placa de micropozos de 96 pozos (no ilustrada). El reactivo fue un conjugado de digitonina (A) enlazada a peroxidasa de rábano (B) a través de un copolímero de anhídrido maleico-N-vinilpirrolidona (C) y se utilizó a una concentración de aproximadamente 1 µg/ml. Las tiras fueron dejadas en la solución por aproximadamente quince minutos a temperatura ambiente, después de lo cual éstas fueron removidas y colocadas en nuevos pozos de una placa de micropozos que contenía aproximadamente 200 µl de la solución de lavado. La placa de micropozos fue agitada para efectuar el lavado y después de aproximadamente un minuto las tiras fueron removidas a nuevos pozos que contenían aproximadamente 200 µl de la solución de lavado fresca y nuevamente agitados por aproximadamente un minuto. El lavado con agitación fue realizado una tercera vez, después de lo cual las tiras fueron removidas y colocadas en aproximadamente 100 µl de una solución de sustrato (reactivo Enhanced K-Blue) . Las tiras fueron luego incubadas con la solución de sustrato, en la oscuridad, por aproximadamente quince minutos a temperatura ambiente. La placa de micropozos puede ser agitada durante este paso. Después de que las tiras fueron incubadas, las tiras pueden ser luego removidas. Aproximadamente cien (100) µl de ácido sulfúrico 1 N son luego agregados a los pozos con la solución de sustrato para detener la reacción adicional, y la densidad óptica de la solución resultante fue leída aproximadamente a 450 nm sobre un espectrofotómetro de lectura de placas, para proporcionar una medición de la cantidad de colesterol en la muestra de piel. Mediante la medición de los niveles de proteína y la cantidad de colesterol en piel de un dispositivo de muestreo como se describe, se permite que la medición del colesterol sea referida cruzadamente al nivel de proteína respectivo para determinar, por ejemplo, si suficiente de una muestra de piel ha sido obtenida para proporcionar una medición de colesterol en piel utilizable. Alternativamente, o en adición a esto, el nivel de proteína puede ser utilizado para normalizar los niveles de colesterol en piel, tales como, por ejemplo, mediante la división del nivel de colesterol de una persona entre el nivel de proteína. Mientras que las enseñanzas del solicitante son descritas en conjunto con las diversas modalidades, no se pretende que las enseñanzas del solicitante sean limitadas a tales modalidades. Por el contrario, las enseñanzas del solicitante abarcan diversas alternativas, modificaciones y equivalentes, como serán apreciadas por aquellos de experiencia en la técnica. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para medir la cantidad de piel removida por el despellejamiento con cinta, caracterizado porque comprende: a) la provisión de una cinta que tiene un miembro de respaldo recubierto sobre al menos un lado del mismo con un adhesivo médico; b) la aplicación de la cinta sobre un área seleccionada de la piel para adherir la cinta al área seleccionada de la piel; c) retirar la cinta del área seleccionada de la piel para obtener una muestra representativa de una capa del estrato córneo externo de la piel, la muestra se adhiere a la cinta para tener constituyentes expuestos de la piel; d) la aplicación de una tinción de proteína sobre un área superficial predeterminada de la muestra y permitir que la tinción de proteína permanezca en contacto con ésta por un periodo suficiente para provocar el enlace de la tinción a la proteína presente en los constituyentes de piel expuestos; y e) la medición de la proteína teñida en los constituyentes de piel expuestos para determinar una medición de la cantidad de proteína, indicadora de la cantidad de piel removida .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la tinción con proteína es seleccionada del grupo que consiste de colorantes aniónicos y ácidos .
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la tinción de proteína es un reactivo de tinción Ponceau S.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la tinción de proteína es Azul de Coomassie .
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la intensidad de la proteína teñida en los constituyentes expuestos de la piel es medida para determinar una medición de la cantidad de proteína .
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la proteína teñida es medida espectrofotométricamente para determinar una medición de la cantidad de proteína.
7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la medición de la cantidad de proteína es comparada a un nivel de umbral predeterminado.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la muestra es desechada si la cantidad de proteína medida está por debajo del umbral predeterminado.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 8, caracterizado porque el miembro de respaldo es formado de poliéster.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo sensible a la presión.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo basado en acrílico.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo elastomérico de caucho sintético.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo basado en silicona.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el adhesivo médico comprende un elastómero formado de polímeros en bloque de estireno-isopreno-estireno o estireno-butadieno-estireno.
15. Un método para comparar los niveles relativos de colesterol en piel a partir de un número de individuos, caracterizado porque comprende: a) la medición del colesterol en piel de cada individuo mediante la obtención de una muestra representativa de una capa externa del estrato córneo de la piel, utilizando despellejamiento con cinta y analizando los constituyentes expuestos a la piel adheridos al adhesivo, para obtener un nivel de colesterol en piel para un individuo; b) aplicar una tinción de proteína sobre un área superficial predeterminada de los constituyentes expuestos de la piel de la muestra separada de donde se mide el colesterol p en piel, y permitiendo que la tinción de proteína permanezca en contacto con ésta por un periodo suficiente para provocar el enlace del colorante a la proteína presente en los constituyentes de la piel expuestos; c) la medición de la proteína teñida en los constituyentes de la piel expuestos para determinar una medición de la cantidad de proteína, indicadora de la cantidad de piel removida; y d) la normalización de la medición del colesterol en piel con la medición de la cantidad de proteína.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la normalización comprende la división de la medición de colesterol en piel mediante la medición de proteína.
17. El método de conformidad con las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque la tinción de proteína es seleccionada del grupo que consiste de colorantes aniónicos y ácidos.
18. El método de conformidad con las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque la tinción de proteína es un reactivo de tinción Ponceau S.
19. El método de conformidad con las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque la tinción de proteína es Azul de Coomassie.
20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque la intensidad de la proteína teñida en los constituyentes de piel expuestos se mide para determinar una medición de la cantidad de proteína .
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque la proteína teñida es medida espectrofotométricamente para determinar una medición de la cantidad de proteína.
22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, caracterizado porque la cantidad de proteína es comparada a un nivel de umbral predeterminado.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la muestra es desechada si la cantidad de proteína medida está por debajo del umbral predeterminado .
24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, caracterizado porque el miembro de respaldo es formado de poliéster.
25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo sensible a la presión.
26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo basado en acrílico.
27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo elastomérico de caucho sintético.
28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo basado en silicona.
29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, caracterizado porque el adhesivo médico comprende un elastómero formado de polímeros en bloque de estireno-isopreno-estireno o estireno-butadieno-estireno.
30. Un kit para llevar a cabo un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: la cinta; y una fuente de la tinción de proteína.
31. Un kit de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la tinción de proteína se selecciona del grupo que consiste de colorantes aniónicos y ácidos.
32. Un kit de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la tinción de proteína es un reactivo de tinción Ponceau S.
33. Un kit de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la tinción de proteína es Azul de Coomassie.
34. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, caracterizado porque el miembro de respaldo es formado de poliéster.
35. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo sensible a la presión.
36. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo basado en acrílico.
37. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo elastomérico de caucho sintético.
38. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, caracterizado porque el adhesivo médico es un adhesivo basado en silicona.
39. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, caracterizado porque el adhesivo médico comprende un elastómero formado de polímeros en bloque de estireno-isopreno-estireno o estireno-butadieno-estireno.
40. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 39, caracterizado porque el adhesivo es llevado por un dispositivo obturable, el dispositivo obturable tiene un miembro de muestreo que lleva el adhesivo, y un miembro de cierre adaptado para acoplarse al miembro de muestreo y retener el adhesivo dentro del dispositivo.
41. El kit de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el adhesivo es sellado dentro del dispositivo cuando el miembro de cierre se acopla al miembro de muestreo.
42. El kit de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque al menos el miembro de cierre o el miembro de muestreo está provisto con un borde periférico, y el otro del miembro de cierre o el miembro de muestreo está provisto con un canal periférico adaptado para recibir el borde de modo que el adhesivo es sellado dentro del dispositivo.
43. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, caracterizado porque el miembro de cierre está conectado al miembro de muestreo por una bisagra.
44. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, caracterizado porque al menos una porción del miembro de muestreo está adaptada para ser cortada desde el dispositivo obturable para formar una tira de inmersión, la tira de inmersión tiene un primer extremo de la misma desprovisto de adhesivo , y un segundo extremo del mismo con adhesivo .
45 . El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43 , caracteri zado porque el dispositivo obturable define al menos una tira de inmersión en éste que es pre-cortada o pre-amuescada , al menos una tira de inmersión tiene el primer extremo de la misma desprovisto de adhesivo y un segundo extremo de la misma con adhesivo.
46. El kit de conformidad con las reivindicaciones 44 ó 45, caracterizado porque el segundo extremo de la tira de inmersión con adhesivo define un área fija y predefinida del adhesivo.
47. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, caracterizado porque al menos una porción del miembro de muestreo está adaptada para ser cortada a partir del dispositivo obturable para formar un disco, el disco tiene el adhesivo proporcionado sobre una cara del mismo.
48 . El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43 , caracterizado porque el dispositivo obturable define al menos un disco en éste que es pre-cortado o pre-amuescado , al menos un disco tiene el adhesivo de una cara del mismo .
49. El kit de conformidad con las reivindicaciones 47 ó 48 , caracterizado porque la cara del disco con adhesivo define un área fij a y predefinida de adhesivo .