BRPI0611281A2 - ensaio direto de proteìna de pele em amostras de pele removidas por remocão da fita - Google Patents

Abstract

ENSAIO DIRETO DE PROTEìNA DE PELE EM AMOSTRAS DE PELE REMOVIDAS POR REMOcãO DA FITA. A presente invencao refere-se a um método de medicao da quantidade de pele removida por remocao da fita. Em um aspecto da invencao, a invencao prov² um método para o ensaio direto de proteína em amos- tras de pele removidas por remocao da fita, com a finalidade de combinar a medida de proteína obtida com uma medida de colesterol de pele correspondente para identificar indivíduos em risco de ter ateroesclerose bem como aqueles em risco de desenvolver ateroesclerose e doencas similares associadas a e atribuíveis a altos níveis de colesterol. Além do mais, a presente invencao permite uma medida comparativa da quantidade de pele removida por remocao da fita que nóo conta unicamente com a área da amostra removida. Adicionalmente, em um aspecto da invencao, o método desta invencao pode permitir que níveis relativos de colesterol na pele sejam comparados com base nas quantidades relativas da pele removida.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENSAIO DI-RETO DE PROTEÍNA DE PELE EM AMOSTRAS DE PELE REMOVIDASPOR REMOÇÃO DA FITA".

Os títulos da seção usados aqui são para finalidades organiza-cionais apenas e não devem ser interpretados como Iimitantes do assuntodescrito de maneira alguma.

Campo

A presente invenção refere-se a um método de medição daquantidade de pele removido por remoção de fita. Mais particularmente, ainvenção pertence a um método para o ensaio direto de proteína em amos-tras de pele removidas por remoção de fita para determinar uma medição daquantidade de proteína indicativa da quantidade de pele removida. Além dis-so, um aspecto da invenção refere-se a um método para o ensaio direto deproteína em amostras de pele removidas por remoção de fita com a finalida-de de combinar a medição de proteína obtida com uma medição de coleste-rol na pele correspondente para identificar indivíduos em risco de ter atero-esclerose bem como aqueles em risco de desenvolver ateroesclerose e do-enças similares associadas a e atribuíveis a altos níveis de colesterol.

Introdução

Como mencionado, um aspecto da invenção refere-se a um mé-todo para o ensaio direto de proteína em amostras de pele removidas porremoção de fita com a finalidade de combinar uma medição de proteína ob-tida com uma medição de colesterol na pele para identificar indivíduos emrisco de ter ateroesclerose bem como aqueles em risco de desenvolver ate-roesclerose e doenças similares associadas a e atribuíveis a altos níveis decolesterol. Numerosos estudos mostraram que ateroesclerose e suas com-plicações, tais como ataques cardíacos e acidentes vasculares cerebrais,são as causas principais de morbidade e mortalidade em quase todos ospaíses do mundo.

Prevenção eficaz de custo de ateroesclerose exige a identifica-ção de indivíduos em risco, desse modo permitindo seu tratamento médico emudança de estilo de vida. Um objetivo desejado é a identificação daquelesindivíduos que pertencem ao grupo de alto risco mas há dificuldades na se-leção de ótimos métodos para fazer a distinção de indivíduos em risco.

Um método amplamente usado para a identificação de indiví-duos em risco de ter ateroesclerose é com base na medição dos níveis decolesterol totais no plasma no sangue venoso (Consensus Conference onLowering Blood Cholesterol to Prevent Heart Disease, JAMA, 1985, 253, pg.2080). Pacientes são considerados estarem em alto risco se seu nível decolesterol for acima de 240 mg/dl e têm havido movimentos recentes paradiminuir este nível de limiar para diminuir valores.

No entanto, níveis de colesterol totais somente não exatamenteprevêem um nível de risco do paciente. Uma melhor previsão pode ser feitapor análise de lipoproteínas no plasma de sangue; em particular, medição deníveis de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e de Iipoprote-ína de alta densidade (HDL) é vantajosa (Total and High Density LipoproteinCholesterol in the Serum and Risk of Mortality, British Medicai Journal, 1985,290, pg. 1239-1243).

Apesar de sua vantagem, o uso dos métodos acima exige amos-tragem de sangue depois de um período de jejum. Adicionalmente, a amos-tragem é desconfortável, apresenta um risco de infecção e análise exigidade colesterol e lipoproteínas é complicada e dispendiosa. Além do mais, es-tudos mostraram que análise no plasma de sangue pode não totalmente re-fletir o processo de acúmulo de colesterol na parede arterial e outros tecidos.Em muitos casos, nem níveis de colesterol no plasma nem sequer perfis delipídio completos se correlacionam com a severidade de ateroesclerose.

Níveis significativos de colesterol ocorrem em tecido bem corpono plasma e mostraram que colesterol no tecido desempenha um papel prin-cipal no desenvolvimento de ateroesclerose. Tecidos, incluindo pele, foramidentificados que acumulavam colesterol do mesmo modo que a parede arte-rial e estudos demonstraram uma correlação próxima entre teor de colesterolna parede arterial e a pele. Por exemplo, colesterol foi extraído das amostrasde pele Iiofilizadas e foi medido usando-se técnicas químicas e bioquímicastradicionais (Nikitin Y. P., Gordienko I. A., Dolgov Α. V., Filimonova T. A."Cholesterol content in the skin and its correlation with Iipid quotient in theserum in normais and in patients with ischemic cardiac disease", Cardiology,1987, II, Nq 10, P.48-51). Embora útil, este método é tão complicado e dolo-roso para ser empregado para triagem de população em grande escala.

A patente U.S. Nq 4.458.686 descreve um método de quantifica-ção de vários compostos no sangue diretamente sob a pele ou em sua su-perfície. O método é baseado na medição nas mudanças de concentração deoxigênio eletroquimicamente, por exemplo, através de polarografia. No casode substância não voláteis que não se difundem através da pele, é necessárioimplantar enzimas sob a pele para efetuar mudanças de oxigênio na superfí-cie da pele. Esta patente também descreve o potencial de uso de tais méto-dos para quantificar a quantidade de colesterol usando oxidase de colesterol.Os procedimentos e instrumentação complexos necessários exigem os servi-ços de pessoas altamente versadas para fazer medições, assim limitando autilidade do método para a triagem de grandes números de pessoas.

A determinação do teor de colesterol na pela dá uma medida daextensão de ateroesclerose e pode ser obtida através de análise de labora-tório padrão de amostras de biopsia da pele. No entanto, existe consideráveldor envolvida em tirar uma amostra da pele e um risco de infecção no sítiode amostragem. Além disso, este método tem outras desvantagens uma vezque a espessura de amostras de pele incorporam várias camadas de pele,incluindo a camada córnea externa (estrato córneo), epiderme e derme. Umavez que a camada dérmica é altamente vascularizada, amostras de biopsiada pele contêm vasos sangüíneos e elementos sangüíneos. Elas podemtambém conter glândulas sebáceas ou sudoríparas e as secreções contidasali. Adicionalmente, gordura subcutânea está localizada diretamente sob aderme e pode também contaminar as amostras. Portanto, amostras de biop-sia da pele são heterogêneas e sua análise pode dar dados falsos no teor decolesterol na pele.

A patente U.S. Ng 5.489.510 descreve um método não invasivopara a identificação visual de colesterol na pele usando-se um reagente ten-do um componente de ligação de colesterol específico em combinação comreagente tendo um componente indicador para prover uma mudança de corvisual que corresponde à presença do componente ligado a colesterol dapele. O método supera muitas das objeções de procedimentos anteriores esatisfaz muitos dos objetivos desejado necessários para uma triagem demassa simples para identificar indivíduos em risco de ter ateroesclerose. Oprocedimento é feito diretamente sobre a pele palmar e, embora seja rápidoe simples, exige que todos indivíduos a serem testados estarem presentesuma clínica ou consultório médico onde o teste é conduzido. Isto natural-mente limita triagem em grande escala eficaz.

Razões molares dos lipídios, incluindo colesterol, em estratocórneo foram determinadas nas amostras obtidas por extração de solventedireta, de pele (Norlen L., e outros J. Invest. Dermatology 72-77, 112, 1999).Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e cromatografia líquidagasosa em combinação com espectrometria de massa foram usadas paraseparar e analisar os lipídios. Os métodos analíticos são complexos, masmais de modo importante, o uso de sistemas de solvente orgânico irritante ecorrosivo para extrair pele humana para determinações rotineiras não é prático.

O perfil de lipídio da camada de estrato córneo da pele foi de-terminado usando-se um método de remoção de fita como descrito por A.Weerheim and M. Ponec (Arch. Dermatol. Res., 191-199, 293, 2001). Nesteestudo, lipídios, incluindo colesterol, foram extraídos por solvente do estratocórneo depois da remoção da fita da pele. O extrato de lipídio resultante foiseparado por cromatografia de camada fina de alto desempenho. Este mé-todo é muito trabalhoso. Exige três sistemas de solventes consecutivos paraefetuar a separação dos lipídios, um método de manchamento e carboniza-ção para visualizar os componentes e uma etapa de densitometria para de-terminar as quantidades relativas dos lipídios. O método não se presta à de-terminação simples e rápida de níveis de colesterol em grandes números deamostras.

Um dispositivo que provê um ensaio com alta compacidade deprodução, simples para a medição de colesterol na pele é um dispositivo defita adesiva para amostragem de pele e um novo método de seu uso, comorelvelado no pedido de patente U.S. co-pendente, Publicação U.S. N5 2005-0272112-A1, cuja a totalidade é incorporada aqui por referência. O métododescrito neste pedido de patente pode ser aplicado para se obter numerosasamostras de pele a partir de numerosos indivíduos, de modo que níveis decolesterol na pele para os indivíduos respectivos possam ser feitas e seurisco para ateroesclerose e doença cardiovascular relacionada determina-dos. Os dispositivos de remoção de fita e métodos descritos neste pedido depatente provêem um ensaio de avaliação de risco de custo eficaz, simplesque é aplicável a triagem em grande escala.

A quantidade total de colesterol em uma amostra de pele tiradacom uma fita adesiva por remoção de fita está relacionada com o tamanhoda amostra de fita. Portanto, para comparar níveis de colesterol na pele en-tre indivíduos, amostras do mesmo tamanho devem ser ensaiadas e compa-radas. Isto é conseguido por uso de um dispositivo de remoção de fita quepermite que pedaços de fita com uma área fixada seja removida depois daaplicação da fita adesiva à pele para se obter uma amostra. Um pouco dafita removida pode ser usada para um ensaio de colesterol na pele. Por e-xemplo, obtenção de amostras de pele de tamanho consistente a partir devários indivíduos é realizado por aplicação da fita adesiva repetidamente àpele de modo que ela se torne saturada com pele. Então, uma pequena "va-reta de mergulhamento" ou "disco" tendo um tamanho fixo é cortado do dis-positivo para dar uma área constante de amostra de pele para o ensaio.

No entanto, comparação de níveis de colesterol na pele entreindivíduos usando-se uma área constante de fita saturada com pele não ne-cessariamente garante que quantidades similares de pele estão sendo com-paradas. Quantidades totais de pele podem ser depositadas sobre fitas res-pectivas quando tirando amostras de diferentes indivíduos. Por relação donível de colesterol da pele com uma quantidade de pele padronizada ounormalizada permitiria melhor comparação de níveis de colesterol na peleentre indivíduos.

Por exemplo, uma aplicação de uso de um dispositivo para re-moção de fita para ensaiar para a medição de colesterol na pele é para indi-víduos os quais solicitam seguro de vida. Testagem quanto a fatores de risco(por exemplo, idade, estado de fumante, pressão sangüínea) em requeren-tes de seguro é prática padrão e permite que prêmios sejam ajustados combase nos resultados de testagem. Uma vez que colesterol é um fator de ris-co para ter ou desenvolver ateroesclerose e doenças similares, seu valorpoderia influenciar prêmios de seguro e amostras poderiam estar sujeitas amanipulação para favorecer obtenção dos resultados. Portanto, há uma exi-gência de assegurar que uma amostra de pele adequada tenha sido tiradapara o ensaio de colesterol na pele e desse modo deter "trapaceiro" de su-bamostragem deliberadamente com a intenção de produzir um nível de cole-terol baixo na pele. Conseqüentemente, para esta aplicação, há uma neces-sidade de medir a quantidade de pele removida para o ensaio de colesterolna pele para assegurar que amostra suficiente foi tirada e para permitir com-paração de níveis de colesterol na pele entre indivíduos para avaliar o esta-do de risco.

Sumário

A presente invenção provê um método de medição da quantida-de de pele removida por remoção de fita. Em um aspecto da invenção, ainvenção provê um método para o ensaio direto de proteína em amostras depele removidas„por remoção de fita, com a finalidade de combinar a mediçãode proteína obtida com uma medição de colesterol de pele correspondentepara identificar indivíduos em risco de ter ateroesclerose bem como aquelesem risco de desenvolver ateroesclerose e doenças similares associadas a eatribuíveis a altos níveis de colesterol.

Além do mais, a presente invenção permite uma medição com-parativa da quantidade de pele removida por remoção de fita que não con-tam unicamente com a área da amostra removida. Adicionalmente, em umaspecto da invenção, o método desta invenção pode permitir que níveis rela-tivos de colesterol na pele sejam comparados com base nas quantidadesrelativas de pele removida.

É também desejável que o método de medição das quantidadesde amostras de pele removidas por remoção de fita seria simples, custo efi-caz, receptivo a processamento de alta capacidade de produção, ainda sercompatível com métodos envolventes, por exemplo, e de acordo com umaspecto da invenção, mas não limitados a, o ensaio de colesterol de pele emamostras de pele removidas por remoção de fita.

Em particular, a invenção compreende um método de mediçãoda quantidade de pele removida por remoção de fita, compreendendo:

a) provisão de uma fita tendo um membro de suporte revestidosobre pelo menos um seu lado com um adesivo médico;

b) aplicação da fita sobre uma área selecionada de pele paraaderir a fita à área de pele selecionada;

c) remoção da fita da área de pele selecionada para se obteruma amostra representativa de uma camada de estrato córneo externo dapele, a amostra que adere à fita de modo a ter constituintes de pele expostos;

d) aplicação de uma mancha de proteína sobre uma área de su-perfície predeterminada da amostra e deixando que a mancha de proteínapermaneça em contato com a mesma por um período de tempo suficientepara causar a ligação da dita mancha à proteína presente nos constituintesde pele expostos; e

e) medição da proteína manchada nos constituintes de pele ex-postos para determinar uma medição da quantidade de proteína indicativada quantidade de pele removida.

A mancha de proteína pode ser selecionada do grupo que con-siste em corantes aniônicos e ácidos. Para uma concretização da invenção amancha de proteína é um reagente de mancha Ponceau S. Para uma outraconcretização da invenção a mancha de proteína é Azul de Coomassie.

Além do mais, a intensidade da proteína manchada nos constitu-intes de pele expostos é medida para determinar uma medição da quantida-de de proteína. Em uma concretização a proteína manchada pode ser medi-da espectrofotometricamente para determinar uma medição da quantidadede proteína.Em uma outra concretização a medição da quantidade de prote-ína é comparada com um nível limiar predeterminado. A amostra pode serdescartada se a quantidade de proteína medida for abaixo do limiar preder-teminado.

Além do mais, em um outro aspecto da invenção membro deverso pode ser formado de poliéster.

Em um outro aspecto da invenção o adesivo médico pode ser,por exemplo, mas não limitado a, um adesivo sensível a pressão; um adesi-vo à base de acrílico; um adesivo de elastômero de borracha sintética; umadesivo à base de silicone; ou compreende um elastômero formado de polí-meros por blocos de estireno-isopreno-estireno ou estireno-butadieno-estireno.

Além do mais, um kit para o uso na realização do método acimamencionado é também contemplado com esta invenção. O kit compreende:

- a fita; e

- uma fonte da mancha de proteína.

A mancha de proteína pode ser selecionada do grupo que con-siste em corantes aniônicos e ácidos. Para uma concretização da invenção amancha de proteína é um reagente de mancha Ponceau S. Para outras con-cretizações da invenção a mancha de proteína é Azul de Coomassie.

Além do mais, em um outro aspecto da invenção o membro deverso pode ser formado de poliéster.

Em um outro aspecto da invenção o adesivo médico pode ser, porexemplo, mas não limitado a, um adesivo sensível a pressão; um adesivo àbase de acrílico; um adesivo de elastômero de borracha sintética; um adesivoà base de silicone; ou compreende um elastômero formado de polímeros porblocos de estireno-isopreno-estireno ou estireno-butadieno-estireno.

Além do mais, em um outro aspecto da invenção, o adesivo éportado por um dispositivo fechável, o dispositivo fechável tendo um membrode amostragem que porta o adesivo, e o membro de fechamento adaptadopara engatar o membro de amostragem e reter o adesivo dentro do disposi-tivo. O adesivo pode ser selado dentro do dispositivo quando o membro defechamento engata o membro de amostragem.

Pelo menos o membro de fechamento ou o membro de amos-tragem pode ser provido com um rebordo periférico, e o outro do membro defechamento ou o membro de amostragem pode ser provido com um sulcoperiférico adaptado para receber o rebordo de modo que o adesivo seja se-lado dentro do dispositivo. Além do mais, o membro de fechamento pode serligado ao membro de amostragem por uma dobradiça.

Além disso, pelo menos uma porção do membro de amostragempode ser adaptado para ser cortado do dispositivo fechável para formar umavareta de mergulhamento, a vareta de mergulhamento tendo uma sua pri-meira extremidade destituída de adesivo, e uma sua segunda extremidadecom adesivo. Em um outro aspecto da invenção pelo menos uma porção domembro de amostragem é adaptada para ser cortada do dispositivo fechávelpara formar um disco, o disco tendo o adesivo provido sobre uma sua face.

Por uso de uma vareta de mergulhamento tendo uma extremidade com ade-sivo, ou um disco cortado do dispositivo fechável, uma área fixa ou predefi-nida do adesivo pode ser definida. Portanto, depois da amostragem da pele,as varetas de mergulho ou discos têm uma amostra de pele ligada a umaárea definida ou predefinida do adesivo.

Além do mais, em outros aspectos da invenção, o membro deamostragem do dispositivo de amostragem fechável pode ter, por exemplo,mas não limitado a, varetas de mergulho ou discos pré-cortados ou pré-estriados para predefinir uma área fixa de adesivo.

Além disso, um aspecto da invenção provê um método de com-paração dos níveis relativo de colesterol na pele a partir de numerosos indi-víduos, compreendendo:

a) medição de pele colesterol a partir de cada indivíduo por ob-tenção de uma amostra representativa de uma camada de estrato córneoexterno da pele usando-se remoção da fita e análise de constituintes de peleexpostos aderidos ao adesivo para se obter um nível de colesterol na pelepara um indivíduo;

b) aplicação de uma mancha de proteína sobre uma área de su-perfície predeterminada dos constituintes de pele expostos da amostra sepa-rada de onde o colesterol na pele é medido e permissão à mancha de prote-ína permanecer em contato com a mesma por um período de tempo sufici-ente para causar ligação da dita mancha a proteína presente nos constituin-tes de pele expostos;

c) medição da proteína manchada nos constituintes de pele ex-postos para determinar uma medição da quantidade de proteína indicativada quantidade de pele removida; e

d) normalização da medição de colesterol na pele com a medidada quantidade de proteína.

A mancha de proteína pode ser selecionada do grupo que con-siste em corantes aniônicos e ácidos. Por uma concretização da invenção amancha de proteína é um reagente de mancha Ponceau S. Para uma outraconcretização da invenção a mancha de proteína é Azul de Coomassie.

Além do mais, a intensidade do proteína manchada nos constitu-intes de pele expostos é medida para determinar uma medição da quantida-de de proteína. Em uma concretização a proteína manchada pode ser medi-da espectrofotometricamente para determinar uma medição da quantidadeda proteína.

Em uma outra concretização a medição da quantidade de prote-ína é comparada com um nível limiar predeterminado. A amostra pode serdescartada se a quantidade de proteína medida for abaixo do limiar prede-terminado.

Além do mais, em um outro aspecto da invenção o membro deverso pode ser formado de poliéster.

Em um outro aspecto da invenção o adesivo médico pode ser, porexemplo, mas não limitado a, um adesivo sensível a pressão; um adesivo àbase de acrílico; um adesivo de elastômero de borracha sintética; um adesivoà base de silicone; ou compreende um elastômero formado de polímeros porblocos de estireno-isopreno-estireno ou estireno-butadieno-estireno.

Essas e outras características dos ensinamentos dos requeren-tes são indicadas aqui.Desenhos

A pessoa versada na técnica entenderá que os desenhos descri-tos abaixo, são apenas para finalidades de ilustração. Pretende-se que osdesenhos não limitem o escopo dos ensinamentos do requerente de maneiraalguma.

a figura 1 é um gráfico que mostra a mudança de uma amostraparticular tendo um valor de refletância selecionado, tirada de amostras re-movidas x1 , x3, e, x10;

a figura 2 é um gráfico que mostra a mudança de uma amostraparticular tendo um valor de densidade ótica (OD) 570 nm tirado de amos-tras removidas x1 , x3, e, x10;

a figura 3 é uma vista de topo de um dispositivo de amostragemcomo usado no Exemplo;

a figura 4 é uma vista fragmentária do dispositivo de amostra-gem ilustrado figura 3, que mostra detalhes do seu membro de amostragem;

a figura 5 é uma vista em perspectiva de um corte de vara demergulhamento do dispositivo de amostragem desta invenção;

figura 6 é uma vista em perspectiva de um dispositivo de amos-tragem alternativo que pode ser usado no Exemplo; e

a figura 7 é uma vista em perspectiva de um corte de disco dodispositivo de amostragem desta invenção da concretização alternativa mos-trada na figura 6.

Descrição de várias concretizações

Um dispositivo que provê um ensaio, de alta capacidade de pro-dução, simples para medição de colesterol na pele é um dispositivo de fitaadesivo para amostragem na pele, como descrito na publicação de pedidode patente co-pendente do requerente U.S. 2005-0272112-A1, cuja totalida-de é incorporada aqui por referência. Em um aspecto da presente invenção,o método descrito neste pedido pode ser aplicado para se obter numerosasamostras de pele a partir de numerosos indivíduos, de modo que níveis depele no colesterol para os indivíduos respectivos possam ser medidos e seurisco para ateroesclerose e doença cardiovascular relacionada determinado.Os dispositivos de remoção de fita e métodos descrito neste pedido de pa-tente podem prover um ensaio de avaliação de risco de custo eficaz, simplesque é aplicável a triagem em grande escala.

Por exemplo, uso pode ser feito de uma fita compreendendomembro de verso formada de poliéster. A fita é aplicada como revestimentopelo menos um de seu lado com um adesivo médico. O termo "adesivo médi-co" como aqui refere-se a um adesivo que é hipoalérgico e seguro para a apli-cação à pele. Tal adesivo é de preferência um adesivo sensível a pressão, porexemplo, um adesivo compreendendo um elastômero formado por polímerospor blocos de estireno-isopreno-estireno ou estireno-butadieno-estireno.

Como pode ser apreciado, há muitas classificações e tipos deadesivos. Em geral, qualquer adesivo adequado para o uso com esta inven-ção é um adesivo médico como definido acima para assegurar que não ha-verá nenhum problema com reações alérgicas quando o adesivo fosse apli-cado à pele para a amostragem. Os inventores testaram vários tipos de ade-sivos para o uso em tirar uma amostra de pele; a maioria desses eram deacrílico sensível a pressão com base em adesivos, mas vários adesivos deelastômero de tipo de borracha sintética e adesivos à base de silicone foramtambém testados.

O inventor também verificou que adesivos de borracha sintéticacom base nos copolímeros por blocos de estireno e butadieno ou estireno eisopreno desempenham bem para esta invenção. Um exemplo de um adesi-vo de borracha sintética é um adesivo de tipo sintético Kraton® (látex livre)sobre um copolímero por blocos de estireno e butadieno. Tal adesivo proviamelhor estabilidade para amostras de pele para facilitar transporte das a-mostras para análise subseqüente.

Uma outra fita adesiva preferida para o uso no método da inven-ção é uma fita de grau médico sensível a pressão de cobertura dupla.

Exemplos de tal fita de grau médico são aqueles vendidos por 3M os Produ-to N- 9877, ou por Adhesive Research, Inc. sob Produto Ns 8570.

Uma lista de algumas das outras fitas que foram testadas pelosinventores é mostrada na tabela anexa. Aquele requisito que é constante é ouso de uma fita de grau médico que é hipoalergênico.

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Tabela 1

Pode ser apreciado que as fitas adesivas listadas na tabela 1não destinam-se a ser exaustivas, mas meramente ilustrativas de diferentesfitas adesivas que são adequadas para o uso com esta invenção no presen-te momento, e que outras fitas adesivas que estarão evidentes por aquelesversados na técnica são contempladas por esta invenção.

Fitas sensíveis a pressão com cobertura dupla estão em geraldisponíveis com um revestimento protetor facilmente removível. O revesti-mento protege a fita contra adesão até que ele seja removido e mantenha oadesivo de se tornar contaminado. Revestimentos podem ser colocados ousobre lado da fita de cobertura dupla ou a fita pode ter um revestimento úni-co e seja envolvido sobre ela própria, desse modo protegendo ambas assuperfícies.

Revestimentos com propriedades de liberação diferenciais po-dem ser usados de modo que um primeiro lado de adesivo possa ser expos-to enquanto protegendo a segunda superfície adesiva. Uma fita de coberturadupla com revestimentos diferenciais é particularmente vantajosa para a-mostragem de pele. Remoção do primeiro revestimento permite que a fitaseja afixada sobre o suporte de verso de um dispositivo de amostragem edeixa o lado de amostragem da pele coberto com o segundo revestimento. Osegundo revestimento protege a área adesiva de amostragem de pele contraagarramento e contra contaminação até que ele deva ser usado. Quandoexigido para amostragem na pele, o segundo revestimento é removido.

O adesivo pode ser aplicado sobre qualquer parte da pele, masa parte mais preferida adequada é a superfície de uma palma uma vez que apalma não tem glândulas sebáceas cujas secreções contêm colesterol quepode afetar resultados para certos aspectos desta invenção, e particular-mente esses aspectos que envolvem medição de colesterol. Adicionalmente,a pele sobre a palma está prontamente acessível para a amostragem.

É desejável se obter quantidades uniformes das amostras depele para análise. A aplicação do adesivo para amostragem é típica e rotinei-ramente feita usando-se uma única aplicação do adesivo à pele. Quantida-des adicionais de material de estrato córneo podem ser obtidas por aplica-ções adicionais do adesivo à pele. Cada aplicação subseqüente do adesivoà pele resulta em adesão de pele adicional ao adesivo. Este processo conti-nua até que o adesivo se torne saturado com o material de pele depois doqual ele não é mais pegajoso. O número de aplicações exigida para saturarum adesivo depende do tipo de adesivo usado, mas para a maioria dos ade-sivos comumente usados, saturação é conseguida com menos do que dezaplicações, por exemplo, não limitadas a, três a sete aplicações. Aplicaçãode adesivo a uma área fresca de pele para cada remoção subseqüente re-sulta em saturação melhor e mais rápida do adesivo. Portanto, para amos-tragem consistente e boa, é conveniente fazer dez aplicações de um adesivoà pele, usando-se novas áreas de pele para cada aplicação.

Para aqueles aspectos da invenção, onde colesterol na pele estásendo medido a quantidade total de colesterol presente na amostra de pelesobre o adesivo está relacionado com o tamanho da amostra de pele obtida.

Além do mais, um tamanho de amostra de pele consistente é exigido a fimde se comparar níveis relativos de colesterol de pele entre indivíduos dife-rentes. Portanto, varetas de mergulho podem ser cortadas de um dispositivopara apresentar uma área fixa de adesivo (por exemplo, mas não limitada a,área retangular ou circular) que tem constituintes de pele expostos ligadosao mesmo que foram removidos pela remoção da fita. Estas varetas de mer-gulhamento permitem uma comparação de níveis de colesterol na pele entreindivíduos com base em uma área unitária fixa de pele sendo analisada.

Como uma alternativa a corte de varetas de mergulhamento ori-undas de um dispositivo tendo uma grande área de fita ou adesiva, as vare-tas de mergulhamento podem ser, por exemplo, mas não limitados a, pré-cortadas ou pré-estriadas para permitir separação fácil do dispositivo. Taisvaretas de mergulhamento pré-cortadas ou pré-estriadas, como descritasacima, definirão uma área fixa ou predefinida de fita ou adesivo em uma suaextremidade. Depois da amostragem, tal vareta de mergulhamento pré-cortada ou pré-estriada pode então ser facilmente removida a partir do dis-positivo e contém uma área de amostra de pele para análise que é de umaárea definida e fixa.

Obtenção de amostras de pele consistentemente dimensionadasa partir de vários indivíduos (ou amostras repetidas oriundas do mesmo indi-víduo) são realizadas pelas seguintes etapas. Primeira, como anteriormentedescrita, a amostra de pele é tirada por aplicação do adesivo repetidamenteà pele de modo que ele se torne saturado com pele e não seja mais pegajo-so. O adesivo se torna saturado com pele depois de cerca de três a sete a-plicações e dez aplicações rotineiramente feitas para assegurar saturação. Aseguir, para se obter uma área constante de amostra de pele a ser ensaiada,uma área dimensionada fixa (como aqui em seguida se tornará evidente apartir do exemplo) oriunda de dispositivo de amostragem da pele é removi-da, e é imersa em volumes padronizados de reagentes indicadores e detec-tores, como será descrito aqui em seguida.

A camada córnea externa da pele (estrato córneo) consistegrandemente em corneócitos enriquecidos com proteína envolvidos por umamistura de lipídio que inclui colesterol. Estruturalmente, isto é freqüentemen-te mostrado como um modelo de "tijolos e argamassa" com os corneócitosque representam tijolos e o lipídio envolvente que representa o almofa-riz(P.M. Elias, J Invest Dermatol. 1983, 80, 44S- 9S). A quantidade de prote-ína no estrato córneo é relativamente constante entre diferentes indivíduos:portanto, proteína na amostra de pele removida por remoção de fita podeprover uma medida indireta da quantidade de pele removida. Por mediçãode proteína, e portanto, a quantidade de amostra de pele obtida, pode serdeterminado, por um aspecto da invenção, que uma amostra de pele ade-quada foi removida para o ensaio de colesterol na pele. Adicionalmente, onível de colesterol na pele medido pode ser comparado com o valor de pro-teína para se obter uma medida de nível de colesterol por nível proteína uni-tária e, desse modo, colesterol por quantidade unitária de pele.

Um ensaio para medir na amostra de pele removida por remo-ção de fita pode usar, por exemplo, mas não limitado a, Azul de Coomassiecomo uma mancha de proteína geral (por exemplo, uma mancha de proteínacomercialmente disponível como Bio Rad®). Verificou-se que Azul de Coo-massie pode ser usado para estimação quantitativa de proteínas imobiliza-das sobre um material de suporte (S. Fazekas de St. Groth, e outros Biochi-mica Et Biophysica Acta, 1863,71 , 377-391). A mancha de Coomassie éaplicada a uma área de pele sobre o adesivo e depois de um período demanchamento adequado a mancha em excesso é removida por lavagem. Aintensidade de proteína de pele manchada é então determinada por mediçãodo saturação da amostra manchada com azul sobre o adesivo e esta inten-sidade está relacionada diretamente com a quantidade de proteína. Mediçãoda intensidade relativa (por exemplo, saturação) das amostras de pele man-chadas permite quantidades relativas de amostras de pele tiradas de indiví-duos por remoção da fita a ser comparada.As seguintes medições foram tiradas para estabelecer de quemodo o número de remoções de fita se correlacionam com a quantidade depele removida, como medida usando-se manchamento de proteína Bio-Rad.De acordo com um aspecto da invenção, essas medições foram feitas paradeterminar se remoção de uma quantidade inadequada de pele pode afetaro teste de colesterol na pele. Portanto, ensaios foram realizados para medira proteína removida com números variáveis de remoção de fita. Em particu-lar, palmas de voluntários foram removidas uma (1), três (3) e dez (10) vezese os níveis de proteína determinados por leitura de saturação e refletância a610 nm depois do manchamento com reagente de corante de proteína Bio-Rad. Esses níveis de proteína proviam uma medida da extensão da remoçãode pele e eficácia da remoção de tira.

Na experiência, determinações de proteína por Bio-Rad foramfeitas nas amostras coletadas a partir de quarenta e cinco (45) voluntários.Cada voluntário provê amostras de pele tiradas usando-se uma (1), três (3) edez) remoções de fita.

Para os três grupos de amostra diferentes (marcados x1, x3 ex10) verificou-se que havia boa correlação entre saturação e refletância a610 nm. A partir de uma análise de regressão de quadrados mínimos Iinea-res os valores de R2 para as amostras x1 , x3 e x10 eram de 0,961 , 0,978 e0,959 respectivamente. Os valores de saturação médio para as amostrasremovidas x1 (n = 45) eram de 11,07, sd 1,83, CV16,3%; os valores de satu-ração médio para as amostras removidas x3 (n = 44) eram de 15,46, sd2,32, CV17,3%; e os valores de saturação médio para as amostras removi-das x10 (n = 44) eram de 23,50, sd 1,06, CV4,6%. Os valores de refletânciamédios para as amostras removidas x1 (n = 45) eram de 55,69, sd 2,95,CV5,6%; os valores de refletância médios para as amostras removidas x3 (n= 44) eram de 48,07, sd 3,08, CV6,4%; e os valores de refletância médiospara as amostras removidas x10 (n = 44) eram de 36,19, sd 1,48, CV4,1%.Havia diferenças significativas entre cada um dos grupos.

Uma análise quanto a chance de uma amostra particular ter umcerto valor de refletância (610 nm) foi feita para cada grupo e é mostrada nafigura 1. Esta análise indicou que 93,2% das amostras removidas χ 10 ti-nham um valor de refletância de <45, 36,4% das amostras removidas x3 ti-nham um valor de refletância de <45 e apenas 4,4% das amostras removi-das x1 tinham um valor de refletância de <45. Alternativamente, 77,3% dasamostras removidas χ 10 tinham um valor de refletância de <40, 11,4% dasamostras removidas x3 tinham um valor de refletância de <40 e apenas2,2% das amostras removidas x1 tinham um valor de refletância de <40.

Verificou-se que usando-se um valor de corte de <45 resultariana rejeição de 63,6% de amostras que tinham sido obtidas usando-se trêsvezes remoções e rejeição de 95,6% de amostras tinham sido obtidas comexatamente uma única remoção.

Embora o método de manchamento de Azul de Coomassie tra-belhe bem, ele exige um espectrômetro de refletância capaz de ler valoresde saturação. Adicionalmente, ele exige que cada amostra manchada sejalida individualmente, enquanto que o ensaio de colesterol na pele pode usarmicroplacas de 96 cavidades, no lugar de medições de saturação de únicaamostra. Este ensaio é baseado em manchamento de Ponceau S (isto é, ummembro da classe geral de corantes aniônicos e ácidos que se liga a proteí-nas, por exemplo, mas não limitado a, resíduos de aminoácidos básicos).

Manchamento Ponceau S se liga a proteínas e é usado em man-chamento histoquímico de tecidos e é também u.sado como uma mancha demembrana reversível para proteínas ligadas a nitrocelulose (O. Salinovich andR. C. Montelaro, Anal. Biochem. 1986, 156, 341-347). Este método permiteproteínas manchadas serem visualizadas sobre membranas e mais tarde, de-pois o manchamento é removido, permite que as proteínas sejam caracteriza-das ulteriormente sem interferência de qualquer mancha ligada. Para a inven-ção real, o método de Ponceau S é ulteriormente desenvolvido, como seráaqui em seguida explicado, e mostra que amostras de pele tiradas por remo-ção de fita podem ser manchadas e, depois da lavagem da amostra de pele, amancha pode ser eluída e quantificada espectrofotometricamente. Poneeau Smancha queratina particularmente bem e queratina é a proteína principal nacamada córnea da pele que é removida por remoção de fita.Apesar do fato de que dez aplicações resultem em saturação doadesivo (isto é, perda de adesão), resultados mostraram que diferentes indi-víduos dão diferentes quantidades de pele. Embora indivíduos possam terníveis levemente diferentes de queratina e outras proteínas na pele os inven-tores acreditam que as diferenças vistas sejam improváveis devido a isso.Por exemplo, diferentes indivíduos podem mostrar várias vezes diferençasem níveis de proteína medida, mas níveis de proteína de corneócitos nãoseriam esperados variar por esta quantidade para as amostras de pele tira-das de acordo com esta invenção. Os inventores acreditam que as diferen-ças sejam mais prováveis devido as quantidades de pele totais diferentesque são removidas durante a remoção da fita. Isto é sugerido uma vez quealguns indivíduos parecem saturar o adesivo depois de apenas duas a qua-tro remoções, enquanto que outros exigem seis a oito remoções para saturaro adesivo: isto implica que quantidades diferentes de pele são removidas.

Em um aspecto da invenção, medições de colesterol na peletiradas por remoção de fita são freqüentemente usadas para determinar orisco de doenças de artéria coronária e eventos trombóticos adversos rela-cionados e isto encontra uso particular na indústria de seguro. Indivíduos queprocuram seguro de vida são avaliados quanto a vários fatores de risco (porexemplo, idade, estado de fumante, pressão sangüínea etc.) e prêmios sãobaseados no risco total. Uma vez que colesterol na pele é um fator de risco,seu valor poderia afetar prêmios de seguro e amostras poderiam estar sujei-tas a manipulação para favorecer obtenção dos resultados. Portanto, outrasvantagens de determinar níveis de proteína é assegurar que uma amostraadequada tenha sido tirada (isto é, acima de um limiar pré-selecionado) edesse modo deter "trapaceiros" de deliberadamente subamostragem com ainvenção de produção de um nível baixo de colesterol na pele.

Para assegurar que uma amostra de pele adequada é tirada pa-ra medições de colesterol na pele, um nível limiar mínimo de proteína depele é fixado. O nível limiar é fixado por análise de muitas amostras de pelee determinação da faixa de distribuição de valores de proteína. Faixas dedistribuição para amostras de pele tiradas com uma única remoção de fita oucom múltiplas remoções da fita incluindo remoção por saturação (isto é, dezremoções da fita) são preparadas. A partir destas faixas de distribuição umlimite limar pode ser escolhido de modo que a probabilidade possa ser de-terminada que um valor de proteína para uma amostra particular está dentrodos limites de uma população predefinida. De modo ideal, haveria um valorlimiar que permitiria que todas as amostras tiradas com dez remoções da fitasejam totalmente distinguidas de amostras tiradas com uma única remoçãoda fita, e possivelmente também de amostras com, por exemplo, três remo-ções da fita. Na prática real as curvas de distribuição se sobrepõem e apare-ce a partir da natureza de uma variabilidade do indivíduo para liberar pela naremoção da fita, que discriminação completa não é possível. No entanto,valores limiares podem ser escolhidos que permitem que uma alta percenta-gem de dez amostras removidas da fita estejam prontamente distinguidas apartir da maioria das amostras tiradas com a única remoção da fita.

Por exemplo, é útil escolher um nível limiar, com base nas dezremoções da fita, tal que 98% da população têm valores acima que nível,então duas amostras em média de cada cem analisadas serão rejeitadascomo tendo amostra insuficiente. No entanto, este nível limiar asseguraráque a maioria das amostras tiradas com uma única remoção da fita não teráproteína suficiente e será rejeitada. Essas remoções da fita que dão valoresabaixo do nível limiar pré-selecionado são consideradas terem uma amostrade pele insuficiente para as determinações de colesterol na pele confiáveis.

Para estabelecer como o número de remoções da fita se corre-laciona com a quantidade de pele removida como medido por manchamentode proteína de Ponceau S, a seguinte experiência foi realizada. Para vercomo a quantidade de pele removida varia com o número de remoções dafita feitas, amostras de pele foram removidas a partir de palmas de 50 volun-tários (N=50) por remoção de uma (1), três (3) e dez (10) vezes e os níveisde proteína determinados depois do manchamento com solução de corantePonceau S. Os níveis de proteína eram com base nas leituras de densidadeótica de corante eluído a partir das amostras de pele manchadas.

Os resultados foram analisados para determinar se os valoresforam normalmente distribuídos e para determinar se valores de corte pude-rem ser estabelecidos para amostras diferentes que foram obtidas usando-se um número particular de remoções da fita. Amostras para remoções x1,x3 e x10 foram obtidas a partir de 50 voluntários (os resultados refletem quedados completos estavam disponíveis para apenas 49 amostras).

A densidade ótica média para as remoções x1 (N=50) foi de 0,078com um CV médio de 13,0%; a densidade ótica média para as remoções x3(N=50) foi de 0,131 com um CV médio de 12,3%; e a densidade ótica médiapara as remoções x10 (N=49) foi de 0,263 com um CV médio de 12,0%.

Análise usando-se o teste de Anderson-Darling ou Shapiro-Wilkindicou uma distribuição anormal para os dados. Análise quanto a mudançade uma amostra particular tendo um valor de densidade ótica (OD) 570 nmfoi feita para cada grupo e foi mostrada na figura 2.

Esta análise indicou que 98% das amostras removidas x10 ti-nham uma OD 570 nm > 0,1 ; 60% das amostras removidas x3 tinham umaOD 570 nm > 0,1 ; e apenas 18% das amostras removidas x1 tinham umaOD 570 >0,1.

Portanto, escolhendo um valor de corte de > 0,1 OD como umcritério para amostragem suficiente resultará em rejeição de 2% das amos-tras removidas x10, 40% das amostras removidas x3, e 82% das amostrasremovidas x1.

O nível de proteína pode também ser usado para normalizar ní-veis de colesterol na pele que variam como um resultado de amostras depele variáveis. Por exemplo, indivíduos os quais dão uma amostra de pelepequena mas os quais têm alto nível de colesterol na pele pode dar um valorde colesterol na pele que é similar a um individual o qual tem níveis baixosde colesterol na pele, os dois indivíduos podem ser distinguidos como tendocolesterol na pele alto e baixo, respectivamente. A normalização poderiamenvolver a manipulação simples de divisão do nível de colesterol pelo nívelde proteína; isto eficazmente dá o nível de colesterol por proteína unitária.

Exemplo

Aspectos dos ensinamentos do requerente podem ser ulterior-mente entendidos à luz do seguinte exemplo, que não seriam interpretadoscomo Iimitantes do escopo dos presentes ensinamentos de maneira alguma.

Uso foi feito de um dispositivo de amostragem como mostradona figura 3. O dispositivo de amostragem, que é em geral designado pornumerai de referência 10, é formado de plástico (polipropileno) e compreen-de um membro de amostragem 12 ligado a um membro de fechamento 14por uma dobradiça integral 16. O membro de fechamento 14 tem um rebordoperiférico 18 e quatro pinos 20, adaptados para entrar trancando, respecti-vamente, um sulco periférico 22 e quatro furos 24 formados no membro deamostragem 12. Dobramento da dobradiça 16 causa engatamento do rebor-do 18 com o sulco 22 e dos pinos 20 com os furos 24, desse modo assegu-rando que as duas metades do dispositivo 10 permanecem fechados e sela-do para prevenir poeira e contaminação das superfícies interiores. A superfí-cie externa (não mostrada nas figuras 3 e 4) do membro de fechamento 14tem uma área plana para receber um rótulo e tira de código de barra, para aidentificação de amostra. O membro de amostragem 12 e membro de fe-chamento 14 são respectivamente providos com tiras de dedo 26 e 28 paraa abertura do dispositivo 10.

Uma fita média sensível a pressão de cobertura dupla 30 tendoum revestimento de liberação de papel Kraft protetor 32 e vendido pela 3Msob Produto Nq 9877 foi aderido à central área do membro„de amostragem12. O revestimento de liberação 32 é mais amplo do que a fita adesiva 30,desse modo definindo um tira 32' ao longo de uma extremidade com fita nãoligada. Esta tira 32' de revestimento projeta a extremidade do dispositivo pa-ra formar uma tira para remoção fácil do revestimento. Imediatamente antesdo uso, o revestimento 32 é removido usando-se a tira de projeção 32' e istoexpõe o adesivo da fita 30 para a amostragem de pele.

A área de pele palmar para amostragem foi limpa e foi seca. Afita 30 com o adesivo exposto foi aplicada sobre a palma. A fita 30 foi com-primida contra a pele por aplicação de pressão ao verso do membro de a-mostragem 12 acima da área adesiva, desse modo causando-se aderênciada camada de estrato córneo. O dispositivo 10 foi removido, foi reaplicado auma nova área da palma e novamente foi comprimido na pele. O dispositivofoi removido e foi aplicado à pele palmar deste modo para um total de 10aplicações.

Uma vareta de mergulhamento 40 (vide figura 5) cerca de cincomm de largura é cortada do dispositivo 10 depois da aplicação à pele, comse segue. Com referência a figura 4, uma porção final do membro de amos-tragem 12 foi removida por corte ao longo da porção de sulco 22, que adja-cente à tira 26. Três cortes foram feitos ao longo de diretrizes 36 (mostradosna figura 4) mostradas no membro de amostragem 12, para delinear a varetade cinco mm, corte a partir de uma extremidade para exatamente após alinha de centro. A vareta de 5 mm de largura foi liberada do membro de a-mostragem 12 por produção de um terceiro corte através do centro do mem-bro 12, usando-se diretriz 38 moldada para formar o membro 12. Vareta 40tem uma primeira porção final 42 destituída de fita e uma segunda porçãofinal 44 com fita tendo a amostra de pele aderida à mesma.

Como uma alternativa a corte de varetas de mergulhamento 40do dispositivo 10 tendo uma grande área de fita ou adesiva, as varetas demergulhamento 40 podem ter diretrizes 36 e 38 pré-cortadas ou pré-estriadas para permitir separação fácil das varetas de mergulhamento 40 dodispositivo 10. As varetas de mergulhamento, se cortadas, pré-cortadas, oupré-estriadas, definirão uma área fixa e predefinida na segunda porção final44. Portanto, depois da amostragem, vareta de mergulhamento 40 é removi-da a partir do dispositivo 10 e contém uma área de amostra de pele para aanálise que é de uma área fixa e definida.

Como uma alternativa a vareta de mergulhamento 40, a figura 6mostra uma ferramenta de corte 60 que pode ser usada para remover umdisco 50, como ilustrado na figura 7. Disco 50 tem amostras de pele aderidasà fita adesiva 30 do dispositivo de amostragem 10 sobre a sua face 52. Fer-ramenta de corte 60 pode remover um disco a partir do dispositivo 10 quan-do o dispositivo 10 está em uma posição dobrada (fechado), como ilustrado.O dispositivo fechado é colocado sobre uma superfície firme (não ilustrado)com a superfície externa 62 do membro de amostragem 12 do dispositivo 10voltado para cima. A ferramenta de corte 60 é inserida em uma depressãocircular 64 que pode ser provida sobre a superfície externa 62 do membro deamostragem 12 do dispositivo 10 e a ferramenta de corte 60 é então com-primida para baixo para cortar através do plástica e a fita 30/amostra de pe-le. A ferramenta de corte 60 não é comprimida para baixo por enquanto, noentanto, de modo a cortar através do plástico do membro de fechamento 14do dispositivo 10.

Como uma alternativa a corte de discos 50 oriundos de dispositi-vo 10 discos 50 podem ser pré-cortados ou pré-estriados (por exemplo, masnão limitados a, no limite da depressão circular), para permitir e separaçãofácil dos discos 50 do dispositivo 10. Como com as varetas de mergulha-mento, no entanto, os discos, se cortados, pré-cortados ou pré-estriados,definirão uma face 52 de área fixa e predefinida da fita ou do adesivo. Por-tanto, depois da amostragem, disco 50 é removido a partir do dispositivo 10e contém uma área de amostra de pele para a análise que é de uma áreafixa e definida.

Continuação do Exemplo com a vareta de mergulhamento 40 dafigura 5, a vareta de mergulhamento a ser analisada foi colocada na soluçãoproximamente de 150 μΙ de reagente de mancha Ponceau S (por exemplo,produto P7170 como provido pela Sigma-Aldrich Canada Ltd.) em uma cavi-dade de uma placa de microcavidade de 96 cavidades (não ilustrada). A va-reta foi deixada na solução por cerca de de quinze minutos a temperaturaambiente, depois da qual foi removida e foi colocada em uma nova cavidadede uma placa de microcavidade contendo aproximadamente 200 μΙ de solu-ção de lavagem com água. A placa de microcavidade foi agitada para efetu-ar a lavagem e depois de cerca de um minuto a vareta foi removida parauma nova cavidade contendo aproximadamente 200 μΙ_ de solução de lava-gem com água fresca e novamente agitada por cerca de um minuto. A lava-gem com agitação foi feita uma terceira vez. Depois da terceira lavagemquaisquer gotículas da solução de lavagem no fundo da vareta foram remo-vidas por manchamento leve em um tecido de manchamento, que foi colo-cado sobre uma superfície lisa limpa.Reagente de mancha ligado foi então eluído a partir da varetapor colocação dele em uma cavidade contendo aproximadamente 150 μΙ_ desolução de hidróxido de sódio a 0,1 N. Depois da agitação da vareta na mi-crocavidade por cerca de 5 minutos a vareta foi removida e a quantidade demancha eluída foi determinada por medição da absorbância da solução a550-570 nm.

Para permitir que muitas amostras a serem processadas entre sié necessário que as varetas de mergulhamento 40 sejam mantidas em umaconfiguração que combina com de uma microplaca de 96 cavidade padrão (8χ 12). Instrumentos estão disponíveis que podem distribuir reagentes nestasplacas e também lavar as cavidades, uma exigência que é necessária paraprevenir transporte de reagente entre as etapas de ensaio. Espectrofotôme-teros que podem ler soluções coloridas diretamente nas cavidades na etapafinal do ensaio estão também prontamente disponíveis. Isto foi conseguidousando-se fixações customizadas que mantêm até 96 varetas de mergulha-mento na orientação correta e posição de modo que elas se encaixem asparedes de uma microplaca de 96 cavidades padrão. As fixações permitemque o grupo de varetas, até 96, sejam removidas juntas como um grupo paranovas placas a cada etapa do ensaio. O grupo de varetas é então processa-do em um procedimento usando-se os mesmos reagentes e métodos descri-tos acima para o ensaio de única vareta.

Além da medição de proteína acima, por um aspecto da inven-ção, varetas de mergulhamento adicionais podem ser cortadas do dispositivopara determinar a quantidade de colesterol na pele. Para a medição daquantidade de colesterol na pela as varetas de mergulhamento foram cadauma colocadas em aproximadamente 100 μΙ de solução de um reagente deA-C-B em cavidades de placa de microcavidade de 96 cavidades (não ilus-trada). O reagente era um conjugado de digitonina (A) ligado a peroxidasede rábano silvestre (B) através de um copolímero de anidrido-N-vinilpirrolidona maléico (C) e foi usado a uma concentração de aproximada-mente 1 μg/mL As varetas foram deixadas na solução por cerca de quinzeminutos a temperatura ambiente, depois da qual elas foram removidas e fo-ram colocadas em novas placas da placa de microcavidade contendo apro-ximadamente 200 μΙ de solução de lavagem. A placa de microcavidade foiagitada para efetuar a lavagem e depois de cerca de onde minuto as varetasforam removidas para novas cavidades contendo aproximadamente 200 μΙde solução de lavagem fresca e novamente foram agitadas por cerca de umminuto. A lavagem com agitação foi feita uma terceira vez, depois da qual asvaretas foram removidas e foram colocadas em aproximadamente 100 μΙ desolução de substrato (reagente Enhanced K-Blue). As varetas foram entãoincubadas com a solução de substrato, no escuro, por cerca de quinze minu-tos a temperatura ambiente. A placa de microcavidade pode ser agitada du-rante essa etapa.

Depois que as varetas foram incubadas, as varetas podem serremovidas. Aproximadamente cem (100) μΙ_ de ácido sulfúrico a 1 N são en-tão adicionados às cavidades com a solução de substrato para parar outrareação, e a densidade ótica da solução resultante foi lida a cerca de 450 nmem um espectrofotômetro de leitura de placa, para prover uma medida deuma quantidade de colesterol na amostra de pele.

Por medição dos níveis de proteína e da quantidade de coleste-rol na pele de um dispositivo de amostragem como descrito, permite que amedição de colesterol seja feita referência ao nível de proteína respectivo,para determinar, por exemplo, se amostra de pele suficiente foi obtida paraprover uma medição de colesterol na pele usável. Alternativa ou adicional-mente, o nível de proteína pode ser usado para normalizar os níveis de co-lesterol na pele, tal como, por exemplo, por divisão do nível de colesterol deuma pessoa pelo nível de proteína.

Embora os ensinamentos do requerente como descritos emcombinação com várias concretizações, pretende-se que os ensinamentosdo requerente não sejam limitados a tais concretizações. Pelo contrário, osensinamentos do requerente incluem várias alternativas, modificações eequivalente, como será apreciado por aqueles versados na técnica.

Claims (49)

1. Método de medição da quantidade de pele removida por re-moção da fita, compreendendo:a) provisão de uma fita tendo um membro de suporte revestidosobre pelo menos um seu lado com um adesivo médico;b) aplicação da fita sobre uma área selecionada de pele paraaderir a fita à área de pele selecionada;c) remoção da fita da área de pele selecionada para se obteruma amostra representativa de uma camada de estrato córneo externo dapele, a amostra que adere à fita de modo a ter constituintes de pele expos-tos;d) aplicação de uma mancha de proteína sobre uma área de su-perfície predeterminada da amostra e deixando que a mancha de proteínapermaneça em contato com a mesma por um período de tempo suficientepara causar a ligação da dita mancha à proteína presente nos constituintesde pele expostos; ee) medição da proteína manchada nos constituintes de pele ex-postos para determinar uma medição da quantidade de proteína indicativada quantidade de pele removida.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita man-cha de proteína é selecionada do grupo que consiste em corantes ácidos eaniônicos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita man-cha de proteína is um reagente de mancha Ponceau S.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita man-cha de proteína é Azul de Coomassie.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 4, em que a intensidade da proteína manchada nos constituintes de peleexpostos é medida para determinar uma medição da quantidade de proteína.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 4, em que a proteína manchada é medida espectrofotometricamente paradeterminar uma medição da quantidade de proteína.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 6, em que a medida da quantidade de proteína é comparada com um nívelde limiar predeterminado.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a amostra édescartada se a quantidade de proteína medida for abaixo do limiar prede-terminado.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 8, em que o dito membro de verso é formado de poliéster.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, em que o dito adesivo médico é um adesivo sensível a pressão.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, em que o dito adesivo médico é um adesivo à base de acrílico.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, em que o dito adesivo médico é um adesivo de elastômero de borra-cha sintético.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, em que o dito adesivo médico é um adesivo à base de silicone.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, em que o dito adesivo médico compreende um elastômero formadodos polímeros por blocos de estireno-isopreno-estireno ou estireno-butadieno-estireno^

15. Método de comparação dos níveis relativos de pele coleste-rol oriundo de numerosos indivíduos, compreendendo:a) medição de pele colesterol a partir de cada indivíduo por ob-tenção de uma amostra representativa de uma camada de estrato córneoexterno da pele usando-se remoção da fita e análise de constituintes de peleexpostos aderidos ao adesivo para se obter um nível de colesterol na pelepara um indivíduo;b) aplicação de uma mancha de proteína sobre uma área de su-perfície predeterminada dos constituintes de pele expostos da amostra sepa-rada de onde o colesterol na pele é medido e permissão à mancha de prote-ína permanecer em contato com a mesma por um período de tempo sufici-ente para causar ligação da dita mancha a proteína presente nos constituin-tes de pele expostos;c) medição da proteína manchada nos constituintes de pele ex-postos para determinar uma medição da quantidade de proteína indicativada quantidade de pele removida; ed) normalização da medição de colesterol na pele com a medidada quantidade de proteína.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a norma-lização de compreende divisão da medição de colesterol na pele pela medi-da de proteína.

17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que adita mancha de proteína é selecionada do grupo que consiste em corantesácidos e aniônicos.

18. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que adita mancha de proteína é um reagente de mancha Ponceau S.

19. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que adita mancha de proteína é Azul de Coomassie.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-15 a 19, em que a intensidade da proteína manchada nas constituintes depele expostos é medida para determinar uma medição da quantidade de pro-teína.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-15 a 19, em que a proteína manchada é medida espectrofotometricamentepara determinar uma medição da quantidade de proteína.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-15 a 21, em que a medida da quantidade de proteína é comparada com umnível de limiar predeterminado.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a amostraé descartada se a quantidade de proteína medida for abaixo do limiar predeterminado.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-15 a 23, em que o dito membro de verso é formado de poliéster.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 15 a 24, em que o dito adesivo médico é um adesivo sensível a pres-são.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 24, em que o dito adesivo médico é um adesivo à base de acrílico.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15a 24, em que o dito adesivo médico é um adesivo de elastômero de bor-racha sintético.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 24, em que o dito adesivo médico é um adesivo à base de silicone.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a 24, em que o dito adesivo médico compreende um elastômero formadodos polímeros por blocos de estireno-isopreno-estireno ou estireno-butadieno-estireno.

30. Kit para o uso na realização de um método como definido nareivindicação 1, compreendendo:a dita fita; eum fonte da dita mancha de proteína.

31. Kit de acordo com a reivindicação 30, em que a dita manchade proteína é selecionada do grupo que consiste em corantes ácidos e aniô-nicos.

32. Kit de acordo com a reivindicação 30, em que a dita manchade proteína é um reagente de mancha Ponceau S.

33. Kit de acordo com a reivindicação 30, em que a dita manchade proteína é Azul de Coomassie.

34. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a 33, em que o dito membro de verso é formado de poliéster.

35. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a 34, em que o dito adesivo médico é um adesivo sensível a pressão.

36. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a 34, em que o dito adesivo médico é um adesivo à base de acrílico.

37. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a-34, em que o dito adesivo médico é um adesivo de elastômero de borrachasintético.

38. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a-34, em que o dito adesivo médico é um adesivo à base de silicone.

39. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a-34, em que o dito adesivo médico compreende um elastômero formado dospolímeros por blocos de estireno-isopreno-estireno ou estireno-butadieno-estireno.

40. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a-39, em que o dito adesivo é portado por um dispositivo fechável, o dispositi-vo fechável tendo um membro de amostragem que porta o adesivo, e ummembro de fechamento adaptado para engatar o membro de amostragem ereter o adesivo dentro do dispositivo.

41. Kit de acordo com a reivindicação 40, em que o dito adesivoé selado dentro do dispositivo quando o membro de fechamento engata omembro de amostragem.

42. Kit de acordo com a reivindicação 41, em que pelo menos omembro de fechamento ou o membro de amostragem é provido com umarebordo periférico, e o outro dentre o membro de fechamento ou o membrode amostragem é provido com uma ranhura periférica adaptada para recebero rebordo de modo que o adesivo seja selado dentro do dispositivo.

43. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a-42, em que o membro de fechamento é ligado ao membro de amostragempor uma dobradiça.

44. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a-43, em que pelo menos uma porção do membro de amostragem é adaptadapara ser cortada do dispositivo fechável para formar uma vareta de mergu-Ihamento, a dita vareta de mergulhamento tendo uma primeira sua extremi-dade isenta de adesivo, e uma segunda sua extremidade com adesivo.

45. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a-43, em que o dispositivo fechável define pelo menos uma vareta de mergu-lhamento ali que é pré-cortada ou pré-estriada, pelo menos uma vareta demergulhamento tendo uma primeira sua extremidade isenta de adesivo euma segunda sua extremidade com adesivo.

46. Kit de acordo com a reivindicação 44 ou 45, em que a se-gunda extremidade da vareta de mergulhamento com adesivo define umaárea fixada ou predefinida de adesivo.

47. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a-43, em que pelo menos uma porção do membro de amostragem é adaptadapara ser cortado do dispositivo fechável para formar um disco, o dito discotendo o adesivo provido sobre uma sua face.

48. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a-43, em que o dispositivo fechável define pelo menos um disco ali que é pré-cortado ou pré-estriado, pelo menos um disco tendo o adesivo sobre umasua face.

49. Kit de acordo com a reivindicação 47 ou 48, em que a facedo disco com adesivo define a área fixada ou predefinida de adesivo.