JP3262443B2 - 皮膚角質細胞のダメージ度の測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、皮膚角質細胞のダメー
ジ度の測定法に関し、詳しくは、アトピー性皮膚炎患者
の診断を確実にするために、皮膚の表面角質細胞のダメ
ージ度を測定する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】アトピー性皮膚炎は、かゆみ、皮膚の炎
症、皮膚の乾燥感などを主症状とする皮膚病であり、主
に乳幼児期から発症し小児期までに治癒することが多い
が、近年成人になっても治らず慢性化している例が増え
ている皮膚疾患である。根本的な治療法は確立されてお
らず、ほとんど対症療法に頼っているのが現状である。
本疾患の発症には、食事（米、牛乳、卵等）や環境因子
（ハウスダスト、ダニ、カビ等）によるアレルギー性の
要因や生活環境の変化（乾燥状態等）や、掻破等による
皮膚のバリアー機能の低下の要因が深く関与していると
されている。

【０００３】上記のアレルギー性の要因を検査する方法
として、アレルギー性については、血清中のＩｇＥ抗体
値を測定する方法やアレルゲンを直接皮膚に滴下、皮下
注射及び貼付等の方法により接触させ、その後の皮膚反
応を測定する方法などが行われている。

【０００４】しかし、これらの方法により選択されたア
レルゲンが、アトピー性皮膚炎の発症と直接結びつくか
どうかはっきりしない。選択された可能性の高い卵、牛
乳等の食物アレルゲンを発見しても、治療上それらを除
去した食事を維持するのに栄養上の問題などを含み容易
でないのが現状である。また、血液中のＩｇＥ抗体は、
あくまで患者のアレルギーの強さのおおまかな目安と考
えられ、ＩｇＥ抗体価が高くてもアトピー性皮膚炎が全
く治っている場合や抗体価が全く検出されないのに皮膚
の炎症が続いている場合がある。したがって、治療上、
抗体価に固執しすぎると栄養上などの問題を引き起こす
可能性がある。

【０００５】一方、皮膚のバリアー機能の低下（ダメー
ジ度）については、（ａ）皮脂量の測定、（ｂ）経表皮
水分損失量（ＴＷＬ）の測定、（ｃ）角層水分量の測定
などが知られているが、いずれも専用の機器を用い、測
定条件をかなり厳密に設定した上で時間をかけた測定が
必要であることなどから、一般的な診療において利用す
るのが困難である。また、（ｄ）皮膚を直接切除して病
理組織学的検査を行う方法もあるが、痛みを伴う点や皮
膚の角層の状態を評価できないこと等により、現在まで
皮膚の検査による診断はほとんど行われていない。

【０００６】ところで、皮膚角層を検査する方法とし
て、有機溶剤に可溶な粘着物質を塗布してあるととも
に、この粘着性物質に皮膚角質層を付着せしめたテープ
を、あらかじめ固着剤を塗布せしめた透明板に張り付
け、次に、これを有機溶剤に浸漬した後、該テープを取
り去ることにより実質的に角質層の一部を透明板上に固
定し、必要によりこれを染色して作成された角質層標本
により角質層の状態を検査する方法が本出願人により開
示されている（特開昭６３−１１３３５８号公報）。こ
の方法によると、肌の状態、肌性、肌質、肌の老化度合
等を検査することはできるが、皮膚のバリアー機能の低
下（ダメージ度）を判定することは困難である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記観点から
なされたものであり、アトピー性皮膚炎患者の皮膚の状
態を、治療効果を判定しながら診断することを可能とす
るために、皮膚のダメージ度を簡単に非侵襲的に測定す
る方法を提供することを課題とする。

【０００８】

【問題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するこめに鋭意検討を重ねた結果、皮膚のダメージ
度を簡単に非侵襲的に測定するには、皮膚の最外層の角
質細胞を病理組織学的あるいは形態学的に観察すること
が最良であると考えた。そして、皮膚の角質細胞を剥離
し透明板あるいは着色した樹脂板に保持せしめ、この角
質細胞に適当な染色や蛍光染色を行い、光学顕微鏡ある
いは走査型電子顕微鏡観察し、角質細胞の不全角化、細
胞剥離の異常、細胞表面の多糖類の存在、角化過程にお
ける角層の形成異常、角質細胞の体表面側および裏面の
形態学的な異常等について病理組織学的あるいは形態学
的に評価することにより、皮膚のダメージ度を測定する
ことができることを見出し、本発明に至った。

【０００９】すなわち本発明は、有機溶剤に可溶な粘着
物質を塗布したテープに皮膚角質細胞を貼着し、このテ
ープをあらかじめ固着剤を塗布した着色板にテープの粘
着面が接するようにして貼付け、前記有機溶剤で粘着物
質を溶解させることによりテープを着色板から剥離させ
て角質細胞を着色板に固定し、得られた角質細胞標本を
用いて角質細胞の形態学的特徴を顕微鏡観察することを
特徴とする皮膚角質細胞のダメージ度の測定法である。

【００１０】また、本発明の一態様として、上記測定法
において、角質細胞標本を標本の表側から顕微鏡観察
し、さらに、皮膚角質細胞を貼着したテープを裏面から
顕微鏡観察することを特徴とする皮膚角質細胞のダメー
ジ度の測定法、さらに、有機溶剤に可溶な粘着物質を塗
布したテープに皮膚角質細胞を貼着し、このテープをあ
らかじめ固着剤を塗布した透明板にテープの粘着面が接
するようにして貼付け、前記有機溶剤で粘着物質を溶解
させることによりテープを透明板から剥離させて角質細
胞を透明板に固定し、これをＨＥ染色、ＰＡＳ染色、Ｄ
ＡＣＭ染色から選ばれる方法により染色して得られる皮
膚角質細胞染色標本を顕微鏡観察することを特徴とする
皮膚角質細胞のダメージ度の測定法を提供する。

【００１１】要約すると、本発明の測定法は、着色板を
用いて作製した角質細胞標本（以下、「表面標本」とい
う）を表側（体表面側）から観察する方法、さらに粘着
面着テープに角質細胞を採取したもの（以下、「裏面標
本」という）を裏側から観察する方法、さらにこれらに
加えて透明板上で角質細胞を染色して得られる標本（以
下、「染色標本」という）を観察する方法である。

【００１２】尚、本明細書において、皮膚のダメージ度
とは、皮膚のバリアー機能の低下の度合いをいい、具体
的には、有核細胞の出現、多層細胞群の存在、ＰＡＳ陽
性細胞の出現、角層細胞膜表面のＳＨ基の蛍光強度、角
層表面のスポンジ状構造や角層裏面の微細絨毛様突起の
出現等により総合評価されるものである。

【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１４】＜１＞本発明の皮膚角質細胞のダメージ度
の測定法に用いる角質細胞標本 （１）表面標本 表面標本は、細胞表面に穴や皺を認めるスポンジ状構
造、溝状の構造及び細胞表面の凹凸等を観察するための
標本である。

【００１５】本発明に用いる粘着性物質を塗布したテー
プは、このテープの粘着面を皮膚に押し付け、テープを
皮膚から剥して角層を採取するために使用するものであ
る。この粘着性物質は、有機溶剤に可溶である樹脂又は
高分子化合物が用いられ、例えば、ポリ酢酸ビニル、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリ塩化
ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリビニルエーテル、ポ
リブテン、アスファルト、及び、天然ゴム又はその誘導
体、ＳＢＲ系ゴム、ＮＢＲ系ゴム、ブタジエン−ビニル
ピリジン系ゴム、ブチルゴム、クロロプレン系ゴム、再
生ゴム、シアノアクリレート系ゴム、アラビアゴム、ト
ラガントゴム等のゴム質などが挙げられる。これらは、
１種又は２種以上よりなる混合物を単独あるいは他の基
材に含有させたものが用いられる。

【００１６】上記の粘着物質のうちでも、天然ゴム又は
その誘導体、ＳＢＲ系ゴム、ＮＢＲ系ゴム、ブタジエン
−ビニルピリジン系ゴム、ブチルゴム、クロロプレン系
ゴム、再生ゴム、シアノアクリレート系ゴム、アラビア
ゴム、トラガントゴム等のゴム質はテープを剥がす際の
剥離性及び角質細胞を変化させないという点で好まし
い。 テープは、一般的又は工業的に使用されているも
のでよく、材質としては、例えば、セロファン、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステ
ル、ふっ素樹脂等のプラスチック素材等が挙げられる。
また、形状としては、均一な厚みを有するものの他、細
孔を有するもの、網目状であるもの等も使用可能であ
る。

【００１７】本発明には、このようなテープに前記粘着
物質を塗布したものを使用するが、粘着テープとして市
販されているもの、例えばセロハンテープ等もそのまま
使用することができる。

【００１８】前記粘着性物質を溶解させるために用いる
有機溶剤としては、メタノール、エタノール、プロパノ
ール、ブタノール、エーテル、アセトン、クロロホル
ム、ヘキサン、ＴＨＦ、酢酸エチル、ｏ−キシレン、ｍ
−キシレン、ｐ−キシレン、メチルベンゼン、エチルベ
ンゼン、プロピルベンゼン、ベンゼン、トルエン、酢酸
アミル等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を混合
又は併用して使用される。

【００１９】次に、本発明に用いる固着剤は、後述する
着色板あるいは透明板に皮膚角層を固定するために使用
されるものであり、角質細胞を変形させないものであっ
て、かつ、上記の有機溶剤に易溶でないものが使用され
る。このような固着剤としては、公知の接着剤、タンパ
ク質等が挙げられるが、得られる角質細胞標本がより鮮
明であるという理由から、公知の接着剤等が好適に使用
され、具体例としては、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルア
ルコール、ポリビニルアセタール、ポリ塩化ビニル、ポ
リ塩化ビニリデン、ポリビニルアルコール等のポリビニ
ル系接着剤、メラミン樹脂接着剤、フェノール樹脂接着
剤、レゾルシノール系接着剤、キシレン樹脂接着剤、フ
ラン樹脂接着剤、ポリイソシアネート樹脂接着剤、ポリ
エステル樹脂接着剤、ポリアミド系接着剤、ポリブテン
接着剤、エチレン共重合系接着剤、熱可塑性ポリエステ
ル接着剤、ポリエステルアクリレート接着剤、シリコー
ンゴム系接着剤、フェノール混合系接着剤、エポキシ系
接着剤、シアノアクリレート系接着剤、嫌気性ポリエス
テル接着剤、ポリベンツイミダゾール系接着剤、ポリイ
ミド系接着剤、メタロキサン系接着剤、にかわ系接着
剤、カゼイン系接着剤、セルロース系接着剤等が挙げら
れ、これらの１種又は２種以上を混合して用いるもので
ある。

【００２０】これらの接着剤のうちでも、染色した場合
に染まりにくいという点で、ポリ塩化ビニル系接着剤が
最も好ましい。又、上記のタンパク質としては、例え
ば、卵白アルブミン、乳アルブミン、ミオーゲン、血清
アルブミン、グロビン、ロイコシン等のアルブミン類、
血清グロブリン、β−ラクトグロブリン、リゾチーム、
ミオシン、エデスチン、インシュリン、フィブリノーゲ
ン、チログロブリン等のグロブリン類、可溶性コラーゲ
ン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン、スポンジ
ン、ゴルゴニン、ヒストン、プロタミン、卵白、ゼラチ
ン、ペプトン、ペプチド、その他、リンタンパク質、リ
ポタンパク質、糖タンパク質等が挙げられ、これらの１
種又は２種以上よりなる混合物を単独あるいは多価アル
コール等の他の基材に含有せしめたものが用いられる。

【００２１】また、本発明に用いる着色板は、皮膚細胞
表面の形態異常等を観察するための標本を得るために必
要なものであり、黒、緑、青等に着色され、鋏で容易に
切断でき、且つ、有機溶剤に不溶又は難溶なものであ
る。樹脂板に着色が必要な理由は、転写した角質細胞を
明確に確認した上で標本作製をするためである。透明板
では、白色の角質細胞を明確に判別することが困難であ
り、また、走査型顕微鏡標本として試料台に固定できな
い。誤って角質細胞を貼付していない面を表にして走査
型電子顕微鏡標本を作製してしまう可能性があるため着
色してあることが好ましい。具体的には、プラスチック
板又はポリメチルペンテン、ポリエチレン等の樹脂板な
どが挙げられ、この中でも固定した角質細胞が肉眼で判
別でき、切断性及び耐溶剤性の点から黒色のプラスチッ
ク板が最も好ましく用いられる。

【００２２】次に、上記材料を用いて表面標本を作製す
る方法を説明する。まず、テープの粘着性物質を塗布し
てある面を皮膚に押し当て、テープ部分の粘着性物質を
塗布していない面を指で押し付け軽く２〜３回擦り、テ
ープを皮膚に密着せしめ、ついで、一定の力で一定の方
向からテープを剥がす。次に、このテープをあらかじめ
前記固着剤を塗布せしめた着色板に張り付ける。この
際、着色板にあらかじめ固着剤を塗布してないと、以下
に述べるテープを剥がす段階において、角層が着色板よ
り遊離してしまう。又、角層を保持したテープを着色板
に張り付ける際には、テープ幅３〜１０ｍｍ程度に切断
しておくことが好ましい。

【００２３】テープ幅が広すぎる場合は、有機溶剤の浸
透性が悪く、又、取扱上不便である。尚、窓孔を有する
ホルダーに、この窓孔に対応するようにテープを貼着し
たものを用意しておくと、ホルダーごとテープを皮膚に
密着させることができ、さらにホルダーの枠をてことし
て利用することにより一定の力で一定の方向からテープ
を剥がすことができ、常に一定量の角層の一部をテープ
上に採取することができる。

【００２４】次に、上記のテープを張り付けた着色板を
前記の有機溶剤に２〜４時間浸漬し、テープに付着して
いる粘着性物質を溶解せしめ、該テープを透明板及び着
色した樹脂板より自然に剥離せしめる。剥離後の粘着性
物質の残りを除去する目的で、新たな有機溶剤に浸漬す
ることも好適である。しかる後有機溶剤を乾燥させる
と、角質細胞が着色板に固定された表面標本が得られ
る。

【００２５】標本を走査型電子顕微鏡を用いて観察する
場合には、標本の角質細胞を固定した着色板を１ｃｍ×
１ｃｍ程度の大きさに切断し、それをあらかじめ１ｃｍ
×１ｃｍ以下の大きさの両面テープを貼付した走査型電
子顕微鏡試料台に固定し、金蒸着することが好ましい。

【００２６】（２）裏面標本 裏面標本は、不規則で微細な襞と絨毛を認める微細絨毛
様突起、円形状のくぼみ構造及び細いシワ状隆起等を観
察するための標本である。これは、上記＜１＞と同様に
して、粘着性物質を塗布したテープを皮膚に押し当て、
テープの粘着性物質を塗布していない面を指で押し付け
軽く２〜３回擦り、テープを皮膚に密着せしめ、つい
で、一定の力で一定の方向からテープを剥がすことによ
り得られる。裏面標本を走査型電子顕微鏡観察する場合
には、標本のテープを１ｃｍ×１ｃｍ程度の大きさに切
断して走査型電子顕微鏡試料台に両面テープ等で固定
し、金蒸着することが好ましい。

【００２７】（３）染色標本 染色標本は、角質細胞の不全角化と細胞剥離の異常、細
胞浸潤の跡による炎症があった可能性、角質細胞の細胞
膜上のＳＨ基からＳＳ結合への変換を評価するための標
本である。

【００２８】染色標本は、着色板の替わりに透明板を用
いる以外は前記表面標本と同様にして透明板に角質細胞
を固定し、さらに角質細胞を染色することにより得られ
る。ここで用いる透明板は、透明で角質細胞標本の観察
を妨げず、且つ、有機溶剤に不溶又は難溶なものであ
る。具体例としては、ガラス板又はポリメチルペンテ
ン、ポリエチレン等の樹脂類が挙げられ、この中でも透
明性及び耐溶剤性の点からガラス板が最も好ましく用い
られる。

【００２９】透明板に固定された角質細胞の染色として
は、細胞質と核を染め分けるヘマトキシリン−エオシン
染色（ＨＥ）、細胞浸潤の跡を示す多糖類を染めるＰＡ
Ｓ染色、角化過程における角層の成熟化に関係している
細胞表面のＳＨ基からＳＳ結合への変換の程度を評価す
るためのＤＡＣＭ（（Ｎ−（７−ジメチルアミノ−４−
メチル−３−クマリニル）−マレイミド）染色等が最適
である。これらは、単独でも評価は可能であるが、２種
又は３種の染色を行い総合評価を行うことが好ましい。

【００３０】ＨＥ染色は、健常者では認められないが、
アトピー性皮膚炎患者ではしばしば認められる核を持っ
た細胞（有核細胞）を判別できると共に健常者では、細
胞同士がバラバラに観察できるが、アトピー性皮膚炎患
者では細胞同士が重なりあっている（多層細胞群）こと
が観察できる。これらの観察結果から、不全角化と細胞
剥離の異常についての情報を与えるものである。

【００３１】ＰＡＳ染色は、炎症に関係のある好中球や
肥満細胞等を染めることができ、健常者では、ほとんど
染まらないが、アトピー性皮膚炎患者では、細胞が青紫
色にＰＡＳ陽性細胞として染まる。これらの観察結果
は、細胞浸潤の跡を示し、炎症があった可能性を示唆す
るものである。

【００３２】また、細胞が角化するにしたがい、細胞膜
上のＳＨ基がＳＳ結合に変換していることが判っている
が、ＤＡＣＭ染色は、このＳＨ基とＳＳ結合を蛍光染色
により染め分け、ＳＨ基からＳＳ結合への変換が正常に
行われているかどうかを判定できる。これにより正常な
角化が行われているかどうかを評価できる。健常者で
は、ＳＨ基の蛍光が弱く、ＳＳ結合の蛍光が認められ、
アトピー性皮膚炎患者では、ＳＨ基の蛍光がかなり強
く、ＳＳ結合の蛍光が健常者と同様に認められている。

【００３３】具体的には、角質細胞を透明板に移した
後、ＨＥ、ＰＡＳあるいはＤＡＣＭ等の染色液を用いて
細胞質や核を染色し、バルサム封入を行い、これを染色
標本とする。

【００３４】尚、ＨＥ、ＰＡＳ染色のような可視光で判
別できる染色による標本の観察は、通常の光学顕微鏡を
用いて行い、ＤＡＣＭ染色のように蛍光染色した標本
は、蛍光顕微鏡を用いて観察する。

【００３５】＜２＞本発明の皮膚角質細胞のダメージ度
の測定法 上記表面標本を、光学顕微鏡あるいは好ましくは走査型
電子顕微鏡を用いて観察し、スポンジ状構造、溝状の構
造、細胞表面の凹凸等の有無を判定することにより、細
胞の形態学的な変化を判定できる。健常者の細胞表面
は、平滑でスポンジ状構造、溝状の構造、細胞表面の凹
凸等がほとんど認められないが、アトピー性皮膚炎患者
では、スポンジ状構造、溝状の構造、細胞表面の凹凸等
が強く認めらる。

【００３６】また、裏面標本を同様に光学顕微鏡あるい
は走査型電子顕微鏡を用いて観察し、微細絨毛突起、円
形状のくぼみ、シワ状隆起の有無を判定することによ
り、細胞の形態学的な変化を判定できる。健常者の細胞
表面の裏面は、平滑で微細絨毛様突起、円形状のくぼ
み、シワ状隆起等がほとんど認められないが、アトピー
性皮膚炎患者では、微細絨毛様突起、円形状のくぼみ、
シワ状隆起等が強く認められる。

【００３７】表面標本のみの観察所見からも、アトピー
性皮膚炎患者特有の細胞の形態学的な変化を判定するこ
とができるが、細胞を表面と裏面との両面から形態学的
な検査をすることにより、細胞の表面の構造と裏面の構
造の関連性が判明する。例えば、表面の穴や皺と裏面の
微細絨毛様突起とが互いに細胞同士が上下に重なり合っ
ていたことが説明できる。また、その重なりが、整然と
したものか、乱れていたかが判定できる。したがって、
両面からの観察所見から、細胞の配列や重層具合を詳し
く調べることにより、一層正確に角質細胞のダメージ度
を判定することができる。

【００３８】さらに、上記観察所見に加えて、染色標本
の顕微鏡観察所見を加えることにより、より一層正確な
角質細胞のダメージ度の判定が可能となる。具体的に
は、得られた染色標本を光学顕微鏡により観察し、角質
細胞に認められる有核細胞の有無、角質細胞の重層剥離
を指標とする多層細胞群の有無、細胞浸潤の場合に認め
られる多糖類を指標とするＰＡＳ陽性細胞の有無等から
角化異常の指標となる不全角化及び細胞剥離の異常、炎
症状態の指標となる細胞浸潤の有無等を調べる。さら
に、角質細胞に認められるＳＨ基の蛍光強度及び核の位
置の蛍光の有無とＳＳ結合の蛍光強度及び不均一な斑状
の蛍光の有無等から角化過程における角質細胞の形成異
常を調べる。

【００３９】

【実施例】以下に、実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。尚、本実施例ではホルダーを使用したが、
ホルダーを使用しなくても同様に標本を作製し、角質細
胞のダメージ度を測定することができる。

【００４０】

【実施例１】７．６ｃｍ×２．６ｃｍの長方形形状であ
り、端部に３．５ｃｍ×２．０ｃｍの長方形の窓孔２を
有するホルダー１（図１）に、窓孔２に対応するように
４．０ｃｍ×２．６ｃｍのセロハンテープ３（市販の粘
着性セロハンテープを切断したもの）を貼着したものを
用意した。ホルダー１の窓孔２の枠には、１ｍｍ毎に目
盛り４が付してある。

【００４１】このホルダー１ごと粘着テープ２の粘着面
を、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部に付け、指で押し付
け軽く２〜３回擦り、セロハンテープの粘着面を皮膚に
密着せしめた。ついで、角層採取ホルダーの枠をてこと
して利用し、一定の力で一定の方向から皮膚からテープ
２を剥がし、枠に付してあり目盛り４を目安として幅４
ｍｍ、長さ５ｍｍにカッター及びはさみを用いて切断
し、これをあらかじめ塩化ビニル系樹脂接着剤を均一に
塗布したスライドグラスに、テープの粘着面が接するよ
うに張り付けた。

【００４２】次に、このスライドグラスをキシレンに３
時間浸漬し、粘着テープの粘着物質を溶解させて、スラ
イドグラスよりセロハンテープが剥離したのを確認して
から、新たなキシレンに３０分浸漬し、もう一度同様に
新たなキシレンに３０分浸漬した。３時間の浸漬により
セロハンテープが剥離していない場合は、自然に剥離せ
しめるまで、キシレンに浸漬すればよい。

【００４３】その後、これを取り出し熱をかけずにキシ
レンを乾燥させた後、細胞質と核を染めるためのヘマト
キシリン・エオシン（ＨＥ）染色及び多糖類を染めるた
めのＰＡＳ染色の２種類を常法に従い行い、乾燥後、常
法によりバルサム封入して角質細胞の染色標本を作成
し、光学顕微鏡観察を行った。

【００４４】さらに、ＤＡＣＭ染色を既に報告された方
法を用いて行った。すなわち、ＳＨ基の染色は、角質細
胞を固定したテープを４℃のＴＡＳ（塩化ナトリウム−
トリスアセテイトバファー）で洗浄後、０．０１ｍＭＤ
ＡＣＭ／ＴＡＳ溶液を標本表面に滴下し、室温で３分間
反応させ、再び４℃のＴＡＳで洗浄することにより行
い、落射蛍光顕微鏡を使用して観察した。一方、ＳＳ結
合の染色は次のようにして行った。標本を４℃のＴＡＳ
で洗浄後、０．１５Ｍ ＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミ
ド）／ＴＡＳ溶液で３７℃で４５分間反応させ、遊離の
ＳＨ基をブロックした後、４℃のＴＡＳで充分洗浄後、
４０ｍＭＤＴＴ（ジチオスレオール）・０．５ｍＭＥＤ
ＴＡ（エチレン−ジアミン四酢酸）／ＴＡＳ溶液洗浄を
３７℃で１５分間反応させ、標本中のＳＳ結合をＳＨ基
に還元し、４℃のＴＡＳで充分洗浄後、前述のＳＨ基染
色を行い、落射蛍光顕微鏡を使用して観察した。

【００４５】角質細胞の表面標本は、黒色の塩化ビニル
樹脂系接着剤を展延した転写用樹脂板に、角層を採取し
たセロファンテープの一部（５×４ｍｍ）を貼付し、上
記と同様にしてキシレンに浸漬してセロファンテープを
剥離させ、キシレンを乾燥させることにより得た。この
標本を、走査型電子顕微鏡用試料台（１５ｍｍφ）に両
面テープで固定し、Ｅ−１０１型イオンスパッタ（日立
製作所製）を用いて金蒸着した。

【００４６】裏面標本は、角層を採取したセロファンテ
ープの一部をそのまま標本とし、走査型電子顕微鏡用試
料台（１５ｍｍφ）に両面テープで固定し、同様に金蒸
着した。

【００４７】これらの表面標本及び裏面標本を、走査型
電子顕微鏡観察を用いて倍率２，５００倍程度で観察
し、写真撮影を行った。各標本の観察項目は以下の如く
である。

【００４８】（光学顕微鏡所見） ＨＥ染色（図２） ：有核細胞の出現の程度及び多層細
胞群の存在の程度 ＰＡＳ染色（図３）：有核細胞の出現の程度及びＰＡＳ
陽性細胞の出現の有無 ＤＡＣＭ染色（図４）：健常人と比較したＳＨ基、ＳＳ
結合の蛍光強度、特異な所見としてＳＨ基の核の位置の
蛍光及びＳＳ結合のまだら状蛍光

【００４９】（走査型電子顕微鏡所見） 表面標本（図５）：スポンジ状構造 裏面標本（図６）：微細絨毛様突起

【００５０】上記観察項目について、各々４グレード
（陰性−、弱度±、強度＋、かなり強度＋＋）で評価
し、各々のグレードを０、０．５、１．０、２．０とし
て数値化し、各観察所見の評点の平均値を算出した。但
し、有核細胞の出現については、ＨＥ染色とＰＡＳ染色
の２サンプルの観察結果の平均を用いた。結果を表１に
示す。尚、角層の採取は、健常小児と小児アトピー性皮
膚炎患者について実施し、角質細胞の不全角化、細胞剥
離の異常、細胞浸潤の有無、角化過程における角質細胞
の形成異常を調べた。

【００５１】得られた各角質細胞標本は、従来にない鮮
明な標本であり、図２〜６に見られる如く、角質細胞が
明瞭に観察され、健康な小児と小児アトピー性皮膚炎患
者の角質細胞の病理組織学的及び形態学的な相違を詳細
に観察できるので、アトピー性皮膚炎による角質細胞の
異常を調べることができた。

【００５２】表１に見られる如く、小児アトピー性皮膚
炎患者において、症状の軽快に伴って角層検査所見の値
が減少し、本方法により皮膚のダメージ度を測定するこ
とにより、アトピー性皮膚炎の臨床症状の経過観察を評
価できた。

【００５３】また、皮膚のダメージ度の測定は、表１及
び図５に示したように、表面標本の観察のみからも行う
ことができるが、裏面標本、さらには染色標本の観察所
見を加えることにより、一層確実な測定ができる。

【００５４】

【表１】

【００５５】

【実施例２】実施例１と同様に各標本の作製を行った
が、角層の採取を、アトピー性皮膚炎患者１例の初診時
と２日後の２回行い、その所見の違いから、治療に使用
した薬剤の有効性を評価した。２回の各角層検査所見を
合計し、その総合評点を比較し、差が２を越える場合を
著名改善、１を越えて２以下の場合をやや改善、０．５
を越えて１以下の場合をやや改善、０．５以下から−
０．５以上までの場合を不変、−０．５未満の場合を悪
化と判定した。その結果を表２、３に示した。

【００５６】

【表２】

【００５７】

【表３】

【００５８】この結果から、アトピー性皮膚炎患者の皮
疹部がかなり改善していることが判明し、治療が有効で
あったことが示された。

【００５９】

【発明の効果】本発明により、非侵襲的に皮膚のダメー
ジ度を簡単に測定することができる。角質細胞の表面標
本の作製に着色板を使用したことで、白色の角質細胞を
明確に判別することができ、電子顕微鏡試料台に固定す
る際に裏表を誤認することを防止することができる。ま
た、本発明に用いる標本は安定に保存でき、更に、１サ
ンプルより数種の染色が行え、鮮明な観察ができるの
で、皮膚疾患の経過状況を把握でき、皮膚診断に有効に
利用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ホルダーの一例を示す斜視図。

【図２】 本発明の方法に用いたＨＥ染色標本（実施例
１）の光学顕微鏡写真（倍率約３５０倍）である（生物
の形態）。左は健康な小児の標本、右はアトピー性皮膚
炎患者の標本である。

【図３】 本発明の方法に用いたＰＡＳ染色標本（実施
例１）の光学顕微鏡写真（倍率約３５０倍）である（生
物の形態）。左は健康な小児の標本、右はアトピー性皮
膚炎患者の標本である。

【図４】 本発明の方法に用いたＤＡＣＭ染色標本（実
施例１）の光学顕微鏡写真（倍率約３５０倍）である
（生物の形態）。左は健康な小児の標本、右はアトピー
性皮膚炎患者の標本である。

【図５】 本発明の方法に用いた角質表面標本（実施例
１）の走査型電子顕微鏡写真（倍率約１２５０倍）であ
る（生物の形態）。左は健康な小児の標本、右はアトピ
ー性皮膚炎患者の標本である。

【図６】 本発明の方法に用いた角質裏面標本（実施例
１）の走査型電子顕微鏡写真（倍率１２５０倍）である
（生物の形態）。左は健康な小児の標本、右はアトピー
性皮膚炎患者の標本である。

【符号の説明】

１．ホルダー ２．窓孔 ３．粘着物質を塗布したテープ ４．目盛り

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−113358（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−281109（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/50 G01N 33/48

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 有機溶剤に可溶な粘着物質を塗布したテ
   ープに皮膚角質細胞を貼着し、このテープをあらかじめ
   固着剤を塗布した着色板にテープの粘着面が接するよう
   にして貼付け、前記有機溶剤で粘着物質を溶解させるこ
   とによりテープを着色板から剥離させて皮膚角質細胞を
   着色板に固定し、得られた角質細胞標本を用いて皮膚角
   質細胞を表側から顕微鏡観察すること、及び皮膚角質細
   胞を貼着したテープを裏面から観察し皮膚角質細胞を裏
   側から顕微鏡観察することにより、角質細胞の形態学的
   特徴を観察することを特徴とする皮膚角質細胞のダメー
   ジ度の測定法。
2. 【請求項２】 請求項１において、さらに、有機溶剤に
   可溶な粘着物質を塗布したテープに皮膚角質細胞を貼着
   し、このテープをあらかじめ固着剤を塗布した透明板に
   テープの粘着面が接するようにして貼付け、前記有機溶
   剤で粘着物質を溶解させることによりテープを透明板か
   ら剥離させて皮膚角質細胞を透明板に固定し、これをＨ
   Ｅ染色、ＰＡＳ染色、ＤＡＣＭ染色から選ばれる方法に
   より染色して得られる皮膚角質細胞染色標本を用いて染
   色された皮膚角質細胞を観察することにより、角質細胞
   の病理組織学的特徴を観察することを特徴とする皮膚角
   質細胞のダメージ度の測定法。
3. 【請求項３】 前記有機溶剤に可溶な粘着物質を塗布し
   たテープが、窓孔を有するホルダーに、この窓孔に対応
   するように貼着されたものであることを特徴とする請求
   項１または２記載の皮膚角質細胞のダメージ度の測定
   法。