CN110753869B - 用于特异染色的过程记录玻片 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于特异染色的粘合剂涂覆的显微镜玻片，特别是用于苏木素和伊红、尿液和巴氏染色的粘合剂涂覆的显微镜玻片，更特别地是用于特异染色的粘合剂涂覆的显微镜玻片，其将共存染色性能靶标结合至患者组织切片或疏松细胞，以便记录染色过程的质量控制并客观测量苏木素的反应性。染色性能永久性地与共存的组织切片或疏松细胞锁定在一起，以支持过程质量控制和染色结果的数字成像。

Description

用于特异染色的过程记录玻片
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月15日提交的标题分别为“用于苏木素伊红染色的过程记录玻片”、“用于巴氏涂片的过程记录玻片”、“用于显微镜玻片蛋白质沉积物的屏蔽涂层”和“免疫组化成像基线参考”的美国临时申请US62/520,334、US62/520,341、US62/520,169和US62/520,178的优先权，其每一个公开的全部内容通过引用并入本文中。
技术领域
本发明涉及用于特异染色的过程记录玻片。本发明特别涉及苏木素和伊红、尿液和巴氏染色的过程记录玻片。更特别地，本发明涉及用于特异染色的过程记录玻片，其将共存染色性能靶标结合至组织切片或疏松细胞，从而记录染色过程的质量控制并且能够客观地测量苏木素反应性。染色性能与共存的组织切片或疏松细胞永久锁定在一起，以支持过程质量控制和染色结果的数字成像。
背景技术
苏木素和伊红(H&E)染色是组织病理学中最常见的染色技术。这是使用苏木素和伊红两种染色剂的组合，用于展示临床标本中的细胞核和细胞质内含物。
染色方法涉及应用血红素，血红素是由铝离子和苏木素(苏木素的氧化产物)形成的复合物。血红素使细胞的细胞核(以及其他一些对象，诸如透明角质颗粒和钙化物质)呈蓝色。核染色后，用伊红Y的水溶液或酒精溶液复染，将嗜酸性结构染成红色、粉色和橙色不同色度。
通常血红素对细胞核的染色是由于染色剂-金属复合物与DNA的结合，但是从组织切片中提取DNA后可以获得细胞核染色。机理不同于碱性(阳离子)染色剂的细胞核染色，诸如硫堇或甲苯胺蓝。碱性染色剂的染色仅发生在比血红素酸性更弱的溶液中，并且可以通过事先的化学或酶促提取核酸来防止。有证据表明，类似于将铝和血红素结合在一起的配位键，将血红素复合物与核染色质中DNA和蛋白质的羧基结合。
嗜酸性结构通常由细胞内或细胞外蛋白组成。路易体和马洛里氏小体是嗜酸性结构的例子。大多数细胞质是嗜酸性的。红细胞呈强烈的红色。
结构不必为酸性或碱性的，即可被称为嗜碱性和嗜酸性的；该术语基于细胞组分对染色剂的亲和力。其他颜色可以存在于样本中，例如黄色和棕色；它们是由固有色素引起的，例如黑色素。一些结构不容易染色。如果必须清晰可见，基底层需要用PAS染色或一些银染染色。网状纤维也需要银染。疏水结构也倾向于保持透明；例如脂肪细胞、神经元轴突周围的髓磷脂和高尔基体膜，这些通常富含脂肪。
根据妇女的年龄，在不同的时间间隔对妇女进行巴氏涂片(Pap smear)检测，以进行宫颈癌筛查。在世界大多数地区，50岁以上的女性的发病率逐年上升。
巴氏涂片检测在所用染色剂的组成和时间、比例和时间上还没有完全标准化。巴氏染色涉及将五种染色剂混合成三种溶液。三种溶液为：细胞核染色剂，第一复染剂和第二复染剂。
因此，本发明的目的是提供一种系统，其将共存靶标与组织样本或疏松细胞结合在一起。优选地，上述靶标具有以下特性：与玻片共价结合并将共价捕获染色分子的化学分子。本发明通过提供具有共存靶标的过程记录玻片，所述共存靶标与玻片粘合剂共价结合并将共价捕获染色分子，作为上述问题的有效解决方案。
发明内容
通常在本发明一方面，公开了一种具有一批无机靶标的过程记录玻片，每种所述无机靶标与作为H&E和PAP染色的一部分的单种染色剂起反应，并共价结合到玻片上，优选地与所述玻片的粘合剂涂层共价结合。其中所述染色剂为作为第一组靶标的苏木素+媒染剂(Mordant)、伊红Y，作为第二组靶标的橙G(Orange G)、磷钨酸、亮绿SF(Light Green SF)或固绿FCF(Fast Green FCF)，以及任选的俾斯麦棕或一到七种特异染色剂；匹配的所述无机靶标支持与H&E染色剂以及一组具有相对羟基的特异染色剂的独特结合，并与玻片的粘合剂涂层共价结合。
在本发明另一方面，所述玻片上包含粘合剂涂层(如上所述)，用于固定组织切片或疏松细胞以进行处理。用于此应用的最常见的粘合剂玻片涂覆有氨基硅烷，并由大多数玻璃玻片制造商生产。胺基将提供与羟基末端的共价键，其在85℃下稳定。
在本发明另一方面，所述匹配的无机靶标为：4-羟基苯磺酸钠，对苯二酚、异丁醇、苯酚磺酸和对甲苯磺酰氯，以及聚磷酸和聚乙烯醇的混合物。
在本发明另一方面，苏木素靶标是聚磷酸和聚乙烯醇的二元、三元或更多元梯度密度的混合物，优选地梯度密度包括1至1000：1的逐步稀释增量，更优选地，梯度或系列稀释遵循-20log(稀释度)曲线。说明：-20log(稀释度)与dBd具有相同的含义，将对数曲线变为线性斜率，使稀释和处理反应的影响易于应用，因为它们在靶标的动态范围内成为线性作用。术语-20log(稀释度)和dBd均指在半对数的基础上描述稀释度，以便将数据线性化，以便易于应用修饰性术语。术语(稀释度)是指稀释X，其中X为[1..1000]，等于1：1至1000：1。术语dBd定义为稀释度或稀释强度的分贝。
在本发明另一方面，特异染色靶标包括但不限于：4-羟基苯磺酸钠，对苯二酚，异丁醇，苯酚磺酸，对甲苯磺酰氯，聚磷酸和聚乙烯醇的混合物，以及使用羟基端基与所述玻片的粘合剂涂层共价结合的其他物质。
在本发明的另一方面，H&E靶标可以用于获取伊红Y和苏木素+媒染剂染色剂的状态，以在捕获的数字图像中进行质量控制和色彩校正。
在本发明的另一方面，过程记录玻片包含一批无机靶标，每种所述无机靶标与作为巴氏染色一部分的单一染色剂反应，并共价结合到玻片的粘合剂涂层上。
在附图和以下描述中公开了本发明的其他方面。
附图说明
列出附图的目的是为了进一步理解本发明，并且附图被并入本发明中并构成本发明的一部分，与说明书一起用于解释本发明的原理。在附图中：
图1示出了根据本发明一实施方式的用于H&E染色的过程记录玻片架构。附图显示了带有可选标签的玻片。
图2示出了根据本发明一实施方式的用于H&E染色的过程记录玻片架构。
图2A显示了已制造的H&E玻片。该玻片通过批次号具有最小ID，并在着色的标签区域中具有空白区域。有两个厚的着色长轴条，其延伸超过靶标点的区域。这些条是最近添加，用于解决标签打印机如何从堆叠底部分配玻片。这些条确保了上面堆叠的玻片不会损坏玻片涂层，更重要的是不会损坏石蜡屏蔽涂层以及石蜡下面的靶标点。
图2B显示了应用了患者组织切片的H&E玻片。在这种情况下，有三个连续的复制切片，但这些切片可以间隔得更远，就像在评估皮肤癌切除时所做的那样，特别是在MOHS手术中。灰色的文字只是用来识别石蜡的区域，但在实际的玻片并不存在。
图2C显示了染色后的H&E玻片。靶标和组织切片现在都可见并准备好进行解释。
图3示出了根据本发明一实施方式的在手动涂片模式下用于PAP涂片染色的过程记录玻片架构。
图3A显示出了所制造的PAP-M玻片。PAP-M是手动应用的巴氏涂片的玻片类型标识码。该玻片通过批次号具有最小ID，并在着色的标签区域中具有空白区域。有两个厚的着色长轴条，其延伸超过靶标点的区域。这些条是最近添加，用于解决标签打印机如何从堆叠底部分配玻片。这些条确保了上面堆叠的玻片不会损坏玻片涂层，更重要的是不会损坏石蜡屏蔽涂层以及石蜡下面的靶标点。
图3B显示了具有患者疏松细胞加粘液及碎屑样本的PAP-M玻片。由于细胞基本上是透明的，因此沉积物会在玻片上显示为轻微的透明雾状。
图3C显示了染色后的PAP-M玻片。靶标和人工巴氏涂片现在都可见并准备好进行解释。
图4示出了根据本发明一实施方案的用于PAP涂片染色的过程记录玻片架构，其中样本自动处理去除了粘液和红细胞，并将清洁的样本置于疏水环中。
图4A示出了所制造的PAP-A玻片。PAP-A是自动清洁粘液的巴氏涂片的玻片类型标识码。该玻片通过批次号具有最小ID，并在着色的标签区域中具有空白区域。该玻片包含疏水阻挡环，“清洁的”PAP样本沉积在疏水阻挡环中。阻挡环的功能是保留样本，并防止标签打印机损坏环内的涂层和石蜡覆盖的对照靶标。
图4B显示了PAP-A玻片，PAP-A玻片的疏水阻挡环内有“清洁的”的患者疏松细胞样本。由于细胞基本上是透明的，因此沉积物会在玻片上显示为轻微的透明雾状。
图4C显示了染色后的PAP-A玻片。靶标和阻挡环内的疏松细胞现在都可见并准备好进行解释。
图5显示了石蜡屏蔽涂层如何确保其沉积物边缘的密封。
具体实施方式
通过参考以下结合附图对本发明的详细描述，可以更容易地理解本发明，所述附图构成本发明的一部分。应当理解，本发明不限于本文描述和/或示出的特定装置、方法、条件或参数，并且本文使用的术语仅是示例性的，并不旨在限制所要求保护的发明。同样，如在包括所附权利要求书的说明书中所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数形式，并且对特定数值的引用至少包括该特定值，除非另有明确指示。当在另一个实施例中表达这样的范围时，范围可以从“大约”或“近似”另一个特定值表达。另外，应该理解，除非另有说明，否则本文所述的尺寸和材料特性是作为示例而非限制，并且是为了更好地理解适当实用性的示例实施方式，并且根据特定应用，所述值以外的变化也可以在本发明的范围内。
本发明的应用不限于所述的结构细节和组件的布置。在以下说明书中或在以下说明书示出中或在附图中示出。本发明能够具有其他实施方式并且能够以各种方式被实践或执行。同样，本文中出于描述的目的而使用的措词和术语不应视为限制性的。“包括”、“包含”、“具有”、“由…组成”、“涉及”及其变体以及其他项的使用。
现在将详细参考本发明的优选实施方式，其示例在附图中示出。在可能的情况下，在附图和说明书中使用相同的参考标号指代相同或相似的部件。
为了便于理解本发明，可以参考本发明中使用的一些术语的定义。
“无机靶标”用于表示能够与检测中使用的染色剂结合的靶标或材料。所述染色剂选自由阿尔新蓝(Alcian Blue)、比耳朔夫斯基银染(Bielschowsky silver stain)、俾斯麦(Bismarck)棕、革兰氏染色(Gram Stain)、焦油紫(Cresyl Violet)、丰塔纳马松(Fontana Masson)、戈登-斯威特浸银染(Gordon and Sweet's silver staining)、亮绿SF或固绿FCF、戈塞特六氨银染色法(Grocett'sMethanamine silver method)、霍尔胆红素染色(Hall's Bilirubin stain)、劳克固蓝粘蛋白卡红(Luxol Fast Blue Mucicarmine)、穆勒-莫里胶体铁(Muller-Mowry colloidal Iron)、新亚甲基蓝、核固红、油红O、耐光橙G、带淀粉酶消化的过碘酸雪夫氏(PAS with Diastase Digestion)、过碘酸雪夫氏(PAS)、磷钨酸、天狼星红(Picro Sirius Red)、普鲁士蓝反应(Prussian Blue Reaction)、酸化甲苯胺蓝(Toluidine Blue Acidified)、一步三色戈莫理氏染色(Trichrome-Gomoris One-Step)、马森三色染色(Trichrome-Masson's)、维尔赫夫-范盖森(Verhoff-Van Geison)、钙盐染色(Von Kossa)、魏格特雷琐辛品红(Weigert'sResorcinFuchsin)、萋-尼氏染色(Zell-Neelsen)组成的组。
所述靶标包括但不限于：聚磷酸和聚乙烯醇的混合物、4-羟基苯磺酸钠、对苯二酚、异丁醇、苯酚磺酸、对甲苯磺酰氯，以及使用羟基端基与所述玻片的所述粘合剂涂层共价结合的其他物质。
“无机沉积”是指染色后的染色颗粒累积量。在一些实施方式中，无机沉积物被染色。
“苏木素”或“苏木精”也被称为天然黑，是从洋苏木树(墨水树)的心材中提取的化合物。苏木素和伊红共同组成苏木素和伊红染色剂，这是组织学中最常用的染色剂之一。
在H&E(苏木素和伊红)染色中，“伊红”最常用作苏木素的复染剂。H&E染色是组织学中最常用的技术之一。用苏木素和伊红染色的组织显示细胞质染成粉橙色，细胞核染成深的蓝色或紫色。
苏木素和伊红(H&E)染色用于处理大量生物样本，以支持免疫组化(IHC)处理的第一视图，H&E作为最终结果，或与特异染色剂一起提供最终结果。
“帕帕尼古劳(Papanicolaou)染色”(也称为巴氏染色)是一种多色染色技术，用于各种身体分泌物的细胞病理学评估。最常见的用途是用于妇科涂片(巴氏涂片)。其他应用包括唾液、刷取物、洗涤物、尿、脑脊液、腹腔液、胸膜液、滑液、精液、细针抽吸材料、肿瘤接触样本和其他含有疏松细胞的材料。
根据妇女的年龄，在不同的时间间隔对妇女进行巴氏涂片检测，以进行宫颈癌筛查。在世界大多数地区，50岁以上的女性的发病率逐年上升。在这种情况下，巴氏涂片检测专门用于检测从妇女子宫宫颈口外侧刮出的鳞状细胞，其中外部的宫颈鳞状细胞与内腺宫颈细胞相交，异常生长可能预示着癌前期或宫颈癌。
巴氏涂片检测在所用染色剂的组成和时间、比例和时间上还没有完全完全标准化。巴氏染色涉及将五种染色剂混合成三种溶液。三种溶液为：细胞核染色剂，第一复染剂和第二复染剂。
■细胞核染色剂，是一种媒染的苏木素混合物，用来染色细胞核。
■第一复染剂橙绿(Orange Green)，是磷钨酸和耐光橙G的混合物。
■第二复染剂是伊红天青(Eosin Azure)，它是伊红Y、亮绿SF(或固绿FCF)和俾斯麦棕的混合物。
因此，本发明的目的是提供一种系统，所述系统将共存靶标与组织样本或疏松细胞结合在一起。因此，上述靶标具有以下特性：与玻片的粘合剂共价结合，并将随后共价捕获染色分子的化学分子。
在本发明一个实施方式中，过程记录玻片包含与被染色的生物材料共存的不同无机染色剂特异性靶标的集合。该靶标代表了每种染色剂组分的功效，并用于具有已知老化行为的染色剂的梯度密度阵列。上述靶标只能与其中一种染色剂组分反应。使用生物材料是不切实际的，因为活性位点的浓度不能很好地控制，因此不能重复。
在本发明另一实施方式中，过程记录玻片涂有各种反应性化学试剂来捕获靶标和组织切片或疏松细胞的粘合剂。在为上述特异染色剂开发的靶标溶液中，所有都使用羟基端基来支持与玻片涂层的共价键。最常见的粘合剂涂覆的玻片使用的是大多数显微镜玻片制造商可提供的氨基硅烷涂层。胺端基与羟基将形成共价键，在85℃内仍保持稳定。但是，如果有需要，本发明不限于在靶标上使用其他端基或使用中间耦合剂，以匹配不同的粘合剂玻片涂层化学。
可以参考图1，在过程记录玻片上示出了H&E的实现。图1示出了一实施方式的双重标记配置中的用于H&E玻片的共存靶标的基本架构。
在一实施方式中，过程记录玻片遵循的总体架构为，在标签区域下方标记批次号，并可选地用玻片类型标记玻片的标签。所有到大部分标签区域留给用户应用他们的二维条形码和文本信息。玻片类型为PRS-H&Exx，其中xx定义应用于第二行的“特异染色剂”组。如果不存在xx，则没有第二行靶标。将靶标打印在标签末端附近，以最大化组织切片复制面积。图2A-C示出了IHC玻片的使用顺序。可以看出，标题已被省略，因为它是可选的并能够嵌入批次号中。
在另一实施方式中，玻片的基本版本包含一种靶标系列，该靶序列由伊红Y和苏木素的梯度密度阵列组成，其末端被黑色和白色靶标包围。黑色和白色靶标用于建立数字成像的动态范围。黑色和白色末端靶标能够使用户知道靶标在玻片上的位置，因为其他靶标大部分是清晰的，因此组织切片没有应用在靶标的顶部。这对于将冷冻的组织切片转移到玻片毛坯上具有很大的价值。
现在可以参考图3和图4，其示出了巴氏涂片染色的玻片。
在本发明的一实施方式中，巴氏涂片的过程记录玻片以两种配置实现：手动涂片图3和自动粘液清洗图4。两个版本都有附图。
在另一实施方式中，两种玻片都遵循总体过程记录玻片架构，即在标签区域下方标记批次号，并可选地用玻片类型标记玻片的标签。全部至大部分的标签区域留给用户，以便应用他们的二维条形码和文本信息。
在另一实施方式中，染色试剂靶标分为两组：第一行包含苏木素+媒染剂反应性靶标的梯度密度阵列，其通过黑白参考靶标界定。最下面一行包含俾斯麦棕的单个靶标、两种不同密度的磷钨酸靶标、两种不同密度的绿色染色剂靶标、耐光橙G的单个靶标和伊红Y的单个靶标。患者巴氏涂片应用于玻片上活动区域的中间。自动的胶粘剂-PAP玻片版本使用疏水阻挡环，以防止来自玻片制造商的清洁细胞浆液扩散。涂层的亲水性确保了细胞不会沿着环壁堆积。这些玻片可以支持浸泡浴和毛细管间隙染色处理。
在另一实施方式中，下面将描述每种染色剂以及与疏松细胞和组织切片结合的方式。然后，对将独特地捕获染色剂的化学结构进行描述。
本发明还包括以下实施方式：
1.一种粘合剂涂覆的显微镜玻片，其包含一系列无机靶标，每种无机靶标均与单一染色剂反应并共价结合到粘合剂涂层，其中所述玻片包括：
(a)可选地，标记在标签空间下方的批次号；
(b)用于共存靶标的区域；
(c)用于应用组织切片或疏松细胞的区域；
可选地，根据玻片类型标记或批次号标记，将特异染色剂组应用于玻片。
2.根据实施方式1所述的粘合剂涂覆的玻片，其中，无机靶标选自与特异染色剂发生独特反应，特异染色剂选自阿尔新蓝、比耳朔夫斯基银染、俾斯麦棕、革兰氏染色、焦油紫、丰塔纳马松、戈登-斯威特浸银染、亮绿SF或固绿FCF、戈塞特六氨银染色法、霍尔胆红素染色、劳克固蓝粘蛋白卡红、穆勒-莫里胶态铁、新亚甲基蓝、核固红、油红O、耐光橙G、带淀粉酶消化的过碘酸雪夫氏、过碘酸雪夫氏(PAS)、磷钨酸、天狼星红、普鲁士蓝反应、酸化甲苯胺蓝、一步三色戈莫理氏染色、马森三色染色、维尔赫夫-范盖森、钙盐染色、魏格特雷琐辛品红、萋-尼氏染色。
3.如实施方式1所述的粘合剂涂覆的玻片，其中，在玻片的标签部分上标记的玻片类型可以选择特定的特异染色剂组来处理用于苏木素和伊红、巴氏涂片或尿液染色的生物材料样本。
4.如实施方式1中所述的粘合剂涂覆的玻片，其中，选择共存反应性靶标以独特地结合苏木素、磷钨酸、耐光橙G、伊红Y，亮绿SF或固绿FCF、俾斯麦棕。
5.如实施方式1所述的粘合剂涂覆的玻片，其中，所述共存靶标印刷在标签末端附近，以便将组织切片复制的面积最大化。
6.如实施方式1所述的粘合剂涂覆的玻片，其中，所述粘合剂涂覆的显微镜玻片可以可选地包括亲水性阻挡环，以防止清洁的细胞浆液扩散。
7.如实施方式1所述的粘合剂涂覆的玻片，其中，浸渍和泡以及毛细管间隙染色处理可以由这些玻片支持。
屏蔽涂层
石蜡通常是一种白色或无色的软固体，来源于自石油、煤炭或油页岩，是由含二十至四十个碳原子的烃分子混合组成。它在室温下为固体，大约高于37℃(99°F)时开始熔化；其沸点>370℃(698°F)。石蜡的常见应用包括润滑、电绝缘和蜡烛；染色的石蜡可以制成蜡笔。它不同于煤油和其他有时称为石蜡的石油产品。
在病理实验室中，在对薄组织样本进行切片之前，使用石蜡来浸渍组织。通过提高酒精浓度(75％至绝对浓度)从组织中除去水，并在有机溶剂，诸如二甲苯，或一种脂肪族替代物，诸如混合二甲苯中清除组织。然后将组织放在石蜡中数小时，然后将其放入带有蜡的模具中冷却并固化，再在切片机上切割成片。
将组织切片包埋在石蜡中是用于组织切片长时间保存的常规操作。然而，尚未报道过将石蜡作为薄涂层施加在显微镜玻片的选定区域。
向组织块和从组织块切下的切片注入石蜡，完全替代组织的细胞结构的水分。石蜡固有地不支持细菌和真菌的生长，这确保了包埋生物材料的长期稳定性。
与无机染料的化学结构独特地发生反应的靶标也易于氧化并与空气传播的材料发生反应。此类染料反应物靶标包括苏木素、伊红和大多数特异染料的组。这些染料的靶标被设计为仅与一种染料发生单一反应。大多数情况下，生物学靶标并不能提供这种单一性，但是化学结构可以提供。因此，本发明通过提供一种方法来提供一种解决方案，该方法用于选择性地施加生物材料以及靶标以屏蔽它们免受任何类型的显微镜玻片上的任何类型的降解。
在本发明一实施方式中，将石蜡与溶剂共混，以在室温下将材料状态从固体改变为液体。共混物使用帕拉普拉斯特X-tra(Paraplast X-tra)或与二甲苯或绿色二甲苯相当的替代品：脂肪族溶剂，例如混合二甲苯，以降低粘度并减慢沉积后的固化速度。在另一个实施例中，可以选择不限于甲苯、油漆稀释剂、松节油或丙酮和煤油的50:50混合物的溶剂。
在另一实施方式中，将固体石蜡在高于石蜡熔融温度的不超过75℃的温度下熔融直至液体，然后缓慢加入脂肪族溶剂直至观察到饱和点(形成固体)。使混合物冷却至45℃，然后缓慢添加更多的脂肪族化合物直至完全澄清。
在另一实施方式中，将上述石蜡涂层施加在具有特异染色反应端基的无机靶标上，其独特地捕获与所施加的抗体和二级染色试剂，以及先前施加在粘合剂涂覆的显微镜玻片上的特异染色反应沉积物反应的特异染色材料。
在另一实施方式中，可以将石蜡层沉积在施加有粘合剂的显微镜玻片上，其包括但不限于：喷涂、喷墨沉积、转移印刷(例如移印)、丝网印刷和气相沉积。在所有沉积方法中，石蜡层的厚度都必须小于5μm，以确保在染色过程的石蜡去除步骤中，所有石蜡(屏蔽层和组织切片的包埋)都可以被溶解并带走。与沉积过程/方法无关，石蜡的标准是：
●薄层，优选不厚于5微米，
●熔融温度低于60℃，优选低于56℃，在暴露于二甲苯或二甲苯类(脂肪族替代物)溶剂时溶解，以及，
●具有与包埋石蜡相似的环境温度硬度。
在另一实施方式中，组织块包埋石蜡材料可以包括但不限于，赛默飞世尔(ThermoFisher)的TissuePrep和TissuePrep2，熔点为56℃，徕卡(Leica)的Paraplast和Paraplastplus，熔点为56℃，徕卡(Leica)的Paraplast X-tra，熔点为50-54℃。Paraplast X-tra特别加入了丁基化羟基甲苯，一种酚类抗氧化剂，以减少无机靶标的氧化降解。
在另一实施方式中，每种都是纯化的石蜡、合成聚合物和其他材料的混合物，以确立熔融温度、硬度和粘度。石蜡固有的特性不支持微生物的生长。
在另一实施方式中，特异染色剂可包括但不限于：阿尔新蓝、苯胺蓝-耐光橙G溶液(Analine Blue-Orange G Solution)、偶氮卡红染色(Azan Stain)、比耳朔夫斯基银染、布朗本-革兰氏染色(Brow&Benn-Gramm Stain)、焦油紫、二氨基联苯胺(DAB)、丰塔纳马松、戈登-斯威特浸银、戈塞特六氨银染色法、霍尔胆红素染色法、琼斯六胺银法(JonesMethanamine silver method)、劳克坚牢蓝(Luxol Fast Blue)、劳克坚牢蓝-焦油紫(Luxol Fast Blue-Cresyl Violet)、黏卡红(梅耶法)(Mucicarmine(Mayer's Method))、穆勒-莫里胶体铁、耐光橙G、核固红、带淀粉酶消化的过碘酸雪夫氏、过碘酸雪夫氏(PAS)、磷钨酸、苏木素、天狼星红、酸化甲苯胺蓝、一步三色戈莫理氏染色、马森三色染色、维多利亚蓝(Victoria Blue)、钙盐染色、魏格特雷琐辛品红、魏格特铁苏木素(Weigert's IronHaematoxylin)、萋-尼氏染色法。
在另一实施方式中，靶标可以选择但不限于颜料着色的沉积物，例如黑色和白色，但是可以包括任何颜料颜色。
在另一实施方式中，其上施加上述石蜡涂层的显微镜玻片可以选自但不限于玻璃、塑料或任何聚合物材料。在另一个实施例中，石蜡可以是纯化的并且无水。
在另一实施方式中，所得的显微镜玻片可以被后加热，以将石蜡颗粒熔化和/或共混成整体表面涂层，从而密封沉积物和围绕沉积物的玻片表面。
在另一实施方式中，在沉积石蜡之后，加热所得的显微镜玻片，以迫使溶剂从石蜡中去除，而确保其返回硬化状态。这必须从玻片的石蜡一侧开始，优选使用红外线。从上到下熔化石蜡可确保溶剂能够上升并从石蜡中蒸发而不会有阻碍。结果如图5所示，该图示出了熔化的石蜡如何确保其沉积物边缘的良好密封。
成像参考靶标
除了靶标阵列，还对黑白成像参考靶标进行打印。
包含染色的生物材料的显微镜玻片的数字成像正在发展成对染色材料进行预筛查和可能的全面诊断进行确定。通常，成像系统必须调整照明光水平，以使数字图像在白色或黑色边界处都不会处于压缩状态。常规解决方案是在标签的预期位置放置黑白靶标。基本假设是白色和黑色靶标代表玻片可以呈现的极限。然而，这样做时，数字比例存在压缩，因为黑色比组织切片的染色黑得多，白色白得多。
在本发明一优选实施方式中，公开了一种显微镜玻片，其包含与患者组织切片或疏松细胞沉积物共存的对照和参考靶标标准。参考靶标和组织切片记录了组织捕获和覆盖盖玻片的染色玻片之间的处理经历。
在本发明另一实施方式中，在显微镜玻片靶阵列之间是共存的黑色和白色参考靶标。黑白参考靶标与其他靶标和组织切片经历相同的试剂暴露和处理。
在本发明另一实施方式中，两种参考靶，即黑色和白色靶都是印刷的涂料沉积物，其与用于处理玻片的任何试剂均不反应。理想情况下的白色靶标将是完美的白色。然而，很少有染色的生物材料的有效性从黑色变成白色达到一半以上。因此，白色可以与完美的白色相差5-10％，仍然具有有用的价值。在一个优选的实施方式中，白色是金属氧化物或硫酸盐组合物，当不暴露在阳光下时，其随着时间的推移是稳定的。在一更优选的实施方式中，白色是铝和氧化钛。
在另一实施方式中，黑色和白色靶标均基于酸酐基环氧底漆，其通过在指定365nm的紫外线下，直接曝光来催化。酸酐催化剂由甲基四氢苯酐和二苯基碘鎓六氟砷酸盐组成。除紫外线引发外，酸酐还需要加热以催化环氧树脂交联。列出了首选的紫外线引发酸酐及其伴侣，但是在搜索酸酐生产公司时，还可以找到其他解决方案。尽管可以根据需要构造此类涂料/油墨，但通常根据所使用的印刷方法优化了的已购买的组件。涂料/油墨的制造必须解决在颜料颗粒和环氧粘合剂之间实现良好润湿的难点。酸酐基涂料(当粘度低时也称为油墨)通常将酸酐与环氧树脂混合在一起，因为适用期可能长达数月。降低粘度是印刷行业相关人员的常识，并且配方会根据环氧混合物的表面和所用的印刷方法而变化。虽然通常使用热引发的酸酐-环氧涂料/油墨，但引发反应所需的热量可能会破坏可能与涂料/油墨共存的生物材料(蛋白质、肽和化学靶标)。
在另一实施方式中，酸酐催化剂消除了氨基硅烷基催化剂发现的未反应的胺，否则该胺将支持非特异性染色。游离胺端基可以并且将捕获生物材料和某些特异染色剂。具体地，这解决了玻片处理试剂，特别是染色试剂对白色靶标的不希望的染色问题。作为涂料/油墨表面上的游离胺端基，它可以同时捕获一级抗体和二级染色试剂，并被染色。因此，破坏了在玻片上具有完整白色靶标的价值。
在另一实施方式中，黑色颜料使用小于2微米直径的碳尘，而白色颜料使用铝、氧化钛或硫酸钡珠。硫酸钡是该应用中优选的白色颜料。
在另一实施方式中，优选的环氧油墨/涂料制剂完全避免了表面活性剂，以防止使油墨/涂料对这些玻片可经历的染色和试剂产生反应。
在另一实施方式中，靶标的印刷可以通过印章或注射器来完成。在另一实施方式中，优选注射器，因为它支持更好地控制靶标沉积的特征尺寸。
在另一实施方式中，上述白色靶标由在酸酐催化的环氧树脂中的金属氧化物或硫酸盐颜料组成。在另一实施方式中，上述黑色靶由紫外线引发的酸酐催化的环氧树脂中的碳颜料组成。在另一实施方式中，酸酐催化剂是通过直接紫外线暴露的紫外线引发的。使用紫外线引发的酸酐催化剂的主要优点是引发酸酐-环氧反应所需的热量超过了生物材料(蛋白质、肽和化学靶标)所能承受而不会受到破坏的热量。更重要的是消除可能与染色试剂反应的任意游离胺。
苏木素
苏木素本身不是染料，并且不会与生物材料结合。但是，当与媒染剂、弱酸和其他材料混合时，会形成染料，与靶标位点形成共价键。媒染剂的选择会影响染料所附着的组织元素。对于巴氏涂片，苏木素用于染色细胞核。因此，染色细胞核的媒染剂选择是铝、铁和钨，通常结果是选择铝。如下所示，苏木因是被氧化的苏木素。
Figure BDA0002319662130000141
铝媒染剂对苏木因端基的改性为:
Figure BDA0002319662130000151
苏木因+媒染剂与DNA中磷酸根碱基的结合显示如下：
Figure BDA0002319662130000152
合成的聚磷酸可以取代DNA链形成一个独特的靶标位点，来捕获苏木因+媒染剂染料。然而为了完成配方，需要与染料不反应的类似聚合物，从而可以针对靶标位点的梯度密度阵列调节靶标浓度。聚磷酸盐是弱碱。但是，必须将聚合物转化为聚磷酸，这需要向O-端基捐赠氢原子。这可以使用过氧化氢，HOHO生成H2O作为离去基团来完成。
Figure BDA0002319662130000153
聚磷酸盐+HOHO(过氧化氢)>>
Figure BDA0002319662130000154
聚磷酸
目标是控制聚磷酸位点的密度以形成梯度密度阵列。为了实现这点，聚磷酸必须与另一种羟基聚合物混合，以使两者都能实现与基片粘合剂形成共价键。解决方案是使用聚乙烯醇，PVA或类似聚合物。
为苏木素提供靶标的梯度密度阵列的合理性来自苏木素的有机来源，其包括其他材料和转化为媒染的苏木因染料。影响苏木素靶标和共存组织的颜色和颜色密度的因素如下：
媒染的苏木因染料的浓度随时间变化，特别是如果在浴液中处理。冲洗水的残留物会稀释浴液。如果试剂不保持运动，则浴液将形成梯度密度，当玻片在浴液中越深，梯度密度变得越密集。发生沉淀是因为染料的分子量比组成浴液大部分的水大。
1.将苏木素转化为苏木因的氧化过程随着时间的推移继续无规律发生，导致染料强度降低并且沉淀的染料必须去除。
2.苏木素的氧化能够产生几种氧化的衍生物：一-(mono-)、二-(di-)、三-(Tri-)、五-(penta-)和四-(tetro-)苏木因。每一种铝媒染的苏木因具有不同的颜色：二-和三-是紫色到蓝色，四-是褐色，以及五-是透明。其他媒介剂将以类似的方式改变颜色基础。
3.苏木因储备溶液的有氧氧化也会导致降解。
如果使用不同反应位点密度的靶标系列，苏木因+媒染剂染料的条件和类型更容易识别。梯度系列将从饱和到中点。因此，随着染色剂浓度减弱和/或氧化降解，苏木因饱和靶标将脱离饱和，从而能够评估染料浓度。
磷钨酸
磷钨酸(TPA)是化学式为H3PW12O40的杂多酸。可以将它更好地描述为围绕单个磷酸分子的钨酸笼，如下所示：
Figure BDA0002319662130000161
磷钨酸通过在缬氨酸和亮氨酸氨基酸中出现的一对相邻的CH3端基与生物材料单独结合。磷钨酸通过替换这些材料中的染料的阴离子，从而与纤维蛋白和胶原蛋白结合，使它们选择性脱色。
Figure BDA0002319662130000171
磷钨酸中的两个相邻的钨酸基团与两个CH3端基反应形成：
R’-CH(CH3)2+--W＝O3—O3＝W->>R’-CH[(CH＝W＝O2]2+2H2O
无机靶标变为异丁醇(isobutanol(isobutyl alcohol))HOCH2CH(CH3)2，其中羟基结合至粘合剂涂层。
Figure BDA0002319662130000172
耐光橙G
耐光橙G是一种合成的偶氮染料，通常含有二钠盐。对于巴氏染色，耐光橙G用于染色角蛋白。最初的功能是对痰液中存在的角化鳞状细胞癌的小细胞染色。
Figure BDA0002319662130000173
靶标需要是具有-SO3Na和-OH端基的苯环。这需要通过将4-羟基苯磺酸与NaCl混合构建或以转化形式购买。
Figure BDA0002319662130000181
产物变为：4-羟基苯磺酸钠
当靶标端基R(C6H4)SO4Na与耐光橙G染料上的-RSO4Na反应时，反应变为：
Figure BDA0002319662130000182
除了H为Na之外，所以废料变为Na2SO4，硫酸钠，沉淀为白色粉末。
伊红Y
伊红Y是伊红的一种形式。它通常用作酸性红色染料，以突出显示细胞中的细胞质。在巴氏涂片中，伊红Y染色表面上皮鳞状细胞、核仁、纤毛和红细胞。
伊红Y结合三种已知的端基：
■酚类基团
■羧基基团
■金属氧化物
Figure BDA0002319662130000183
对于我们的应用，重要的是使用与伊红独特反应且没有其他特异染料的靶标。酚类基团是唯一可行的选择。
Figure BDA0002319662130000191
为了与其他巴氏靶标一致，苯酚必须具有相反的羟基端基，如下出现的：
Figure BDA0002319662130000192
(对苯二酚，或1,4-苯二酚，或4-间苯二酚)
亮绿SF或固绿FCF
亮绿SF是绿色的三芳基甲烷染料，而固绿FCF是海绿色的三芳基甲烷染料。该染料染色除角质化鳞状细胞外的其他细胞的细胞质。结构非常相似，允许单个靶标支持两种绿色染料。
Figure BDA0002319662130000193
这两种绿色染色剂都在靶标位点上寻找–R(C6H4)SO3H端基。这是通过苯酚磺酸，HO(C6H4)SO3H实现的。
Figure BDA0002319662130000201
俾斯麦棕
俾斯麦棕是一种重氮染料，用于染色酸性粘蛋白。
Figure BDA0002319662130000202
关键是要偶联到染料的-NH2端基上。解决方案是使用甲苯磺酰偶联反应，其中发生以下情况：
Figure BDA0002319662130000203
解决方案如下：
将对甲苯磺酰基活化剂应用于对甲苯磺酰氯至玻片粘合剂上的羟基端基
R’-C(CH2)2OH+Cl(S＝O2)C6H4CH3>>R’-CH2O(S＝O2)C6H4CH3+HCl
当染色剂的-NH2端基出现时，活化剂被释放并且胺被捕获。
R’-CH2O(S＝O2)C6H4CH3+R”-NH2>>-R’-CH2NH-R”+HO(S＝O2)C6H4CH3。
在一实施方式中，如果选择，第二排染色靶标支持特异的染色剂用法。这些靶标是无机的，独特地靶向特异的染色剂，以及通过共价键捕获特异的染色剂。特异的染色反应性靶标可以选自但不限于阿尔新蓝、比耳朔夫斯基银染、俾斯麦棕、革兰氏染色、焦油紫、丰塔纳马松、戈登-斯威特浸银染、亮绿SF或固绿FCF、戈塞特六氨银染色法、霍尔胆红素染色、劳克固蓝粘蛋白卡红、穆勒-莫里胶体铁、新亚甲基蓝、核固红、油红O、耐光橙G、带淀粉酶消化的过碘酸雪夫氏、过碘酸雪夫氏(PAS)、磷钨酸、天狼星红、普鲁士蓝反应、酸化甲苯胺蓝、一步三色戈莫理氏染色、马森三色染色、维尔赫夫-范盖森、钙盐染色、魏格特雷琐辛品红、萋-尼氏染色。
在另一实施方式中，用粘合剂涂覆的显微镜玻片进行H&E染色的优选的溶液如下：
PRS-H&E的基本版本仅支持H&E目标。这些靶标被设计成与苏木因+媒染剂和伊红Y发生独特地反应。但是，当苏木因的媒染剂是磷钨酸时，单独的磷钨酸需要一种额外的靶标。
苏木因+媒染剂
混合聚磷酸和聚乙烯醇以形成遵循dBd曲线的最少五元素梯度密度阵列。
伊红Y
对苯二酚
这些无机靶标化学物质不是唯一可能的解决方案，但是它们代表了在H&E染色序列中仅与单个染料单独反应的靶标系列的可行性。那些精通化学的人可以开发出替代靶标配方以达到相同的结果，但不会改变本发明的范围或结果。
实施例
实施例1测试每个染色靶标或梯度密度目标组。
制造H&E(图2)、PAP-M(图3)和PAP-A(图4)玻片，它们具有用于苏木素和伊红染色测试的相同靶标顶线。两个巴氏玻片的第二行都包含磷钨酸、耐光橙G、亮绿SF或固绿FCF，以及俾斯麦棕的靶标。可以看出PAP-A包含所有三个玻片的靶标，因此PAP-A玻片可以很好地测试这三种玻片类型的所有元素。根据染色剂表现将测试分为四组。
>测试A：对耐光橙G、亮绿SF或固绿FCF，以及俾斯麦棕的染色存在的二元测试。该测试只是将玻片暴露到所列染色剂之一，以确认正确捕获的靶标被染色，而剩余的靶标没有被染色。
>测试B：伊红Y的基于pH的测试。该测试将伊红Y的pH强制为4.5、5.5和6.5。低和高pH条件都应染色很差，而中等pH值靶标染色正确。
>测试C：苏木素的浓度测试。测试开始于在一27mm的ID罐中的50ml量新鲜配制的浓度。玻片染色并且浓缩液静置30分钟，鼓泡通过液体来强制氧化。测试持续4小时。
>测试D：pH对磷钨酸的影响。当pH从8.5降至7时，染色剂性能会发生变化。
测试A的结果：每种染色剂在高27mm的ID罐中制备50ml量的标准浓度混合物。每种染色剂测试3次以显示复制。所有玻片显示正确的靶标被染色，没有其他靶标也被染色。
测试B的结果：5-玻片存储管中装满购买的随时可以使用的新鲜伊红Y。该容器容纳约20ml试剂。测试是成对进行的：正常和低pH，然后是正常和高pH。根据需要通过用硼水化物和硼酸调节将正常pH设置为4.5。每个测试周期制作三个玻片。正常基线玻片染色后，pH降低至3.5，并对新的玻片染色。正常基线染色后，pH升至5.5，并对新的玻片染色。不出所料，每个玻片的染色密度为1％，随着pH的变化下降了近50％。
测试C的结果：苏木素是作为梅耶尔的苏木精明矾(Mayer’s Hemalum)溶液购买的。靶标开始时全部处于饱和状态，随着时间的推移，梯度刻度显示出试剂的氧化继续。测试加速了降解以显示行为。到4小时后，100％的靶标降低了50％以上。
测试D的结果：将磷钨酸以标准50ml量在高27mm的ID罐中混合，并用HCl调节pH至8.5。玻片染色并将pH降低0.5pH。重复测试循环直到pH为7。不出所料，所有靶标在pH8.5下饱和。当pH降至7时，可以看到梯度密度刻度并且100％的靶标颜色密度损失约30％。

Claims (25)

1.一种玻片，包括：
（a）用于应用包括组织切片或疏松细胞的样本进行染色和随后检测的检测区域；和
（b）施加一种或多种靶标的对照区域，每种所述靶标对单一染色剂具有反应，
其中所述对照区域还包括直接设置在所述玻片上的成像参考加样点，所述成像参考加样点包括黑色参考靶标和白色参考靶标。
2.如权利要求1所述的玻片，其中所述靶标选自与染色剂独特结合，所述染色剂选自由阿尔新蓝、比耳朔夫斯基银染色剂、俾斯麦棕、革兰氏染色剂、焦油紫、丰塔纳马松、戈登-斯威特浸银染色剂、亮绿SF或固绿FCF、戈塞特六氨银染色剂、霍尔胆红素染色剂、劳克固蓝粘蛋白卡红、穆勒-莫里胶态铁、新亚甲基蓝、核固红、油红O、耐光橙G、带淀粉酶消化的过碘酸雪夫氏、过碘酸雪夫氏、磷钨酸、天狼星红、普鲁士蓝反应染色剂、酸化甲苯胺蓝、一步三色戈莫理氏染色剂、马森三色染色剂、维尔赫夫-范盖森、钙盐染色剂、魏格特雷琐辛品红、或萋-尼氏染色剂组成的组。
3.如权利要求1或2所述的玻片，其中所述靶标包括聚磷酸和聚乙烯醇的混合物、4-羟基苯磺酸钠、对苯二酚、异丁醇、苯酚磺酸或对甲苯磺酰氯。
4.如权利要求1所述的玻片，包括两种或多种靶标的至少一种阵列，每种所述靶标与作为苏木素-伊红染色一部分的单一染色剂反应。
5.如权利要求4所述的玻片，其中所述苏木素-伊红染色为两种或多种聚磷酸和聚乙烯醇的梯度密度混合物。
6.如权利要求1所述的玻片，其中，所述玻片包括两种或多种靶标的至少一种阵列，每种所述靶标与作为巴氏涂片染色一部分的单一染色剂反应。
7.如权利要求6所述的玻片，其中作为巴氏涂片染色一部分的所述染色剂包括：耐光橙G、磷钨酸、亮绿SF、固绿FCF或俾斯麦棕。
8.如权利要求6所述的玻片，其中与作为巴氏涂片染色一部分的染色剂结合的所述靶标包括：4-羟基苯磺酸钠、异丁醇、苯酚磺酸或对甲苯磺酰氯。
9.如权利要求1所述的玻片，其中，所述玻片涂覆有粘合剂，所述粘合剂使所述玻片与所述靶标结合，所述粘合剂共价连接至玻璃并与反应性端基共形，所述反应性端基选自由氨基、酰胺基、羧基或羟基组成的组。
10.如权利要求1所述的玻片，其中所述黑色参考靶标选自碳尘；和
所述白色参考靶标选自氧化钛、氧化铝、硫酸铝或硫酸钡。
11.如权利要求1所述的玻片，其中所述玻片包括在所述玻片上的标签空间下方施加的批次号。
12.如权利要求1所述的玻片，其中所述玻片包括标记标签，所述标记标签施加在所述玻片的所述标签空间内。
13.如权利要求1所述的玻片，其中所述玻片包括亲水阻挡环，以防止清洁的细胞浆液扩散。
14.如权利要求1所述的玻片，其中所述玻片支持浸泡浴和毛细管间隙染色处理。
15.如权利要求1所述的玻片，其中所述玻片进一步覆盖有用于在所述玻片上的所述靶标的石蜡涂层，石蜡屏蔽涂层通过以下步骤覆盖在显微镜玻片上：
（a）在60-75°C的温度范围熔化固体石蜡，直至所述固体石蜡为液体石蜡；
（b）向步骤（a）得到的所述液体石蜡中加入溶剂，直至获得饱和混合物；
（c）使步骤（b）获得的饱和混合物在30-33°C之间的温度冷却，然后缓慢加入溶剂直至获得基本澄清的石蜡液体；
（d）将步骤（c）得到的所述澄清的石蜡液体的层施加至所述显微镜玻片的所述靶标上，以在所述显微镜玻片上形成所述石蜡屏蔽涂层；
（e）施加红外线加热，以从所述石蜡屏蔽涂层中蒸发溶剂，从而使其恢复至其硬化和固态。
16.如权利要求15所述的玻片，其中所述固体石蜡是纯化的并且无水。
17.如权利要求15所述的玻片，其中所述固体石蜡的熔融温度为50-60°C。
18.如权利要求15所述的玻片，其中所述固体石蜡选自具有56°C熔融温度的赛默飞世尔的TissuePrep、具有56°C熔融温度的赛默飞世尔的TissuePrep 2、具有56°C熔融温度的徕卡的Paraplast、具有56°C熔融温度的徕卡的Paraplast plus、或具有50-54°C熔融温度的徕卡的Paraplast X-tra。
19.如权利要求15所述的玻片，其中所述溶剂选自二甲苯、脂肪族二甲苯替代物、甲苯、涂料稀释剂、松节油，或丙酮和煤油的50:50混合物，或所列溶剂的混合物。
20.如权利要求15所述的玻片，其中步骤（d）的所述层的厚度为1至5微米。
21.如权利要求15所述的玻片，其中，所述石蜡屏蔽涂层用于保护所述显微镜玻片上的所述靶标免受氧化或微生物侵袭，以及无机物免受与引起氧化或空气传播的酸碱材料的反应；或者所述石蜡屏蔽涂层用于增加所述显微镜玻片上所述无机靶标或所述无机沉积物的保存期限。
22.如权利要求1所述玻片的染色方法，包括如下步骤：
b.将样本施加到玻片的组织切片或疏松细胞的区域，其中所述样本为组织切片或疏松细胞；
c.将一种或多种染色剂施加到所述样本以及能够与所述染色剂结合的靶标上；
d.基于靶标梯度定量地确定染色的组织或细胞的颜色密度，和基于所述靶标的染色结果评估所述组织或细胞的染色过程；
如果将石蜡涂层选择性地施加到玻片上的所述靶标，并且所述组织切片/疏松细胞也包埋在石蜡中，则在步骤b之前执行以下步骤：
a.从石蜡包埋的所述组织切片或疏松细胞中去除石蜡，并在所述靶标上覆盖石蜡屏蔽涂层；
步骤a中所述去除石蜡是通过以下步骤进行：在65-75°C之间的温度范围下加热所述石蜡3-10分钟以获得半液态，然后用有机溶剂液化，直到在缓冲溶液中再水化；
所述有机溶剂选自二甲苯、混合二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇或50%乙醇，每个暴露时间为3分钟；
其中所述靶标包括聚磷酸和聚乙烯醇的混合物和对苯二酚，所述靶标与用于苏木素-伊红染色的染色剂结合；和
用于巴氏涂片染色的染色剂包括：耐光橙G、磷钨酸、亮绿SF、固绿FCF或俾斯麦棕，与用于巴氏涂片染色的染色剂结合的所述靶标包括：4-羟基苯磺酸钠，异丁醇，苯酚磺酸或对甲苯磺酰氯。
23.如权利要求22所述的染色方法，其中所述染色为苏木素-伊红染色、巴氏涂片染色或两者。
24.如权利要求22所述的染色方法，其中在所述玻片上，结合用于巴氏涂片染色的染色剂的靶标与结合用于苏木素-伊红染色的染色剂的靶标共存。
25.一种试剂盒，包括如权利要求1-21任一项所述的玻片，或执行权利要求22-24任一项所述的染色方法。
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