CN114441265B - 一种细胞蜡块的制备方法及其在甲状腺穿刺涂片中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞蜡块的制备方法及其在甲状腺穿刺涂片中的应用，步骤如下：在室温下将涂片放入二甲苯中洗去封片胶；将涂片放入碱性溶液进行染料脱色；用切片刀刮取涂片表面组织，再用75%酒精冲洗刮取组织进入离心管内，离心，弃上清液，用3mL一次性塑料滴管将OTC胶注入离心管，吹打混匀后吸取样本、倒置滴管放入离心管，离心，在冰冻切片机‑30℃下冷冻10min，剖开滴管，剥离冷冻细胞块，滤纸包裹后装入包埋盒，放入全自动组织脱水机，设置程序并启动，包埋成细胞蜡块。该方法操作简便、收集效率高、组织损耗小、细胞块处理时间充分。
Description
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及一种细胞蜡块的制备方法及其在甲状腺穿刺涂片中的应用。
背景技术
目前文献中已报道的二次细胞学收集方法共有两种：一是“普通细胞收集法”；二是“离心管浸蜡收集法”。
“普通细胞收集法”的步骤为：1.70℃烤片机中烤片5min；2.分别在两缸二甲苯中洗胶各10min；3.无水乙醇清洗二甲苯10min；4.将涂片浸泡至95％酒精中防止干片，用切片刀逐一刮取涂片表面的组织，用75％酒精冲洗刮取组织进入离心管；5.配平，3000r/min，离心10min；6.弃上清液，用小挖勺将管底组织挖出，滤纸包裹后放入包埋盒，将包埋盒放入全自动组织脱水机，设置程序并启动；7.包埋成细胞蜡块。该方法的缺点：a.离心后细胞沉淀物较松散，从离心管中取出时无法避免组织的损耗，并且损耗较多(肉眼可见)；b.70℃烤片机中烤片5min，烤片温度过高，影响细胞块后续的免疫组化及分子检测结果；c.细胞穿刺涂片经过苏木素-伊红染色，没有进行碱性溶液脱色就直接收集细胞并制作细胞蜡块，会影响后续免疫组化及分子检测。
“离心管浸蜡收集法”的步骤为：1.70℃烤片机中烤片5min；2.分别在两缸二甲苯中洗胶各10min；3.无水乙醇清洗二甲苯10min；4.将涂片浸泡至95％酒精中防止干片，用切片刀逐一刮取涂片表面的组织，用75％酒精冲洗刮取组织进入离心管；5.配平，3000r/min，离心10min；6.弃上清液，缓慢滴入5mL的4％中性缓冲甲醛溶液固定10min后离心(重复2次)；7.弃上清液，加入95％酒精5mL离心(重复2次)；8.弃上清液，加入5mL无水乙醇离心(重复2次)；9.弃上清液，加入5mL二甲苯离心(重复2次)；10.弃上清液，加入融化石蜡液，置于温箱浸蜡10min后离心；11.放入冰箱冷冻10min；12.从离心管中将凝固的石蜡及细胞块一并取出，切下细胞块包埋成细胞蜡块。该方法的缺点有以下几点：a.70℃烤片机中烤片5min，烤片温度过高，影响细胞块后续的免疫组化及分子检测结果；b.细胞穿刺涂片经过苏木素-伊红染色，没有进行碱性溶液脱色就直接收集细胞并制作细胞蜡块，会影响后续免疫组化及分子检测；c.没有充分利用全自动组织脱水机的智能化优势，完全纯手工操作步骤繁琐，且浸蜡需要在温箱中进行，受条件限制也较多；d.由于石蜡凝固后，将细胞沉淀物固化为细胞块，杜绝了普通方法中细胞沉淀物松散不易收集的缺点，很大程度上降低了组织的损耗，但是细胞块从离心管中取出环节受技术人员操作技巧及熟练性影响较大，不能保证每次都能达到同样的效果；e.组织固定、脱水、透明、浸蜡均在离心管内完成，每步时间都明显短于全自动脱水机中，尤其是固定时间不足就进入较高温度的石蜡融液浸蜡，导致细胞蜡块在后续免疫组化及基因检测时受到较大程度的影响。
因此，需要重新发现一种新的二次细胞学的收集方法，能够既避免了组织损耗问题，又能简化操作步骤，最重要的是不影响组织进行后续的免疫组化及分子检测。
另外，甲状腺细针穿刺过程中应该避免使用过强的冲击力，但临床工作中穿刺医生为了提高细胞获取量，常常采用反复冲击穿刺的方法，反复冲击穿刺的外力使得获取的细胞数量明显增多，且组织片段更大，但同时会伴有大量的出血，很多组织片段混杂其中，由于出血很多，当血液凝固时便进一步遮挡了组织片段。与此同时，血凝块的收缩也使得更多混杂其中的上皮细胞和组织片段被聚拢，出现更多的重叠、拥挤，甚至合体细胞团及梁状结构，由于遮挡严重，使得病理医生无法识别甲状腺乳头状癌细胞核的特点：核沟、核内假包涵体及核膜不规则等；由于血凝块收缩造成的上皮细胞和组织片段的重叠、拥挤、合体细胞团及梁状结构等假象，使得病理医生往往将良性滤泡性病变过诊断为甲状腺滤泡性肿瘤。为了很好的利用这些有价值的细胞和组织片段，只有通过二次细胞收集制作成细胞蜡块，并进一步通过免疫组化及基因检测，才能得到精确的诊断结论，使患者得到精准及时的治疗。
发明内容
解决的技术问题：针对现有技术存在的缺点，本发明提供一种细胞蜡块的制备方法及其在甲状腺穿刺涂片中的应用，该方法操作简便、收集效率高、组织损耗小、细胞块处理时间充分，更有利于后续制作成的细胞蜡块进行免疫组化及分子检测，是一种良好的细胞学收集方法。
技术方案：一种细胞蜡块的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、封片胶的清洗：在室温下将经过环保封片胶封片的细胞涂片放入二甲苯中浸泡洗胶5min，接着用无水乙醇清洗二甲苯10min；
步骤二、染料的脱色：将步骤一清洗后的涂片依次放入0.01％氢氧化钠、0.5％氨水、饱和碳酸氢钠水溶液及无水乙醇中各3min进行脱色，直至肉眼观察涂片无明显着色，然后分别用自来水、蒸溜水各冲洗一次；
步骤三、细胞蜡块的制备：将步骤二脱色后的涂片浸泡至95％酒精中，用切片刀刮取涂片表面的组织，再用75％酒精冲洗刮取组织进入离心管，离心管内共有样本液30mL，将该离心管放入离心机，配平后在转速3000r/min下离心10min，弃上清液，用3mL一次性塑料滴管将OTC胶注入离心管，吹打混匀后吸取样本、倒置滴管后放入离心管内，在转速为2000r/min下离心5min，接着将离心管放入冰冻切片机中，在-30℃下冷冻10min，立即剖开滴管，剥离冷冻细胞块，滤纸包裹后装入包埋盒，放入全自动组织脱水机，设置程序并启动，包埋成细胞蜡块。
上述所述的步骤三中的配平方法是另取一支同样规格的离心管，注入75％酒精溶液30ml，将两支离心管对称放置入离心机即可。
上述所述的步骤三中全自动组织脱水机的程序设置为：(1)4％中性缓冲甲醛溶液两道各45min，35℃；(2)95％酒精三道各1h，35℃；(3)无水乙醇三道各1h，35℃；(4)二甲苯两道，第一道20min，第二道30min，35℃；(5)石蜡四道，第一道、第二道各45min，第三道、第四道各1h，63℃。
上述所述的一种细胞蜡块的制备方法在甲状腺穿刺血性涂片的二次细胞学收集中的应用。
有益效果：本发明提供的一种细胞蜡块的制备方法及其在甲状腺穿刺涂片中的应用，具有以下有益效果：
1.本发明的步骤简单、耗时短，仅比“普通收集法”多了滴管离心和快速冷冻的步骤，且这两个步骤总耗时约15min，但由于该方法选择不经70℃高温烤片直接在常温下进行二甲苯洗胶，共节省15min，因此总耗时并无增加，而且不经70℃高温烤片避免了组织与切片粘附过紧密，使组织更易刮除，节省时间的同时还有效避免了组织损耗；
2.本发明同时充分利用了全自动组织脱水机智能化的优势，很大程度节省了人力和时间成本；
3.本发明利用OCT胶的粘附性以及冰冻凝固后常温下不易快速解冻的特点，同时又利用一次性塑料滴管作为离心载体，滴管壁薄、光滑，能在极短时间内剖开并彻底剥离冷冻细胞块，明显降低了细胞的损耗，操作简单，重复性好；
4.本发明的组织固定、脱水、透明、浸蜡均在全自动组织脱水机中进行，组织每一步的处理时间得到了充分保障，并且经OTC胶包埋的组织经冰冻切片机速冻后不会影响后续免疫组化及分子检测结果，因此本发明的方法制作出的细胞蜡块在后续免疫组化及基因检测时得出的结果可靠性强；
5.本发明的一个离心管可加3支滴管，每支滴管分别加入一例不同的样本，这样检测效率可提升至以往收集方法的3倍。
附图说明
图1为实施例1制备得到的组织切片的显微镜观察图。其中图A为甲状腺滤泡结构；图B为平铺的正常甲状腺滤泡上皮细胞；图C为甲状腺乳头状癌的乳头结构；图D为清晰的毛玻璃核及核沟。
具体实施方式
为使本发明的目的、内容和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步描述。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等效形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
以下实施例所使用的仪器有：离心机(规格型号：SC-3612低速离心机Low speedcentrifuge；厂家：科大创新股份有限公司中佳分公司USTC Chuangxin Co.,Ltd.ZonkiaBranch)、冰冻切片机(规格型号：CryoStar NX50；厂家：Thermo Shandon Limited)、全自动组织脱水机(规格型号：6032:Tissue Tek-VIP6(Model VIP6-E2)；厂家：Sakura SeikiCo.,Ltd.)、包埋机(规格型号：TEC5 EM JC-2；厂家：Sakura Seiki Co.,Ltd.)。
试剂有：环保封片胶(厂家：无锡市江原实业技贸有限公司)、二甲苯(厂家：镇江久亿化学试剂有限公司)、4％中性缓冲甲醛溶液(厂家：上海久亿化学试剂有限公司)、无水乙醇(厂家：上海久亿化学试剂有限公司)、氢氧化钠(厂家：上海久亿化学试剂有限公司)、氨水(厂家：上海久亿化学试剂有限公司)、碳酸氢钠水溶液(厂家：上海久亿化学试剂有限公司)、蒸溜水(厂家：上海久亿化学试剂有限公司)、95％酒精(用无水乙醇配制而成)、75％酒精(用无水乙醇配制而成)、OTC胶(厂家：Thermo Shandon Limited)。
实施例1
该实施例提供了甲状腺细针穿刺细胞涂片的制备方法和利用本发明的制备方法进行甲状腺细针穿刺涂片的二次细胞收集和细胞蜡块的制作，具体步骤如下：
一、甲状腺细针穿刺细胞涂片的制备
1.B超医生进行甲状腺结节的位置定位及大小测量；
2.局部消毒、铺巾，2％利多卡因局麻；
3.使用23G细胞学活检针，超声引导下行甲状腺结节穿刺活检术，共活检4针，涂片12张，并将涂片放入95％乙醇中固定，送病理科检查；
4.局部压迫止血，手术过程顺利，患者无不适反应，术后超声扫查未见出血征象；
5.病理科技师对甲状腺穿刺涂片进行苏木素-伊红染色；
6.用环保封片胶对涂片进行封片。
二、甲状腺细针穿刺涂片的二次细胞收集及细胞蜡块制备
1.室温下，首先将经过环保封片胶封片的12张甲状腺穿刺涂片分别放入两缸二甲苯中浸泡洗胶各5min；
2.再将经二甲苯洗去环保封片胶的甲状腺穿刺涂片放入一缸无水乙醇中清洗二甲苯10min；
3.由于甲状腺穿刺涂片是经过苏木素和伊红染色的，所以要将12张涂片分别放入0.01％氢氧化钠、0.5％氨水、饱和碳酸氢钠水溶液及无水乙醇进行涂片脱色，每种溶液各一缸共四缸，室温条件下将所有涂片依次放入以上四缸溶液中进行处理，每缸处理3min，处理完毕后肉眼观察涂片无明显着色，然后分别用自来水、蒸溜水各冲洗一次；
4.将涂片浸泡至95％酒精中防止干片，用切片刀逐一刮取涂片表面的组织，用75％酒精冲洗刮取组织进入离心管；
5.离心管中有样本及75％酒精溶液共30mL，另取一支同样规格的离心管，其中注入75％酒精溶液30mL，将两支离心管对称放置入离心机中，完成配平后在转速3000r/min下离心10min；
6.弃上清液，用3mL一次性塑料滴管吸取少量OTC胶后注入离心管内，用同一滴管吹打混匀后吸取样本、倒置滴管、放入离心管内离心(2000r/min，离心5min)，每个离心管最多可放入3支滴管；
7.将离心管置于冰冻切片机速冻台快速冷冻(-30℃冷冻10min)；
8.迅速剖开滴管，剥离冷冻细胞块，滤纸包裹后装入包埋盒，放入全自动组织脱水机，设置程序并启动：(1)4％中性缓冲甲醛溶液两道各45min，35℃；(2)95％酒精三道各1h，35℃；(3)无水乙醇三道各1h，35℃；(4)二甲苯两道，第一道20min，第二道30min，35℃；(5)石蜡四道，第一道、第二道各45min，第三道、第四道各1h，63℃。
9.最后，将12张涂片上的组织全部包埋制作成一个细胞蜡块，并制作成一张组织切片；
10.显微镜下观察如图1所示。
其中图A为甲状腺滤泡结构；图B为平铺的正常甲状腺滤泡上皮细胞；图C为甲状腺乳头状癌的乳头结构；图D为清晰的毛玻璃核及核沟。
上述实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。以上所述仅为本发明较佳可行的实施例而已，并非因此局限本发明的权利范围，凡运用本发明说明书内容所作的等效结构变化，均包含于本发明的权利范围之内。
Claims (4)
1.一种细胞蜡块的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、封片胶的清洗：在室温下将经过环保封片胶封片的细胞涂片放入二甲苯中浸泡洗胶5min，接着用无水乙醇清洗二甲苯10min；
步骤二、染料的脱色：将步骤一清洗后的涂片依次放入0.01%氢氧化钠、0.5%氨水、饱和碳酸氢钠水溶液及无水乙醇中各3min进行脱色，直至肉眼观察涂片无明显着色，然后分别用自来水、蒸馏水各冲洗一次；
步骤三、细胞蜡块的制备：将步骤二脱色后的涂片浸泡至95%酒精中，用切片刀刮取涂片表面的组织，再用75%酒精冲洗刮取组织进入离心管，离心管内共有样本液30mL，将该离心管放入离心机，配平后在转速3000r/min下离心10min，弃上清液，用3mL一次性塑料滴管将OTC胶注入离心管，吹打混匀后吸取样本、倒置滴管后放入离心管内，在转速为2000r/min下离心5min，接着将离心管放入冰冻切片机中，在-30℃下冷冻10min，立即剖开滴管，剥离冷冻细胞块，滤纸包裹后装入包埋盒，放入全自动组织脱水机，设置程序并启动，包埋成细胞蜡块。
2.根据权利要求1所述的一种细胞蜡块的制备方法，其特征在于：所述步骤三中的配平方法是另取一支同样规格的离心管，注入75%酒精溶液30mL，将两支离心管对称放置入离心机即可。
3.根据权利要求1所述的一种细胞蜡块的制备方法，其特征在于：所述步骤三中全自动组织脱水机的程序设置为：（1）4%中性缓冲甲醛溶液两道各45min，35℃；（2）95%酒精三道各1h，35℃；（3）无水乙醇三道各1h，35℃；（4）二甲苯两道，第一道20min，第二道30min，35℃；（5）石蜡四道，第一道、第二道各45min，第三道、第四道各1h，63℃。
4.如权利要求1所述的一种细胞蜡块的制备方法在甲状腺穿刺血性涂片的二次细胞学收集中的应用。
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