CN107976353B - 作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法，其包括如下步骤：选材；微波固定；染色；微波脱水；微波透明；微波浸蜡；包埋；修块；粘固；切片、展片和烤片；脱蜡；封片和干固；其中，所述微波固定的步骤具体包括如下操作：将植物组织置于固定液中，在75℃下水浴的同时进行解冻档条件下的微波处理，3min后，更换至少两次固定液，每次更换后均在75℃下水浴的同时进行解冻档条件下的微波处理2min。本发明具有如下的有益效果：本发明实现了快速石蜡切片的制作。传统石蜡切片方法完整切片的制作需要约6～7天，而本发明所需时间为3天，在保证制片效果的基础上节约了时间。

Description

作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法

技术领域

本发明涉及一种作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法，属于植物样本组织石蜡切片技术领域。

背景技术

石蜡切片技术是显微技术上最重要、最常用的方法之一，起始于18世纪，1869年为Klebs所引用。此法是将材料包埋在石蜡中，然后连同石蜡在切片机上一同进行切片，所以称为石蜡切片法。最初的石蜡切片法，切片材料仅仅是为石蜡所包围，并非为石蜡所渗透。直到1882年Bourne发表一篇关于石蜡包埋技术的报告之后，石蜡包埋法才被广泛地采用，在植物细胞、组织研究史上发挥了重要作用，并且在今后仍将作为一项常规技术而发挥作用。

传统石蜡切片方法包括取材、固定(用时12～24h)、脱水(共9个步骤，耗时11h)、透明(共4个步骤，耗时4～16h)、浸蜡(16～24h)、包埋、修块、切片、展片、烤片、脱蜡(50min)、复水、染色、脱水、透明(共22个步骤，耗时3.5～14h)、封片、干固。传统石蜡切片法步骤繁琐，若中间有一步不慎出错都会影响制片效果；制片周期长，制片效率低。另外传统石蜡切片用二甲苯、丙酮等有机试剂较多，严重危害了制片者的身体健康。

近年来，关于石蜡切片制作方法的改进已有很多研究。周东华介绍了一种微波水浴辐射快速石蜡切片法，在术中病理诊断取得满意的效果。魏欣悦等人用微波快速石蜡切片法观察水稻叶片组织，结果表明该方法可以大幅缩短处理时间，提高工作效率。姜福建等人对植物组织石蜡切片包埋、修蜡过程进行改进，不仅提高了工作效率，而且修出的蜡块工整一致，同时对后面的切片过程无任何影响。但针对作物幼嫩根系快速石蜡切片法尚少。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法，其包括如下步骤：

选材；

微波固定；

染色；

微波脱水；

微波透明；

微波浸蜡；

包埋；

修块；

粘固；

切片、展片和烤片；

脱蜡；

封片和干固；

其中，所述微波固定的步骤具体包括如下操作：

将植物组织置于固定液中，在75℃下水浴的同时进行解冻档条件下的微波处理，3min后，更换至少两次固定液，每次更换后均在75℃下水浴的同时进行解冻档条件下的微波处理2min。

作为优选方案，所述染色的步骤具体包括如下操作：

用番红溶液染色后，分别依次用不同体积浓度的乙醇溶液进行脱色，再用固绿溶液复染。

作为优选方案，所述番红溶液的质量分数为1％，所述固绿溶液的质量分数为0.5％。

作为优选方案，所述微波脱水的步骤具体包括如下操作：

用乙醇水溶液在75℃的水浴的同时，在解冻档条件下进行微波处理。

作为优选方案，所述微波透明的步骤具体包括如下操作：

先用乙醇和叔丁醇的混合液在75℃下水浴的同时，进行解冻档条件下的微波处理，再用叔丁醇在75℃下水浴的同时，进行解冻档条件下的微波处理。

作为优选方案，所述微波浸蜡的步骤具体包括如下操作：

用叔丁醇和石蜡的混合液在75℃下水浴的同时，进行解冻档条件下的微波处理后，用石蜡在75℃下水浴的同时，进行解冻档条件下的微波处理。

作为优选方案，所述脱蜡的步骤具体包括如下操作：

将脱蜡切片经脱蜡剂在室温或40℃下进行脱蜡。

作为优选方案，所述脱蜡剂为脂肪族碳氢化合物和精油的混合物，如海德创业(北京)生物技术有限公司生产的、货号为64111的脱蜡剂。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、实现了快速石蜡切片的制作，制作时间仅需3天，在保证制片效果的基础上节约了时间；

2、将染色步骤提前，为以下操作步骤提供方便，由于作物的幼嫩根系一般呈现白色，和石蜡的颜色接近，提前染色避免包埋和切片时找不到植物组织带来的麻烦；

3、脱蜡过程采用脱蜡剂，代替了二甲苯等有毒试剂，更加安全；

4、可以广泛用于作物幼嫩根系石蜡切片的快速制作，为作物根系生长、发育、病理等研究中组织切片的制作提供技术支持。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例涉及一种作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法，具体包括如下步骤：

S1、选材：

1、材料的选择

根据制片目的决定。根据目的，按根系的生长特性及生长发育阶段的特性定期取样，如主根、侧根发育、毛丝体分化观察等，需要根据根生育特征在不同生育时期定期、连续取样；选取有代表性的根材料(除病理取样外，一般需求新鲜、健壮、正常)，能代表某一类根系的结构；取样环境一致且具有典型性。

2、材料的切取

作物的幼嫩根，在不同的切面细胞形状、排列、结构均存在差异，在制片时，必须准确切取观察部位。在取材时，材料要冲洗干净，并在切割过程中保持湿润(如可用毛笔等蘸水湿润)，切割时均匀用力，避免拉切造成组织伤害。

对于根的切取，要根据观察内容确定横切还是纵切。在进行根形态结构(初生结构、次生结构)、发育特性时，根据观察结构选择适当的切面进行制片，防止制片后观察不到预定结构或观察效果差的发生，而且根材料一般需要切成三个切面进行观察，才能全面地了解到它的立体结构而取得完整的概念。根的直径5mm以内的，可切取5～10mm长小段。

(1)横切：切面与根轴垂直，形成根的横切面。

(2)纵切：有两种：茎向切面(也叫半径切面，是以刀通过茎或者根的中心点与其半径吻合的切面。这种切面可以观察到各种组织纵向排列的情况)、切向切面(也叫切线切面，是以刀沿茎或根的圆周切线面，与半径成直角的切面。

S2、微波固定：

固定方法：将样品片段放入10mL小玻璃瓶中，加入约4mL的FAA固定液(甲醛∶冰乙酸∶50％乙醇＝1∶1∶18)，确保样品完全浸没在固定液中，放入盛有100mL水的500mL玻璃烧杯中(液面高度不超过小玻璃瓶高度)，再使用微波炉解冻档(本发明微波处理试剂操作时均使用解冻档，水浴温度均为75℃)对样品进行微波处理，同时维持玻璃烧杯中水浴的温度为75℃，微波3min后，将玻璃瓶取出，更换固定液，再微波2min，重复上述微波操作2次。

S3、染色：

染色在室温环境下进行。将固定好的组织放入50v/v％乙醇中2min，之后用吸管将乙醇吸净，加入1％番红溶液染色10～12小时。之后依次用50v/v％、70v/v％、85v/v％、95v/v％乙醇溶液脱色1～2min，再用0.5％固绿溶液复染50s(固绿复染时间要严格控制，时间太短，材料会呈现紫色，造成分色效果不佳；时间过长又会将红色全部褪去)。

S4、微波脱水：复染后的组织用95v/v％乙醇室温脱色1～2min，然后用60v/v％乙醇水浴微波50s。

S5、微波透明：用吸管吸净乙醇，加入等体积100％乙醇和叔丁醇水浴微波2min，然后换100％叔丁醇水浴微波7～8min，水浴温度保持75℃。

S6、微波浸蜡：透明完成后，用吸管吸净叔丁醇。加入等体积叔丁醇和石蜡水浴微波2min，然后换纯石蜡微波7～8min，水浴温度保持75℃。

S7、包埋：

材料经浸蜡以后即可进行包埋。在包埋前应先准备好道具，如镊子、解剖针、酒精灯、包埋盒、生物组织包埋机、生物组织包埋冷冻机等。

包埋时将包埋盒放在温台上，使温台保持高于石蜡熔点的温度。然后将材料连同石蜡迅速倒入包埋盒内，若石蜡不够可再加入融化的石蜡。用镊子或解剖刀在酒精灯上烧热后伸进石蜡中，迅速而轻轻地把材料按所需的切面摆好位置，材料与材料之间要有一定的间隔并排列整齐。若蜡中有气泡，可用烧热的解剖刀把气泡烫去。材料安置妥当后，将包埋盒放到包埋冷冻机上，经5～6min后，盒中的石蜡凝结成不透明状态时，即成为蜡块。

S8、修块：

用小刀或解剖刀在所要切取的材料四周逐渐刻划成适当的直线沟(1～2mm)，刀口不宜过深，四周要平行，然后两手轻轻地将蜡块掰开。如果不宜掰开，再用小刀沿原划沟处深划，决不可用力硬掰，否则容易损坏材料或使石蜡块内部碎裂而无法切片。把切下的蜡块修成梯形的六面体(有材料的一面较小，相对固着的一面应较大些，这样固着较牢固)。将组织块以外的多余石蜡切去，但注意不要太接近组织，让组织四周留有1-2mm的石蜡。

S9、粘固：

包埋有材料的蜡块，必须粘固在载物器上方可切片。在载物器有纹沟的一面融化上石蜡，再把修好的蜡块固着的一面，用烤热的解剖刀烫熔化，并迅速粘固在载蜡器上，蜡块的四周在用些碎蜡烫牢。放到冷冻台上使其迅速凝固。粘牢凝固后用刀片再整修好四周，准备切片。

S10、切片、展片、烤片：

用切片机连续切片，切片厚度8μm，将蜡带光滑的一面朝下放入40℃左右的温水中展平蜡带，用干净的载玻片挑起放于48℃的烤片机上烤片24h；

S11脱蜡：

切片经脱蜡剂室温脱蜡30～40min后，蜡基本脱净。如放在40℃左右温箱中，脱蜡则只需3-5min即可溶净石蜡。

S12封片、干固：

把切片从脱蜡剂取出，在脱蜡剂挥发完之前迅速用加拿大中性树胶封片，制成永久切片。切忌不能乱动盖玻片。贴上标签，平放在玻片板上，在50℃左右温箱中烤干固即可观察。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一种作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，选材；

步骤S2，微波固定；

步骤S3，染色；

步骤S4，微波脱水；

步骤S5，微波透明；

步骤S6，微波浸蜡；

步骤S7，包埋；

步骤S8，修块；

步骤S9，粘固；

步骤S10，切片、展片和烤片；

步骤S11，脱蜡；

步骤S12，封片和干固；

其中，所述步骤S2中微波固定的步骤具体包括如下操作：将植物组织置于固定液中，在75℃下水浴的同时进行解冻档条件下的微波处理，3min后，更换至少两次固定液，每次更换后均在75℃下水浴的同时进行解冻档条件下的微波处理2min；

所述步骤S3中染色步骤具体包括如下操作：将固定好的组织放入50v/v％乙醇中2min，之后用吸管将乙醇吸净，加入1％番红溶液染色10～12小时，之后依次用50v/v％、70v/v％、85v/v％、95v/v％乙醇溶液脱色1～2min，再用0.5％固绿溶液复染50s；

所述步骤S4中微波脱水步骤具体包括如下操作：复染后的组织用95v/v％乙醇室温脱色1～2min，然后用60v/v％乙醇水浴微波50s，所述用60v/v％乙醇水浴微波50s是指用60v/v％乙醇在75℃的水浴的同时，在解冻档条件下进行微波处理；

所述作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法的上述步骤S1-S12依次进行。

2.如权利要求1所述的作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述微波透明的步骤具体包括如下操作：先用乙醇和叔丁醇的混合液在75℃下水浴的同时，进行解冻档条件下的微波处理，再用叔丁醇在75℃下水浴的同时，进行解冻档条件下的微波处理。

3.如权利要求1所述的作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述微波浸蜡的步骤具体包括如下操作：用叔丁醇和石蜡的混合液在75℃下水浴的同时，进行解冻档条件下的微波处理后，用石蜡在75℃下水浴的同时，进行解冻档条件下的微波处理。

4.如权利要求1所述的作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述脱蜡的步骤具体包括如下操作：将脱蜡切片经脱蜡剂在室温或40℃下进行脱蜡。

5.如权利要求4所述作物幼嫩根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述脱蜡剂为脂肪族碳氢化合物和精油的混合物。