CN104849110A - 一种植物组织的石蜡切片方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物领域，特别涉及一种植物组织的石蜡切片方法。本方法中采用荞麦果皮经过温水浸泡后，果皮组织中含有20％～40％水分，然后采用石蜡包裹含水的组织的“含水式”包埋法，通过“含水式”包埋的方法可以替代常规石蜡切片的脱水、透明、浸蜡等步骤，同时在展片时用解剖针剥去石蜡替代脱蜡步骤，大大减少了切片过程的时间和操作。该方法切出10～16μm厚度的荞麦果皮组织切片，组织完整、各部位显示清晰，明显增强切片和观察效果。

Description

一种植物组织的石蜡切片方法

技术领域

本发明涉及植物领域，特别涉及一种植物组织的石蜡切片方法。

背景技术

石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法，主要用于观察细胞组织的形态，制成的装片经过封片后可制成永久装片，并长期保存。

常规的石蜡切片制作程序包括固定、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片染色等步骤，涉及到的程序和环节繁多，周期长。并且不同组织材料所用的试剂、浓度、时间各不相同，并且制作过程中容易出现切片弯曲、组织破碎等问题，造成制片失败。

造成制片的失败的原因可以追溯到石蜡切片制作过程中的许多不足，包括脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡及封片等等，如脱水不彻底，则会造成透明不彻底，从而使得石蜡浸入组织不够充分，导致组织变形、切片失败等，所以整个石蜡切片制作过程需要大量的时间摸索处理时间、试剂条件、处理方式等。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有的石蜡切片方法中存在的上述问题和荞麦果皮材料特点，提供一种新型荞麦果皮切片方法，通过“含水式”包埋的方法可以替代常规石蜡切片的脱水、透明、浸蜡等步骤，同时在展片时用解剖针剥去石蜡替代脱蜡步骤，大大减少了切片过程的时间和操作。该方法切出10～16μm厚度的荞麦果皮组织切片，组织完整、各部位显示清晰，明显增强切片和观察效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种植物组织的石蜡切片方法，包括如下步骤：

步骤1：获得具有缺口、除去多余部位的目的植物组织；

步骤2：取所述目的植物组织浸泡，获得含水率为20％～40％的含水植物组织；

步骤3：将所述含水植物组织多余水分吸干，获得待包埋植物组织，经包埋、切片、展片、分蜡、染色、封片。

本发明中所述含水率指绝对含水率(果皮中水分的质量/果皮干重*100)。

在本发明的一些具体实施方案中，所述植物组织为荞麦果皮。

在本发明的一些具体实施方案中，石蜡切片方法步骤1所述缺口的切割方式为在所述植物组织距顶部和/或底部1/4～2/5处环形横切。

在本发明的一些具体实施方案中，石蜡切片方法步骤2所述浸泡采用65～70℃的水浸泡所述目的植物组织5～10min。

在本发明的一些具体实施方案中，石蜡切片方法步骤3所述包埋为将盛有60～65℃的石蜡的包埋底模置于0℃冰浴15～25s后将所述待包埋植物组织的缺口朝上，转移、浸入到盛有融化的石蜡的包埋底模，在所述包埋底模上架好包埋框，加入融化的石蜡以浸没包埋框底部。

在本发明的一些具体实施方案中，石蜡切片方法步骤3所述融化的石蜡为60～65℃的石蜡。

在本发明的一些具体实施方案中，石蜡切片方法步骤3所述切片获得的组织切片的厚度为10～16μm。

在本发明的一些具体实施方案中，石蜡切片方法步骤3所述展片是将所述组织切片在45～50℃的水中展片；所述分蜡为将所述组织切片中待包埋植物组织四周的石蜡分离。

在本发明的一些具体实施方案中，石蜡切片方法步骤3所述染色为番红～固绿染色，具体为：将展片、分蜡后的组织切片置于滴有一滴番红的凹形载玻片中染色15～20min，置于水中洗涤20～30min，每隔5min震荡一次，直至无红色染液从组织中渗出，然后依次浸入50％、75％、85％的乙醇中，各2min；

按照番红的染色方式，对番红染色后的组织切片进行固绿染色，时间10s，置于无水乙醇中10min，二甲苯10min。

在本发明的一些具体实施方案中，石蜡切片方法所述封片具体为吸取一滴二甲苯于载玻片中央，将染色后的切片置于二甲苯中，展开，弃去多余的二甲苯，滴加一滴中性树胶，用载玻片进行封片。

具体的，本发明提供的植物组织石蜡切片方法包括以下步骤：

(1)利用双面刀片采用横切的方式，横切区域为种子最宽处与种脐之间部分；

(2)将(1)步骤中得到的果皮置于温水中浸泡；

步骤(2)中的温水是指温度为65～70℃的纯净水，浸泡时间至为5～10min；

(3)用滤纸吸干(2)中浸泡过后的果皮表面以及内侧的水分，然后快速转移、浸入到装有融化的石蜡的金属包埋底模中，然后在包埋底模上架好包埋框，再次加入适当融化的石蜡；在步骤(3)中所涉及到的包埋方式为，将果皮切口朝上，缓慢浸入到包埋底模中，底模中预先装满60～65℃的石蜡，并在冰上放置15～25s后，再将果皮浸入其中；

(4)切片，展片，染色

将剥去石蜡后的组织切片置于滴有一滴番红的凹形载玻片中染色15～20min，然后置于纯净水中洗涤20～30min，每隔5min震荡一次，直至无红色染液从组织中渗出，然后依次浸入50％、75％、85％的乙醇中，各2min，参照本方法中番红的染色方式，对组织切片进行固绿染色，时间10s，然后置于无水乙醇中10min，二甲苯10min；

(5)封片

吸取一滴二甲苯于载玻片中央，将组织切片置于二甲苯中，用解剖针缓慢将其展开，用一次性吸管吸去多余的二甲苯，滴加中性树胶，用载玻片进行封片。

本发明与常规石蜡切片方法过程对比，见表1。

表1 本发明提供的石蜡切片方法与常规石蜡切片方法过程对比

本方法中采用荞麦果皮经过温水浸泡后，果皮组织中含有20％～40％水分，然后采用石蜡包裹含水的组织的“含水式”包埋法，通过“含水式”包埋的方法可以替代常规石蜡切片的脱水、透明、浸蜡等步骤，同时在展片时用解剖针剥去石蜡替代脱蜡步骤，大大减少了切片过程的时间和操作。该方法切出10～16μm厚度的荞麦果皮组织切片，组织完整、各部位显示清晰，明显增强切片和观察效果。

本发明具有以下突出优点：

1)本发明采用了“含水式”包埋法替代了传统石蜡切片操作中的固定、脱水、透明、浸蜡程序，缩短试验时间，大大提高制作效率。减少各种试剂的使用，节约成本，并可减少废液对环境、操作人员的伤害。

2)采用“含水式”包埋法，将经过温水浸泡、软化后的果皮在含20～40％水分的条件下用石蜡进行包埋，使果皮中的水分不易散失，保持组织软化，降低切片难度。并且由于组织含水的缘故，使石蜡不易浸入到组织中本身的细胞结构中，从而优化了脱蜡步骤，直接采用剥蜡的方式进行脱蜡。

3)通过采用本发明所述的方法，能够切出10～16μm厚度的荞麦果皮组织切片，组织完整、各部位显示清晰，明显增强切片和观察效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1本发明提供的植物组织石蜡切片方法获得的切片效果图；

图2示实施例2本发明提供的植物组织石蜡切片方法获得的切片效果图；

图3示对比例1常规石蜡切片操作获得的切片效果图；

图4示对比例2采用的纵切方式；

图5示对比例3采用15～35℃水浸泡植物组织获得的切片效果图；

图6示对比例4采用含水率为60％～80％的植物组织获得的切片效果图。

具体实施方式

本发明公开了一种植物组织的石蜡切片方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的植物组织的石蜡切片方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1)取成熟荞麦种子，利用双面刀片采用横切的方式，按照附图4虚线A或B处进行切割，除去胚和胚乳。

2)浸泡：将荞麦种子果皮置于65～70℃的温水中浸泡5～10min；

3)含水式包埋：用滤纸快速吸干浸泡过后的果皮表面以及内侧的水分，使果皮含水率保持在20％～40％之间，然后快速转移、将果皮切口朝上，缓慢浸入到装有60～65℃石蜡的金属包埋底模中；其中，底模中预先装满的石蜡，并在冰上放置15～25s后，再将果皮浸入其中然后在包埋底模上架好包埋框，再次加入适当融化的石蜡；

4)切片：采用普通生物切片机切片，切片厚度10～16μm；

5)展片、分蜡：将切出的组织切片置于40～45℃的温水中展片，并同时利用解剖针进行分蜡，将组织切片与周围石蜡分离；

6)染色：将剥去石蜡后的组织切片置于滴有一滴番红的凹形载玻片中染色15～20min，然后置于纯净水中洗涤20～30min，每隔5min震荡一次，直至无红色染液从组织中渗出，然后依次浸入50％、75％、85％的乙醇中，各2min，参照本方法中番红的染色方式，对组织切片进行固绿染色，时间10s，然后置于无水乙醇中10min，二甲苯10min；

7)封片：吸取一滴二甲苯于载玻片中央，将组织切片置于二甲苯中，用解剖针缓慢将其展开，用一次性吸管吸去多余的二甲苯，滴加中性树胶，用载玻片进行封片。(得到的切片效果如图1，d＝12μm)。

实施例2

1)～5)如实施例1中所描述

6)组织切片不经过番红和固绿染色，依次浸入50％、75％、85％的乙醇中，各2min，然后置于无水乙醇中10min，二甲苯10min；

7)如实施例1中所描述。(得到的切片效果如图2，d＝12μm)

对比例1(常规石蜡切片操作)

1)取成熟荞麦种子，利用双面刀片采用纵切，将种子切成两部分，除去胚和胚乳；

2)固定：采用卡洛固定液(醋酸：无水乙醇＝1:3)固定24h；

3)脱水：采用逐级脱水法，具体为60％乙醇2h→70％乙醇2h→80％乙醇2h→85％乙醇2h→90％乙醇2h→95％乙醇2h→100％乙醇2h→100％乙醇2h；

4)透明：采用逐级透明法，具体为无水乙醇：二甲苯(1:3)2h→无水乙醇：二甲苯(1:1)2h→无水乙醇：二甲苯(3:1)2h→纯二甲苯2h→纯二甲苯2h；

5)浸蜡和包埋：浸蜡采用52～54℃的石蜡，采用二甲苯：石蜡为1:2和2:1的比例，于50℃的恒温箱中过渡浸蜡，每级12h，最后换成纯石蜡于60℃恒温箱中浸蜡4h，中间换一次纯蜡，然后将组织置于盛有石蜡的包埋盒中，进行包埋；

6)切片：采用普通生物切片机切片，切片厚度30～35μm

7)展片：置于45℃温水中展片；

8)贴片：用鸡蛋清作为粘片剂，在载玻片上均匀涂抹，从温水中捞起切片；

9)烤片：于40℃恒温干燥箱中烤片24h；

10)脱蜡复水：具体过程为40℃二甲苯30s(第一次)→40℃二甲苯30s(第二次)→无水乙醇：二甲苯(1:2)2min→无水乙醇：二甲苯(1:1)2min→无水乙醇1min(第一次)→无水乙醇1min(第二次)→95％乙醇1min→90％乙醇1min→80％乙醇1min→70％乙醇1min→50％乙醇1min；

11)染色：具体程序为1％番红染液(水溶)1h→60％乙醇2min→70％乙醇2min→80％乙醇2min→85％乙醇2min→90％乙醇2min→95％乙醇2min→1％固绿染液(95％乙醇溶解)10s→95％乙醇1min(第一次)→95％乙醇1min(第二次)→100％乙醇1min(第一次)→100％乙醇2min(第二次)→无水乙醇：二甲苯(1:1)2min→纯二甲苯3min→纯二甲苯5min；

12)封片：以中性树胶进行封片(切片效果见图3，d＝24μm)

对比例2

1)取成熟荞麦种子，利用双面刀片采用纵切(与图4虚线呈垂直方式)的方式，沿果脐和萌发孔中轴线将种子切开，除去胚和胚乳。

2)～7)如实施例1中描述

最后组织严重变形，已经失去正常的组织轮廓。

对比例3

1)如实施例1中所描述

2)浸泡：将荞麦种子果皮置于15～35℃的水中浸泡5～10min；

3)～7)如实施例1中所描述。

最后切片效果：切片厚度增加(图5，d＝20μm)。

对比例4

1)～2)如实施例1中所描述

3)含水式包埋：用滤纸吸去浸泡过后的果皮表面以及内侧的水分，使果皮水分保持在60％～80％之间，然后快速转移、将果皮切口朝上，缓慢浸入到装有60～65℃石蜡的金属包埋底模中；其中，底模中预先装满的石蜡，并在冰上放置15～25s后，再将果皮浸入其中然后在包埋底模上架好包埋框，再次加入融化的石蜡至浸没包埋框底部。

4)～7)如实施例1中所描述

最终效果：石蜡无法将果皮包裹和固定，导致无法切片(图6)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种植物组织的石蜡切片方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：获得具有缺口、除去多余部位的目的植物组织；

步骤2：取所述目的植物组织浸泡，获得含水率为20％～40％的含水植物组织；

步骤3：将所述含水植物组织多余水分吸干，获得待包埋植物组织，经包埋、切片、展片、分蜡、染色、封片。

2.根据权利要求1所述的石蜡切片方法，其特征在于，所述植物组织为荞麦果皮。

3.根据权利要求1或2所述的石蜡切片方法，其特征在于，步骤1所述缺口的切割方式为在所述植物组织距顶部和/或底部1/4～2/5处环形横切。

4.根据权利要求1至3任一项所述的石蜡切片方法，其特征在于，步骤2所述浸泡采用65～70℃的水浸泡所述目的植物组织5～10min。

5.根据权利要求1至4任一项所述的石蜡切片方法，其特征在于，步骤3所述包埋为将盛有60～65℃的石蜡的包埋底模置于0℃冰浴15～25s后将所述待包埋植物组织的缺口朝上，转移、浸入到盛有融化的石蜡的包埋底模，在所述包埋底模上架好包埋框，加入融化的石蜡以浸没包埋框底部。

6.根据权利要求5所述的石蜡切片方法，其特征在于，步骤3所述融化的石蜡为60～65℃的石蜡。

7.根据权利要求1至6任一项所述的石蜡切片方法，其特征在于，步骤3所述切片获得的组织切片的厚度为10～16μm。

8.根据权利要求1至7任一项所述的石蜡切片方法，其特征在于，步骤3所述展片是将所述组织切片在45～50℃的水中展片；所述分蜡为将所述组织切片中待包埋植物组织四周的石蜡分离。

9.根据权利要求1至8任一项所述的石蜡切片方法，其特征在于，步骤3所述染色为番红～固绿染色，具体为：将展片、分蜡后的组织切片置于滴有一滴番红的凹形载玻片中染色15～20min，置于水中洗涤20～30min，每隔5min震荡一次，直至无红色染液从组织中渗出，然后依次浸入50％、75％、85％的乙醇中，各2min；

按照番红的染色方式，对番红染色后的组织切片进行固绿染色，时间10s，置于无水乙醇中10min，二甲苯10min。

10.根据权利要求1至9任一项所述的石蜡切片方法，其特征在于，所述封片具体为吸取一滴二甲苯于载玻片中央，将染色后的切片置于二甲苯中，展开，弃去多余的二甲苯，滴加一滴中性树胶，用载玻片进行封片。