CN105136546B - 一种红叶植物防止叶片花色苷流失的石蜡切片方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种红叶植物防止叶片花色苷流失的石蜡切片方法，包括如下步骤：第一步：准备原料：采集富含花色苷的植物新鲜叶片作为材料；第二步：材料干燥：将采集叶片放置在干燥器中干燥24小时以上；第三步：浸蜡：将干燥后的叶片裁成方块，放入60‑70℃的石蜡中，维持0.1‑0.15个大气压，处理时间在6个小时以上；第四步：包埋；第五步：切片；第六步：粘片与脱蜡；第七步：封片。本发明在制片的过程中没有使用乙醇、丙酮、甲醛及水等极性溶剂，较好的保存了花色苷在细胞中的位置及含量，将切片的整个过程由原来的102小时缩短至现在的30小时，工作量不足原来的1/3。

Description

一种红叶植物防止叶片花色苷流失的石蜡切片方法

技术领域

本发明涉及植物叶片切片标本制作方法，特别涉及一种红叶植物防止叶片花色苷流失的石蜡切片方法。

背景技术

显微观测是了解植物内部特征的主要途径，其主要方法是植物制片。常用的植物制片方法有徒手切片、冰冻切片和石蜡切片。徒手切片法的特点是简便快捷，要求设备简单，不经过化学药物的处理，基本上保留了植物组织的自然色泽和活体结构，但切片较厚，很难切到非常薄的切片。石蜡切片法是用石蜡作为包埋剂的一种显微制片方法，是显微技术中最重要的方法之一。它的优点是能够切出薄而均匀的连续切片，便于器官的三维重构。但是步骤繁琐，耗时较长，包含取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片与粘片、脱蜡、染色、封片。冰冻切片的特点是简便、快速、用时短，可以不需要对组织进行固定、脱水、透明、包埋等步骤即可进行切片，减少了一些中间环节，能很好保存脂肪、类脂、及各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。但是不容易制作较薄的切片，切取的组织不能过大，组织块在冻结过程中容易产生冰晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。

红叶植物是叶片呈现显著紫红色的植物统称，其呈色物质主要是花色苷，其易溶于水、乙醇及丙酮等溶剂。不同红叶植物呈色组织不同，在研究中常需进行显色组织定位，进而了解其在细胞内生成及运输过程。而在进行切片的过程中，徒手切片法和冰冻切片法难以切到足够薄的切片以观察到理想的组织结构，而石蜡切片法在固定、脱水等必要环节需使用乙醇和甲醛等溶液，会造成花色苷流失，无法进行显色组织定位观测。因此，传统的制片方法均无法有效的实现细胞内花色苷形成与积累过程的动态观测。

发明内容

有鉴于此，本发明在于提供一种避免水、乙醇、丙酮及甲醛等溶剂使用的红叶植物防止叶片花色苷流失的石蜡切片方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种红叶植物防止叶片花色苷流失的石蜡切片方法，包括如下步骤：

第一步、准备原料：采集富含花色苷的植物新鲜叶片作为材料；

第二步、材料干燥：将采集叶片放置在干燥器中干燥24小时以上；

第三步、浸蜡：将干燥后的叶片裁成方块，放入60-70℃的石蜡中，维持0.1-0.15个大气压，处理时间在6个小时以上；

第四步、包埋；

第五步、切片；

第六步、粘片与脱蜡；

第七步、封片。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的第二步中的干燥时间为24-36h。本发明的中的干燥实在室温下进行的，一般根据室温的高低决定干燥时间。选择24-36h，是在室温25-35℃做出的最优选择，干燥时间不长，可以保证干燥合适，植物叶片脱水合适，最大限度的保护植物组织不发生大的变形。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的第三步、浸蜡：将干燥后的叶片放入65℃的石蜡中，维持0.1个大气压，处理时间6-8个小时

进一步，本发明的一种优选方案：所述的第四步、包埋：将浸蜡后的溶解的石蜡倒入小正长方体的包埋盒中，再将经石蜡浸透的叶片放入盒中，调整叶片的位置，并迅速放入8-15℃冷水中使之快速冷却。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的第五步、切片：将包埋好的蜡块经分割、修整、固着，后经旋转切片机切成8~10µm厚的蜡带。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的第六步、粘片与脱蜡；将分割成小段的蜡带放在涂有柴油的载玻片上使蜡片展平，并在叶片位置滴上柴油，3分钟后使用滤纸吸收，重复操作，直至石蜡全部去除。

进一步，本发明的一种优选方案：所述的第七步、封片：将封藏剂均匀、布满在叶片上，然后轻轻盖上干净的盖玻片。

本发明的有益效果是：

1、本发明在制片的过程中没有使用乙醇、丙酮、甲醛及水等极性溶剂，较好的保存了花色苷在细胞中的位置及含量。

2、通过本发明的实施，可以切出8~10um的叶片组织切片，有利于进行显微观测。

3、本发明简化了普通石蜡切片的步骤，降低了实验人员的工作强度，缩短了实验时间，将切片的整个过程由原来的102小时缩短至现在的30小时，工作量不足原来的1/3。

4、本发明操作方法简便、规范，生产过程中使用对人体无害的有机溶剂，对保证实验室人员健康有积极意义。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将通过实施例对本发明的技术方案进行简单地介绍，显而易见地，下面描述中的实施例仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施例。

实施例1

第一步、材料采集：采集‘红叶’杜仲（Eucommia ulmoides‘Hongye’）新鲜叶片作为材料；

第二步、材料干燥：将采集叶片在干燥器中放置24小时；

第三步、浸蜡：将干燥后的叶片和液态石蜡放入小锥形瓶中，置于65℃的水浴锅内，使用真空泵抽维持0.1个大气压6个小时。

第四步、包埋：将浸蜡后的溶解的石蜡倒入体积为2cm×2cm×1cm的小正长方体的包埋盒中，再将经石蜡浸透的叶片放入盒中，调整叶片的位置，并迅速放入8℃冷水中使之快速冷却；

第五步、切片：将包埋好的蜡块经分割、修整、固着，后经旋转切片机切成8~10µm厚的蜡带。

第六步、粘片与脱蜡：将切下的蜡片放在涂有柴油的载玻片上使蜡片展平，在材料位置滴上柴油，3分钟后使用滤纸吸收，重复操作，直至石蜡全部去除。

第七步、封片：将封藏剂均匀地布满在叶片上，然后轻轻盖上干净的盖玻片。

实施例2

第一步、材料采集：采集紫叶碧桃（Amygdalus persica L.var. persica f.atropurpurea Schneid.）新鲜叶片作为材料。

第二步、材料干燥：将采集叶片在干燥器中放置36小时；

第三步、浸蜡：将干燥后的叶片和液态石蜡放入小锥形瓶中，置于70℃的水浴锅内，使用真空泵抽维持0.15个大气压7个小时。

第四步、包埋：将浸蜡后的溶解的石蜡倒入体积为2cm×2cm×1cm的小正长方体的包埋盒中，再将经石蜡浸透的叶片放入盒中，调整叶片的位置，并迅速放入10℃冷水中使之快速冷却；

第五步、切片：将包埋好的蜡块经分割、修整、固着，后经旋转切片机切成8~10µm厚的蜡带。

第六步、粘片与脱蜡：将切下的蜡片放在涂有柴油的载玻片上使蜡片展平，在材料位置滴上柴油，3分钟后使用滤纸吸收，重复操作，直至石蜡全部去除。

第七步、封片：将封藏剂均匀地布满在叶片上，然后轻轻盖上干净的盖玻片。

实施例3

第一步、材料采集：采集红叶石楠（Photiniaxfraseri）刚展开的红色叶片作为材料。

第二步、材料干燥：将采集叶片在干燥器中放置30小时；

第三步、浸蜡：将干燥后的叶片和液态石蜡放入小锥形瓶中，置于60℃的水浴锅内，使用真空泵抽维持0.12个大气压8个小时。

第四步、包埋：将浸蜡后的溶解的石蜡倒入体积为2cm×2cm×1cm的小正长方体的包埋盒中，再将经石蜡浸透的叶片放入盒中，调整叶片的位置，并迅速放入15℃冷水中使之快速冷却；

第五步、切片：将包埋好的蜡块经分割、修整、固着，后经旋转切片机切成8~10µm厚的蜡带。

第六步、粘片与脱蜡：将切下的蜡片放在涂有柴油的载玻片上使蜡片展平，在材料位置滴上柴油，3分钟后使用滤纸吸收，重复操作，直至石蜡全部去除。

第七步、封片：将封藏剂均匀地布满在叶片上，然后轻轻盖上干净的盖玻片。

实施例4

第一步、材料采集：采集月季（Photiniaxfraseri）刚展开的红色叶片作为材料；

第二步、材料干燥：将采集叶片在干燥器中放置24小时；

第三步、浸蜡：将干燥后的叶片和液态石蜡放入小锥形瓶中，置于60℃的水浴锅内，使用真空泵抽维持0.10个大气压8个小时。

第四步、包埋：将浸蜡后的溶解的石蜡倒入体积为2cm×2cm×1cm的小正长方体的包埋盒中，再将经石蜡浸透的叶片放入盒中，调整叶片的位置，并迅速放入10℃冷水中使之快速冷却；

第五步、切片：将包埋好的蜡块经分割、修整、固着，后经旋转切片机切成8~10µm厚的蜡带。

第六步、粘片与脱蜡：将切下的蜡片放在涂有柴油的载玻片上使蜡片展平，在材料位置滴上柴油，3分钟后使用滤纸吸收，重复操作，直至石蜡全部去除。

第七步、封片：将封藏剂均匀地布满在叶片上，然后轻轻盖上干净的盖玻片。

对比例1

第一步、材料采集：采集‘红叶’杜仲（Eucommia ulmoides‘Hongye’）新鲜叶片作为材料。

第二步、固定：用70% FAA固定液（70%酒精：甲醛：冰乙酸=16:1:1），置于4℃固定24h。

第三步、脱水：将固定液倒去，加入50%乙醇，室温静置30 min；重复一次，室温静置20 min。换成1%番红溶液 (用70%酒精配制)，室温脱水染色过夜。次日继续脱水，酒精浓度梯度和时间依次为： 80% 乙醇1h、95% 乙醇 1h、无水乙醇1h、40min（2次）。

第四步、透明：1/2无水乙醇+二甲苯混合液1h，纯二甲苯1h、40 min（2次）。最后加入少量二甲苯（浸没材料即可）和碎蜡，放入38℃温箱中过夜。

第五步、浸蜡：将温箱温度调至56℃，计时1h；换成二级蜡1h；三级蜡（3次）各1h、1h、40min（从温度上升到56℃开始计时）。

第六步、包埋：将带有材料的液体蜡倒入叠好的纸槽中，迅速放入冰水中使蜡凝固，防止气泡产生，以及凝蜡不匀。

第七步、切片：修整蜡块，用切片机切片，厚度5-10 μm。

第八步、贴片: 在载玻片上涂少许粘片剂，将切好的蜡带放入温水中，捞至载玻片上，最后置于37℃恒温箱过夜烤片。

第九步、 脱蜡及染色：番红-固绿对染，脱蜡：二甲苯60min，二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5min、1%番红室温过夜。

ⅱ染色： 80%乙醇5 min，1%固绿（95%酒精配制）迅速蘸一下，大约10s，直接放到95%乙醇5min 、无水乙醇5min、无水乙醇5min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5min、二甲苯5 min（2次）。

第十步、封片：从二甲苯中取出后，立即在载玻片上滴一滴中性树胶，盖上盖玻片，放至37℃恒温箱中烤片。

对比例2

与对比例1的方法一样，不同点在于材料选择采集紫叶碧桃（Amygdalus persicaL.var. persica f. atropurpurea Schneid.）新鲜叶片。

对比例3

与对比例1的方法一样，不同点在于，采集红叶石楠（Photiniaxfraseri）刚展开的红色叶片作为材料，固定采用用50% FAA固定液（50%酒精：甲醛：冰乙酸=16:1:1）。

对比例4

与对比例1的方法一样，不同点在于，采集月季（Photiniaxfraseri）刚展开的红色叶片作为材料，固定采用用50% FAA固定液。

实施例和对比例所制备的切片用显微镜观察，具体结果见表1。

表1实施例和对比例的实验结果

	对比例1-4	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
						操作步骤	取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、染色、封片	取材、干燥、浸蜡、包埋、切片、粘片与脱蜡、封片	取材、干燥、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、封片	取材、干燥、浸蜡、包埋、切片、粘片与脱蜡、封片	取材、干燥、浸蜡、包埋、切片、粘片与脱蜡、封片
所用时间	102小时	30小时	43小时	38小时	32小时
						叶绿素	无	有	有	有	有
花色苷	无	有	有	有	有
						组织呈色特点	无	栅栏组织为红色，海绵组织为绿色	上下表皮为紫红色，叶肉为绿色；叶脉表皮紫红色，输导组织无色。	上下表皮无色，栅栏组织和海绵组织为红色。	上下表皮无色，栅栏组织和海绵组织为红色。
组织形态清晰度	清晰	清晰	清晰	清晰	清晰

由表1可知，本发明简化了普通石蜡切片的步骤，降低了实验人员的工作强度，缩短了实验时间，将切片的整个过程由原来的102小时缩短至现在的30小时，工作量不足原来的1/3。并且本发明的方法较好的保存了花色苷在细胞中的位置及含量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种红叶植物防止叶片花色苷流失的石蜡切片方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步、准备原料：采集富含花色苷的植物新鲜叶片作为材料；

第二步、材料干燥：将采集植物新鲜叶片放置在干燥器中干燥24-36h；

第三步、浸蜡：将干燥后的叶片裁成方块，放入65℃的石蜡中，维持0.1个大气压，处理时间在6-8小时；

第四步、包埋；

第五步、切片；

第六步、粘片与脱蜡；

第七步、封片。

2.根据权利要求1所述的一种红叶植物防止叶片花色苷流失的石蜡切片方法，其特征在于，所述的第四步包埋：将浸蜡后的溶解的石蜡倒入小正长方体的包埋盒中，再将经石蜡浸透的叶片放入盒中，调整叶片的位置，并迅速放入8-15℃冷水中使之快速冷却。

3.根据权利要求1所述的一种红叶植物防止叶片花色苷流失的石蜡切片方法，其特征在于，所述的第五步切片：将包埋好的蜡块经分割、修整、固着，后经旋转切片机切成8~10µm厚的蜡带。

4.根据权利要求1所述的一种红叶植物防止叶片花色苷流失的石蜡切片方法，其特征在于，所述的第六步粘片与脱蜡：将分割成小段的蜡带放在涂有柴油的载玻片上使蜡片展平，并在叶片位置滴上柴油，3分钟后使用滤纸吸收，重复操作，直至石蜡全部去除。

5.根据权利要求1所述的一种红叶植物防止叶片花色苷流失的石蜡切片方法，其特征在于，所述的第七步封片：将封藏剂均匀地布满在叶片上，然后轻轻盖上干净的盖玻片。