CN105716926B

CN105716926B - 一种扁桃花药细胞纤维骨架的染色方法

Info

Publication number: CN105716926B
Application number: CN201410715798.8A
Authority: CN
Inventors: 李疆; 李鹏; 罗淑萍
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2014-12-02
Filing date: 2014-12-02
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2034-12-02
Also published as: CN105716926A

Abstract

本专利发明了一种扁桃花药细胞纤维骨架的染色方法，其特征是用提前2天配制好的考马斯亮蓝G‑250染液对常规石蜡切片法处理好的扁桃花药切片进行染色，显微镜下观察扁桃花药发育过程中裂口组织细胞变化、纤维骨架结构和细胞壁生长变化，可用于研究扁桃花药裂口组织程序性死亡、花药开裂过程和花期低温对扁桃花药发育的影响。

Description

一种扁桃花药细胞纤维骨架的染色方法

技术领域

本专利发明了一种扁桃花药细胞纤维骨架的染色方法，用提前2天配制好的考马斯亮蓝G-250染液对常规石蜡切片法处理好的扁桃花药切片进行染色，显微镜下观察扁桃花药发育过程中裂口组织细胞变化、纤维骨架结构和细胞壁生长变化，可用于研究扁桃花药裂口组织程序性死亡、花药开裂过程和花期低温对扁桃花药发育的影响。

背景技术

扁桃营养价值丰富，是我国维吾尔民族人民的优良保健干果之一，除含有丰富的植物蛋白外还含有不饱和脂肪酸、无机盐、糖、维生素和Na、Mg、Ca、Fe、Cu等18种元素，据测定果实含脂肪油55％～61％，蛋白质类物质22％～28％，糖类物质10％～11％，磷444～500mg/100g，钙230～385mg/100g,铁4.4～4.8mg/100g，维生素B10.24～0.29mg/100g，维生素B20.4～0.92mg/100g，灰分2.9％～3.2％，尼克酸2.0mg/100g,烟酸1.0～3.5mg/100g，Vc1mg/100g，单位重量的营养价值比同牛肉高6倍。国外食品产业普遍以扁桃种仁为原料，加工成高级糕点、糖果、干果、罐头、药品、滋补品等。扁桃(AmygdaluscommunisL.)属于蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属植物，是世界著名的干果树种之一，起源于中亚细亚，约6000年的栽培历史，大面积栽培始于19世纪后期。目前扁桃的引种栽培遍及美国、西班牙、希腊、意大利、土耳其等32个国家和地区，其中美国的栽培面积及产量均居世界之首。在我国，栽培扁桃的分布和产区位于新疆的南部，目前的栽培面积约10000hm2。南疆具有适合扁桃生长的自然条件和种质资源，南疆的塔里木盆地，尽管海拔较高，由于其特殊的地形结构，四周环绕于高大的山脉中，属于冬季不太严寒、夏季炎热干燥的亚热带气候，扁桃在良好的灌溉条件下，可以生长良好。据2006年底的新疆维吾尔自治区林业部门统计，新疆扁桃栽培面积约9647公顷，产量约721吨。其二三十年大树平均株产量仅有1～2kg，是美国和伊朗等发达国家扁桃产量的1/10～1/5。本新疆特色果树研究中心前期研究发现，我国扁桃产量较低主要是两方面原因造成的，一方面是因为授粉树和主栽树搭配不合理，授粉品种花药开裂时间和主栽品种柱头伸展出花蕾的时间不一致，导致授粉受精不良，结果率低；另一方面是因为花期冻害造成的，扁桃植株在大地封冻期可忍耐-20～-27℃的低温，但生长季节抵御低温的能力较弱，花期容易受低温晚霜、倒春寒的影响，引起花蕾受冻，花药不能按时开裂，花药褐变等现象，导致授粉品种和主栽品种花期不能按时相遇，产量降低，如2012年英吉沙的春季降雪，导致抗寒性稍差的双果、双软、纸皮等品种花药受冻严重，座果率低，几乎绝收；抗寒性较强的鹰嘴、麻壳等品种产量也显著降低。基于上述我国南疆地区有广泛的适合扁桃栽培的区域，但扁桃春季容易受冻害影响、产量较低，不能满足国内人民需要的情况，本实验室发明了一种扁桃花药细胞纤维骨架染色方法，用于研究扁桃花药开裂过程和花期低温对扁桃花药开裂的影响。而国内科研工作者在对扁桃花药发育过程研究过程中所使用的方法主要是艾氏苏木精整体染色法，但艾氏苏木精整体染色法的染色液配制过程比较复杂，需要2个月的后熟过程，花药染色时间较长不宜把握，而且对药壁细胞的纤维结构染色不明显，不能清楚的看到纤维骨架、细胞壁上的蜂窝状结构，不能满足花药程序性死亡研究的需要。

发明内容

针对传统艾氏苏木精染色方法费时较长、不能清楚看到纤维骨架、细胞壁上的蜂窝状结构，不能满足花药程序性死亡研究的缺陷，本发明要解决的问题是提供一种操作简便的细胞纤维骨架染色方法，能对扁桃花药内部各种细胞进行立体染色，且彼此间区分明显。为解决上述技术问题，本特色果树研究中心发明了一种扁桃花药细胞纤维骨架染色方法，先将考马斯亮蓝G-250、乙醇、85％(W/V)磷酸和蒸馏水按一定的比例提前2天配制好，再在避光条件下对常规石蜡切片法处理好的花药切片组织染色20-30分钟，然后倒掉部分染色液，擦干净载玻片的下表面后，将载玻片放在显微镜下，拍照观察花药细胞的纤维骨架结构(也可以盖上盖玻片后再在显微镜下拍照观察，切片组织褪色后2个小时内可重复染色，不影响观察效果)。本专利一种扁桃花药细胞纤维骨架的染色方法，能将花药细胞原生质染成鲜艳的蓝色(图1-5)，纤维骨架染成淡蓝色(图6)，对细胞壁不着色，能清楚看到细胞壁上的蜂窝状结构(图6)，能将花药内的各部分细胞区分明显，可用于观察花药裂口组织细胞变化(图1-5)、纤维骨架结构变化和细胞壁生长变化，用于扁桃花药裂口组织程序性死亡、花药开裂过程及低温对花药发育影响的研究。与传统的艾氏苏木精整体染色方法相比，本专利方法具有以下优点:1.能将细胞质染成鲜艳的蓝色，纤维骨架染成淡蓝色，细胞壁上的蜂窝状结构清晰可见，各部位细胞着色清楚，区分明显，具有立体染色效果。2.本方法易于操作，染色时间容易把握，不用香柏油就可以在1000倍显微镜下观察，且各部位细胞、组织清楚可见。3.节约时间和材料，不需要载玻片即可直接观察。

附图说明

图1是露红期药隔处细胞程序性死亡图；图2是小蕾期药隔处细胞程序性死亡图；图3是大蕾期药隔处细胞程序性死亡图；图4是花药开裂期药隔处细胞程序性死亡图；图5是药隔处细胞程序性死亡后期图；图6是药壁细胞纤维骨架图

具体实施方法

1.样品固定：用FAA固定液将扁桃各生长时期的花芽固定，2天更换一次固定液，固定一个星期效果较好。如果样品需要长期保存，可将样品放在4℃冰箱内。FAA固定液配制方法是70％无水乙醇:冰乙酸:40％甲醛溶液＝89:5:6。2.试剂：考马斯亮蓝G-250，乙醇，85％磷酸(W/V)。3.配制方法：称取40-60mg考马斯亮蓝G-250固体颗粒，溶于25ml90％乙醇溶液中，加入85％(W/V)磷酸50ml，最后用蒸馏水定容至400ml，2天后对花药切片进行染色，效果较好，此溶液在常温下避光保存可持续使用2个月以上。

4.操作步骤：(1)取出FAA固定液中的样品，用50％乙醇溶液浸洗10-20分钟，然后经50％乙醇溶液浸泡2小时→70％乙醇溶液浸泡2小时(可过夜保存)→80％乙醇溶液浸泡2小时→90％乙醇溶液浸泡2小时→95％乙醇溶液浸泡2小时→100％乙醇浸泡1小时→100％乙醇浸泡1小时→1/2体积的无水乙醇+1/2体积的二甲苯混合液中浸泡2小时→二甲苯浸泡1.5小时→二甲苯浸泡1小时→1/2二甲苯+1/2石蜡溶液浸泡12-24小时(置于40℃恒温箱内)→干净的石蜡溶液浸泡，置于60-61℃恒温箱内，6个小时换一次干净的石蜡溶液，一共更换3-5次→包埋→冷自来水浸泡6小时以上→取出纸盒，在纸盒干燥后剥掉纸盒，用手术刀修蜡块，用石蜡切片机将花药组织切成12um厚的蜡带，均匀放到干净的载玻片上→滴水展片，40℃展片台上展片1个小时，至蜡带完全展开→40℃烘箱烘烤4-6个小时→取出玻片，二甲苯脱蜡10分钟→1/2二甲苯+1/2乙醇浸泡5分钟→无水乙醇浸泡3分钟→95％乙醇浸泡2分钟→90％乙醇浸泡2分钟→80％乙醇浸泡2分钟→70％乙醇浸泡2分钟→50％乙醇浸泡2分钟→30％乙醇浸泡2分钟→蒸馏水浸泡1分钟。(2)在避光条件下用提前配制好的染色液对步骤1中处理好的切片染色20-30min，至切片组织呈蓝色。(3)将载玻片上的大部分染色液倒掉，仅余下薄薄的一层，擦干净载玻片下表面后放在光学显微镜下拍照，也可以盖上盖玻片后，再用光学显微镜拍照。(4)拍照一段时间后，切片组织上的显色物质会分解，切片组织颜色会变为红褐色，在2个小时内可以在避光条件下用考马斯亮蓝G-250溶液进行2次染色(2个小时内可重复染色多次)，染色效果和第一次没有区别。

Claims

1.一种扁桃花药细胞纤维骨架的染色方法，其特征在于，染色方法的步骤为：

1)、样品固定：用FAA固定液将扁桃各生长时期的花芽固定，2天更换一次固定液，固定一个星期，所述的FAA固定液配制方法是70％无水乙醇:冰乙酸:40％甲醛溶液＝89:5:6；

2)、取出FAA固定液中的样品，用50％乙醇溶液浸洗10-20分钟，然后经50％乙醇溶液浸泡2小时→70％乙醇溶液浸泡2小时或过夜保存→80％乙醇溶液浸泡2小时→90％乙醇溶液浸泡2小时→95％乙醇溶液浸泡2小时→100％乙醇浸泡1小时→100％乙醇浸泡1小时→1/2体积的无水乙醇+1/2体积的二甲苯混合液中浸泡2小时→二甲苯浸泡1.5小时→二甲苯浸泡1小时→1/2二甲苯+1/2石蜡溶液浸泡12-24小时，置于40℃恒温箱内→干净的石蜡溶液浸泡，置于60-61℃恒温箱内，6个小时换一次干净的石蜡溶液，一共更换3-5次→包埋→冷自来水浸泡6小时以上→取出纸盒，在纸盒干燥后剥掉纸盒，用手术刀修蜡块，用石蜡切片机将花药组织切成12um厚的蜡带，均匀放到干净的载玻片上→滴水展片，40℃展片台上展片1个小时，至蜡带完全展开→40℃烘箱烘烤4-6个小时→取出玻片，二甲苯脱蜡10分钟→1/2二甲苯+1/2乙醇浸泡5分钟→无水乙醇浸泡3分钟→95％乙醇浸泡2分钟→90％乙醇浸泡2分钟→80％乙醇浸泡2分钟→70％乙醇浸泡2分钟→50％乙醇浸泡2分钟→30％乙醇浸泡2分钟→蒸馏水浸泡1分钟；

3)、在避光条件下用2天前配制好的染色液对步骤2)中处理好的切片染色20-30min，至切片组织呈蓝色；

4)、将载玻片上的大部分染色液倒掉，仅余下薄薄的一层，所余下的溶液能没过组织切片，但又不能使染色液表面形成弧度，使切片组织在1000倍显微镜下能清楚显示，擦干净载玻片下表面后放在光学显微镜下拍照，或盖上盖玻片后，再用光学显微镜拍照；

5)、拍照一段时间后，切片组织上的显色物质会分解，切片组织颜色会变为红褐色，在2个小时内，将褪色的切片在避光环境下进行2次染色或者更多次染色，染色时间5-10min，观察效果不变；

所述的染色液的配制方法：称取40-60mg考马斯亮蓝G-250固体颗粒，溶于25mL90％乙醇溶液中，加入质量体积浓度85％磷酸50mL，最后用蒸馏水定容至400mL。