CN102816401A - 一种适合植物组织冰冻切片的包埋剂和冰冻切片的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包埋剂和直接进行冰冻切片，能在快速在植物组织中进行组织化学等分析的方法。包埋剂聚乙烯醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素纳、丙三醇、甲醛、胶原蛋白、植物凝胶、去离子水组成。冰冻切片方法是对植物材料未进行固定，直接把经过组织化学染色等处理的样品或新鲜组织用上述包埋剂包裹在样品台上进行冷冻切片的方法。该方法解决了在植物组织化学、免疫定位和原位杂交等研究的显微观察中，目标化学物质易溶于固定剂，无法先固定再切片或目标化学物质溶于醇类物质，无法用乙醇脱水的难题。

Description

一种适合植物组织冰冻切片的包埋剂和冰冻切片的方法
技术领域
本发明涉及能在快速在植物组织中进行组织化学等分析的方法，具体的说，涉及一种用于植物组织冰冻切片方法及包埋剂。 
背景技术
与常规的石蜡切片相比, 冰冻切片具有快速、简便、易操作等特点, 且有利于进行组织化学、免疫定位和原位杂交等研究。冰冻切片技术在动物和人体的研究中已广泛应用, 但由于植物细胞结构的特殊性，仅在少数植物组织切片中应用，在植物的研究中难以推广。如何改进冰冻切片技术和寻找适合的冰冻切片包埋剂是冰冻切片技术在植物细胞学研究应用中所面临的一个重要问题。目前虽然有冰冻切片组织包埋剂发明的报道（冰冻切片组织支持剂，专利ZL00109471.8；生物组织冰冻切片包埋剂及其配制方法，专利号ZL92102744.3），但这些包埋剂比较适合于动物和人体组织，不适宜用于新鲜的植物组织；也有简单快速植物组织冰冻切片方法的报道，但这些方法是包埋时选用进口包埋剂OCT(Optimum cutting temperature compound)进行包埋（一种简单快速植物组织冰冻切片方法.热带亚热带植物学报,2008,16:386-389；植物冰冻切片技术的改进.南京林业大学学报,2006,30:128-130），进口包埋剂OCT价格贵，不易购买，同时有些植物材料不太适合用OCT包埋。我们在植物组织化学和免疫定位等研究中发现，部分研究的目标化学物质易溶于固定剂，无法先固定再切片；有些目标化学物质溶于醇类物质，无法用乙醇脱水，如在植物细胞中原花色素组织化学染色的显微观察时，原花色素易溶于醇类物质，不能用含醇类的固定剂固定和乙醇脱水，以前报道的方法不能完成这些试验任务，因此寻找一种植物材料非固定的冰冻切片方法及适合于这些植物材料的包埋剂是解决这些试验难题的关键。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种价格低廉且适合植物组织冰冻切片的包埋剂和冰冻切片的方法，该方法能解决在植物组织化学、免疫定位和原位杂交等研究的显微观察中，目标化学物质易溶于固定剂，无法先固定再切片或目标化学物质溶于醇类物质，无法用乙醇脱水的难题。 
一种适合植物组织冰冻切片的包埋剂，由以下组分的原料配制而成：聚乙烯醇8-10份；聚乙二醇1-2份；羧甲基纤维素纳 0.5-1.0份；丙三醇1-2份；甲醛4-7份；胶原蛋白0.5-0.8份；植物凝胶0.3-0.9份；去离子水 90-100份；配置时先将聚乙烯醇加入去离子水中，充分加热溶解，待温度降至80-90℃时，依次加入上述的其他原料，水浴加热溶解后，至室温备用。 
所述的适合植物冰冻切片包埋剂，由以下组分的原料配制而成：聚乙烯醇9份；聚乙二醇2份；羧甲基纤维素纳 1.0份；丙三醇2份；甲醛4份；胶原蛋白0.8份；植物凝胶0.4份；去离子水 100份。 
一种采用权利要求1所述的适合植物组织冰冻切片的包埋剂进行冰冻切片方法，包括冰冻包埋、切片、展片和显微观察，其特征在于，在冰冻包埋过程中，把经过组织化学染色处理的目标化学物质直接用包埋剂包裹在样品台上进行切片。 
所述目标化学物质为易溶于固定剂、无法先固定再切片的新鲜植物组织。 
所述目标化学物质为易溶于醇类物质、无法用乙醇脱水的新鲜植物组织。 
所述的新鲜植物组织为授粉后25天的芥菜型油菜种子。 
本发明与现有技术相比，找到了一种价格低廉且适合植物组织冰冻切片的包埋剂，制备的切片平整、无皱褶、切片薄、厚度均匀，显微结果清晰；克服了显微观察中目标化学物质易溶于固定剂，无法先固定再切片的难题；克服了目标化学物质溶于醇类物质，无法用乙醇脱水的难题。 
附图说明
图1是采用本发明方法的芥菜型油菜种子切片图。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。 
实施例1
（1）包埋剂的制作
包埋剂由下述配比的原料制成:聚乙烯醇9g；聚乙二醇2g；羧甲基纤维素纳 1.0g；丙三醇2g；甲醛4g；胶原蛋白0.8g；植物凝胶0.4g；去离子水 100g；配置时先将聚乙烯醇加入去离子水中，充分加热溶解，待温度降至80℃时，依次加入上述的其他原料，水浴加热溶解后降至室温备用。
（2）冰冻包埋和切片 
启动冷冻超薄切片机（YD-1900，浙江金华益迪医疗设备厂生产）降温开关，把箱温降低并维持在-30℃，冰冻台的温度降低到-20 ℃时，为了观察原花色素在油菜种子中的分布，把新鲜的授粉后25天的芥菜型油菜种子经过DMACA（p-dimethylaminocinnamaldehyde）的酸性-醇类溶液组织化学染色20分钟后（DMACA与原花色素反应产生蓝色物质），直接用上述包埋剂包裹在样品台上，使材料迅速冷却并固着在样品台上，切片厚度为15μm。切片方法按常规方法和切片机厂商提供的说明书进行。
 （3）展片 
让载玻片以合适的角度靠近切片刀, 在快速的切片过程中, 被冰冻切片的材料以一定的速度移向载玻片并展开在玻片上。
（4）显微观察 
按常规方法和显微镜厂商（Olympus）提供的说明书进行。在显微镜下观察发现本发明的制备的切片显微结果清晰，平整、无皱褶，厚度均匀，细胞层次明显，见图1。
实施例2
（1）包埋剂的制作
包埋剂由下述配比的原料制成:聚乙烯醇8g；聚乙二醇1g；羧甲基纤维素纳 0.5g；丙三醇1g；甲醛 7g；胶原蛋白0.5g；植物凝胶0.9g；去离子水90g；配置时先将聚乙烯醇加入去离子水中，充分加热溶解，待温度降至90℃时，依次加入上述的其他原料，水浴加热溶解后降至室温备用。
（2）冰冻包埋和切片 
启动冷冻超薄切片机（YD-1900，浙江金华益迪医疗设备厂生产）降温开关，把箱温降低并维持在-20℃，冰冻台的温度降低到-40 ℃时，为了观察原花色素在油菜种子中的分布，把新鲜的授粉后25天的芥菜型油菜种子经过DMACA（p-dimethylaminocinnamaldehyde）的酸性-醇类溶液组织化学染色20分钟后（DMACA与原花色素反应产生蓝色物质），直接用上述包埋剂包裹在样品台上，使材料迅速冷却并固着在样品台上，切片厚度为15μm。切片方法按常规方法和切片机厂商提供的说明书进行。
 （3）展片 
用预冷的解剖针轻轻地碰触切片周围的包埋剂，切片即刻附着在解剖针上，随后用解剖针将切片转移到机箱外的载玻片上并展开在玻片上。
其它同实施例1。 
实施例3
（1）包埋剂的制作
包埋剂由下述配比的原料制成:聚乙烯醇10g；聚乙二醇1.5g；羧甲基纤维素纳 0.8g；丙三醇1.5g；甲醛6g；胶原蛋白0.6g；植物凝胶0.3g；去离子水95g；配置时先将聚乙烯醇加入去离子水中，充分加热溶解，待温度降至85℃时，依次加入上述的其他原料，水浴加热溶解后降至室温备用。
（2）冰冻包埋和切片 
启动冷冻超薄切片机（YD-1900，浙江金华益迪医疗设备厂生产）降温开关，把箱温降低并维持在-40℃，冰冻台的温度降低到-30 ℃时，为了观察原花色素在油菜种子中的分布，把新鲜的授粉后25天的芥菜型油菜种子经过DMACA（p-dimethylaminocinnamaldehyde）的酸性-醇类溶液组织化学染色20分钟后（DMACA与原花色素反应产生蓝色物质），直接用上述包埋剂包裹在样品台上，使材料迅速冷却并固着在样品台上，切片厚度为15μm。切片方法按常规方法和切片机厂商提供的说明书进行。
 （3）展片 
用预冷的毛笔轻轻地碰触切片周围的包埋剂，切片即刻附着在毛笔上，随后用毛笔将切片转移到机箱外的载玻片上并展开在玻片上。
其它同实施例1。 
本申请的冰冻切片对象，除了芥菜型油菜种子外，还可以是根、茎、叶等其它植物组织。该方法不仅可用于油菜，还可以用于其他特点相似的植物材料。 

Claims (6)

1.一种适合植物组织冰冻切片的包埋剂，其特征在于，由以下组分的原料配制而成：聚乙烯醇8-10份；聚乙二醇1-2份；羧甲基纤维素纳 0.5-1.0份；丙三醇1-2份；甲醛4-7份；胶原蛋白0.5-0.8份；植物凝胶0.3-0.9份；去离子水 90-100份；配置时先将聚乙烯醇加入去离子水中，充分加热溶解，待温度降至80-90℃时，依次加入上述的其他原料，水浴加热溶解后，至室温备用。
2.根据权利要求1所述的适合植物冰冻切片包埋剂，其特征在于，由以下组分的原料配制而成：聚乙烯醇9份；聚乙二醇2份；羧甲基纤维素纳 1.0份；丙三醇2份；甲醛4份；胶原蛋白0.8份；植物凝胶0.4份；去离子水 100份。
3.一种采用权利要求1所述的适合植物组织冰冻切片的包埋剂进行冰冻切片方法，包括冰冻包埋、切片、展片和显微观察，其特征在于，在冰冻包埋过程中，把经过组织化学染色处理的目标化学物质直接用包埋剂包裹在样品台上进行切片。
4.根据权利要求3所述的采用适合植物组织冰冻切片的包埋剂进行冰冻切片方法，其特征在于，所述目标化学物质为易溶于固定剂、无法先固定再切片的新鲜植物组织。
5.根据权利要求3所述的采用适合植物组织冰冻切片的包埋剂进行冰冻切片方法，其特征在于，所述目标化学物质为易溶于醇类物质、无法用乙醇脱水的新鲜植物组织。
6.根据权利要求4或5所述的采用适合植物组织冰冻切片的包埋剂进行冰冻切片方法，其特征在于，所述的新鲜植物组织为授粉后25天的芥菜型油菜种子。
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