CN106482997B - 一种适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法，该方法包括以下步骤：⑴取样：骨骼样品于中性甲醛溶液中常温下固定后流水冲洗；⑵脱钙：将冲洗好的骨骼样品去除皮肤和肌肉组织，并放入硝酸溶液中脱钙、流水冲洗；⑶在预冷的载物台表面涂布一层合成胶水，冷冻后备用；⑷包埋：将脱钙后的骨骼样品先置于合成胶水中浸泡，然后放到载物台上冷冻的合成胶水表面，冷冻后再次滴加合成胶水冷冻彻底包埋；⑸切片：将所得的包埋好骨骼样品的胶水块切片、贴片、晾干，得到晾干的片子；⑹晾干的片子染色；⑺冲洗蓝化结束后，迅速滴加一滴甘油封片，即得骨切片。本发明操作简便、成本低廉，适合于推广和应用实验教学的脱钙冰冻骨切片实验方法。

Description

一种适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法

技术领域

本发明涉及组织学及显微技术领域，尤其涉及一种适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法。

背景技术

骨骼主要由骨组织、骨膜及骨髓构成，在机体中起到支持、运动和保护的作用。骨组织是骨骼的主要组成部分，大量的骨盐沉积为坚硬的结缔组织。骨组织细微结构的观察和研究可以通过骨切片实现，但由于骨组织坚固的特性给切片带来很多困难。

目前，骨切片常用的方法主要有脱钙和不脱钙两种方式。前者通常采用石蜡切片的方法，需要经过取材、固定、脱钙、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、展片、烘干、脱蜡、染色、封片等步骤，过程繁琐且容易出现问题，如果采用冰冻切片，则需要使用液氮和超低温冰箱进行材料的冷冻以及专用的冰冻切片包埋剂，成本较高；后者将不脱钙的骨材料直接磨成薄片或采用专用不脱钙切片设备，费时费力且难度大。

这些骨组织制片技术难度大、耗时长且成本高，给广泛应用以及教学实验带来了极大的困难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便、成本低廉的适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法

为解决上述问题，本发明所述的一种适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法，包括以下步骤：

⑴取样：取骨骼样品置于中性甲醛溶液中，常温下固定24~48小时后流水冲洗12小时，去除残留固定液；

⑵脱钙：将所述步骤⑴冲洗好的骨骼样品去除皮肤和肌肉组织，并放入质量浓度为5%的硝酸溶液中脱钙12~24小时，再流水冲洗12小时去酸，得到脱钙后的骨骼样品；

⑶在预冷的载物台表面涂布一层合成胶水，-20℃冷冻后备用；

⑷包埋：将所述脱钙后的骨骼样品置于合成胶水中浸泡5min，得到胶水浸润的骨骼样品；将所述步骤⑶所得的冷冻好的载物台置于体视镜下，用常温镊子粘着去除多余合成胶水的所述胶水浸润的骨骼样品，放到载物台上冷冻的合成胶水表面，因遇冷初步凝固，然后放入-20℃冰箱进一步冷冻后再次滴加合成胶水冷冻彻底包埋；

⑸切片：先将冰冻切片机于-20℃预冷，然后将所述步骤⑷所得的包埋好骨骼样品的胶水块用刀片修成5mm×5mm的正方形，然后固定到冰冻切片机上匀速切出厚度为12~18μm的连续条带，再用常温载玻片贴片后自然晾干，得到晾干的片子；

⑹滴加Ehrlich苏木精染液到所述晾干的片子上，以染液浸没材料为准，染色10~15min后，自来水缓慢冲洗15s；

⑺冲洗蓝化结束后，迅速滴加一滴甘油封片，即得骨切片。

所述步骤⑴的固定和所述步骤⑵的脱钙后冲洗时用纱布分隔小室固定和分装骨骼样品。

所述步骤⑴中的中性甲醛溶液是指体积浓度为40%的甲醛100mL、磷酸二氢钾4.0g、磷酸氢二钠6.5g和蒸馏水900mL混合均匀后所得的溶液。

所述步骤⑷中去除多余合成胶水的所述初步包埋后的骨骼样品以实验者所需的方向置于所述冷冻好的载物台上。

所述步骤⑹中的Ehrlich苏木精染液是指苏木精1g、甘油50mL、无水乙醇50mL、硫酸铝钾7.5g、冰醋酸5mL和蒸馏水50mL混合均匀后所得的溶液。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明中采用普通市售合成胶水（得力，NO.7302）代替冰冻切片常用进口OCT包埋剂（optimal cutting temperature compound），极大地降低了骨组织冰冻切片成本。

2、本发明改进冰冻切片流程，使用冰冻切片机或者普通冰箱冷冻材料，而无需液氮和超低温冰箱，减少了设备需求。

3、本发明改进包埋方法，使得操作者很容易控制材料的包埋方向，得到特定角度（横切或纵切）的切片。同时，简化染色、封片操作，减少流程节约时间，降低操作难度。本发明从包埋到制片完成仅需30分钟左右，而石蜡切片需要2~3天，普通冰冻切片需要2~3小时。

4、本发明操作简便、成本低廉，除了用于两栖、爬行类物种的指骨切片以观察骨组织结构，还可以非致死情况下，通过趾骨横截面切片上的停滞生长线的数量用于两栖类和爬行类物种的个体年龄的快速、准确鉴定。

5、本发明适合于推广和应用实验教学的脱钙冰冻骨切片实验方法，对于组织学研究和显微技术应用都具有重要的意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为采用本发明方法制备的青海沙蜥牙齿切片。a.牙齿（100×）；b.牙质（400×）。

图2为采用本发明方法制备的青海沙蜥尾椎切片。a.尾椎Ⅰ（100×）；b.尾椎Ⅱ（100×）。

图3为采用本发明方法制备的青海沙蜥趾骨，黑色箭头为停滞生长线（LAG）。a.趾骨骨干横切（200×）；b.趾骨骨干横切（400×）。

具体实施方式

一种适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法，包括以下步骤：

⑴取样：取骨骼样品置于中性甲醛溶液中，常温下固定24~48小时后流水冲洗12小时，去除残留固定液。冲洗时用纱布折叠后订书机分隔成分隔小室，每个小室固定和分装骨骼样品。

其中：中性甲醛溶液是指体积浓度为40%的甲醛100mL、磷酸二氢钾4.0g、磷酸氢二钠6.5g和蒸馏水900mL混合均匀后所得的溶液。

⑵脱钙：将步骤⑴冲洗好的骨骼样品去除皮肤和肌肉组织，并放入质量浓度为5%的硝酸溶液中脱钙12~24小时，依据骨骼材料的大小和脱钙状况而定，针刺柔软易于弯曲时视为脱钙完成。再流水冲洗12小时去酸，得到脱钙后的骨骼样品。冲洗时用纱布折叠后订书机分隔成分隔小室，每个小室固定和分装骨骼样品。

⑶在预冷的载物台表面涂布一层合成胶水（得力，NO.7302），注意表面平整且无气泡，-20℃冷冻后备用。

⑷包埋：将脱钙后的骨骼样品置于合成胶水中浸泡5min，得到胶水浸润的骨骼样品；将步骤⑶所得的冷冻好的载物台置于体视镜下，用常温镊子粘着去除多余合成胶水的胶水浸润的骨骼样品，放到载物台上冷冻的合成胶水表面。骨骼样品因载物台的低温遇冷被初步凝固，然后放入-20℃冰箱进一步冷冻后再次滴加合成胶水冷冻彻底包埋。

去除多余合成胶水的初步包埋后的骨骼样品以实验者所需的方向（横向或者纵向）置于冷冻好的载物台上。

合成胶水为市售的得力合成胶水，NO.7302。

⑸切片：先将冰冻切片机于-20℃预冷，然后将步骤⑷所得的包埋好骨骼样品的胶水块用切片修成5mm×5mm的正方形，然后固定到冰冻切片机上匀速切出厚度为12~18μm的连续条带。切片刀与包埋好骨骼样品的胶水块平行，以能切出连续的合成胶水条带为准。再用常温载玻片贴片（每张载玻片可以贴三排）后自然晾干，得到晾干的片子。

材料冷冻时，可以在预冷的冰冻切片机内，也可以用普通冰箱代替。

⑹滴加Ehrlich苏木精染液到晾干的片子上，以染液浸没材料为准，染色10~15min（视染色情况而定）。染色完成后，倾去多余染液（可回收重复使用），自来水缓慢冲洗15s多余染液兼有蓝化作用后。

其中：Ehrlich苏木精染液是指苏木精1g、甘油50mL、无水乙醇50mL、硫酸铝钾7.5g、冰醋酸5mL和蒸馏水50mL混合均匀后所得的溶液。

⑺冲洗蓝化结束后，在片子干燥前迅速滴加一滴甘油封片，即得骨切片。该骨切片即可显微镜观察，照相。

实施例1

1材料和方法

1.1仪器和试剂

冰冻切片机（莱卡，CM1100），体视镜（卡尔蔡司，stemi DV4），数码显微镜（麦克奥迪，BA300），载玻片，盖玻片，刀片，镊子等。

合成胶水（得力，NO.7302），Ehrlich苏木精染液，5%（W/V）硝酸，中性甲醛固定液

1.2材料

青海沙蜥牙齿

2操作步骤

（1）取蜥蜴牙齿于中性甲醛溶液中常温下固定24小时，流水冲洗12小时。

（2）冲洗好的材料放入5%（W/V）硝酸溶液中脱钙16小时，流水冲洗12小时去酸。

（3）冰冻切片机-20℃预冷后，在预冷的载物台表面涂布一层合成胶水（得力，NO.7302），冷冻后备用。材料置于合成胶水中浸泡5min备用。冷冻好的载物台置于体视镜下，用常温镊子粘着材料，放到载物台上冷冻的合成胶水表面，然后放入冰冻切片机内冷冻，然后再次滴加合成胶水冷冻彻底包埋。

（4）切片：包埋好的材料用刀片修成大致为5mm×5mm的正方形，冰冻切片机内平衡5min。调节切片厚度16μm，匀速切片。用常温载玻片贴片，自然晾干。

（5）滴加Ehrlich苏木精染液到晾干的片子上，以染液浸没材料为准，染色10min。染色完成后，倾去多余染液，自来水缓慢冲洗30 sec。

（6）冲洗蓝化结束后，迅速滴加一滴甘油封片，即得到蜥蜴牙齿切片，可显微镜观察，照相（图1）。

实施例2

1材料和方法

1.1仪器和试剂

冰冻切片机（莱卡，CM1100），体视镜（卡尔蔡司，stemi DV4），数码显微镜（麦克奥迪，BA300），载玻片，盖玻片，刀片，镊子等。

合成胶水（得力，NO.7302），Ehrlich苏木精染液，5%（W/V）硝酸，中性甲醛固定液

1.2材料

青海沙蜥尾椎骨

2操作步骤

（1）取青海沙蜥尾椎骨于中性甲醛溶液中常温下固定24小时，流水冲洗12小时。

（2）冲洗好的材料放入5%（W/V）硝酸溶液中脱钙24小时，流水冲洗12小时去酸。

（3）冰冻切片机-20℃预冷后，在预冷的载物台表面涂布一层合成胶水（得力，NO.7302），冷冻后备用。材料置于合成胶水中浸泡5min备用。冷冻好的载物台置于体视镜下，用常温镊子粘着材料，放到载物台上冷冻的合成胶水表面，然后放入冰冻切片机内冷冻，然后再次滴加合成胶水冷冻彻底包埋。

（4）切片：包埋好的材料用刀片修成大致为5mm×5mm的正方形，冰冻切片机内平衡5min。调节切片厚度16μm，匀速切片。用常温载玻片贴片，自然晾干。

（5）滴加Ehrlich苏木精染液到晾干的片子上，以染液浸没材料为准，染色10min。染色完成后，倾去多余染液，自来水缓慢冲洗30 sec。

（6）冲洗蓝化结束后，迅速滴加一滴甘油封片，即得到蜥蜴尾椎骨切片，可显微镜观察，照相（图2）。

实施例3

1材料和方法

1.1仪器和试剂

冰冻切片机（莱卡，CM1100），体视镜（卡尔蔡司，stemi DV4），数码显微镜（麦克奥迪，BA300），载玻片，盖玻片，刀片，镊子等。

合成合成胶水（得力，NO.7302），Ehrlich苏木精染液，5%（W/V）硝酸，中性甲醛固定液

1.2材料

青海沙蜥尾趾骨

2操作步骤

（1）取青海沙蜥趾骨于中性甲醛溶液中常温下固定24小时，流水冲洗12小时。

（2）冲洗好的材料放入5%（W/V）硝酸溶液中脱钙12小时，流水冲洗12小时去酸。

（3）冰冻切片机-20℃预冷后，在预冷的载物台表面涂布一层合成胶水（得力，NO.7302），冷冻后备用。材料置于合成胶水中浸泡5min备用。冷冻好的载物台置于体视镜下，用常温镊子粘着材料，放到载物台上冷冻的合成胶水表面，然后放入冰冻切片机内冷冻，然后再次滴加合成胶水冷冻彻底包埋。

（4）切片：包埋好的材料用刀片修成大致为5mm×5mm的正方形，冰冻切片机内平衡5min。调节切片厚度16μm，匀速切片。用常温载玻片贴片，自然晾干。

（5）滴加Ehrlich苏木精染液到晾干的片子上，以染液浸没材料为准，染色10min。染色完成后，倾去多余染液，自来水缓慢冲洗30sec。

（6）冲洗蓝化结束后，迅速滴加一滴甘油封片，即得到蜥蜴趾骨切片，可显微镜观察，照相（图3）。

实施例4

按照实施例3中的方法，对趾骨骨干横切得到骨干横切片，根据切面上趾骨骨外板上的停滞生长线（图3a），即可得到该个体的年龄为3龄。

Claims (5)

1.一种适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法，包括以下步骤：

⑴取样：取骨骼样品置于中性甲醛溶液中，常温下固定24~48小时后流水冲洗12小时，去除残留固定液；

⑵脱钙：将所述步骤⑴冲洗好的骨骼样品去除皮肤和肌肉组织，并放入质量浓度为5%的硝酸溶液中脱钙12~24小时，再流水冲洗12小时去酸，得到脱钙后的骨骼样品；

⑶在预冷的载物台表面涂布一层合成胶水，-20℃冷冻后备用；

⑷包埋：将所述脱钙后的骨骼样品置于合成胶水中浸泡5min，得到胶水浸润的骨骼样品；将所述步骤⑶所得的冷冻好的载物台置于体视镜下，用常温镊子粘着去除多余合成胶水的所述胶水浸润的骨骼样品，放到载物台上冷冻的合成胶水表面，因遇冷初步凝固，然后放入-20℃冰箱进一步冷冻后再次滴加合成胶水冷冻彻底包埋；

⑸切片：先将冰冻切片机于-20℃预冷，然后将所述步骤⑷所得的包埋好骨骼样品的胶水块用刀片修成5mm×5mm的正方形，然后固定到冰冻切片机上匀速切出厚度为12~18μm的连续条带，再用常温载玻片贴片后自然晾干，得到晾干的片子；

⑹滴加Ehrlich苏木精染液到所述晾干的片子上，以染液浸没材料为准，染色10~15min后，自来水缓慢冲洗15s；

⑺冲洗蓝化结束后，迅速滴加一滴甘油封片，即得骨切片。

2.如权利要求1所述的一种适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法，其特征在于：所述步骤⑴的固定和所述步骤⑵的脱钙后冲洗时用纱布分隔小室固定和分装骨骼样品。

3.如权利要求1所述的一种适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法，其特征在于：所述步骤⑴中的中性甲醛溶液是指体积浓度为40%的甲醛100mL、磷酸二氢钾4.0g、磷酸氢二钠6.5g和蒸馏水900mL混合均匀后所得的溶液。

4.如权利要求1所述的一种适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法，其特征在于：所述步骤⑷中去除多余合成胶水的所述初步包埋后的骨骼样品以实验者所需的方向置于所述冷冻好的载物台上。

5.如权利要求1所述的一种适用于两栖、爬行类物种的骨切片制备方法，其特征在于：所述步骤⑹中的Ehrlich苏木精染液是指苏木精1g、甘油50mL、无水乙醇50mL、硫酸铝钾7.5g、冰醋酸5mL和蒸馏水50mL混合均匀后所得的溶液。