CN102279121B - 动物组织石蜡切片的绿色环保制作技术 - Google Patents

Abstract

本发明“动物组织石蜡切片的绿色环保制作技术”的目的在于提供一种应用于农业大学动物医学等专业对动物组织进行石蜡切片的技术。特点是使用化学试剂种类少，无毒害，对组织脱水彻底，加快制片的同时又不使组织过度收缩和硬度增加。替代了对传统石蜡切片制作中对人体有害的二甲苯的使用，消除由此产生的职业病和环境污染。组织由混合固定液(100ml固定液的比例是：85％酒精91ml，甲醛4ml，冰醋酸5ml)固定和梯度酒精脱水后，置入混合透明剂(分析纯正丁醇14％，丙酮29％，无水酒精57％)中，3小时，然后进行常规浸蜡和包埋。切片染色时，用分析纯松节油(60℃)，进行两次脱蜡，常温下行水化，苏木素染核、脱色、兰化及伊红染色。上行脱水到纯酒精后，风干，直接用松节油稀释的树胶封片。

Description

动物组织石蜡切片的绿色环保制作技术

技术领域

本发明涉及一种动物组织石蜡切片的制作方法。 

背景技术

石蜡切片技术是组织学、发育生物学研究的主要实验方法，同时也是病理学中观察病理变化的重要手段，广泛地应用于临床病理诊断、教学和科研工作中。动物标本的形态学观察、免疫组化、原位杂交及原位PCR等技术手段，都离不开标本组织的处理和石蜡切片的制作。 

常规的组织石蜡切片技术使用二甲苯作为透明剂和脱蜡剂，对组织的收缩性强，作用迅速，但组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变硬。二甲苯极易挥发，会对人们的健康造成极大的伤害，可造成操作人员患哮喘，甚至癌症。处理废液时，还会造成空气、水源和食物污染。急需一种或多种代替二甲苯的试剂。 

有一些资料和文献曾报道过一些替代二甲苯的试剂，但还没有成熟的全套技术，能像本发明一样能够包含最少种类、不含有毒物质和污染物质的化学试剂，来制作动物组织切片。 

专利和文献资料报道如下： 

专利号为200810136961.X的发明专利“生物组织标本常规石蜡制片HE染色无二甲苯全程处理液”^[1]，使用了桉油素，四氢呋喃，苯甲酸甲酯，汽油等化学试剂。个别化学试剂对人体和环境有害，如： 

苯甲酸甲酯的缺点：属低毒类，吸入、口服或经皮吸收都对身体有害。蒸气或雾对眼和上呼吸道有刺激性，对皮肤有致敏作用。遇明火、高热或与氧化剂接触，有引起燃烧的危险。该物质对环境可能有危害。 

汽油的缺点：易燃。吸入、食入、经皮肤可被人吸收。急性中毒时对中枢神经系统有麻醉作用。当慢性中毒时，会出现神经衰弱综合症、植物神经功能症状类似精神分裂症。液体吸入呼吸道可引起吸入性肺炎。溅入眼内可致角膜溃疡、穿孔，甚至失明。皮肤接触致急性接触性皮炎，甚至灼伤。 

谭俊等^[2]在组织切片的制作中，使用了松节油。根据本人实验表明，由于透明液只含有单一的松节油，脱水透明效果欠佳。制作方法如下： 

组织在固定液固定60分钟；入80％乙醇，120分钟；入95％乙醇I，90分钟；入95％乙醇II，60分钟；入95％乙醇III，60分钟；为无水乙醇I，60分钟；为无水乙醇II，60分钟；TO型生物制片透明剂(主要成分为松节油)I，90分钟；TO型生物制片透明剂II，90分钟；石蜡3个缸，分别为60分钟；染色时用TO型生物制片透明剂代替二甲苯进行脱蜡。 

丁伟星^[3]和李海等^[4]在组织切片的制作中，使用了正丁醇进行脱水兼透明，但染色时仍使用了二甲苯。

其方法如下：组织在固定液固定兼脱水1缸，1小时；入I液，为无水乙醇，温度为65℃，40分钟；正丁醇脱水兼透明3缸，每缸约40-60分钟，温度为65℃。 

专利号为200810136961.X的发明专利“生物组织标本常规石蜡制片HE染色无二甲苯全程处理液”中，在脱水时，使用了丙酮和乙醇的混合液，但在透明时，没有再使用丙酮。 

综上所述，在动物医学专业中，急需一种成熟的全套技术，不含二甲苯，包含最少种类、不含有毒物质和污染物质的化学试剂，来制作动物组织切片。 

发明内容

用混合固定液(100ml固定液的比例是：85％酒精91ml，甲醛4ml，冰醋酸5ml)和混合透明剂(分析纯正丁醇14％，丙酮29％，无水酒精57％，常温下按比例混配制)及松节油脱蜡剂代替二甲苯，制作出绿色环保的动物组织切片。 

具体方法如下： 

1、手工蜡块制作方法如下： 

(1)固定  病变组织块置于混合固定液中固定18至24小时(有其它用途的特殊染色除         外) 

(2)脱水  85％乙醇1小时→95％乙醇1小时→95％乙醇1小时→无水乙醇I1小时          →无水乙醇II1小时(如果用60℃烤箱，时间均为40分钟) 

(3)透明  混合透明剂中3小时(如果用60℃烤箱，时间为2小时) 

(4)浸蜡  石蜡I(52-54℃)、II(54-56℃)和III(56-58℃)中分别1小时 

(5)包埋 

(6)修块、切片和烤片 

2、自动脱水机制作蜡块方法如下(从当日16时到次日8时)： 

(1)固定  病变组织块置于混合固定液中固定4小时(有其它用途的特殊染色除外) 

(2)脱水  85％乙醇40分钟→95％乙醇40分钟→95％乙醇40分钟→无水乙醇I40分          钟→无水乙醇II40分钟(3小时20分) 

(3)透明  混合透明剂中2小时 

(4)浸蜡  石蜡I(52-54℃)2小时、II(54-56℃)3小时和III(56-58℃)中分别2小         时40分 

(5)包埋、修块、切片和烤片 

3、HE染色，用松节油替代二甲苯，时间上比传统长(二甲苯脱蜡2-5分钟，而松节油            脱蜡20-30分钟，且在60℃烤箱中进行)： 

(1)脱蜡至水  松节油I20-30分钟(在60℃烤箱中进行)→松节油II20-30分钟(在              60℃烤箱中进行)→无水乙醇I1分钟→无水乙醇II1分钟→95％乙             醇1分钟→80％乙醇1分钟→70％乙醇1分钟→自来水洗2分钟 

(2)染色      Harris苏木素液20分钟→自来水洗5分钟→1％盐酸乙醇分化30秒→自来              水洗→饱和碳酸锂30秒→自来水水1分钟→伊红10分钟 

(3)脱水、透明和封固   75％乙醇20秒→80％乙醇40秒→90％乙醇1分钟→                      无水乙醇I1分钟→无水乙醇II1分钟→风干后，直接用松节油                      稀释的中性树胶封固。 

具体实施方式

以下通过几个实施例对本发明的效果进行说明。 

实施例1：猪蓝耳病的病理学观察 

选择有代表性的病猪的各个病变器官组织块，当日下午16点置于混合固定液中。 

次日上午8点，组织入85％乙醇1小时。 

9点，组织入95％乙醇1小时。 

10点，组织入95％乙醇1小时 

11点，组织入无水乙醇I1小时 

12点，组织入无水乙醇II1小时(如果用60℃烤箱，以上脱水时间均为40分钟) 

13点，组织入混合透明剂中3小时(如果用60℃烤箱，时间为2小时) 

16点，组织入52-54℃熔点的石蜡I中1小时(在60℃烤箱中进行) 

17点，组织入54-56℃熔点的石蜡II中1小时(在60℃烤箱中进行) 

18点，组织入56-58℃熔点的石蜡III中1小时(在60℃烤箱中进行) 

19点，进行包埋 

至此，蜡块做好。切片时，放入冰箱冷冻层冻1小时后，取出可以进行常规切片。 

切片进行染色的具体步骤如下： 

(1)脱蜡至水  松节油I20-30分钟(在60℃烤箱中进行)→松节油II20-30分钟              (在60℃烤箱中进行)→无水乙醇I1分钟→无水乙醇II1分钟→              95％乙醇1分钟→80％乙醇1分钟→70％乙醇1分钟→自来水洗2分钟 

(2)染色     Harris苏木素液20分钟→自来水洗5分钟→1％盐酸乙醇分化30秒→自来             水洗→饱和碳酸锂30秒→自来水1分钟→伊红10分钟 

(3)脱水、透明和封固入   75％乙醇20秒→80％乙醇40秒→90％乙醇1分钟→             无水乙醇I1分钟→无水乙醇II1分钟→风干后，直接用松节油稀释的中性             树胶封固。 

以下为本病例的病理组织学观察结果。 

肺脏：部分区实变，部分肺泡扩张破裂，部分肺泡内有淋巴细胞、红细胞、组织细胞渗出，扩张的肺泡中有脱落的肺泡上皮组织细胞，肺泡毛细血管扩张充血。肺间质可见淋巴细胞、组织细胞呈小灶状分布。 

肝脏：肝小梁间质增宽，小血管扩张充血，间质有淋巴细胞、组织细胞渗出，肝血窦扩张，窦内淋巴细胞肥大、增生，肝细胞体积增大。 

肾脏：肾小球毛细血管扩张、充血，间质水肿，组织细胞形成小结，有散在淋巴细胞，肾小管上皮细胞颗粒变性，肾脏中有脱落的肾小管上皮细胞。 

脾脏：脾动脉淋巴鞘变薄，有坏死灶，有组织细胞、少量淋巴细胞和少量嗜酸性粒细胞渗出。 

淋巴结：弥漫性肿大，淋巴细胞弥漫增生，淋巴窦扩张，有浆液渗出，淋巴细胞、组织细胞和少量巨噬细胞渗出，滤泡局灶性坏死。 

实施例2：獭兔螨虫病的病理学观察 

取皮损组织，按实施例1猪蓝耳病的病理学观察的组织蜡块制作和切片染色的方法，进行。以下为本病例的组织病理学观察结果。 

皮肤角化层增厚毛细血管扩张充血角化层增厚，皮下组织疏松水肿(有炎症)，可见大量虫体，有炎细胞浸润。 

实施例3：火鸡滴虫病的病理学观察 

取病死鸡肝脏病变病灶组织，按实施例1猪蓝耳病的病理学观察的组织蜡块制作和切片染色的方法进行。以下为本病例的组织病理学观察结果。 

火鸡肝脏实质内具有散在和广泛性融合性肝细胞大量坏死，并与周围组织分界不清。肝脏的组织减少。小叶间胆管扩张、胆管内有组织滴虫寄生。胆管数量增多，胆管上皮细胞脱落。 

综上所述，本发明为绿色制片法制作动物组织石蜡切片技术，其特点如下： 

1、从蜡块制作和切片染色的全程中，试剂种类少、不含有毒物质和污染物质的化学试剂。 

2、使用混合固定液(100ml固定液的比例是：85％酒精91ml，甲醛4ml，冰醋酸5ml)和混合透明剂(分析纯正丁醇14％，丙酮29％，无水酒精57％，常温下按比例混配制)及松节油脱蜡剂代替二甲苯，制作出绿色环保的动物组织切片。 

正丁醇的沸点为117℃-118℃，挥发慢。其饱和吸水量，比乙醇大。丙酮的脱水能力比酒精强，且脱水速度快，但容易使组织过度硬化。三种试剂取长补短，代替二甲苯，加快了脱水速度，不会引起组织块过度收缩和硬化，并且不存在透明时间过长的问题。 

3、用绿色制片法制作的石蜡组织切片，镜下观察组织结构清晰完整，颜色鲜艳协调，细胞核呈蓝紫色，细胞质呈淡粉色，对比度好，层次分明。细胞大小和细胞间距与传统相比，没见明显差异。 

4、本发明是结合二十多年临床医学实践和动物医学的教学和科研实践而创造的，并经过多年实践验证的制作动物石蜡组织切片的新方法，可以代替传统方法，低能减排，是绿色环保型的。 

参考文献 

[1]赵晓辉.专利号为200810136961.X的发明专利“生物组织标本常规石蜡制片HE染色无二甲苯全程处理液” 

[2]谭俊，符弘枚.松节油型生物制片透明剂在HE制片中的应用.国际检验医学杂志”，2010，31(8)：908-909 

[3]丁伟星.正丁醇在组织制备中的应用”，河北医学，1998，4(3)：68-69 

[4]李海，邓志勇，陈金珍，陈芳等.正丁醇及乙醇在病理组织制片中的改进应用”，实用医技杂志，2008，15(11)：4389-4390 

附图说明

图1-6为施例1猪蓝耳病的病理学观察结果

图1是患有蓝耳病的病猪，皮肤发绀，肝脏肿大淤血，黑红色 

图2是病猪的肺脏，肺间质可见淋巴细胞、组织细胞呈小灶状分布    H.E 400× 

图3是病猪的肝脏，肝脏间质血管扩张，有淋巴细胞、组织细胞渗出  H.E 400× 

图4是病猪的肾脏，肾小管上皮细胞颗粒变性，间质水肿，淋巴细胞和组织细胞形成小结                                               H.E 400× 

图5是病猪的脾脏，脾动脉淋巴鞘变薄，有坏死灶                  H.E 400× 

图6是病猪的淋巴结，淋巴细胞弥漫增生，滤泡局灶性坏死          H.E 100× 

图7-10是实施例2獭兔螨虫病的病理学观察结果

图7是病兔，精神萎靡不振，耳部皮肤红肿，皮肤增厚，有结痂 

图8是兔的皮肤，血管扩张充血                                  H.E 200× 

图9是兔的皮肤，皮肤角化层增厚                                H.E 400× 

图10是兔的皮肤，皮下有大量虫体                               H.E 400× 

图11-14是实施例3火鸡滴虫病的病理学观察结果

图11是火鸡，腹腔内有淡黄色液体，肝脏肿大，有圆形中央稍凹陷或微突、边缘稍降起、中心黄绿色或黄白色、边缘灰白色的大小不等的坏死灶。盲肠肿大，壁增厚。 

图12是火鸡的肝脏，肝细胞坏死                                  H.E 400× 

图13是火鸡的肝脏，胆管内有虫体                                H.E 400× 

图14是火鸡的肝脏，胆管上皮细胞脱落                            H.E 400×。 

Claims (1)

1.动物组织石蜡切片的制作方法，包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片和烤片、脱蜡、染色、脱水、透明和封固步骤，其特征在于：

所述固定步骤是：采用如下混合固定液：100m1固定液的比例是：85%酒精91m1，甲醛4m1，冰醋酸5m1；采用手工或自动脱水机制作蜡块，固定时间分别为18至24小时或4小时；

所述透明步骤是：采用如下混合透明剂：用分析纯正丁醇14%，丙酮29%，无水酒精57%，常温下按比例混配；采用手工或自动脱水机制作蜡块，透明时间分别为3小时或2小时；

所述脱蜡步骤是：采用的切片脱蜡液如下：

切片脱蜡液Ⅰ：用分析纯松节油；

切片脱蜡液Ⅱ：用分析纯松节油；

60℃烤箱中进行；脱蜡时间依次是：切片脱蜡液Ⅰ20-30分钟→切片脱蜡液Ⅱ20-30分钟；

脱蜡后用伊红染色，梯度酒精脱水后，自然风干，直接用松节油稀释的树胶封片。

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