CN104155160A - 一种不含苯的组织脱蜡透明剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种不含苯的组织脱蜡透明剂，用于生物组织学、组织病理学或者法医学，它既可以使组织透明、又可以使组织脱蜡的制剂。属体外诊断试剂技术领域。本发明脱蜡透明剂主要含有95%－100%脂环烃，余量为辅料，所述的脂环烃为单环脂环烃或二环脂环烃。本发明不含苯的脱蜡透明剂具有无毒，作用柔和，不易引起组织材料收缩变形、硬化脆化，可提高切片的完好率；对潮湿环境不敏感，不易因吸收空气中的水分而变浑浊的优点；不仅可用于液基细胞学、免疫组织化学、生物组织学、常规病理诊断、免疫组织化学的诊断技术，也适用于特殊染色法和组织化学技术中。采用的脂环烃透明剂（环己烷）的折射指数为1.42，(甲基环己烷)折射率1.42,与组织的折射指数（1.418）基本一致，透明效果更好。

Description

一种不含苯的组织脱蜡透明剂

技术领域

本发明涉及一种用于生物组织学，组织病理学，法医学的不含苯的组织脱蜡透明剂, 是一种体外诊断试剂，具体涉及既可以使组织透明、又可以使组织脱蜡的制剂。属体外诊断试剂技术领域。 

背景技术

临床实验室在临床医学中发挥着越来越重要的作用，临床实验室提供的诊断信息涉及诊断、治疗、健康状况评估、公共卫生突发事件、科学研究各方面。占患者全部诊断、疗效等医疗信息的60%以上。 

组织病理学的诞生已有150多年的历史。组织石蜡切片是在观察组织形态和免疫组化等定性分析中最常用的一种切片技术，广泛应用于临床病理诊断和实验研究。组织经固定、脱水后，必须经过一种既能与乙醇相混合，又能溶解石蜡的溶剂，通过其媒介作用，使石蜡浸入组织块。在此过程中组织中的水分被溶剂取代，其折射指数接近组织蛋白的折射指数，组织块变得透明。组织经石蜡包埋后制成蜡块，用切片机制成切片后，需要将切片中的蜡脱去，才能进行染色。在透明和脱蜡这两个程序中，使用最多的脱蜡透明剂仍在沿用100多年前使用的二甲苯、苯、甲苯。 

苯、甲苯、二甲苯属于有毒有害化学品，会损伤肝、肾、骨髓和中枢神经系统。具有潜在的致癌性。长期接触二甲苯对人体机能会产生严重的影响，且二甲苯的排放也会对环境造成严重污染。实验和临床研究都表明吸入二甲苯蒸汽会导致头痛、头晕、恶心和呕吐。医院病理科大量使用二甲苯，会对医生和实验室人员的身体造成伤害。 

       二甲苯的的替代品用于人体组织标本石蜡切片脱蜡和透明多年来一直是研究的对象。 

       使用松节油作为透明剂是P.Mayer1910年提出的，由于其挥发慢，使透明后封片的时间延长。松节油还会导致银染色的褪色。含松节油的透明剂在国外已上市多年，如Baxter公司的AmeriClear。中国发明专利（ZL91108571.8；CN200910050030.2 和CN201110023746.0）配方中皆使用松节油作为组织染色后透明。这些透明剂只有透明作用，无脱蜡作用。 

       柠檬烯用于脱蜡始于1981年，但柠檬烯是油性的；对某些个体可能会引起极为严重的过敏反应。美国专利（USP7,070,951)， 就是采用醇类与柠檬烯的混合物，辅以表面活性剂脱蜡。醇类本身脱蜡效果很差，会造成组织过度脱水，使标本发收缩、硬化、脆裂。 

亦有用短链烷烃或支链烷烃做脱蜡剂， 如中国专利ZL00122030.6，用的是航空煤油和石油醚（航空煤油和石油醚都是短链烷烃的混合物）。短链烷烃的缺点是气味强烈，沸点低，在环境中迅速弥散，使用者难于接受。航空煤油含有不会挥发的多种添加剂，如四乙基铅，碱性酚，二壬基萘磺酸等，这些添加剂对组织的影响尚待认识。 

目前Merck 公司在国际市场上销售一种用于组织透明的二甲苯替代品，商品名为NEO-CLEAR(R) XYLENE SUBSTITUTE。其成分是一种工业用油漆稀释剂（bromohexanol acetate），气味强烈，有致癌性。对人体和环境均可能造成危害。因此不是理想的二甲苯替代品。 

为使组织达到最佳的透明效果，透明剂的折射指数应尽可能与组织蛋白的折射指数接近。动物组织的折射指数为1.418，而二甲苯的折射指数为1.49，苯、甲苯的折射指数为1.50，并不能达到最佳的透明效果。目前未見既可以使组织透明、又可以脱蜡，完全取代苯类制剂达到最佳效果的产品。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种不含苯，甲苯，二甲苯的生物组织（包括人体组织、动物、植物、昆虫、微生物及其它标本）的脱蜡、透明剂。可以用于石蜡切片脱蜡，也可用于组织固定后透明，和染色后封片前透明。 

实现本发明不含苯的组织脱蜡透明剂采用的具体技术方案：脱蜡透明剂主要含有95%－100%脂环烃，余量为辅料，所述的脂环烃为单环脂环烃或二环脂环烃。 

所述辅料为表面活性剂、植物精油及抗氧化剂中的一种或多种；其中表面活性剂浓度为0.0%－0.1%、植物精油浓度为0.0%－5.0%，抗氧化剂浓度为0.01%－0.05％。 

脱蜡透明剂中可以加入抗氧化剂，让染色的组织透明后长期保持颜色。 

所述脂环烃中的单环脂环烃或二环脂环烃为环戊烷、环已烷、环庚烷、环辛烷、甲基环己烷，二甲基环己烷，二环己烷中的一种或者多种。 

所述的单环脂环烃为环己烷，甲基环己烷；所述的二环脂环烃为二环己烷。 

所述表面活性剂为阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或者双性离子表面活性剂中的一种或者多种。 

抗氧化剂为丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）、没食子酸丙酯（PG）、特丁基对苯二酚（TBHQ）或者樟脑醌（CQ）中的一种或者多种。 

一种不含苯的组织脱蜡透明剂的纯化制作方法，其特征在于采用市售含有一定量的苯和/或其他烃类的脂环烃，需按以下方法纯化： 

（1）加入少量的发烟硫酸进行振摇，分出酸，再加发烟硫酸振摇；

（2）步骤（1）反复多次，直至酸的颜色呈淡黄色，依次再用浓硫酸、水、2%氢氧化钠溶液洗涤，再用水洗涤，用氢氧化钾干燥后蒸馏，即可。

使用权利要求1所述的不含苯的组织脱蜡透明剂作为用于组织切片脱蜡的应用。 

使用权利要求1所述的不含苯的组织脱蜡透明剂作为用于组织固定后透明或者染色后封片前透明的应用。 

本发明采用脂环烃作为组织透明的脱蜡剂，采用的脂环烃可以是单环脂环烃或二环脂环烃。在相同时间、温度的条件下，经本发明处理的石蜡切片组织观察效果与用二甲苯处理的组织切片观察效果一致，从而代替二甲苯。 

本发明采用的脂环烃透明剂（环己烷）的折射指数为1.42，(甲基环己烷) 折射率1.42,与组织的折射指数（1.418）基本一致，透明效果更好。 

本发明不含苯的脱蜡透明剂具有无毒，作用柔和，不易引起组织材料收缩变形、硬化脆化，可提高切片的完好率；对潮湿环境不敏感，不易因吸收空气中的水分而变浑浊的优点；不仅可用于液基细胞学、免疫组织化学、生物组织学、常规病理诊断、免疫组织化学的诊断技术，也适用于特殊染色法和组织化学技术中。 

附图说明

图1为采用本发明配方1脱蜡透明剂，制作的空腔组织（狗肺部）组织染色样本。 

图2为采用本发明配方2脱蜡透明剂制作的空腔组织（狗肺部）组织染色样本。 

图3是使用传统二甲苯为脱蜡透明剂制作的空腔组织（狗肺部）组织染色样本。 

图4为采用本发明配方3脱蜡透明剂制作的致密组织（兔子肝脏）组织染色样本。 

图5为使用传统二甲苯为脱蜡透明剂制作的致密组织（兔子肝脏）组织染色样本。 

图6为采用本发明配方5脱蜡透明剂制作的黏膜组织（兔子胃底）组织染色样本。 

图7是使用传统二甲苯为脱蜡透明剂制作的黏膜组织（兔子胃底）组织染色样本。 

图8为采用本发明配方6脱蜡透明剂制作的腺体组织（兔子唾液腺）组织染色样本。 

图9是使用传统二甲苯为脱蜡透明剂制作的腺体组织（兔子唾液腺）组织染色样本。 

图10为采用本发明配方7脱蜡透明剂制作的表皮组织（兔子皮肤）组织染色样本。 

图11是使用传统二甲苯为脱蜡透明剂制作的表皮组织（兔子皮肤）组织染色样本。 

图12为采用本发明配方4脱蜡透明剂制作的皮质骨组织（兔子股骨）组织染色样本。 

图13是使用传统二甲苯为脱蜡透明剂制作的皮质骨组织（兔子股骨）组织染色样本。 

图14为采用本发明配方5脱蜡透明剂制作的软骨组织（兔子股骨头的软骨）组织染色样本。 

图15是使用传统二甲苯为脱蜡透明剂制作的软骨组织（兔子股骨头的软骨）组织染色样本。 

图16为采用本发明配方1脱蜡透明剂进行免疫组化染色，所制作的空腔组织（狗肺部）组织染色样本。 

图17为采用本发明配方2脱蜡透明剂进行免疫组化染色，所制作的空腔组织（狗肺部）组织染色样本。 

图18是使用传统二甲苯为脱蜡透明剂进行免疫组化染色，制作的空腔组织（狗肺部）组织染色样本。 

具体实施方式   

       下面结合实例对本发明作进一步解释，但本发明不局限于这些实施例。以下实施例仅为本发明的举例，对本发明而言无任何限定意义。专业人员尽管可对其进行许多改变、组合或增减，如加入各种辅助成分，但都是归于本发明权利要求所保护的范围内。

本发明采用市售脂环烃含有一定量的苯和其他烃类，需按以下方法纯化：加入少量的发烟硫酸进行振摇，分出酸，再加发烟硫酸振摇。上一步如此反复多次，直至酸的颜色呈淡黄色。依次再用浓硫酸、水、2%氢氧化钠溶液洗涤，再用水洗涤，用氢氧化钾干燥后蒸馏，即可。 

本发明的不含苯的脱蜡透明剂在应用时，与传统使用酒精脱水，二甲苯脱蜡、透明的程序不相冲突。 

本发明不含苯的脱蜡透明剂的主要成分是脂环烃。本发明所述的脱蜡透明剂中的脂环烃，可选用：环戊烷、环已烷、环庚烷、环辛烷、甲基环己烷，二甲基环己烷，二环己烷。 

本发明所述的脱蜡透明剂中可以加入其它辅助成分，如表面活性剂（阳离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，非离子表面活性剂，双性离子表面活性剂），植物精油等。 

为使染色的组织透明后长期保持颜色，在透明剂中可加入适量的抗氧化剂， 如丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）、没食子酸丙酯（PG）、特丁基对苯二酚（TBHQ）、樟脑醌（CQ）等。 

实施例1，将配方各成分混合均匀溶解即得 （液体按体积比，二丁基羟基甲苯按质量体积百分比计）。 

配方举例

配方	1	2	3	4	5	6	7
								环己烷	100.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	50.0
甲基环己烷	0.0	100.0	0.0	100.0	50.0	50.0	50.0
								二环己烷			100.0		50.0	50.0
植物精油	0.0	0.0	0.0	5.0	0.0	1.0	0.0
								两性表面活性剂	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.1	0.0
二丁基羟基甲苯	0.0	0.0	0.05	0.05	0.0	0.05	0.0

实施例2

对空腔组织（肺）透明、脱蜡试验及结果

材料: 实施例1中的配方1、配方2

实验方法：

实验组1（配方1）

①.取狗的肺部组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用配方1的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为第一缸10分钟，第二缸5分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将配方1置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡，每缸各5分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤.用配方1分两缸透明，每缸各透明5分钟后取出，风干封片。（参见图1） 

实验组2（配方2）

①.取狗的肺部组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用配方2的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为第一缸10分钟，第二缸5分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将配方2置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡，每缸各5分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤.用配方2分两缸透明，每缸各透明5分钟后取出，风干封片。（参见图2） 

对照组：

①.取狗的肺部组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用二甲苯的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为第一缸10分钟，第二缸5分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将二甲苯置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡，每缸各5分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用二甲苯分两缸透明，每缸各透明5分钟后取出，风干封片。（参见图3） 

结果：镜下观察，本发明的组织脱蜡透明剂与二甲苯对照具有相同的透明及脱蜡效果，二者处理后的肺部组织染色无差异。（参见图1、图2、图3）

实施例3

对致密组织（肝脏）透明、脱蜡试验及结果

材料：实施例1中的配方3

实验方法：

实验组：

①.取兔子的肝脏组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用配方3的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为20分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将配方3置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用配方3一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图4） 

对照组：

①.取兔子的肝脏组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用二甲苯的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为20分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将二甲苯置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用二甲苯一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图5） 

结果：镜下观察，本发明的组织脱蜡透明剂与二甲苯对照具有相同的透明及脱蜡效果，二者处理后的肝脏组织染色无差异。（参见图4、图5）

实施例4

对黏膜组织（胃黏膜）透明、脱蜡试验及结果

材料：实施例一中的配方5

实验方法：

实验组：

①.取兔子的胃底组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用配方5的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为30分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将配方5置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用配方5一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图6） 

对照组：

①.取兔子的胃底组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用二甲苯的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为30分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将二甲苯置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用二甲苯一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图7） 

结果：镜下观察，本发明的组织脱蜡透明剂与二甲苯对照具有相同的透明及脱蜡效果，二者处理后的胃底黏膜组织染色无差异。（参见图6、图7）

实施例5

对腺体组织（唾液腺）透明、脱蜡试验及结果

材料：实施例1中的配方6

实验方法：

实验组：

①.取兔子的唾液腺组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用配方6的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为30分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将配方6置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用配方6一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图8） 

对照组：

①.取兔子的唾液腺组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用二甲苯的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为30分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将二甲苯置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用二甲苯一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图9） 

结果：镜下观察，本发明的组织脱蜡透明剂与二甲苯对照具有相同的透明及脱蜡效果，二者处理后的唾液腺组织染色无差异。（参见图8、图9）

实施例6

配方4 对表皮组织（皮肤）透明、脱蜡试验及结果

材料：实施例一中的配方7

实验方法：

实验组：

①.取兔子的皮肤组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用配方7的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为30分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将配方7置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用配方7一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图10） 

对照组：

①.取兔子的皮肤组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用二甲苯的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为30分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将二甲苯置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用二甲苯一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图11） 

结果：镜下观察，本发明的组织脱蜡透明剂与二甲苯对照具有相同的透明及脱蜡效果，二者处理后的皮肤组织染色无差异。（参见图10、图11）

实施例7

对皮质骨组织（股骨）透明、脱蜡试验及结果

材料：实施例一中的配方4

实验方法：

实验组：

①.取兔子的股骨组织，按常规脱钙、组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用配方4的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为30分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将配方4置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用配方4一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图12） 

对照组：

①.取兔子的股骨组织，按常规脱钙、组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用二甲苯的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为30分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将二甲苯置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用二甲苯一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图13） 

结果：镜下观察，本发明的组织脱蜡透明剂与二甲苯对照具有相同的透明及脱蜡效果，二者处理后的皮质骨组织染色无差异。（参见图12、图13）

实施例8

对软骨组织（软骨）透明、脱蜡试验及结果

材料：实施例一中的配方5

实验方法：

实验组：

①.取兔子股骨头的软骨组织，按常规脱钙、组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用配方5的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为30分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将配方5置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤用配方5一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图14） 

对照组：

①.取兔子股骨头的软骨组织，按常规脱钙、组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用二甲苯的试剂分两缸进行组织透明，每缸透明时间分别为30分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。

②.切片，温水中摊片。 

③.将二甲苯置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟。 

④.取出载玻片，按标准操作进行酒精梯度洗脱，并进行常规HE染色。 

⑤.用二甲苯一缸透明30秒后取出，风干封片。（参见图15） 

结果：镜下观察，本发明的组织脱蜡透明剂与二甲苯对照具有相同的透明及脱蜡效果，二者处理后的软骨组织染色无差异。（参见图14、图15）

实施例9

S-P免疫组化实验

材料：实施例一中的配方1、配方2

实验方法：

实验组1：

采用S-P免疫组化染色试剂盒，采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

①.取狗的肺组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用配方1的试剂分两缸进行同一组织块的透明，每缸透明时间分别为10分钟和5分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。 

②.切片，温水中摊片。

③.将配方1置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟，并水化。 

④. 用PBS（PH7.4）冲洗三次，每次3分钟，根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 

⑤.每张切片加1滴或50ul过氧化物酶阻断溶液（试剂A），以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。 

⑥.用PBS（PH7.4）冲洗三次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清（试剂B），室温下孵育10分钟。 

⑦.甩去血清，每张切片加1滴或50ul的第一抗体（PCNA-ab1），4℃过夜。 

⑧. PBS冲洗3次，每次5分钟，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10分钟。 

⑨.PBS冲洗3次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液（试剂D），室温下孵育10分钟。⑩.PBS冲洗3次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟，阳性显色为棕色。.自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸酒精分化，0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。.经过梯度酒精脱水干燥，配方4透分两缸分别透明5分钟，风干后封片。（参见图16） 

实验组2：

采用S-P免疫组化染色试剂盒，采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

①.取狗的肺组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用配方2的试剂分两缸进行同一组织块的透明，每缸透明时间分别为10分钟和5分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。 

②.切片，温水中摊片。 

③.将配方2置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟，并水化。 

④. 用PBS（PH7.4）冲洗三次，每次3分钟，根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 

⑤.每张切片加1滴或50ul过氧化物酶阻断溶液（试剂A），以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。 

⑥.用PBS（PH7.4）冲洗三次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清（试剂B），室温下孵育10分钟。 

⑦.甩去血清，每张切片加1滴或50ul的第一抗体（PCNA-ab1），4℃过夜。 

⑧. PBS冲洗3次，每次5分钟，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10分钟。 

⑨.PBS冲洗3次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液（试剂D），室温下孵育10分钟。 

⑩.PBS冲洗3次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟，阳性显色为棕色。.自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸酒精分化，0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。.经过梯度酒精脱水干燥，配方4透分两缸分别透明5分钟，风干后封片。（参见图17） 

对照组：

采用S-P免疫组化染色试剂盒，采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

①.取狗的肺组织，按常规组织固定及酒精梯度脱水操作步骤进行固定和脱水，然后用二甲苯的试剂分两缸进行同一组织块的透明，每缸透明时间分别为10分钟和5分钟。最后按标准浸蜡步骤进行组织浸蜡包埋。 

②.切片，温水中摊片。 

③.将二甲苯置于两个玻璃缸中，将载有组织切片的载玻片分别放入两个玻璃缸中分别脱蜡10分钟，并水化。 

④. 用PBS（PH7.4）冲洗三次，每次3分钟，根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 

⑤.每张切片加1滴或50ul过氧化物酶阻断溶液（试剂A），以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。 

⑥.用PBS（PH7.4）冲洗三次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清（试剂B），室温下孵育10分钟。 

⑦.甩去血清，每张切片加1滴或50ul的第一抗体（PCNA-ab1），4℃过夜。 

⑧. PBS冲洗3次，每次5分钟，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体（羊抗鼠或兔-IgG聚合物），室温下孵育10分钟。 

⑨.PBS冲洗3次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液（试剂D），室温下孵育10分钟。⑩.PBS冲洗3次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟，阳性显色为棕色。.自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸酒精分化，0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。.经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透分两缸分别透明5分钟，风干后封片。（参见图18） 

结果：镜下观察，本发明的组织脱蜡透明剂与二甲苯对照具有相同的透明及脱蜡效果，二者处理后组织的免疫组化抗原表达无差异。（参见图16、图17、图18）。

Claims (10)

1.一种不含苯的组织脱蜡透明剂，其特征在于脱蜡透明剂主要含有95%－100%脂环烃，余量为辅料，所述的脂环烃为单环脂环烃或二环脂环烃。

2.根据权利要求1所述的不含苯的组织脱蜡透明剂，其特征在于所述辅料为表面活性剂、植物精油及抗氧化剂中的一种或多种；其中表面活性剂浓度为0.0%－0.1%、植物精油浓度为0.0%－5.0%，抗氧化剂浓度为0.01%－0.05％。

3.根据权利要求1所述的不含苯的组织脱蜡透明剂，其特征在于脱蜡透明剂中可以加入抗氧化剂，让染色的组织透明后长期保持颜色。

4.根据权利要求1或2所述的不含苯的组织脱蜡透明剂，其特征在于所述脂环烃中的单环脂环烃或二环脂环烃为环戊烷、环已烷、环庚烷、环辛烷、甲基环己烷，二甲基环己烷，二环己烷中的一种或者多种。

5.根据权利要求4所述的不含苯的组织脱蜡透明剂，其特征在于所述的单环脂环烃为环己烷，甲基环己烷；所述的二环脂环烃为二环己烷。

6.根据权利要求1或2所述的不含苯的组织脱蜡透明剂，其特征在于所述表面活性剂为阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或者双性离子表面活性剂中的一种或者多种。

7.根据权利要求2所述的不含苯的组织脱蜡透明剂，其特征在于所述抗氧化剂为丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）、没食子酸丙酯（PG）、特丁基对苯二酚（TBHQ）或者樟脑醌（CQ）中的一种或者多种。

8.一种不含苯的组织脱蜡透明剂的纯化制作方法，其特征在于采用市售含有一定量的苯和/或其他烃类的脂环烃，需按以下方法纯化：

（1）加入少量的发烟硫酸进行振摇，分出酸，再加发烟硫酸振摇；

（2）步骤（1）反复多次，直至酸的颜色呈淡黄色，依次再用浓硫酸、水、2%氢氧化钠溶液洗涤，再用水洗涤，用氢氧化钾干燥后蒸馏，即可。

9.使用权利要求1所述的不含苯的组织脱蜡透明剂作为用于组织切片脱蜡的应用。

10.使用权利要求1所述的不含苯的组织脱蜡透明剂作为用于组织固定后透明或者染色后封片前透明的应用。