CN111982637A - 一种环保的石蜡切片透明脱蜡试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物组织石蜡切片技术领域，尤其为一种环保的石蜡切片透明脱蜡试剂，所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂包括以下步骤：浸蜡前透明、染色前脱蜡。该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂，实现石蜡切片制作全程苯类物质零使用，消除健康危害与环境污染以及苯类物质固有的缺点；缩短制片总时间，避免高浓度脱水剂导致的组织硬化，导致制片失败；降低制片经验要求、提高组织样本的普适性以及实现不同样本的同步处理；降低毒性和降低空气湿度对脱蜡效果的影响；消除切片中的脱水剂，增强切片组织的折光性，降低凝固点，适合实验室手工制片或自动脱水(染色)机制片，应用本发明中的试剂对HE、特殊染色、免疫组化等染色质量好。
Description
技术领域
本发明涉及动物组织石蜡切片技术领域，具体为一种环保的石蜡切片透明脱蜡试剂。
背景技术
动物组织石蜡切片传统制作方法中在浸蜡前透明、染色前脱蜡、染色后透明、封片四个步骤中应用到二甲苯、甲苯等苯类芳烃物质，苯类物质的毒性与高挥发性对人体健康和空气水体等环境影响较大，且对操作者的制片技术与经验的要求较高，同时该类物质对部分组织器官存在透明易硬化和易碎的缺陷，使用该类物质多样本(不同器官)制片不能同步进行的固有，免疫组化研究时苯类物质会减弱组织中抗原物质的抗原性。
现有替代苯类物质的技术主要基于高浓度丁醇、氯仿类、松节油等植物提取液类、正构烷烃(包括汽油)类、离子液体类的透明剂或脱蜡剂，主要存在对样品水分含量要求高、气味与刺激性强、物质安全性未被确认、处理样本时间长或作用时间要求高、溶蜡能力差、易导致样品硬化或碎裂、成本高与不易购买等多缺点。
本发明技术目的是：实现石蜡切片制作全程苯类物质零使用，消除健康危害与环境污染以及苯类物质固有的缺点；缩短制片总时间，避免高浓度脱水剂导致的组织硬化，导致制片失败；降低制片经验要求、提高组织样本的普适性以及实现不同样本的同步处理；降低毒性和降低空气湿度对脱蜡效果的影响；消除切片中的脱水剂，增强切片组织的折光性，降低凝固点，适合实验室手工制片或自动脱水(染色)机制片。
针对上述问题，急需在原有替代苯类物质的基础上进行创新设计。
发明内容
本发明的目的在于提供一种环保的石蜡切片透明脱蜡试剂，以解决上述背景技术中提出传统替代苯类物质的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种环保的石蜡切片透明脱蜡试剂，所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂包括以下步骤：浸蜡前透明、染色前脱蜡、染色后透明和封片，其中浸蜡前透明采用苯类物质替代剂的浸蜡前透明剂，其中染色前脱蜡采用苯类物质替代剂的染色前脱蜡剂，其中染色后透明采用苯类物质替代剂的封片前透明剂，其中封片采用苯类物质替代剂的封片剂；
所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂采用苯类物质替代剂构成如下：
1)浸蜡前透明剂由低级一元醇、长链脂肪醇和烷烃碳氢化合物构成；
2)染色前脱蜡剂由水果精油中的萜烯化合物、长链脂肪醇、烷烃碳氢化合物和非离子表面活性剂构成；
3)封片前透明剂由水果精油中的萜烯化合物和烷烃碳氢化合物构成；
4)封片剂由光学树脂胶和封片前透明剂溶解构成。
优选的，所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中浸蜡前透明剂具体成分包括微毒的叔丁醇、无毒的异构十八醇和环保无味的异构十二烷，体积比为1:1:3，其中在制片程序中可按步骤：
①脱水(70％-95％梯度乙醇)
②透明(浸蜡前透明剂)
③浸蜡
或
①脱水(70％-100％梯度乙醇)
②透明(浸蜡前透明剂)
③浸蜡；
其中该透明试剂中处理时透明剂分Ⅰ、Ⅱ两级，每级处理时间1-3小时。
优选的，所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中染色前脱蜡剂具体成分为D-柠檬烯、异构十二烷、异构十八醇和长链脂肪酸醇聚氧乙烯组成，比例为45:49:5:1，其中切片的脱蜡程序为：
①脱蜡Ⅰ(10-20min)
②脱蜡Ⅱ(10min)
③脱蜡Ⅲ(10min)；
通过手动和自动染色机完成。
优选的，所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中封片前透明剂具体成分为D-柠檬烯、异构十二烷，体积比例为1:1，其中该试剂的折射率(n20D)≥1.45，其中封片前的透明程序为：
①脱水(70％-100％乙醇)
②透明Ⅰ(5-10min)
③透明Ⅱ(5-10min)
④透明Ⅲ(5-10min)；
通过手动和自动染色机完成。
优选的，所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中封片剂具体配制为以D-柠檬烯、异构十二烷等体积混合作溶剂溶解冷杉胶，其中冷杉胶的质量百分比为50—60％，折射率(n20D)≥1.50。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
石蜡切片制作全程苯类物质零使用，消除健康危害与环境污染以及苯类物质固有的缺点，浸蜡前透明剂低挥发性、低气味、气味物质安全，透明剂与水、乙醇、石蜡互溶，实现高浓度脱水剂脱水步骤与透明步骤融合，缩短制片总时间，避免高浓度脱水剂导致的组织硬化、制片失败，浸蜡前透明剂处理样本的允许时间可变范围大，降低制片经验要求、提高组织样本的普适性以及实现不同样本的同步处理，脱蜡剂毒性小、溶蜡能力强，脱蜡时间与二甲苯相当，脱蜡剂允许切片上少量水分，降低空气湿度对脱蜡效果的影响，封片前透明剂与脱水剂相溶，易于消除切片中的脱水剂，透明剂增强切片组织的折光性，苯类物质替代剂凝固点极低(<0℃)，适合实验室手工制片或自动脱水(染色)机制片，应用本发明中的试剂对HE、特殊染色、免疫组化等染色质量好。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种环保的石蜡切片透明脱蜡试剂，该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂包括以下步骤：浸蜡前透明、染色前脱蜡、染色后透明和封片，其中浸蜡前透明采用苯类物质替代剂的浸蜡前透明剂，其中染色前脱蜡采用苯类物质替代剂的染色前脱蜡剂，其中染色后透明采用苯类物质替代剂的封片前透明剂，其中封片采用苯类物质替代剂的封片剂；
该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂采用苯类物质替代剂构成如下：
1)浸蜡前透明剂由低级一元醇、长链脂肪醇和烷烃碳氢化合物构成；
2)染色前脱蜡剂由水果精油中的萜烯化合物、长链脂肪醇、烷烃碳氢化合物和非离子表面活性剂构成；
3)封片前透明剂由水果精油中的萜烯化合物和烷烃碳氢化合物构成；
4)封片剂由光学树脂胶和封片前透明剂溶解构成。
本例中该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中浸蜡前透明剂具体成分包括微毒的叔丁醇、无毒的异构十八醇和环保无味的异构十二烷，体积比为1:1:3，其中在制片程序中可按步骤：
①脱水(70％-95％梯度乙醇)
②透明(浸蜡前透明剂)
③浸蜡
或
①脱水(70％-100％梯度乙醇)
②透明(浸蜡前透明剂)
③浸蜡；
其中该透明试剂中处理时透明剂分Ⅰ、Ⅱ两级，每级处理时间1-3小时。
该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中染色前脱蜡剂具体成分为D-柠檬烯、异构十二烷、异构十八醇和长链脂肪酸醇聚氧乙烯组成，比例为45:49:5:1，其中切片的脱蜡程序为：
①脱蜡Ⅰ(10-20min)
②脱蜡Ⅱ(10min)
③脱蜡Ⅲ(10min)；
通过手动和自动染色机完成。
该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中封片前透明剂具体成分为D-柠檬烯、异构十二烷，体积比例为1:1，其中该试剂的折射率(n20D)≥1.45，其中封片前的透明程序为：
①脱水(70％-100％乙醇)
②透明Ⅰ(5-10min)
③透明Ⅱ(5-10min)
④透明Ⅲ(5-10min)；
通过手动和自动染色机完成。
该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中封片剂具体配制为以D-柠檬烯、异构十二烷等体积混合作溶剂溶解冷杉胶，其中冷杉胶的质量百分比为50—60％，折射率(n20D)≥1.50。
工作原理：本发明中苯类物质替代剂包括浸蜡前透明剂、染色前脱蜡剂、封片前透明剂、封片剂；
1、浸蜡前透明剂
该试剂由低级一元醇、长链脂肪醇、烷烃碳氢化合物构成，具有饱和蒸气压低，无色，极弱的气味，粘度系数低，凝固点低(<0℃)，与水、乙醇、石蜡互溶，作用组织样本温和等特点，试剂的具体成分包括微毒的叔丁醇、无毒的异构十八醇和环保无味的异构十二烷，体积比1:1:3；
其中各成分的功能分别为：叔丁醇可与水、乙醇、石蜡互溶，主要司职脱水；异构十八醇司职乙醇置换和降低其他组分的挥发，异构十二烷增强透明剂的溶蜡能力；
在制片程序中可按步骤：脱水(70％-95％梯度乙醇)，透明(浸蜡前透明剂)，浸蜡或脱水(70％-100％梯度乙醇)，透明(浸蜡前透明剂)，浸蜡进行，其中在该透明试剂中处理时透明剂分Ⅰ、Ⅱ两级，每级处理时间1-3小时均可，时间选择范围大，对组织样本作用温和；
2、染色前脱蜡剂
该试剂由水果精油中的萜烯化合物、长链脂肪醇、烷烃碳氢化合物和非离子表面活性剂构成，具有橘香味，无色透明，低粘度液体，其溶蜡能力强，脱蜡速度较快，但切片即使长时间停留其中也不易脱片、对免疫组化实验、原位杂交实验无影响，该试剂的具体成分为D-柠檬烯、异构十二烷、异构十八醇和长链脂肪酸醇聚氧乙烯组成，体积比例为45:49:5:1；
其中D-柠檬烯易溶解石蜡和乙醇，虽有橘香味，但无急性毒性(LD50≥5g.kg-1)，对于人无基因、免疫及生殖毒性与致癌性，异构十二烷无毒无味、环保、无刺激性，在本配比中降低脱蜡剂的成本，异构十八醇增加试剂的醇溶性和降低其他试剂挥发速率，长链脂肪酸醇聚氧乙烯解决切片的微水分，如：烤片不彻底、空气潮湿；
在制片的脱蜡程序为：脱蜡Ⅰ(10-20min)，脱蜡Ⅱ(10min)，脱蜡Ⅲ(10min)，通过手工或自动染色机完成；
3、封片前透明剂
该试剂由水果精油中的萜烯化合物、烷烃碳氢化合物构成，具有橘香味，无色透明，低粘度液体，能溶解乙醇(脱水剂)，增强组织透明度，该试剂具体成分为D-柠檬烯、异构十二烷，最佳体积比例为1:1，其中该试剂的折射率(n20D)≥1.45；
封片前的透明程序为：脱水(70％-100％乙醇)，透明Ⅰ(5-10min)，透明Ⅱ(5-10min)，透明Ⅲ(5-10min)”通过手工或自动染色机进行；
4、封片剂
该试剂由光学树脂胶和封片前透明剂溶解而成，其具体成分为冷杉胶、D-柠檬烯和异构十二烷，具体配制为以D-柠檬烯、异构十二烷等体积混合作溶剂溶解冷杉胶，使冷杉胶的质量百分比为50—60％，折射率(n20D)≥1.50。该试剂具有良好的透明度、不结晶、无毒、胶合强度好、封胶干凅快、盖玻片固定好和切片不易氧化褪色。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种环保的石蜡切片透明脱蜡试剂，其特征在于：所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂包括以下步骤：浸蜡前透明、染色前脱蜡、染色后透明和封片，其中浸蜡前透明采用苯类物质替代剂的浸蜡前透明剂，其中染色前脱蜡采用苯类物质替代剂的染色前脱蜡剂，其中染色后透明采用苯类物质替代剂的封片前透明剂，其中封片采用苯类物质替代剂的封片剂；
所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂采用苯类物质替代剂构成如下：
1)浸蜡前透明剂由低级一元醇、长链脂肪醇和烷烃碳氢化合物构成；
2)染色前脱蜡剂由水果精油中的萜烯化合物、长链脂肪醇、烷烃碳氢化合物和非离子表面活性剂构成；
3)封片前透明剂由水果精油中的萜烯化合物和烷烃碳氢化合物构成；
4)封片剂由光学树脂胶和封片前透明剂溶解构成。
2.根据权利要求1所述的一种环保的石蜡切片透明脱蜡试剂，其特征在于：所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中浸蜡前透明剂具体成分包括微毒的叔丁醇、无毒的异构十八醇和环保无味的异构十二烷，体积比为1:1:3，其中在制片程序中可按步骤：
①脱水(70％-95％梯度乙醇)
②透明(浸蜡前透明剂)
③浸蜡
或
①脱水(70％-100％梯度乙醇)
②透明(浸蜡前透明剂)
③浸蜡；
其中该透明试剂中处理时透明剂分Ⅰ、Ⅱ两级，每级处理时间1-3小时。
3.根据权利要求1所述的一种环保的石蜡切片透明脱蜡试剂，其特征在于：所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中染色前脱蜡剂具体成分为D-柠檬烯、异构十二烷、异构十八醇和长链脂肪酸醇聚氧乙烯组成，比例为45:49:5:1，其中切片的脱蜡程序为：
①脱蜡Ⅰ(10-20min)
②脱蜡Ⅱ(10min)
③脱蜡Ⅲ(10min)；
通过手动和自动染色机完成。
4.根据权利要求1所述的一种环保的石蜡切片透明脱蜡试剂，其特征在于：所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中封片前透明剂具体成分为D-柠檬烯、异构十二烷，体积比例为1:1，其中该试剂的折射率(n20D)≥1.45，其中封片前的透明程序为：
①脱水(70％-100％乙醇)
②透明Ⅰ(5-10min)
③透明Ⅱ(5-10min)
④透明Ⅲ(5-10min)；
通过手动和自动染色机完成。
5.根据权利要求1所述的一种环保的石蜡切片透明脱蜡试剂，其特征在于：所述该环保的石蜡切片透明脱蜡试剂中封片剂具体配制为以D-柠檬烯、异构十二烷等体积混合作溶剂溶解冷杉胶，其中冷杉胶的质量百分比为50—60％，折射率(n20D)≥1.50。
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