CN105067413B - 一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法 - Google Patents
一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，有效解决简便、低廉、安全的用于观察植物中单宁类物质分布结构的问题，方法是，将植物切成1mm3的小块，切块置入浸渍液中浸渍2—16h，再置入锇酸固定1~2h，用蒸馏水漂洗5min，用乙醇溶液脱水；将Epon 812用乙醇渗透，静置12h；将切块包入胶囊或包埋板中，加入Epon 812，加热，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；将包埋块修整成梯形，切成厚度60~80μm的切片，制干；将切片用绿茶提取液染色，用蒸馏水洗涤三次，室温晾干，本发明方法简单，易操作，成本低，安全，污染少，成功率高，效果好，有效用于观察植物细胞中单宁类物质分布结构，是植物切片染色上的一大创新。
Description
技术领域
本发明涉及植物显微形态学领域，特别是一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法。
背景技术
单宁即鞣质，指分子量为500-3000的能沉淀蛋白质、生物碱的水溶性多酚化合物。单宁广泛存在于中草药和植物食品，由于具有独特的功能活性，目前植物多酚已广泛应用于医药、食品、制革和日用化工等相关领域，并发挥着不可替代的作用。医药上单宁可止血愈伤，抑菌抗过敏，尤其是具有抗氧化、抗癌变、防止心脑血管疾病的功效，成为近年酚类物质的研究热点。在亚显微结构水平上观察单宁的产生、运输、储存和分布需要做超薄切片。超薄切片要经过染色才能在电镜下显示清晰的结构，铅和铀盐都是优良染色剂，但染色特征又有不同，所以经常采用“双染色法”，即先用铀染，后用铅染，铀、铅双染色已成为超薄切片常规染色方法（见“植物显微技术”，科学出版社2010年6月第二版72页倒数第3、4行），自20世纪60年代以来，通常采用醋酸铀-柠檬酸铅双染法进行电子染色，以提高细胞结构成分的反差，增强图象的清晰度，使各种组织成分达到满意的染色效果（见《组织化学与细胞化学技术》，人民卫生出版社2014年12月第2版第79页，以及“醋酸双氧铀-柠檬酸铅染液复染方法的具体步骤及染色液配制”，2008年7月7日百度知道）。然而，醋酸铀（又称乙酸铀）和柠檬酸铅不仅价格昂贵，醋酸铀本身具有放射性，光照和高温下不稳定（详见百度百科醋酸铀即乙酸铀危险品运输编号2917和《安徽农业科学》2013年第13期），因此使用时应注意避光，铀也是一种核燃料，醋酸铀的使用在许多国家受到限制。柠檬酸铅毒性大（见中国化工制造网2013年1月11日柠檬酸铅资料），染色时需注意密封以减少污染，特别是铅染液很容易与空气中CO2分子反应生成碳酸铅沉淀物，造成切片的污染，而且不安全。因此发明一种简便、低廉、安全的用于观察植物中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，是亟待解决的技术问题。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，可有效解决简便、低廉、安全的用于观察植物中单宁类物质分布结构的问题。
本发明解决的技术方案是，将植物材料在含有咖啡碱和戊二醛的浸渍液中浸渍，再用锇酸固定，乙醇脱水，Epon 812包埋，超薄切片，用绿茶提取液染色，具体步骤是：
（1）、切块：在室温下，将植物切成1mm3的小块，0~4℃保存；
（2）、浸渍和固定：首先配制浸渍液，浸渍液是由pH7.0的磷酸缓冲液、戊二醛、咖啡碱混匀制成，重量百分比为戊二醛3%~9%、咖啡碱0.5-2.5%和余量为pH7.0的磷酸缓冲液（总量100%），切块置入浸渍液中浸渍2—16h，开始时，每0.5-1h更换一次浸渍液，连续更换3次，得浸渍后的切块；浸渍后的切块再置入质量浓度1%~2%的锇酸（OsO4）固定液固定1~2h；
（3）、漂洗：从锇酸固定液中取出切块，用蒸馏水漂洗5min，去除切块表面的锇酸；
（4）、脱水：在室温下，依次用体积浓度30%乙醇溶液、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度70%乙醇溶液、体积浓度90%乙醇溶液各脱水10~20min，将切块捞出，再用100%乙醇溶液中脱水2-3次，每次10-20min；
（5）、渗透：采用梯度对Epon 812渗透，方法是，首先按重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰3混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为3︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812，35~40℃下静置12h；
（6）、包埋和聚合：将切块包入胶囊或包埋板中，加入渗透后的Epon 812，放烘箱中加热，35℃加热12h ，45℃加热12h ，60℃加热24h，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；
（7）、修块：将包埋块经粗修，修整成梯形；
（8）、切片：将梯形包埋块切成厚度60~80μm的切片，制干；
（9）、染色：将切片相间隔放在蜡盘上，用吸管吸取体积浓度0.2-0.5%的绿茶提取液，逐滴滴在切片上，盖好蜡盘染色10-30分钟；
所述的蜡盘是由培养皿中浇铸融化的石蜡，冷却后制成；
所述的绿茶提取液，取绿茶1kg，粉碎，45-50℃下，用体积浓度70%乙醇8L浸渍30min，过滤，滤液在50℃下用旋转蒸发仪去除乙醇，浓缩得到浸出物，将浸出物在真空干燥箱中40 ℃干燥24h，得到粗提物，磨碎，4℃保存，使用时用水稀释成所需体积浓度0.2-0.5%的绿茶提取液；
（10）、漂洗：取出切片，用蒸馏水洗涤三次，滤纸吸出水分，室温晾干；
（11）、镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥，在透射电镜下观察照相，得结构清晰的图像。
本发明方法简单，易操作，成本低，安全，污染少，成功率高，效果好，有效用于观察植物细胞中单宁类物质分布结构，是植物切片染色上的一大创新，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，由以下步骤实现：
（1）、切块：在室温下，用刀片将植物切成1mm3的小块，0~4℃保存；
（2）、浸渍和固定：首先配制浸渍液，浸渍液是由pH7.0的磷酸缓冲液、戊二醛、咖啡碱混匀制成，重量百分比为戊二醛5-7%、咖啡碱1-2%和余量为pH7.0的磷酸缓冲液（总量100%），切块置入浸渍液中浸渍2—16h，开始时，每0.5-1h更换一次浸渍液，连续更换3次，得浸渍后的切块；浸渍后的切块再置入质量浓度1.5%的锇酸（OsO4）固定液固定1~2h；
（3）、漂洗：从锇酸固定液中取出切块，用蒸馏水漂洗5min，去除切块表面的锇酸；
（4）、脱水：在室温下，依次用体积浓度30%乙醇溶液、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度70%乙醇溶液、体积浓度90%乙醇溶液各脱水12-18min，将切块捞出，再用100%乙醇溶液中脱水2-3次，每次12-18min；
（5）、渗透：采用梯度对Epon 812渗透，方法是，首先按重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰3混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为3︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812，35~40℃下静置12h；
（6）、包埋和聚合：将切块包入胶囊或包埋板中，加入渗透后的Epon 812，放烘箱中加热，35℃加热12h，45℃加热12h，60℃加热24h，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；
（7）、修块：将包埋块经粗修，修整成梯形；
（8）、切片：在切片机上固定好梯形包埋块和切片刀，切成厚度65-75μm的切片，铜网捞出，制干；
（9）、染色：将放有切片的铜网相间隔放在蜡盘上，用吸管吸取体积浓度0.3-0.4%的绿茶提取液，逐滴滴在切片上，盖好蜡盘染色10-30分钟；
（10）、漂洗：取出铜网切片，用蒸馏水洗涤三次，滤纸吸出水分，室温晾干；
（11）、镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥，在透射电镜下观察照相，得结构清晰的图像。
实施例2
本发明在具体实施中，由以下步骤实现：
（1）、切块：在室温下，用刀片将植物切成1mm3的小块，0~4℃保存；
（2）、浸渍和固定：首先配制浸渍液，浸渍液是由pH7.0的磷酸缓冲液、戊二醛、咖啡碱混匀制成，重量百分比为戊二醛6%、咖啡碱1.5%和余量为pH7.0的磷酸缓冲液（总量100%），切块置入浸渍液中浸渍2—16h，开始时，每0.5-1h更换一次浸渍液，连续更换3次，得浸渍后的切块；浸渍后的切块再置入质量浓度1%~2%的锇酸（OsO4）固定液固定1~2h；
（3）、漂洗：从锇酸固定液中取出切块，用蒸馏水漂洗5min，去除切块表面的锇酸；
（4）、脱水：在室温下，依次用体积浓度30%乙醇溶液、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度70%乙醇溶液、体积浓度90%乙醇溶液各脱水15min，将切块捞出，再用100%乙醇溶液中脱水2-3次，每次15min；
（5）、渗透：采用梯度对Epon 812渗透，方法是，首先按重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰3混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为3︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812，35~40℃下静置12h；
（6）、包埋和聚合：将切块包入胶囊或包埋板中，加入渗透后的Epon 812，放烘箱中加热，35℃加热12h，45℃加热12h，60℃加热24h，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；
（7）、修块：将包埋块经粗修，修整成梯形；
（8）、切片：在切片机上固定好梯形包埋块和切片刀，切成厚度75μm的切片，铜网捞出，制干；
（9）、染色：将放有切片的铜网相间隔放在蜡盘上，用吸管吸取体积浓度0.4%的绿茶提取液，逐滴滴在切片上，盖好蜡盘染色10-30分钟；
（10）、漂洗：取出铜网切片，用蒸馏水洗涤三次，滤纸吸出水分，室温晾干；
（11）、镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥，在透射电镜下观察照相，得结构清晰的图像。
本发明具有操作容易，成本低，安全，污染少，成功率高，效果好的特点，实验证明，本发明有两大特色，一是材料的浸渍和固定中，用戊二醛和咖啡碱混合液，使得单宁在这个步骤中与咖啡碱发生反应，起到了电子染色的效果。二是利用绿茶粗提物中的10-35% (w/w) 的多酚进行染色，多酚可通过疏水键和多点氢键与蛋白质发生结合反应是其最重要的化学特征；多酚与其他生物大分子，如生物碱、多糖等的分子复合反应也与此相似。
经以山茱萸、柿子和葡萄三种果实为材料做实验，取得了非常满意的有益技术效果，制作超薄切片用绿茶粗提物染色可长期保存使用，能有效提高细胞结构成分的反差，增强图象的清晰度，使各种组织成分达到满意的染色效果，观察结果清晰。与现有的染色方法相比，具有使用安全、成本低，操作容易的特点，染色剂方面可节约成本90%以上（即仅是原成本的1/10），观察结果不亚于现有的任何染色方法，成功率达99.9%，工作效率提高50%以上，可广泛用于观察单宁类物质分布的植物超薄切片的染色，染色方法的简易、成本低廉及安全有效，质量之好是未曾料到的，其显著进步是现行方法无可相比的，是超薄切片染色方法的一大创造，有显著的经济和社会效益。
Claims (3)
1.一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，其特征在于，具体步骤是：
（1）、切块：在室温下，将植物切成1mm3的小块，0~4℃保存；
（2）、浸渍和固定：首先配制浸渍液，浸渍液是由pH7.0的磷酸缓冲液、戊二醛、咖啡碱混匀制成，重量百分比为戊二醛3%~9%、咖啡碱0.5-2.5%和余量为pH7.0的磷酸缓冲液，切块置入浸渍液中浸渍2—16h，开始时，每0.5-1h更换一次浸渍液，连续更换3次，得浸渍后的切块；浸渍后的切块再置入质量浓度1%~2%的锇酸固定液固定1~2h；
（3）、漂洗：从锇酸固定液中取出切块，用蒸馏水漂洗5min，去除切块表面的锇酸；
（4）、脱水：在室温下，依次用体积浓度30%乙醇溶液、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度70%乙醇溶液、体积浓度90%乙醇溶液各脱水10~20min，将切块捞出，再用100%乙醇溶液中脱水2-3次，每次10-20min；
（5）、渗透：采用梯度对Epon 812渗透，方法是，首先按重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰3混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为3︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812，35~40℃下静置12h；
（6）、包埋和聚合：将切块包入胶囊或包埋板中，加入渗透后的Epon 812，放烘箱中加热，35℃加热12h ，45℃加热12h ，60℃加热24h，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；
（7）、修块：将包埋块经粗修，修整成梯形；
（8）、切片：将梯形包埋块切成厚度60~80μm的切片，制干；
（9）、染色：将切片相间隔放在蜡盘上，用吸管吸取体积浓度0.2-0.5%的绿茶提取液，逐滴滴在切片上，盖好蜡盘染色10-30分钟；
所述的蜡盘是由培养皿中浇铸融化的石蜡，冷却后制成；
所述的绿茶提取液，取绿茶1kg，粉碎，45-50℃下，用体积浓度70%乙醇8L浸渍30min，过滤，滤液在50℃下用旋转蒸发仪去除乙醇，浓缩得到浸出物，将浸出物在真空干燥箱中40℃干燥24h，得到粗提物，磨碎，4℃保存，使用时用水稀释成所需体积浓度0.2-0.5%的绿茶提取液；
（10）、漂洗：取出切片，用蒸馏水洗涤三次，滤纸吸出水分，室温晾干；
（11）、镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥，在透射电镜下观察照相，得结构清晰的图像。
2.根据权利要求1所述的用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，其特征在于，由以下步骤实现：
（1）、切块：在室温下，用刀片将植物切成1mm3的小块，0~4℃保存；
（2）、浸渍和固定：首先配制浸渍液，浸渍液是由pH7.0的磷酸缓冲液、戊二醛、咖啡碱混匀制成，重量百分比为戊二醛5-7%、咖啡碱1-2%和余量为pH7.0的磷酸缓冲液，切块置入浸渍液中浸渍2—16h，开始时，每0.5-1h更换一次浸渍液，连续更换3次，得浸渍后的切块；浸渍后的切块再置入质量浓度1.5%的锇酸固定液固定1~2h；
（3）、漂洗：从锇酸固定液中取出切块，用蒸馏水漂洗5min，去除切块表面的锇酸；
（4）、脱水：在室温下，依次用体积浓度30%乙醇溶液、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度70%乙醇溶液、体积浓度90%乙醇溶液各脱水12-18min，将切块捞出，再用100%乙醇溶液中脱水2-3次，每次12-18min；
（5）、渗透：采用梯度对Epon 812渗透，方法是，首先按重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰3混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为3︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812，35~40℃下静置12h；
（6）、包埋和聚合：将切块包入胶囊或包埋板中，加入渗透后的Epon 812，放烘箱中加热，35℃加热12h，45℃加热12h，60℃加热24h，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；
（7）、修块：将包埋块经粗修，修整成梯形；
（8）、切片：在切片机上固定好梯形包埋块和切片刀，切成厚度65-75μm的切片，铜网捞出，制干；
（9）、染色：将放有切片的铜网相间隔放在蜡盘上，用吸管吸取体积浓度0.3-0.4%的绿茶提取液，逐滴滴在切片上，盖好蜡盘染色10-30分钟；
（10）、漂洗：取出铜网切片，用蒸馏水洗涤三次，滤纸吸出水分，室温晾干；
（11）、镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥，在透射电镜下观察照相，得结构清晰的图像。
3.根据权利要求1所述的用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，其特征在于，由以下步骤实现：
（1）、切块：在室温下，用刀片将植物切成1mm3的小块，0~4℃保存；
（2）、浸渍和固定：首先配制浸渍液，浸渍液是由pH7.0的磷酸缓冲液、戊二醛、咖啡碱混匀制成，重量百分比为戊二醛6%、咖啡碱1.5%和余量为pH7.0的磷酸缓冲液，切块置入浸渍液中浸渍2—16h，开始时，每0.5-1h更换一次浸渍液，连续更换3次，得浸渍后的切块；浸渍后的切块再置入质量浓度1%~2%的锇酸固定液固定1~2h；
（3）、漂洗：从锇酸固定液中取出切块，用蒸馏水漂洗5min，去除切块表面的锇酸；
（4）、脱水：在室温下，依次用体积浓度30%乙醇溶液、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度70%乙醇溶液、体积浓度90%乙醇溶液各脱水15min，将切块捞出，再用100%乙醇溶液中脱水2-3次，每次15min；
（5）、渗透：采用梯度对Epon 812渗透，方法是，首先按重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰3混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为1︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812；再以重量计Epon 812︰100%乙醇为3︰1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812，35~40℃下静置12h；
（6）、包埋和聚合：将切块包入胶囊或包埋板中，加入渗透后的Epon 812，放烘箱中加热，35℃加热12h，45℃加热12h，60℃加热24h，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；
（7）、修块：将包埋块经粗修，修整成梯形；
（8）、切片：在切片机上固定好梯形包埋块和切片刀，切成厚度75μm的切片，铜网捞出，制干；
（9）、染色：将放有切片的铜网相间隔放在蜡盘上，用吸管吸取体积浓度0.4%的绿茶提取液，逐滴滴在切片上，盖好蜡盘染色10-30分钟；
（10）、漂洗：取出铜网切片，用蒸馏水洗涤三次，滤纸吸出水分，室温晾干；
（11）、镜检：将染色后的切片放入干燥器中干燥，在透射电镜下观察照相，得结构清晰的图像。
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2015
- 2015-09-21 CN CN201510599958.1A patent/CN105067413B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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