DE10305768A1 - Verfahren zum Färben von lipophilen Zellbestandteilen einer biologischen Probe - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein schnelles Verfahren zum Färben von lipophilen Zellen und Zellbestandteilen einer biologischen Probe, im besonderen von eosinophilen Leukozyten mit einem aus der Flechte Xanthoria parietina extrahierten, auch in höheren Pflanzen vorkommenden Fluoreszenzfarbstoff.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Färben von lipophilen Zellbestandteilen einer biologischen Probe, im besonderen von eosinophilen Leukozyten mit einem Physcion-haltigen Extrakt aus Pflanzen.
- Für den hämatologischen Status eines Individuums ist neben der Vollblutzahl besonders das Leukozytendifferential von Bedeutung. Das periphere Blut von Menschen enthält fünf Typen von Leukozyten, nämlich Lymphozyten (B-Zellen, T-Zellen und natürliche Killerzellen), Monozyten, Neutrophile, Basophile und Eosinophile in allen Reifestadien. Diese Leukozytentypen unterscheiden sich voneinander in der Funktion und kommen normalerweise in einem bestimmten Zahlenverhältnis vor, welches sich aber durch verschiedene Krankheitseinflüsse verschieben kann. Ein Nachweis über Art und Menge der jeweiligen Leukozyten ist daher sehr wichtig bei der Diagnose verschiedener Krankheiten. Beispielsweise ist die Anzahl der Neutrophilen bei Entzündungen, Myokardinfarkt und Leukämien erhöht, bei vitalen Erkrankungen dagegen erniedrigt. Eine erhöhte Anzahl der Eosinophilen ist bei Parasitosen, Hodgkin-Krankheit und Allergosen, auch bei eosinophilem Erythrödem, zu finden.
- Der Stand der Technik kennt zahlreiche Verfahren zum Zählen von Zellen, in vielen Laboratorien werden Vollblutzahlen (d.h. die Anzahl der Zellen pro Standardeinheit des Volumens) und Leukozytendifferentiale (d.h. die Anzahl der Zellen eines gegebenen Typs pro Standardeinheit des Volumens) mit dem visuellen Zählverfahren oder manuellen Verfahren durchgeführt. Bei diesem Verfahren wird eine Blutprobe mit bestimmtem Volumen auf ein Objektglas gestrichen, die Zellen werden unter dem Lichtmikroskop gezählt und ihre Anzahl je nach Volumenfaktor multipliziert. Die Identifizierung der Leukozyten erfolgt dabei manuell anhand ihrer morphologischen Merkmale. Bei einer Anzahl von 100-200 Leukozyten in einer durchschnittlichen Blutprobe führt diese Methode allerdings zu einer hohen Ungenauigkeit des Zählergebnisses.
- In einem weiteren Verfahren werden die Zellen entweder elektrisch durch eine Öffnungsimpedanz (z.B. Coulter Counter®) oder optisch durch Lichtstreuung nachgewiesen. Allerdings müssen bei diesen Ver fahren die Erythrozyten zuvor von den Leukozyten getrennt werden, da bei einer von einem gesunden Individuum stammenden Blutprobe das Verhältnis von Erythrozyten zu Leukozyten 1000:1 beträgt und die Erythrozyten zu störenden Effekten führen können.
- Die
US 4 661 913 ,US 4 284 412 undUS 3 826 364 beschreiben ein Verfahren zur Leukozytendifterenzierung mittels Durchflusszytometer. In diesem Verfahren werden verschiedene Populationen von Leukozyten in einer heterogenen Probe durch Nachweis mehrerer unabhängiger Parameter für einzelne Zellen, die durch den Nachweisbereich treten, identifiziert. Als Parameter werden Lichtstreuung und Fluoreszenz genannt, wobei die Fluoreszenz für Zellen gemessen wird, die einen Nucleinsäurefarbstoff enthalten oder mit Fluorochrom-gekoppeltem Antikörper markiert sind. DieDE 69120 026T2 offenbart Farbstoffe, die zur selektiven Färbung verschiedener Leukozytentypen geeignet sind. Es handelt sich dabei um den Fluorochromfarbstoff Astrazongelb 3G der eosinophile und basophile Leukozyten anfärbt, aber auch unspezifisch unreife Granulozyten. DieDE 692 17 757T2 beschreibt die spezifische Färbung von stark basischen Substanzen in Körnchen von eosinophilen Leukozyten mit dem Fluorochromfarbstoff Neutralrot, so dass die Eosinophilen rot fluoreszieren. Es wird vorgeschlagen die Intensität der Fluoreszenz nach Untersuchung mit einem Durchflusszytometer im Streulichtdiagramm auszuwerten. - Allerdings ist durch Rost, F.W.D., Fluorescence Microscopy, Vol. II, S. 333, Cambridge University Press, 1995, ISBN 0-521-41088-6 bekannt, dass der Fluorochromfarbstoff Neutralrot nur eine sehr geringe Fluoreszenzintensität aufweist und bevorzugt zur Färbung von Nuclei und des Golgiapparates geeignet ist.
- Im Blut gesunder Menschen beträgt die Anzahl der eosinophilen Leukozyten nur 40-400 je μl Vollblut, gegenüber 2500-7500 Neutrophilen, 1500-3500 Lymphocyten oder 200-800 Monocyten. Für die medizinische Diagnostik, insbesondere für Diagnostik und Behandlung von Parasitosen, Hodgkin-Krankheit, eosinophilem Erythrödem, Bronchialasthma und Allergosen ist ein zuverlässiges Färbeverfahren speziell für die eosinophilen Leukozyten sehr wichtig. Da bisher kein einfach durchzuführendes Verfahren zur schnellen Färbung von eosinophilen Leukozyten in Vollblut bekannt ist, besteht der Bedarf für einen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff und ein entsprechendes Schnellfärbeverfahren zur speziellen Färbung von eosinophilen Leukozyten.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen geeigneten Farbstoff und ein zum Stand der Technik alternatives Färbeverfahren zum Anfärben von lipophilen Zellbestandteilen einer biologischen Probe, im besonderen zum Anfärben von eosinophilen Leukozyten bereitzustellen, das einfach, schnell und kostengünstig durchzuführen ist.
- Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit der Bereitstellung eines Physcion-haltigen Farbstoffextraktes aus Pflanzen und Flechten und mit einem Verfahren zur selektiven Färbung von lipophilen Zellbestandteilen einer biologischen Probe, im besonderen zum Anfärben von eosinophilen Leukozyten gemäß Anspruch 1.
- Die Charakteristika des Farbstoffextraktes und des Färbeverfahrens werden durch die folgenden Figuren dargestellt:
-
1 : Extinktionsspektrum des Farbstoffextraktes von Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. in Aceton -
2 : Vollblutausstrichpräparat gefärbt mit einem Farbstoffextrakt von Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. in Aceton. Darstellung von Erythrozyten (1 ) und einem eosinophilen Leukozyt (2 ) im Fluoreszenzmikroskop bei Blaulichtanregung (470–490 nm; Leica Filterblock K3) -
3 : Vollblutausstrichpräparat gefärbt mit einem Farbstoffextrakt von Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. in Aceton. Vergleichende Darstellung von Erythrozyten (1 ) und einem eosinophilen Leukozyt (2 ) im Mikroskop bei Fluoreszenz (A) und bei Durchlicht (B) -
4 : Färbung der suberinierten Zellwände (mit Pfeil markiert) einer Leitbündelscheide von Ranunculus repens im Fluoreszenzmikroskop bei Blaulichtanregung (Filter 495/30 nm; Emission: Filter 605/55 nm; Chroma). - Überraschenderweise wurde gefunden, dass ein Extrakt der Flechte Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. und ein Extrakt aus Wurzeln von Rhabarber (Rheum palmatum) besonders zur Färbung von lipophilen Zellbestandteilen einer biologischen Probe, im besonderen zum Anfärben von eosinophilen Leukozyten geeignet ist. In wässriger Lösung dringt der Naturfarbstoff in lebende Zellen ein und färbt selektiv lipophile Zellbestandteile, die unter Fluoreszenzanregung sichtbar werden.
- Der für die Färbung wichtigste Bestandteil des Extraktes aus der Flechte Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. und des Extraktes aus Wurzeln von Rhabarber (Rheum palmatum) ist Physcion, ein Stoff, der auch in verschiedenen höheren Pflanzen vorkommt und dort vermutlich als Fraßschutz vor Feinden wirkt. Nach N. Schweppe (Handbuch der Naturfarbstoffe, Seite 215, Nikol Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG, ISBN 3-933203-46-5) gehören zu den Physcion-haltigen Spezies neben Rheum- auch Rumex-, Polygonum-, Rhamnus- und Cassia-Arten, sowie Wurzelrinde von Ventilago maderaspatana, Rinde von Haronga madagascariensis, Kernholz von Vataireopsis araroba, neben der Flechte Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. auch X. fallax, X. elegans, Teloschistes flavicans, T. exilis, Stereocaulon corticulatum, Caloplaca cinnabarina und Fulgensia fulgida.
- Die Strukturformel von Physcion lautet gemäß H. Schweppe
-
- Die Extraktion des Farbstoffes aus Physcion-haltigen Pflanzen, bevorzugt aus der Flechte Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. und aus Wurzeln von Rhabarber (Rheum palmatum), erfolgt nach einem dem Durchschnittsfachmann geläufigen Extraktionsverfahren mit reinem Aceton bei Raumtemperatur. Physcion (= Parietin) (siehe Huneck, Yoshimura, 1996) kristallisiert aus acetonischer Lösung in Form orangefarbiger Kristalle aus, die bei Blaulichtanregung eine intensive Fluoreszenz zeigen.
- In Aceton gelöst zeigt der Physcion-haltige Farbstoffextrakt eine starke Extinktion zwischen 450 und 520 nm Wellenlänge mit einem Absorptionsmaximum nahe 495 nm, wobei beispielsweise die Emission von gefärbten, suberin-inkrustierten Zellwänden ein Maximum bei 570 nm hat.
1 zeigt das Extinktionsspektrum des Farbstoffextraktes von Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. in Aceton mit dem Absorptionsmaximum nahe 495 nm. - Das Ausgangsmaterial für die Färbung umfasst Pflanzenmaterial, Bakterien oder eine biologische Probe einer Körperflüssigkeit, wobei die Flüssigkeit Spinalflüssigkeit, peritoneale Flüssigkeit oder Gehirnflüssigkeit, Urin oder Vollblut ist und außerdem Gewebezellsuspensionen von Knochenmark, Lymphknoten, Milz- und Leberzellen.
- Die biologische Probe ist ebenfalls eine aus Pflanzen oder pflanzlichen Zellen gewonnene Suspensionsflüssigkeit.
- In einem Färbeverfahren wird sowohl konzentrierter Farbstoftextrakt in Aceton als auch verdünnte wässrige Farbstoffextraktlösung verwendet, dadurch variieren die Färbezeiten von wenigen Minuten bis hin zu Stunden. Dem mit Fluoreszenzfarbstoffen vertrauten Durchschnittsfachmann ist geläufig, dass der Färbevorgang und die Aufbewahrung der hergestellten Präparate soweit wie möglich unter Ausschluss von Lichteinwirkung erfolgen müssen.
- Der erfindungsgemäße Farbstoffextrakt hat den Vorteil, dass er, neben lipophilen Zellen und Zellbestandteilen in biologischen Proben aus Pflanzen und Tieren, in einem Vollblutausstrich selektiv nur eosinophile Leukozyten anfärbt, wobei überraschenderweise nicht die Kerne angefärbt werden.
- Die Analyse der gefärbten Zellen oder Zellbestandteile erfolgt aufgrund der Extinktion im Bereich von 450 und 520 nm und dem Absorptionsmaximum nahe 495 nm (
1 ) des erfindungsgemäßen Farbstoftextraktes bevorzugt im Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung von Lichtquellen wie Xenon- oder Quecksilberlampen. Bei geringeren Ansprüchen an die Fluoreszenzintensität ist auch ein Nachweis mit Halogenlampe möglich. Darüber hinaus wird der Farbstoff mit Laserlicht (488 nm) angeregt. - Zur besseren Analyse in der Fluoreszenzmikroskopie werden entsprechende Anregungsfilter eingesetzt, z. B. 495/30 nm oder 470–490 nm. Wenn ein besonders helles Fluoreszenzbild gefordert wird, ist für die Emission ein Filter vom Typ LP (Langpass) 515 oder LP 540 geeignet. Unterhalb von 540 nm ist die Fluoreszenz gering. Um das Maximum der Emission (um 570 nm) zu nutzen, wird ein Filter 570/40 eingesetzt. Ein längerwelliger Teil der Emission wird mit einem Filter 605/55 separat erfasst, die bei Pflanzen evtl. störende Chlorophyllfluoreszenz spielt hierbei keine große Rolle.
4 zeigt die Färbung der suberinierten Zellwände einer Leitbündelscheide von Ranunculus repens im Fluoreszenzmikroskop bei Blaulichtanregung (495/30 nm, mit Emissions-Filter 605/55 der Firma Chromo). Die Wahl dieses Emissions-Filters ist besonders gut geeignet, wenn die Darstellung der gefärbten Probe im Fluoreszenzmikroskop möglichst frei von störendem Hintergrund sein soll. - Der Farbstoftextrakt wird auch in wässriger Lösung angewandt und ist daher generell für Verfahren der Durchflußzytophotometrie (z. B. FACS) geeignet.
- Die Erfindung wurde in Bezug auf die Verwendung von Farbstoffextrakt beschrieben. Es ist einem Fachmann jedoch klar, dass das Verfahren auch unter Verwendung von reinem, kommerziell erhältlichen Physcion durchgeführt werden kann.
- In einem besonderen erfindungsgemäßen Verfahren zur Färbung von Zellen und Zellbestandteilen einer biologischen Probe wie z.B. einem Blutausstrich wird der Farbstoffextrakt zum selektiven Nachweis einer Gruppe von Leukozyten, den eosinophilen Leukozyten (auch eosinophile Granulozyten genannt) verwendet. Das Verfahren zur Färbung ist sehr schnell und kostengünstig durchführbar, der zeitaufwendige Schritt der Erythrozyten-Abtrennung entfällt, so dass es zum schnellen Nachweis eosinophilen Leukozyten, die im Vollblut gesunder Menschen weniger häufig als Erythrozyten vorkommen, gut geeignet ist.
- Die Fluoreszenz ist deutlich vor dem dunklen Hintergrund sichtbar, da die Granula innerhalb der eosinophilen Leukozyten hell fluoreszieren. Zellkerne werden nicht angefärbt, sie erscheinen innerhalb der Zellen als dunkle Stellen. Durch ihr charakteristisches Erscheinungsbild (
2 ) wird das Auffinden der eosinophilen Leukozyten erleichtert. Durch die Wahl eines Naturfarbstoffes sind im Gegensatz zu den synthetisch hergestellten Farbstoffen kaum störende Nebeneffekte durch Synthesezwischenprodukte zu beobachten. Darüber hinaus wird die Gefahr von Vergiftungen für das Laborpersonal durch im Verlauf einer künstlichen Synthese entstehende und aus dem Endprodukt nicht vollständig entfernte toxische Zwischenprodukte erheblich vermindert. - Ein Vollblutausstrich (aus humaner oder tierischer Blutprobe) wird zur Vorbereitung an der Luft getrocknet, in 96 %igem Ethanol fixiert und erneut an der Luft getrocknet. Die Inkubation mit dem Farbstoffextrakt erfolgt in Aceton. Überschuss an Farbstoffextrakt wird durch kurzes Spülen mit Wasser entfernt. Die eosinophilen Leukozyten fallen nach diesem schnellen und einfachen Verfahren durch eine deutliche Fluoreszenz im Mikroskop auf.
2 zeigt ein Vollblutausstrichpräparat gefärbt mit einem Farbstoffextrakt von Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. in Aceton. Dargestellt sind die nichtgefärbten Erythrozyten (1 ) und ein deutlich fluoreszierender eosinophiler Leukozyt (2 ) im Fluoreszenzmikroskop bei Blaulichtanregung (470–490 nm; Leica Filterblock K3). - Alle anderen Leukozyten-Arten, wie Basophile und Neutrophile, werden nicht angefärbt, sie können aber darüber hinaus im gleichen Präparat nach Auswaschen mit reinem Aceton (ca. 30 Sekunden) durch anschließende Standard-Färbungen für Blutausstriche (wie z.B. May-Grünwald-Färbung) für die Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht werden.
3 zeigt ein Vollblutausstrichpräparat gefärbt mit einem Farbstoffextrakt von Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. in Aceton. Vergleichend ist dasselbe Präparat mit Erythrozyten (1 ) und einem eosinophilen Leukozyt (2 ) im Mikroskop bei Fluoreszenz (A) und nach Auswaschen des Farbstoffes mit Aceton und anschließendem Standardfärbeverfahren für Blutausstriche (wie z.B. May-Grünwald-Färbung) im Durchlicht (B) dargestellt. Der eosinophile Leukozyt (2 ) wird im Fluoreszenzlicht (A) deutlich markiert und ist von den nicht markierten Erythrozyten (1 ) leicht zu unterscheiden. - Das Verfahren kann in einem breiten Diagnostikbereich, z.B. der medizinischen Hämatologie und Cytologie, in der Pflanzenphysiologie, in der Bakteriologie und sogar in der Kriminalistik angewandt werden.
- In einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren zur Färbung von pflanzlichen Zellen werden Handschnitte von Pflanzenorganen ohne weitere Vorbehandlung direkt in ein Konzentrat des Farbstoffextraktes in Aceton eingelegt und anschließend gewässert. In
4 ist eine Leitbündelscheide von Ranunculus repens im Fluoreszenzmikroskop bei Blaulichtanregung (470–490 nm; Chromo Filter 605/55) dargestellt, der Farbstoffextraktes färbt spezifisch die suberinisierten Zellwände. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Farbstoffextraktes gegenüber bisher gebräuchlichen Fluoreszenzfarbstoffen für Zellwandsubstanzen (wie z.B. Chelidonium-Extrakt oder Berberinsulfat) beruht darauf, dass Lignin nicht angefärbt wird. - 1. Färbung von pflanzlichen Zellen und Geweben
- Die Färbung erfolgt mit 1–2 g Farbstoffextrakt/l Aceton, die zu färbende Probe (z. B. frische Handschnitte ohne weitere Vorbehandlung) wird in einem Glasgefäß mit Deckel 60 Sekunden bis 5 Minuten, bevorzugt 90 Sekunden mit Farbstoffextrakt bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Probe mindestens 2 mm hoch mit der Farbstoffextraktlösung überschichtet sein muss, und nach der Inkubationszeit rasch in reichlich (mindestens 5 ml je Handschnitt) destilliertes Wasser oder Leitungswasser übertragen, um das Aceton und überschüssige Farbstofflösung zu entfernen. Es ist unbedingt zu vermeiden, dass die Schnitte zur Wasseroberfläche aufsteigen und dort schwimmen, da sich sonst, für die spätere Analyse störende, Luftblasen in den Handschnitten bilden können. Danach wird die Probe auf einem Objektglas in Wasser eingelegt, mit einem Deckglas bedeckt und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Es ist dem Fachmann ersichtlich, dass je nach Art der biologischen Probe eine Überfärbung oder Auskristallisieren des Farbstoffs eintreten kann. Die Probe kann in diesem Fall durch kurzes (ca. 20 Sekunden) Einlegen mit in reines Aceton bei Raumtemperatur ausgewaschen und gegebenenfalls erneut gefärbt werden.
- Bei Verwendung von wasserverdünntem Extrakt wird zunächst die Farbstoffextrakt-Aceton-Lösung mit destilliertem Wasser gründlich durch Schütteln gemischt und anschließend gefiltert (z. B. mit aschefreien Papier-Rundfiltern, Macherey-Nagel, MN 640w), um evtl. durch die Verdünnung der Farbstoffextrakt-Aceton-Lösung mit Wasser ausgefallenen Extrakt (Farbstoff) zu entfernen. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass sich bei Verdünnung des Farbstoffextraktes die Färbezeit gegenüber dem konzentrierten Extrakt verlängert. Bei einer Verdünnung von 3:1 ist eine Färbezeit von 1 Stunde bei Raumtemperatur vorteilhaft.
- Nach der Färbung muss die biologische Probe in mindestens 5 ml destilliertem Wasser oder Leitungswasser je Schnitt bei Raumtemperatur ausgewaschen werden, da der Farbstoff auch in Lösung fluoresziert.
- Ist die zu färbende Probe eine aus Pflanzen oder pflanzlichen Zellen gewonnene Suspensionsflüssigkeit, erfolgt die Färbung bevorzugt mit einem Gemisch aus Farbstoffextrakt-Aceton-Lösung und Wasser, mit dem die Suspensionsflüssigkeit gemischt wird, oder die Probe wird alternativ zunächst zentrifugiert und das Pellet anschließend in der Färbeextraktlösung suspendiert. Um die Färbeextraktlösung von der suspendierten pflanzlichen Probe zu trennen, wird die Probe mit der Farbstoffextraktlösung nach Ende der Färbezeit (z. B. 1 Stunde) zentrifugiert (oder filtriert) und das Pellet (oder der Rückstand) in Wasser aufgenommen und danach zur Analyse mit dem Fluoreszenzmikroskop auf ein Objektglas aufgebracht.
- In Aceton gelöst zeigt der Farbstoffextrakt eine starke Extinktion zwischen 450 und 520 nm Wellenlänge mit einem Maximum zwischen 490 und 500 nm nahe 495 nm (
1 ). Die Emission von gefärbten, suberininkrustierten Zellwänden hat ein Maximum bei 570 nm. Der Farbstoff wird auch mit Laserlicht (488 nm) angeregt. - Die Analyse der gefärbten Zellen oder Zellbestandteile erfolgt mit dem Fluoreszenzmikroskop beispielsweise unter Verwendung von Lichtquellen wie Xenon-, Quecksilber oder bei geringeren Ansprüchen an die Fluoreszenzintensität auch bei Halogenlampen. Grundsätzlich darf bei der fluoreszenzmikroskopischen Analyse das gefärbte Material nicht direkt mit Immersionsöl überschichtet werden, da sich Physcion aus dem Farbstoftextrakt in Immersionsöl lösen kann und das entsprechende Präparat hierdurch entfärbt wird.
- Zur besseren Analyse in der Fluoreszenzmikroskopie werden entsprechende Anregungsfilter eingesetzt, z. B. 495/30 nm oder 470–490 nm. Wenn ein besonders helles Fluoreszenzbild gefordert wird, ist für die Emission ein Filter vom Typ LP (Langpass) 515 oder LP 540 geeignet. Unterhalb von 540 nm ist die Fluoreszenz gering. Um das Maximum der Emission (um 570 nm) zu nutzen, wird ein Filter 570/40 eingesetzt. Ein längerwelliger Teil der Emission wird mit einem Filter 605/55 separat erfasst, die bei Pflanzen evtl. störende Chlorophyllfluoreszenz spielt hierbei keine große Rolle. Die Wahl eines Filters K605/55, beispielweise von der Firma Chromo, wird bevorzugt, so dass die Darstellung der gefärbten Probe im Fluoreszenzmiknoskop frei von störendem Hintergrund ist.
4 zeigt dazu beispielsweise die Färbung der suberinisierten Zellwände einer Leitbündelscheide von Ranunculus repens im Fluoreszenzmikroskop bei Blaulichtanregung (495/30 nm; Chroma). - 2. Färbung von Zellen aus einer biologischen Probe
- Zur Vorbereitung werden Ausstriche von frischem Vollblut oder von Vollblut mit Hirudinin- oder EDTA-Zusatz (aus humaner oder tierischer Blutprobe) auf einem Objektträger luftgetrocknet. Nach dem Trocknen werden die Ausstriche in Ethanol (96%ig) zwei Minuten lang fixiert und danach erneut an der Luft getrocknet. Ohne weitere Vorbehandlung erfolgt danach das Färben in dem in reinem Aceton gelösten Fanbstoffextrakt aus Xanthoria parietina. Bei einer Konzentration von 1,3 g/l gelöstem Extrakt ist eine Inkubationszeit von 90 Sekunden bis 5 Minuten bei Raumtemperatur günstig. Ein Wassergehalt der Farbstofflösung von bis etwa 5 % wirkt sich kaum nachteilig oder färbezeitverlängernd aus. Nach der Färbung werden die Ausstriche sofort gründlich in mindestens 30–40 ml destilliertem oder Leitungswasser gespült, um nicht gebundenen Farbstoff auszuwaschen. Nach der anschließenden Trocknung Trocknung (5–15 Minuten) der schräg auf eine Kante, zweckmäßigerweise die Schmalseite gestellten Objektgläser ist die Analyse sofort möglich. Hierbei dürfen die Ausstriche nicht direkt mit Immersionsöl überschichtet werden, da die Ausstriche durch die Löslichkeit von Physcion in Immersionsöl entfärbt werden. Für die fluoreszenzmikroskopische Analyse werden starke Trockenobjektive (z. B. 63/0,90) oder Wasserimmersionen benutzt, bei deren Rechnung eine Deckglasdicke = 0 mm (o. D. = ohne Deckglas) berücksichtigt wird. Bei der Verwendung von Ölimmersionen ist auf den Ausstrich stets ein Deckglas aufzulegen, damit er nicht mit Immersionsöl in Berührung kommt. Zwischen dem Objektglas und dem Deckglas kann sich Luft oder Wasser befinden.
-
2 zeigt ein Vollblutausstrichpräparat gefärbt mit einem Farbstoffextrakt von Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. in Aceton. Dargestellt sind die nichtgefärbten Erythrozyten (1 ) und ein deutlich fluoreszierender eosinophiler Leukozyt (2 ) im Fluoreszenzmikroskop bei Blaulichtanregung (470–490 nm; Leica Filterblock K3). - Alle anderen Leukozyten-Arten, wie Basophile und Neutrophile, werden nicht angefärbt, sie werden erst durch anschließende Standard-Färbungen für Blutausstriche für die Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht.
3 zeigt ein Vollblutausstrichpräparat gefärbt mit einem Farbstoffextrakt von Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. in Aceton. Vergleichend ist dasselbe Präparat mit Erythrozyten (1 ) und einem eosinophilen Leukozyt (2 ) im Mikroskop bei Fluoreszenz (A) und nach Auswaschen des Farbstoffes mit Aceton und Standardfärbung (z.B. May-Grünwaldfärbung) im Durchlicht (B) dargestellt. Der eosinophile Leukozyt (2 ) wird im Fluoreszenzlicht (A) deutlich markiert und ist von den nicht markierten Erythrozyten (1 ) zu unterscheiden. - Die Emission der gefärbten eosinophilen Leukozyten hat ein Maximum bei 570 nm.
- Bei der Analyse der Vollblutausstriche zeigen nur die eosinophilen Leukozyten eine deutliche Fluoreszenz. Obwohl die eosinophilen Leukozyten in einem Vollblutausstrich verhältnismäßig selten sind, werden sie schnell aufgefunden, da die Fluoreszenz ihrer Granula deutlich vor dunklem Hintergrund sichtbar ist, die Zellkerne aber nicht fluoreszieren (
2 ). - Als biologische Probe werden neben Vollblut auch Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Spinalflüssigkeit, peritoneale Flüssigkeit oder Gehirnflüssigkeit oder Urin und außerdem Gewebezellsuspensionen von Knochenmark, Lymphknoten, Milz- und Leberzellen verwendet. Von diesen Proben werden jeweils Ausstrichpräparate analog des Blutausstriches hergestellt.
- 3. Extraktion des Farbstoffes
- Ausgangsmaterial sind beispielsweise im Freiland gesammelte Flechten der Art Xanthoria parietina. Die getrockneten Flechten werden mit Skalpell und/oder Pinzette von anhaftendem Substrat des Wuchsortes und vollständig von Begleit-Flechtenarten befreit. Zur Herstellung einer Stammlösung in Aceton werden z.B. 4 g Flechten bei 60° C getrocknet und mit 60 ml reinem Aceton bei Zimmertemperatur extrahiert. An einer kleinen Teilmenge des Stammextraktes wird nach Verdampfen des Acetons die acetonfreie Extraktmenge/Volumeneinheit Stammlösung durch Wägung bestimmt. Die gebrauchsfertige Farblösung wird durch Verdünnen der Stammlösung auf etwa 1,3 g Extrakt/l Aceton eingestellt.
- Diese Lösung hält sich in einer dunkelbraunen Flasche aufbewahrt bei Zimmertemperatur mindestens 2 Jahre lang. Als Lösungsmittel für den Extrakt werden neben Aceton und Wasser z. B. auch Polyethylenglykol 200 und DMSO verwendet.
- Weiteres Ausgangsmaterial sind getrocknete Teile von anderen, Physcion enthaltenden Pflanzen, wie Rheum, Rumex, Polygonum, Rhamnus und Cassia, sowie Wurzelrinde von Ventilago maderaspatana, Rinde von Haronga madagascariensis, Kernholz von Vataireopsis araroba, neben der Flechte Xanthoria parietina (L.) Th.Fr. auch X. fallax, X. elegans, Teloschistes flavicans, T. exilis, Stereocaulon corticulatum, Caloplaca cinnabarina und Fulgensia fulgida. Zur Herstellung eines Farbstoffextraktes beispielsweise aus Wurzelstöcken von Rheum, werden diese gemahlen und das Material dann wie im oben angegebenen Verfahren mit Aceton extrahiert. Der Extrakt aus Rheum enthält zusätzlich eine größere Anzahl von Substanzen (z. B. Chrysarubin) als der von Xanthoria. Für das Färbeverfahren ergeben sich jedoch keine abweichenden Eigenschaften und auch pflanzliches Material ist gut anfärbbar.
Claims (12)
- Verfahren zum Färben von lipophilen Zellen und Zellbestandteilen aus biologischen Proben, bestehend aus den Schritten – Bereitstellen einer biologischen Probe – Bereitstellen von Physcion-haltigem Farbstoftextrakt – Färbung der lipophilen Zellen und Zellbestandteile mit Physcion-haltigem Farbstoffextrakt - Auswaschen von nicht gebundenem Farbstoff
- Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine Spinalflüssigkeit, peritoneale Flüssigkeit, Gehirnflüssigkeit, Urin oder Vollblut sowie eine Gewebezellsuspensionen von Knochenmark, Lymphknoten, Milz- und Leberzellen ist.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe gemäß Anspruch 2 auf einem Objektträger getrocknet und mit Ethanol fixiert wird.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Physcion-haltige Farbstofflösung ein Extrakt aus einer Physcionhaltigen Pflanze ist, insbesondere mit einer Konzentration von 1-2 g/l in Aceton gelöstem Extrakt.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Physcion-haltige Farbstofflösung 90–300 Sekunden bei Raumtemperatur inkubiert wird.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die lipophilen Zellen insbesondere eosinophile Leukozyten sind.
- sVerfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe ein pflanzlicher Gewebeschnitt oder eine pflanzliche Zellsuspension ist.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die lipophilen Zellbestandteile insbesondere suberinisierte pflanzliche Zellwände sind.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass der Physcion-haltige Farbstoftextrakt in Wasser gelöst ist.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse der gefärbten lipophilen Zellen oder Zellbestandteile im Fluoreszenzmikroskop erfolgt.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Extinktion des Farbstoffes zwischen 450 und 520 nm Wellenlänge mit einem Maximum zwischen 490 und 500 nm gemessen wird.
- Verwendung eines Physcion-haltigen Farbstoffextraktes zum selektiven Nachweis von lipophilen Zellen in einer biologischen Probe.
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| DE2003105768 DE10305768A1 (de) | 2003-02-11 | 2003-02-11 | Verfahren zum Färben von lipophilen Zellbestandteilen einer biologischen Probe |
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