DD229218A5 - Verfahren zum kontinuierlichen und automatischen identifizieren, sortieren und zaehlen von teilchen kleiner abmessungen - Google Patents
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Abstract
Ziel und Aufgabe der Erfindung bestehen darin, das Verfahren so auszugestalten, dass es automatisch ablaeuft und die gewuenschten Ergebnisse rasch und kontinuierlich liefert, bei Vermeidung menschlicher Irrtuemer. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in einem ersten Arbeitsgang eine Folge von Proben vorbereitet und auf einen kontinuierlich sich verschiebenden Traeger kontinuierlich aufgebracht wird, wobei die Proben ueber den Untersuchungsweg eines mit einer Videokamera ausgeruesteten Registriersystems verteilt werden, welche Bilder dieser Proben mittels eines Mikroskops erhaelt, in einem zweiten Arbeitsgang die Registrierung erfolgt, in einem dritten Arbeitsgang das Bild jeder Probe in Karos aufgeteilt wird, in einem vierten Arbeitsgang die Analyse des genannten Bildes gemaess den Techniken der sogenannten Mustererkennung durchgefuehrt wird und schliesslich die Ergebnisse dieser Analyse statistisch behandelt, digitalisiert und inhaltlich der Bedienperson uebergeben werden. Die Erfindung kann insbesondere auf die Analyse von Blut und auf die Suche von Bakterien in Milch angewendet werden.
Description
Berlin, den 17. 4. 85 64 654 16
Verfahren zum kontinuierlichen und automatischen Identifizieren, Sortieren und Zählen von Teilchen kleiner Abmessungen
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum vollautomatischen Identifizieren, Sortieren und Zähl-en von Teilchen mit sehr kleinen Abmessungen, insbesondere (aber nicht ausschließlich) von Mikroorganismen tierischer oder pflanzlicher Herkunft, sowie zum Verwerten von Ergebnissen, die erhalten werden auf Gebieten, die ebenso verschieden sind, wie die biologischen Analysen, z# B, Milch- oder Blutanalysen, oder auf dem Gebiet der automatischen Überwachung einer bakteriellen Verunreinigung, z# B, bei der Selbststeuerung von Stationen zur Reinigung von Industrieabwässern oder von Trinkwasser. Das Verfahren zeichnet sich durch seine Genauigkeit, seine Schnelligkeit und seinen guten Verlauf aus.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Es sind verschiedene Verfahren bekannt, die den Zweck haben, ähnliche Resultate zu erzielen. Beispielsweise besteht im Falle der Analyse von menschlichem Blut das übliche Verfahren in einem ersten Schritt aus dem manuellen Herstellen einer jeden Probe durch verschiedene mechanische und/oder chemische Behandlungen und dann im mikroskopischen Überprüfen derart, daß die verschiedenen untersuchten Zellelemente analysiert und gezählt werden. Diese Technik ist zeit- und arbeitsaufwendig und bring doch noch eine zulässige Fehler-
- 2 quote zwischen 20 und 30 % mit sich.
Ebenso muß für das Analysieren und Zählen der in einer Flüssigkeit vorliegenden Bakterien die Bedienungsperson Proben aus der Flüssigkeit entnehmen, dann jeweils Kulturen anlegen, welche die Bakterien zum Vorschein bringen, was eine Verzögerung von mehreren Stunden bedeutet, und schließlich unter Bezugnahme auf bekannte Formen mit den gleichen Einschränkungen und Nachteilen, wie sie oben angegeben sind, diese Bakterien analysieren und zählen.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein automatisches Verfahren verfügbar zu haben, das erlaubt, die gewünschten Ergebnisse rasch und kontinuierlich unter Vermeidung eines menschlichen Irrtums zu erhalten.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Verfahren in geeigneter Weise auszugestalten«
Die Erfindung gestattet es, dieses Ergebnis durch den Einsatz einer Folge von Arbeitsgängen zu erreichen, deren Prinzip jeweils durch andere Anwendungen bekannt ist, die aber hier mit dem Ziel dieses neuen Ergebnisses miteinander kombiniert und aufeinander abgestimmt sind.
Der erste Arbeitsgang besteht im automatischen und kontinuierlichen Herstellen und Aufbringen einer Folge von Pro-
ben auf einen kontinuierlichen Träger, wobei die Proben über einen Untersuchungsweg eines Systems verteilt werden, das alle Proben nacheinander mittels einer Videokamera registriert.
Der zweite Arbeitsgang besteht in der genannten, mittels einer Videokamera durchgeführten Registrierung des mit Hilfe eines Mikroskops erhaltenen Bildes, wobei das Mikroskop besondere optische Elemente umfaßt.
Der dritte Arbeitsgang besteht in einem Zerlegen des Bildes einer jeden Probe in Karos, wobei eine gewisse Anzahl an Linien und Spalten vorliegt und für jede Probe eine gewisse Anzahl an gut identifizierten Zonen oder "Pixels" definiert werden im Hinblick auf die Analyse einer jeden Probe entsprechend den Techniken, die selbst klassisch sind«
Der vierte Arbeitsgang besteht in der genannten Analyse des Bildes als Funktion des Helligkeitsgrades eines jeden Pixels mittels eines Computers, wobei die Analysenergebnisse für alle Proben statistisch behandelt und dann durch einen Drucker digitalisiert werden* Dies erlaubt nicht nur in jedem Augenblick die Kenntnis des Analysenergebnisses, sondern darüber hinaus das zeitliche Verfolgen der Entwicklung dieser Ergebnisse,
Der Einsatz dieser verschiedene/i Arbeitsgänge erfordert gewisse Erläuterungen/
Erläuterungen bezüglich des ersten Arbeitsganges:
Oede Probe durchläuft vor der Phase des Absetzens auf den Träger eine physikochemische Vorbereitung. Diese Vorbereitung ist mit üblichen Behandlungen bezüglich des betrachteten Produkts vergleichbar wobei aber gewisse Modifikationen vorliegen.
Ebenso diente bei den früheren Techniken z. B# die Phase des Färbens nur dem Zweck, eine ganze Kategorie von Zellen, z# B, Bakterien, sichtbar zu machen, ohne über den Zustand ihrer Entwicklung oder ihres Todes eine Voraussage zu treffen» Gemäß der vorliegenden Erfindung hat das Färben den Zweck, den lebensfähigen Zustand gewisser Zellen anzuzeigen und sie sichtbar zu machen, ohne die Artefakten zu färben» Das benutzte Färbemittel ist Akridin-orange und/oder ein gefärbtes spezielles Serum*
Ebenso erlaubt es nach dem Färben die Anwendung einer Epifluoreszenz-Behandlung (im allgemeinen durch UV-Bestrahlung von oben) , wobei die Reemission gefiltert wird, alle Zellen, die einen Kern enthalten, deutlich zu machen, während eine Immunofluoreszenz-Behandlung gestattet, die Zellen auf spezielle Art zu extrahieren»
Schließlich wird jede Probe in Form von hinsichtlich ihrer Dicke kalibrierten und hinsichtlich ihres Durchmessers konstanten Tropfen automatisch durch Sprühen oder Blasen auf dem kontinuierlichen Träger abgesetzt bzw, niedergeschlagen. Diese Tropfen werden in regelmäßiger und homogener Form auf
dem Träger verteilt, damit sie nacheinander von der Kamera gesehen werden. Gemäß einer ersten Ausführungsform ist der Träger eine um ihre Achse rotierende horizontale Scheibe, und die Tropfen werden in konzentrischen Kreisen niedergeschlagen, damit sie entweder entsprechend den aufeinanderfolgenden Kreisen oder wechselweise radial und kreisförmig untersucht werden» Gemäß einer zweiten Ausführungsform ist der Träger ein kontinuierliches Band, das sich von einer ,- Λ Vorratsrolle abwickelt und auf eine Aufnahmerolle aufwickelt, wobei das Ganze in einer wegwerfbaren Kassette angeordnet ist» Dies beseitigt die Notwendigkeit, den Träger zu waschen, wie im Falle der Scheibe» Im allgemeinen stellt 1 mm die entsprechende Anzahl an Tropfen dar, wovon das statistische Ergebnis als Wert für eine Probe genommen wird, und dies gilt ebenso für die Folgenden. Selbstverständlich wird der Träger nach jeder Messung einem Waschvorgang unterworfen, was automatisch kontrolliert wird»
Erläuterungen bezüglich des zweiten Arbeitsganges:
Das verwendete System umfaßt die Kombination aus einem mit , einer Spezialoptik ausgerüsteten Mikroskop und einer Videokamera, von der das Bild im Hinblick auf den dritten Arbeitsgang zu einem Minicomputer übertragen wird. Dieses Mikroskop übermittelt kontinuierlich Informationen, und es ist daher erforderlich, daß seine genaue Einstellung dauerhaft gewährleistet ist» Zu diesem Zweck ist zwischen dem Objektiv und dem Probenträger eine Mikrometerschraube vorgesehen, die eine mechanische konstante Fokussierung sicherstellt» Das Mikroskop wird vorzugsweise mit direktem UV-
betrieben, da die Beobachtung durch die Kamera foto-
grafiert WiTd1 welche mehr Licht als das menschliche Auge aufnehmen kann»
Erläuterungen bezüglich des dritten Arbeitsganges:
Die Fotografie der Probe durch die Kamera wird auf den Computer übertragen, der seine Analyse entsprechend komplexen, aber gut bekannten Techniken durchführt. Deshalb ist es nicht nötig, diese Techniken im einzelnen zu beschreiben. Es genügt daher der einfache Hinweis» daß das Bild in dem Computer gespeichert wird ("acquisition"), man bestimmt zuerst den Minimalwert der Helligkeit bzw. Beleuchtungsstärke eines Pixel, das einem in Betracht gezogenen Teilchen entspricht ("seuillage") , dann wird diese Schwelle für die Probe festgelegt und man bestimmt den Umriß eines jeden Teilchens, Man wird jedoch feststellen, daß es insbesondere auf die Ausnutzung dieser Technik zurückzuführen ist, daß das erfindungsgemäße Verfahren sich grundsätzlich von den klassischen manuellen Techniken unterscheidet, die sich auf einen visuellen Vergleich mit einer Reihe von gegebenen Formen beschränkt. Dieser Unterschied findet seinen Ausdruck gleichzeitig in der Genauigkeit und der Schnelligkeit der Arbeitsgänge, im Gegensatz zu dem einfachen visuellen, langsamen, ungenauen und eine Fehlerquelle darstellenden Vergleich,
Die folgende Phase dieses Arbeitsganges ist das Sortieren der Teilchen, die durch ihre Abmessungen und Formen definiert sind. Dieses Sortieren wird für jeden Tropfen durchgeführt* Die Ergebnisse aller Tropfen werden dann statistisch
behandelt, was die Genauigkeit der gesammelten Informationen sicherstellt, sowohl in einem bestimmten Augenblick als auch in ihrer Entwicklung mit der Zeit,
Da die allgemeine Technik der Bild- oder Formanalyse ("pattern recognition") eine klassische Methode ist, sind selbstverständlich alle Hilfsarbeitsgänge, welche gleichfalls in der Technik bekannt sind, verwendbar, z» B, das Vorbehandeln ( ) des Bildes im Hinblick auf das Eliminieren des "Hintergrundrauschens", um in den Genuß eines sauberen Bildes zu kommen, oder die Filterung, die Ausdehnung oder die Vereinfachung (Erosion oder Skelettierung) des Bildes» Diese Techniken können in speziellen Fällen angewandt werden.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf zwei praktische Anwendungsbeispiele dieses Verfahrens erläutert»
Im ersten Beispiel wird das erfindungsgemäße Verfahren auf die Suche nach Bakterien in der Milch angewandt»
In diesem Falle beinhaltet der erste Arbeitsgang das Färben der Probe mittels Akridinorange bei einem pH-Wert von 6* In dem Tropfen kommen nun zum Vorschein: nichtgefärbte Fettkörperchen, die lebenden Leukozyten mit einer Form ähnlich jener der Fettkörperchen, jedoch bestehen Unterschiede hinsichtlich ihrer Färbung, die Bazillen in Form von Stäbchen und die Kokken in Form von Ringen erscheinen mit oder ohne Ribonucleinsäure (RNS) im Laufe des "Todes" und Desoxyribo-
nucleinsäure (DNS) im Falle der Wiederbelebung, Man kennt also demnach die Anzahl der gesamten Keime und die Anzahl der Leukozyten» die man durch Epifluoreszenz identifiziert, und zwar durch Beleuchtung von oben mit UV-Licht mit einer Wellenlänge von < 400 nm und mit einer Reernission eines Spektrums von etwa 600 nm, das man ausfiltern kann*
Man kann dann unter den Bazillen die Spezies Clostridium butyricum und Pseudomonas fluorescens suchen» Um sie zu extrahieren, benutzt man die Immunofluoreszenz mit einem Serum, das dem gesuchten Keim entspricht, und mit einem spezifischen Färbemittel,
Anschließend führt man die folgenden Arbeitsgänge, jeweils bei niedriger Temperatur, an den Proben aus:
a) Man erhält die gesamten Keime durch Versetzen der Probe ' mit 1 % Cyanid und 10 % Akridinorange, sowie dadurch, daß man Tropfen des Reaktionsproduktes den Arbeitsgängen 2 und 3 unterwirft*
b) Man erhält Pseudomonas allein durch nochmaliges Durchführen des Versuchs a), jedoch ohne Färbemittel«
c) Man erhält Clostridium allein beim nochmaligen Durchführen des Versuchs a), wobei aber Akridinorange und das speziell gefärbte Serum gleichzeitig zugegeben werden»
Welches der Verfahren a, b oder c auch gewählt wird, man fotografiert dann das durch das Mikroskop erzeugte Bild mittels einer Kamera und das Bild wird in Form eines durch
512 Zeilen und 512 Spalten, also 262 144 Punkte oder Pixels, eingeteilten Rechtecks auf den Speicher des Computers übertragen. Die Tiefe eines jeden Punktes, d. h, die Menge des empfangenen Lichts, wird dargestellt, durch eine Zahl oder ein "Bit"« Im vorliegenden Fall benutzt man sechs Bits entsprechend 64 Niveaus, wobei der Wert Null Schwarz und der Wert 63 Weiß entspricht» Die Bilder, welche helle Objekte darstellen, heben sich vor dem schwarzen Hintergrund ab (bei
( ) Anwesenheit von Parasiten). Am Beginn eines Arbeitsganges der Analyse legt man den Mindestwert der Helligkeit (Schwellenwert) fest, von dem aus ein Punkt als Element des Objekts abgezogen wird* Wenn diese "Schwelle" festgelegt ist, geht man zur Phase "Kontur" über, d, h, zur Bestimmung des Umfangs eines jeden Objekts, und man nimmt sämtliche Objekte in eine Tabelle auf, in welcher man gemäß den Koordinaten eines jeden Umrisses eine gewisse Anzahl an Parametern bestimmt, z« B# "die größte Länge" und ebenso einen "Formfaktor", der ausgehend vom Kreis, welcher willkürlich mit 1 angenommen wird, zu einem Trennen der "langen" Objekte von den "runden" Objekten führt« Man sortiert dann in der Tabelle die einzelnen interessierenden Objekte als Funktion
vV der gewählten Parameter, und für jeden Tropfen sowie für die Gesamtheit der Tropfen werden die Ergebnisse schließlich statistisch behandelt. Im gegebenen Fall entspricht die Analyse eines Tropfens 1 1/2 see mit einer zulässigen Fehlerquote von 5 %t Diese Werte müssen innerhalb der Dauer nebeneinander liegen und sich in den bis jetzt zulässigen Fehlergrenzen befinden· Die Werte ergeben sich aus der vollständigen Automatisierung der Arbeitsgänge,
- 10 Das zweite Beispiel betrifft die Analyse von Blut.
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt es nicht nur» die genannten Zellen, d· h· die roten und die weißen Körperchen, rasch und genau zu bewerten, sondern ebenso die in ihnen enthaltenen Parasiten automatisch nachzuweisen und zu zählen» Wegen ihrer sehr geringen Größe konnten sie bisher nicht zum Gegenstand einer solchen Arbeitsmethode gemacht werden» Ebenso ist es jetzt aufgrund der Erfindung beispielsweise möglich, ein automatisches Suchen und Zählen von Malariaparasiten durchzuführen, deren Abmessung in der Größenordnung von 2 ,um liegt.
Genauer gesagt, die Blutanalyse mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach folgender Methode durchgeführt:
Zuerst erfolgt das kontinuierliche und automatische Abscheiden auf dem Träger durch Sprühen oder Blasen« Dies entspricht einem Fortschritt gegenüber früheren Techniken, wo jeder Tropfen Blut zwischen einem Träger und einer Glasplatte zerdrückt wird, wodurch die Zellen zerstört und verändert werden»
Die Phase des Färbens mit Akridinorange bei einem pH-Wert von 6 ergibt eine Differenzierung zwischen den roten Körperchen, welche durch das Fehlen des Kerns weder RNS noch DNS enthalten und deshalb nicht-gefärbt bleiben, und im Gegensatz dazu den weißen Körperchen, welche leben und einen Kern sowie verschiedene Einschlüsse enthalten und verschiedene Färbungen annehmen (DNS für den Kern, RNS für
- 11 die Einschlüsse)·
Andererseits werden im Falle der Anwesenheit von Blutparasiten im Innern eines roten Körperchens diese Parasiten durch die Färbung offenkundig, da sie DNS und RNS enthalten.
Man führt die Bildanalyse entsprechend den vorgenannten allgemeinen Methoden durch, wobei aber die Komplexizität der "Objekte" berücksichtigt wird.
Da die weißen Körperchen in gefärbtem Zustand gut bekannt sowie leicht zu identifizieren und zu zählen sind, findet man ausgehend von ihrem Umriß im Innern dieses äußeren Umrisses eine oder mehrere innere Konturen, die von Kernen gebildet werden, und man kann in ihrem Innern noch andere Bestandteile nachweisen. Es wird also möglich, verschiedene Arten von mehrkernigen Bestandteilen als Funktion der Anzahl der so nachgewiesenen Objekte zu identifizieren und zu zählen.
Das gleiche gilt für die Parasiten der roten Körperchen, Was eine große Besonderheit des vorliegenden Verfahrens darstellt» Ebenso zeigt sich beispielsweise der Malariaparasit in Form eines offenen Ringes (RNS) , der an seinen beiden Enden Wucherungen oder kätzchenartige Auswüchse (DNS) trägt, was ungeachtet ihrer sehr kleinen Abmessungen (2 ,um) zum erstenmal ihre automatische und kontinuierliche Zählung in dem der Analyse unterworfenen Blut gestattet.
Die Anwendungen dieses neuen Verfahrens, die zu Beginn be-
schrieben sind» sind tatsächlich praktisch unbegrenzt und gehen insbesondere über das einfach Zählen von Teilchen in einer Flüssigkeit hinaus· Ebenso kann man als Anwendung ein Sortieren und Zählen von Oberflächenfehlern auf festen Materialien ins Auge fassen. Die Anpassung dieses Verfahrens an solche und andere Anwendungen wird Gegenstand künftiger Zusätze zur vorliegenden Patentanmeldung sein.
Claims (9)
1, Verfahren zum kontinuierlichen und automatischen Identifizieren, Sortieren und Zählen von Teilchen kleiner Abmessungen, gekennzeichnet dadurch, daß in einem ersten Arbeitsgang eine Folge von Proben vorbereitet und auf einen kontinuierlich sich verschiebenden Träger kontinuierlich aufgebracht wird, wobei die Proben über den Untersuchungsweg eines mit einer Videokamera ausgerüsteten Registriersystems verteilt werden, welche Bilder dieser Proben mittels eines Mikroskops erhält, in einem zweiten Arbeitsgang die Registrierung erfolgt, in einem dritten Arbeitsgang das Bild jeder Probe in Karos aufgeteilt wird, in einem vierten Arbeitsgang die Analyse des genannten Bildes gemäß den Techniken der sogenannten "Mustererkennung" ("pattern recognition") durchgeführt wird und schließlich die Ergebnisse dieser Analyse statistisch behandelt, digitalisiert und inhaltlich der Bedienungsperson übergeben werden»
2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die im ersten Arbeitsgang durchgeführte Vorbereitung in einem speziellen Färben, gefolgt von einer Beobachtung mittels Epifluoreszenz,besteht«
3» Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Aufbringen der Probe auf den Träger durch kontinuierliches Sprühen oder Blasen erfolgt.
4· Verfahren nach Punkt 1 bis Z9 gekennzeichnet dadurch, daß der kontinuierliche Träger eine um ihre vertikale Achse
rotierenden Glasscheibe ist sowie einem kontinuierlichen Waschvorgang unterliegt.
5# Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß der Träger ein kontinuierliches Band ist, das sich von einer ersten Rolle abwickelt und nach einmaligem Gebrauch auf eine zweite Rolle aufwickelt, und daß dieses Band in einer wegwerfbaren Kassette eingeschlossen ist*
6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Mikroskop mit Mitteln ausgerüstet ist, die automatisch und dauernd eine Okularfokussierung auf die Probe sicherstellen»
7# Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5* gekennzeichnet dadurch, daß das Mikroskop mit UV-Licht betrieben wird,
8„ Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß das im ersten Arbeitsgang benutzte Färbemittel Akridin-orange und/oder ein gefärbtes spezielles Serum ist»
9» Verfahren nach Punkt 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß es auf der Suche von Bakterien in Milch angewendet wird·
1O# Verfahren nach Punkt 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß es auf die Analyse von Blut und insbesondere auf die Suche von Parasiten, wie Malariaparasiten, im Blut angewendet wird.
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