JPH073419B2 - 流体中の細胞分析方法および装置 - Google Patents

流体中の細胞分析方法および装置

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JPH073419B2
JPH073419B2 JP61238827A JP23882786A JPH073419B2 JP H073419 B2 JPH073419 B2 JP H073419B2 JP 61238827 A JP61238827 A JP 61238827A JP 23882786 A JP23882786 A JP 23882786A JP H073419 B2 JPH073419 B2 JP H073419B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、流れの中の血球等の細胞の静止像を捉え、解
析する細胞分析方法および装置に関するものである。
（従来の技術） 従来から、細胞の検査においては、スライドグラス上に
塗抹染色された細胞を、顕微鏡を通して観察する方法が
行なわれていた。
しかし、この方法には、顕微鏡による観察の前に細胞の
塗抹、固定、染色等の繁雑な標本作成操作が必要である
こと、さらに、血球等の細胞は生体中では血液等の流体
中に存在しているのに対し、細胞を固定した状態でしか
観察できないため、必ずしも本来の細胞の形態を正しく
見ていないこと、という問題があつた。
一方、流れの中の粒子の顕微鏡像を撮影する試みは、最
近、いくつか行なわれている。たとえば、カツヘル（Ka
chel）他、「ザ・ジヤーナル・オブ・ヒストケミストリ
ー・アンド・サイトケミストリー（The Journal of His
tochemistry and Cytochemistry）」、第27巻第１号,33
5頁、1979年に記載された方法は、懸濁液中の粒子を細
孔へ一列に通過させ、そのときの電気インピーダンスの
変化によつて細胞の通過を検知し、その瞬間にフラツシ
ユランプを点灯させ、同時にカメラで撮影して、粒子の
静止画像を得るものである。
また、特表昭57-500995号公報および特開昭58-76740号
公報に記載された方法は、流体試料を流路に通し、作像
領域中において一定周期でストロボを点灯させ、同時に
CCDカメラで撮影することにより、流体液中の粒子の静
止画像を得るものである。
（発明が解決しようとする問題点） 流れの中の粒子の顕微鏡像を撮影する試みのうち、前述
のカツヘルの方法においては、抵抗式および光式検出原
理を組み合わせているため、検出器の構造が非常に複雑
で調整もしにくくなつている。
また、特表昭57-500995号公報等に記載された方法にお
いても、作像領域を形成するフローセルの構造が非常に
複雑で試料流れの流し方も複雑になつている。これはさ
らに、単に定期的にストロボを点灯させるものであっ
て、流体中を流れる細胞を検知してこれを撮像するもの
ではなく、撮像効率が悪い。即ち、細胞数が少ない場合
は、細胞なしの状態が多発し、無意味な撮像を繰り返す
ことになる。
従前のいずれの方法においても、細胞内部の画像解析お
よびその清報の利用については何ら述べられておらず、
本格的な細胞分析が不可能であるばかりでなくもともと
それを目的としたものではなかつた。
（問題点を解決するための手段） 本発明は上述したような従来技術の難点を解決するもの
であって、第１の発明は、細胞を浮遊させた液体試料を
シース液で囲繞して流動させる段階と、上記細胞の流れ
る上記液体試料の領域にトリガー用の光を常時照射する
段階と、上記トリガー用の光による細胞からの光を検知
することにより上記細胞を検出する段階と、上記細胞の
検出に基いて撮像用パルス光を発光させ上記細胞に対し
て上記パルス光を照射させる段階と、上記パルス光によ
る細胞の静止画像を撮像する段階と、得られた画像を処
理し解析する段階と、を包含する流体中の細胞分析方法
を特色とする。
さらに、第２の発明は、細胞を浮遊させた液体試料をシ
ース液で囲繞して流動させるためのフローセルと、上記
細胞の流れる上記液体試料の領域にトリガー用の光を常
時照射するトリガー用光源と、上記細胞の撮像時にパル
ス光を発光する撮像用パルス光源と、上記トリガー用光
源からの光を上記細胞が横切ったことを検知して細胞検
知信号を発生する細胞検出器と、上記細胞検知信号に基
づき上記撮像用パルス光源を発光させる手段と、上記撮
像用パルス光源からのパルス光を細胞に照射する集光レ
ンズと、上記パルス光による細胞の静止画像を撮像する
ための対物レンズおよび撮像手段と、得られた静止画像
を処理し解析する画像処理部と、を具備する流体中の細
胞分析装置を特色とする。より具体的には、常時点灯さ
れたトリガー用光源と、トリガー用光源からの光線を細
胞が横切つたことを検知して細胞検知信号を発する細胞
検出器と、細胞検知信号を一定時間遅延せしめて撮像用
レーザーパルス光源へ送る遅延回路と、を備えた流体中
の細胞分析装置、あるいは、集光レンズとフローセルと
の間に撮像用レーザーパルス光のコヒーレンスを低下せ
しめる部材を配置して成る流体中の細胞分析装置、を特
色とするものである。
（作用） トリガー用光源と細胞検出器とによって流体中の細胞を
キャッチし、そのキャッチした細胞に撮像用パルス光源
からのパルス光を照射して撮影するので、流れの中の細
胞についてその静止画像が得られる。そのうえで、得ら
れた細胞の静止画像を解析し、細胞の形状や細胞の内部
状態についての情報を得るとともに、これらの情報を細
胞の正しい識別分析に利用してオンラインで精密な細胞
の分析を実現する。
（実施例） 本発明の一実施例を第１図に示された図面に基いて説明
する。
まず、細胞を希釈液または染色液中に浮遊させた液体試
料は、細胞分析装置10において、チヤンバー12の上部の
入口14から供給される。一方、チヤンバー12の上方側面
部の入口16からは、生理食塩水または蒸留水（以下これ
をシース液と呼ぶ）が供給される。
液体試料とシース液はともにチヤンバー12内を下方へ流
れ、角柱状のフローセル18に達する。フローセル18中で
は、液体試料はシース液にさや状にとり囲まれた形で流
れ、いわゆるシース流が形成されている。
次に、本実施例の光学系について述べる。撮像用レーザ
ーパルス光源20としては窒素レーザー、半導体レーザー
またはYAGレーザー等を使用する。第１図において矢印
は光線の進行方向を示す。撮像用レーザーパルス光源20
から発せられた光は、集光レンズ22で絞られ、その焦点
はフローセル18中においてシース流の液体試料が流れる
位置に結ばれる。この点を以下撮像点38と呼ぶ。フロー
セル18を透過したレーザー光は対物レンズ24に達する。
レーザーパルス光が発せられたとき、液体試料中の細胞
が撮像点38を通過すると、その細胞の全体像がCCDカメ
ラ26で撮像される。撮像された細胞の画像は静止画像入
力部28へ送られ、システム制御・画像解析部30で画像処
理され、解析される。
トリガー用光源32を常時点灯させておき、フローセル18
中を細胞が通過したことを細胞検出器34で検知し、細胞
検知信号を発生させ、遅延回路36でこの細胞検知信号を
一定時間遅延させたのち、撮像用レーザーパルス光源20
を発光させることによつても細胞を撮影することができ
る。遅延回路36は、細胞が細胞検出器34で検知されてか
ら撮像点38に達するまでフローセル18中を流れる時間だ
け撮像用レーザーパルス光源20の発光を遅延させるため
のものである。また、細胞の大きさによつて細胞検出器
34で検知したパルスのパルス幅が異なるので、目的とす
る大きさの細胞を検知したときのみ撮像用レーザパルス
光源20を発光させて、液体試料中の細胞を選択的に撮像
することもできる。なお、撮像用レーザーパルス光源20
を一定の周期で連続的に発光させておくと、液体試料中
に存在する細胞の濃度に応じた確率で細胞をとらえ撮影
することができる。
システム制御・画像解析部30は、この細胞分析装置10の
全体の動作を制御する働きもする。
次に、トリガー用光源32と細胞検出器34を備えた実施例
について第２図に基いて詳細に説明する。
18は横断面が長方形をしたフローセルであり、光軸に直
交する最も肉厚の薄い所で約0.3mmの肉厚になつてお
り、さらにこのセルの内径は一辺が0.1〜0.5mm、他辺は
0.2〜1mmである。これらの寸法は分析対象の試料に応じ
て可変である。試料を注入するノズル19の内径は0.2〜
0.5mmに作られる。
40は可視光を発光する半導体レーザーであり、出力は２
〜20mWである。
42はコリメートレンズであり、光デイスク装置用として
市販されているものが利用できる。このレンズ42は開口
数NAが0.45〜0.6であり、光ビームの断面形状が楕円で
ある平行光を出力する。
44はコンデンサレンズＡであり、そのＦ数は30より小さ
く、焦点距離ｆは10mm以上のものである。このコンデン
サレンズA44は微動位置調整装置（図示せず）によつ
て、フローセル18の中心部付近に焦点を結ぶように位置
を調整される。
46はシリンダーレンズであり、第３図（ａ）断面の形状
の放射パターンを（ｂ）断面のように絞る。第３図
（ｂ）断面の寸法Ｓは、コンデンサレンズA44のＦ数で
決まり、寸法ｌは、シリンダレンズ46による非点収差の
量で決まる。細胞検出用としては、Ｓ＝７〜20μm,l＝1
00〜300μｍが適当である。
上述の半導体レーザー40,コリメートレンズ42,コンデン
サレンズA44,シリンダーレンズ46は第１図におけるトリ
ガー用光源32を構成している。
48はビームストツパであり、直接光を遮断し、光軸に対
して２度以上の範囲の前方散乱光を透過させる。このよ
うな低角度前方散乱光の強度は細胞の大きさを反映する
ことが知られている。
50はコレクタレンズであり、顕微鏡対物レンズの低倍率
のもの、すなわち４倍〜20倍のものが使用される。この
コレクタレンズ50は前方散乱光を後述のピンホール52の
中心に集光する。
52はピンホールであり、ピンホール径は倍率やフローセ
ル18の厚さに応じてψ0.2〜ψ2mmの間に選ばれる。コレ
クタレンズ50、および、ピンホール52は、ともに、微動
位置調整装置（図示せず）によつて、その位置を調整さ
れる。コレクタレンズ50とピンホール52の間の距離は、
コレクタレンズ50に生物顕微鏡用対物レンズを使用する
場合には約150mmに、金属顕微鏡用対物レンズを使用す
る場合には約200mmにする。またフローセル18とコレク
タレンズ50の間の距離に応じて、コレクタレンズ50とピ
ンホール52の間の距離は調整される。
54はフオトダイオードまたはピンフオトダイオードであ
る。このフオトダイオードまたはピンフオトダイオード
54には逆バイアス電圧をかけ、接合容量を減少させるこ
とにより素子の応等速度を上げている。このように素子
の応答速度を上げないと、細胞の通過が検知されてから
細胞が撮像点38に達するまでにレーザーパルス光源を発
光させることが出来なくなることがある。
以上のコレクタレンズ50、ピンホール52、フオトダイオ
ード54が第１図における細胞検出器34の１部に相当す
る。
56はパルスダイオードレーザーであり、これにはたとえ
ば、浜松ホトニクス製L2376（波長890nm、出力10W）ま
たはSANDERS製GAAP-12（波長870〜904nm、出力12W）を
使用する。
58はコンデンサレンズＢであり、撮像用光源側の拡大光
学系を構成するものである。このコンデンサレンズB58
の焦点位置Ｆは、第４図に示すように、パルスダイオー
ドレーザー56から見てフローセル18の中心位置よりもや
や遠方にある。すなわち、この焦点位置Ｆは、CCDカメ
ラ64で撮像したとき、画面内に充分な大きさで細胞の像
が得られるように設定される。また、コンデンサレンズ
B58と焦点位置Ｆとの間の距離ｑと、パルスダイオード
レーザー56とコンデンサレンズB58との間の距離Ｐとの
間にはq/p≫10の関係があることが望ましい。
パルスダイオードレーザー56とコンデンサレンズB58は
それぞれ、第１図の撮像用レーザーパルス光源20および
集光レンズ22にほゞ相当する。
60はコヒーレンシー低下用部品であり、たとえば、スリ
ガラス、または、光フアイバーの束が使用される。
62は撮像用レンズであり、倍率20倍〜40倍の顕微鏡用対
物レンズが使用され、第１図の対物レンズ24に相当する
ものである。この撮像用レンズ62も微動位置調整装置
（図示せず）によつて、その位置を調整される。
64はCCDカメラである。
次に、第２図におけるパルスダイオードレーザー56のか
わりに光源としてN2レーザー,YAGレーザー，N2/Dyeレー
ザー、および、YAGレーザーと高調波発振器との組合せ
等を用いた場合の例を第５図に示す。この場合には、レ
ーザー66からの光が平行であるため第２図のコンデンサ
レンズB58は必要とせず、レーザー光をそのままフロー
セル18へ投射する。
さらに、細胞検出のために第２図のように前方散乱光を
検出することに加えて側方散乱光も検出する様にした場
合を第６図に示す。この場合、68はコレクタレンズであ
り、側方散乱光を検出する。前方散乱光に合わせて側方
散乱光を検出する様にしたことにより、細胞検出をより
確実に、かつ、多用途に実施できる。なぜならば、側方
散乱光は細胞の大きさと細胞の表面または内部状態を反
映するため、細胞の大きさを主として反映する前方散乱
光のみを検出する場合よりも情報量が増大し、細胞の通
過をより確実に検知できるものとなる。さらに、細胞の
表面または内部状態を反映した情報が得られるため、細
胞の大きさだけでは識別できなかつた細胞の種類を正確
に判定できるようになり、必要とする種類の細胞の通過
時のみ撮像することも可能となる。
次に、本実施例の細胞分析装置10の光学分解能と、細胞
が静止画像として捉えられるためのシース流の流速の限
界に関して窒素レーザーを使用した場合について述べ
る。
窒素レーザーは波長337.1nm,パルス幅約10nSの強力な
（ピーク出力:100KW以上のものがある）パルス発振が得
られるものである。レーザー光以外では、このように短
いパルス幅でしかも強力な光を発することはできない。
また、窒素レーザーは紫外光であるため、以下に述べる
様に分解能に優れている。
分解能δは、対物レンズの開口数NAと光の波長λとで決
り、 δ＝λ／NA の式が成り立つ。本実施例では、対物レンズ24の開口数
NAは0.85であつたので、分解能δは δ＝λ／NA＝337.1/0.85＝396.6〔nm〕 となり、約0.4μｍである。
一方、窒素レーザーのパルス幅Δｘは約10nSであり、分
解能が約0.4μｍであるから、細胞が静止画像として見
られるためのシース流の最高流速ｖは、 ｖ＝δ／Δｘ＝0.40×10-6/10×10-9＝40〔m/S〕 となる。すなわち、約40m/s以下の速度で細胞を流せ
ば、静止画像を得ることができる。
しかし、余り流速を速くしすぎるとシース流が乱れるの
で、実際には流速は約6m/s以下としなければならない。
次に、本実施例の細胞分析装置10を使用して健常人の白
血球を撮像し、得られた画像から白血球をグループ分け
した例を示す。
まず、細胞内の顆粒等の状態を良く認識できるように白
血球を染色する。ここでの染色方法は、塗抹方式では乾
燥された血液に染色するのに対し、採血した血液を生き
たままの状態で染色することに特色がある。
細胞の染色および希釈方法は以下のとおりである。
a.蒸留水1c.c.に対し、ギムザ染色液１滴を加えてギム
ザ希釈液を作る。
b.ギムザ希釈液と血液源液を４対１の割合で混合し、時
々攪拌しながら30分程度染色する。
上記の方法（この方法を以下、超生体染色法と呼ぶ）で
作成された試料は細胞分析装置10へ入口14から流し込ま
れる。撮像点38を通過中の細胞の像はCCDカメラ26によ
り捉えられ、静止画像入力部28を介してシステム制御・
画像処理部30へ送られる。得られた画像には、ちらつき
や雑音の除去のための処理が施される。
上記の様にして得られた白血球画像は、４つのグループ
に分けられる。表１は各グループの特徴と出現率を示し
たものである。第７図ａ〜ｄは、各グループの画像を示
したものである。画像の一辺は、グループA,グループC,
グループＤが約30μm,グループＢが約15μｍである。
これらの白血球画像につき、メイ・ギムザ複合染色を施
した塗抹標本や超生体染色を施した血液をスライドグラ
スに採りカバーガラスで封じて作成した標本の顕微鏡観
察による白血球画像と比較した結果、グループＡは好中
球、グループＢはリンパ球、グループＣは単球、グルー
プＤは好酸球および好塩基球であると同定された。
したがつて、本実施例の装置により、白血球細胞を撮像
し、さらに、得られた白血球の画像を解析し、この白血
球の大きさと顆粒の状態を認識することにより、表１に
示す特徴に基いて白血球を各種細胞へ分類・同定するこ
とができる。
次に、本実施例装置におけるフローセルの流れの中の赤
血球を撮像した例を第８図に示す。図中の周辺のリング
状の縞は、赤血球による回折縞である。この回折縞が赤
血球の画像解析にとつて妨げとなる場合には、レーザー
光のコヒーレンスを低下させて回折現象を弱めてやれば
よい。そのためには、例えば、集光レンズ22とフローセ
ル18の間にすりガラスを配置することが適当である。
本実施例では、撮像用パルス光源としてレーザーを使用
しているが、パルス用の光源としては、周知のキセノン
ランプ等の他のパルス光源を使用することができること
は当然である。
（発明の効果） 本発明によれば以下に述べる様な特有の効果が得られ
る。
（１）従来例のように単に定期的にストロボを点灯させ
るものではなく、流体中の細胞を的確にキャッチし、そ
のキャッチした細胞のみを撮像するので、無意味な撮像
を行うことはなく撮像効率が向上する。
（２）この静止画像を解析することにより、細胞の形状
や内部状態についての情報を得ることができる。
（３）スライドグラス上の細胞の顕微鏡観察では得られ
なかつた流れの中に存在するときの細胞の形態が直接に
観察できる。
（４）装置に使用されたフローセルが製作しやすい角柱
状の極めて単純な形状のものである。また細胞通過の検
出を行い撮像用レーザーパルス光源の発光を制御する場
合にも、撮像用光学系の上部に細胞検出用光学系を備え
るだけでよいので、本発明による装置は構造が非常に簡
単であり、製造が容易であるとともにその保守および調
整がしやすい。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明による細胞分析方法を実施する装置の
一実施例を示す概略図、 第２図は、本発明による細胞分析装置において半導体レ
ーザーを使用した一実施例の光学系の説明図、 第３図は、第２図の実施例の細胞検出系における光放射
パターンを示す説明図、 第４図は、第２図の実施例の撮像用光源側の拡大光学系
を示す説明図、 第５図は、本発明による細胞分析装置において、撮像用
光源としてN2レーザー等を使用した一実施例の光学系の
部分説明図、 第６図は、第２図の実施例に側方散乱光検出系を加えた
場合の光学系の部分説明図、 第７図（ａ）ないし（ｄ）は白血球細胞の４つのグルー
プの細胞粒子の構造の撮像写真、 第８図は赤血球の細胞粒子の構造の撮像写真を示すもの
である。 図中： 10……細胞分析装置、12……チヤンバー、14……試料入
口、16……シース液入口、18……フローセル、20……撮
像用レーザーパルス光源、22……集光レンズ、24……対
物レンズ、26……CCDカメラ、28……静止画像入力部、3
0……システム制御・画像解析部、32……トリガー用光
源、34……細胞検出器、36……遅延回路、38……撮像
点。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞を浮遊させた液体試料をシース液で囲
    繞して流動させる段階と、上記細胞の流れる上記液体試
    料の領域にトリガー用の光を常時照射する段階と、上記
    トリガー用の光による細胞からの光を検知することによ
    り上記細胞を検出する段階と、上記細胞の検出に基いて
    撮像用パルス光を発光させ上記細胞に対して上記パルス
    光を照射させる段階と、上記パルス光による細胞の静止
    画像を撮像する段階と、得られた画像を処理し解析する
    段階と、を包含することを特徴とする流体中の細胞分析
    方法。
  2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載の方法におい
    て、上記細胞を検出する段階にあって、検出した信号の
    相異により上記細胞を選択して検出することを含み、上
    記細胞の検出時所定の大きさの信号を検知したとき選択
    的に上記撮像用パルス光を発光させて選択的に細胞を撮
    像すること、を特徴とする流体中の細胞分析方法。
  3. 【請求項３】細胞を浮遊させた液体試料をシース液で囲
    繞して流動させるためのフローセルと、上記細胞の流れ
    る上記液体試料の領域にトリガー用の光を常時照射する
    トリガー用光源と、上記細胞の撮像時にパルス光を発光
    する撮像用パルス光源と、上記トリガー用光源からの光
    を上記細胞が横切ったことを検知して細胞検知信号を発
    生する細胞検出器と、上記細胞検知信号に基づき上記撮
    像用パルス光源を発光させる手段と、上記撮像用パルス
    光源からのパルス光を細胞に照射する集光レンズと、上
    記パルス光による細胞の静止画像を撮像するための対物
    レンズおよび撮像手段と、得られた静止画像を処理し解
    析する画像処理部と、を具備することを特徴とする流体
    中の細胞分析装置。
  4. 【請求項４】特許請求の範囲第３項記載の装置におい
    て、撮像用パルス光源はレーザーパルス光源である流体
    中の細胞分析装置。
  5. 【請求項５】特許請求の範囲第３項記載の装置におい
    て、上記細胞検出器が細胞からの前方散乱光の検出器
    と、上記細胞からの側方散乱光の検出器を含み、上記両
    検出器からの信号を用いて細胞を選択的に検出するよう
    にしたこと、を特徴とする細胞分析装置。
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