DE10117303A1 - Ein natürlicher Fluoreszenzfarbstoff, gewonnen aus einem marinen Invertebraten, Zusammensetzungen die diesen Farbstoff enthalten und ihre Verwendung - Google Patents
Ein natürlicher Fluoreszenzfarbstoff, gewonnen aus einem marinen Invertebraten, Zusammensetzungen die diesen Farbstoff enthalten und ihre VerwendungInfo
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- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
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Abstract
Die vorliegende Erfindung enthüllt ein Verfahren zur Extraktion, Reinigung und Charakterisierung eines Fluoreszenzfarbstoffs aus dem marinen Echinoderm Holothuria scabra, Zusammensetzungen, enthaltend den Farbstoff und verschiedene Anwendung des Farbstoffs.
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Fluoreszenzfarbstoff, gewonnen aus
einem marinen Invertebraten, Holothuria scabra. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren
zur Extraktion, Reinigung und Charakterisierung des neuen Farbstoffs zur Verfügung, wel
cher ein natürlicher Farbstoff eines marinen Invertebraten, hauptsächlich der Seegurke, ist.
Seegurken sind Echinodermen, Mitglieder der Gruppe der Stachelhäuter, die ebenfalls See
sterne und Seeigel umfaßt. Sie haben folgende taxonomische Stellung.
Die besagte Seegurke hat folgende taxonomische Stellung.
Unterreich: Metazoa
Stamm: Echinodermata
Unterstamm: Eleutherozoa
Klasse: Holothuroidea
Unterklasse: Aspidochirotacea, Dendrochirotacea, Apodacea
Ordnung: Dendrochirota, Aspidochirota, Elasipoda Molpadonia und Apoda
Unterreich: Metazoa
Stamm: Echinodermata
Unterstamm: Eleutherozoa
Klasse: Holothuroidea
Unterklasse: Aspidochirotacea, Dendrochirotacea, Apodacea
Ordnung: Dendrochirota, Aspidochirota, Elasipoda Molpadonia und Apoda
Innerhalb dieser Ordnungen gehört die Seegurke Holothuria scabra zu:
Ordnung: Aspidochirota
Familie: Holothuriidae
Gattung: Holothuria
Art: scabra
Ordnung: Aspidochirota
Familie: Holothuriidae
Gattung: Holothuria
Art: scabra
Echinodermen sind coelomate Invertebraten, die ausschließlich marin leben, keine Kolonien
bilden, unsegmentiert mit einer basalen pentameren radialen Symmetrie in der erwachsenen
Form, keinen Kopf oder Hirn besitzen und sich von allen anderen Tieren durch strukturelle
Eigenheiten des Skeletts und Coeloms unterscheiden. Zur Klasse der Holothuroidea gehören
Tiere mit einer bilateralen Körpersymmetrie, im allgemeinen in der oral-aboralen Achse ver
längert mit einem Mund auf oder in der Nähe der einen Seite und einem After auf oder in der
Nähe der anderen Seite. Die Körperoberfläche ist rauh, das Endoskelett zu mikroskopisch
kleinen Nadeln oder Platten, eingebettet in die Körperwand, reduziert, der Mund von einem
Tentakelapparat, verbunden mit dem Wassergefäßsystem, umgeben; Podia oder Röhren
füsschen sind im allgemeinen vorhanden und beweglich; der Darmkanal ist lang und gewun
den und die Kloake besitzt im allgemeinen respiratorische Auswüchse; die Geschlechter sind
im allgemeinen getrennt und die Gonaden einzel oder paarige Knäule von Röhren. Sie sind
seßhafte Formen, die entweder an ein hartes Substrat geheftet oder in weiche Sedimente ein
gegraben sind, wobei Vorder- und Hinterende nach oben gebogen sind. Sie treten in allen
Meeren hauptsächlich im Flachwasser auf, wobei einige wenige Spezies auch in Tiefen über
1000 Meter vorkommen. Die Art Holothuria scabra, von einigen auch Metriatyla scabra Jae
gea genannt, ist in Ostafrika, dem Roten Meer, der Bucht von Bengal, Ostindien, Australien,
Japan, dem Südpazifik, den Philippinen, dem Indischen Ozean und anderen indopazifischen
Regionen weit verbreitet. Sie wird zum Verzehr durch Menschen und Tiere in Sabah, Malay
sia und Indonesien und andern indopazifischen Ländern genutzt.
Pigmente gehören zu den Kategorien des inorganischen und organischen Typs. Die erstge
nannten sind inorganisch chemische Verbindungen, die für verschiedene dekorative Zwecke
und Gemälde etc. genutzt werden. Organische Pigmente wie organische Farbstoffe lassen sich
bis ins Altertum zurückverfolgen. Die Verwendung von Pflanzenfarbstoffen wie Brasilholz,
Campeche, Persisch Blau und Persisch Rot wird aus Ländern des Nahen Ostens und fernöstli
chen Länder selbst vor biblischen Zeiten beschreiben (George L. Clark, 1966 "Encyclopaedia
of chemistry", 2nd ed. Seiten 833-835). Debra K. Hobson und David S. Wales beschreiben
"Green dyes" welche als sekundäre Metabolite von einigen Gruppen lebender Organismen
wie Pilzen, Blau- und Grünalgen, Seeigeln, Seesternen, Arthropoden und Coelenteraten des
Korallenriffs produziert werden (Journal of the Society of Dyers and Colourists (JSDC), 114,
42-44, 1998). Dies sind Anthrachinonverbindungen, die historisch eine entscheidende Rolle
in der Farbstoffindustrie spielten. Stainsfile-Dyes A bietet einen Farbstoffindex von 264
Farbstoffen. Unter diesen befinden nur sechs natürliche Farbstoffe von allen Arten lebender
Organismen.
Kürzlich wurden verschiedene Patente über natürliche Farbstoffe veröffentlicht, von denen
aber die Mehrzahl aus Pflanzen stammte. Wrolstad, et al. haben einen natürlichen Farbstoff
aus Kartoffelextrakt beschrieben (US-Patent Nr. 6,180,154, veröffentlicht am 30. Januar
2001). Shrikhande, Anil J haben im US-Patent Nr. 4,452,822, veröffentliche am 5. Juni 1984,
über die Extraktion und Intensivierung von Anthocyaninen aus Fruchtfleisch von Trauben
und anderen Material berichtet. Lenoble, et al. haben im US-Patent Nr. 5,908,650, veröffent
licht am 1. Juni 1999, eine neue Zusammensetzung zur Verstärkung der roten Farbe eines
Anthocyaninpigments beschrieben.
Carotinoid-produzierende Bakterienarten sind in zwei US-Patenten mit den Nummern
5,935,808, veröffentlicht am 10. August 1999, Erfinder Hirschberg, et al. und 5,858,761, ver
öffentlicht am 12. Januar 1999, Erfinder Tsubokura, et al. offenbart, Collin; Peter Donald hat
in seinem US-Patent der Nr. 6,055,936, veröffentlicht am 2. Mai 2000, Seegurkencarotinoid
lipidfraktionen und Verfahren offenbart.
All diese Färbestoffe und Farbstoffe sind jedoch nicht fluoreszierend. Die meisten Fluores
zensfarbstoffe sind synthetisch und in verschiedenen US- und internationalen Patenten offen
bart. Diese sind in einer Reihe von Anwendungen eingesetzt worden. Die Anzahl der Patente
auf diesem Gebiet zeigt die Wichtigkeit dieser Farbstoffe.
Es wurde entdeckt, daß das synthetische Parazoanthoxanthin A (Molekulargewicht 214,2),
emittierend Fluoreszenz bei Lambda (em) 420 nm, ein reiner kompetetiver Inhibitor der Cho
linesterasen ist. Sepcic K, Turk T, Macek P (Toxicon, 36 (6): 937-940, 1998). Welch; David
Emanuel (US-Patent Nr. 5,989,135, veröffentlicht am 23. November 1999) offenbarte einen
lumineszierenden Golfball. White et al. (US-Patent Nr. 6,110,566, datiert auf den 29, August
2000 und WO 9920688) beschrieb einen flexiblen Polyvinylchloridfilm, der dauerhafte fluo
reszierende Farben zeigt.
Dipietro Thomas C (Internationales Patent WO 9938916) offenbarte die Verwendung eines
fluoreszierenden polymeren Pigments in verschiedenen Farben, Tinten und Textilien. Cramer
Randall J (Patent-Nr. EP 0206718, veröffentlicht am 30. Dezember 1986) beschrieb eine Zu
sammensetzung mit fluoreszierenden Farbstoff zum Bleichen und Aufhellen eines Polymers.
Die Detektion von Lecks ist eine andere, durch jemanden (Leighley; Kenneth C. US-Patent
6,056,162, datiert auf den 2. Mai, 2000) offenbarte Verwendungsform. Cooper et al. offen
barten im US-Patent 6,165,384, veröffentlicht am 26. Dezember 2000, eine Zusammenset
zung für einen Vollspektrumfluoreszenzfarbstoff für die gleichen Verwendungen.
Lichtwardt et al. benutzen im US-Patent 5,902749, datiert auf den 11. Mai 1999, einen Fluo
reszenzfarbstoff in einem automatischen chemischen Dosiersystem.
Es gibt nur wenige Veröffentlichungen von marinen Tieren. Ein grünes Fluoreszenzprotein
GFP - ein neues Reportergen aus der pazifischen Qualle Aequora aequora ist durch Shi
momura, O, Johnson, F. H. und Saiga, Y (Journal of cellular and comparative physiology, 59,
223-239, 1962) beschrieben worden. GFP ist durch das Vorhandensein eines hochfluoreszie
renden Chromatophors gekennzeichnet. Gereinigtes GFP absorbiert Blaulicht maximal bei
395 nm mit einem kleiner Peak bei 470 nm und emittiert grünes Licht. Sepcic K, Turk T, Ma
cek P berichteten über das fluoreszierende Zoanthidpigment Parazoanthoxanthin A. Toxicon,
36 (6): 937-940, 1998.
Marine Farbstoffe finden verschiedene Verwendungen als Farbstoffe an sich und als Be
standteil von Zusammensetzungen.
Verschiedene Autoren haben fluoreszierende Farbstoffgemische für zahlreiche Verwendungs
zwecke offenbart (Burns, et al. im US-Patent Nr. 5,920,429, veröffentlicht am 6. Juli, 1999;
Burns; David M und Pavelka Lee A, (Internationales Patent AU 704112). Die marinen Farb
stoffzusammensetzungen wurden in etlichen Anwendungen zur Markierung der Lage abge
stürzter Flugzeuge, von Rettungsbooten und Militärausrüstung wie z. B. Raketen verwendet.
Die im allgemeinen verwendeten Farbstoffe sind Fluorescein, ein wasserlöslicher, syntheti
scher Farbstoff. Verschiedene Zusammensetzungen des Farbstoffs für eine bessere Wirksam
keit und längere Dauern der Fluoreszenz in verdünnter Form sind in der Untersuchung
(Swinton; Robert J, US-Patent Nr. 5405,416, veröffentlicht am 11. April 1995 und Internatio
nales Patent Nr. WO 9010044, offenbart am 7. Juli 1990). Hyosu et al. (5. April 1977, US-
Patent 4,016,133) hat fluoreszenzmarkierte Harzpartikel hergestellt.
Von einer anderen Verwendung mariner Farbstoff als Unterseeproben wurde durch Crosby
David A und Ekstrom Philip A im US-Patent Nr. 5321268, veröffentlicht am 14. Juni 1994,
berichtet. Die Versuchsanordnung umfaßt eine zentrale optische Faser, enthaltend einen Fluo
reszenzfarbstoff, eingeschlossen in eine transparente oder lichtdurchlässige, schützende und
schmutzbeständige Scheide. Diese kann an marinen Tieren angebracht werden, um Daten wie
Lichtintensität und Temperatur in Gebieten, in denen die marinen Tiere wandern, zu sam
meln.
Einige Autoren haben UVA in Photochemotherapie für Hautkrebs verwendet. Kowalzick L;
Ott A; Waldmann T; Suckow M; Ponnighaus J, M. Vogtlandklinikum Plauen offenbaren
PUVA-Badphotochemotherapie bei lymphomatoider Papulosis (ein Hautkrebs), wobei UVA-
Behandlung eine Verbesserung gezeigt hat (Elsevier Science B. V, 2000). UVA-Sonnenbänke
werden verbreitet bei Patienten mit Psoriasis benutzt.
Sabatelli, Anthony D. (US-Patent Nr. 5,210,275, Veröffentlichungsdatum 11. Mai 1993) of
fenbarte eine chromatophore Sonnencremezusammensetzung zur Vorbeugung von Sonnenbränden.
Das Chromatophor hatte die Fähigkeit, UVA- und UVB-Wellenlängenstrahlungen
zu absorbieren.
Fluoreszenzfarbstoffe sind bei der Markierung molekularer Sonden für die Fluoreszenzmikro
skopie sehr nützlich. Fluoreszenzmikroskopie, auch bekannt als lichtreflektierte Fluoreszenz
oder Epifluoreszenzmikroskopie, ist von großem Nutzen für nicht-radioaktive in situ-
Hybridisierung, da sie eine hohe Sensitivität aufweist und die Fähigkeit besitzt, drei verschie
den Immunfluorophore mit spektral getrennten Emissionen anzuregen. Dies ermöglicht mul
tiple Detektionen (Chapter II. Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual.
Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica, gedruckt in Deutschland 1992). Das zugrundelie
gende Prinzip beruht darauf, daß die durch die Erregungswellenlänge bestrahlte Probe ent
sprechend dem Stokeschen Gesetz das erläutert, das die Wellenlänge der Fluoreszenzstrah
lung immer länger als die der Erregungsstrahlung ist, reagiert ("Fluorescence" von George L.
Clark, 1966 in Encyclopaedia of chemistry, 2nd Ed. Seite 435-436). Chapter V in: In Situ Hy
bridization Application Manual. Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica, gedruckt in
Deutschland, 1992, Seite 23-62 und Olympus Optical Co. Ltd, Tokyo Japan, Katalog. "In
structions BX-FLA Reflected Light Fluorescence attachment" Seite 16, 1999 beschreibt eine
Reihe von nicht-radioaktiven, fluorochromen Färbungen, die heutzutage verwendet werden.
Verschiedene Färbungen werden für verschiedene Anregungswürfel des Fluoreszenzmikro
skops genutzt. Zum Beispiel DAPI (DNA-färbend, emittiert blaue Farbe), Fluorescein-
dUTP; Hoechst 33258, 33342 werden unter Anregung mit 330-385 Anregungswürfeln gese
hen; FITC, Acridin-Orange (für DNA, RNA, emittiert grünliche/gelbliche Farbschattierun
gen), Auramin unter einem 450-480 Anregungswürfel und Rhodamin, TRITC und Propidiu
miodid (DNA, emittiert orangene Farbschattierungen) unter einem 510-550 Anregungswürfel.
Rosenblum Barnett B und Spurgeon Sandra L; Lee Linda G; Benson Scott c; Graham Ronald
J verwendeten eine Reihe von 4,7-Dichlororhodaminverbindungen, einsetzbar als Fluoreszenzfarbstoffe
für molekulare Proben, veröffentlicht am 5. Oktober 2000 in der internationa
len Patent-Nr. WO 0058406.
LaClair; James J. (US-Patent Nr. 6,140,041, veröffentlicht am 31. Oktober 2000 und
WO 9938919) legten die Synthese eines Fluoreszenzfarbstoffs und seine Anwendung in der
Proteinmarkierung, DNA-Markierung, Einzelmolekülspektroskopie und Fluoreszenz offen.
Die Anmelder haben einen anderen Ansatz verwendet; der in der vorliegenden Erfindung be
schriebene Farbstoff ist ein natürlicher Farbstoff und nicht synthetisch. Er ist von einem mari
nen Tier und nicht von einer Pflanze oder Mikroben. Der teilweise reine Farbstoff ist direkt
aus den Hautzellen des Invertebraten extrahiert worden. Dies ist der erste Bericht eines natür
lichen Farbstoffs von einem marinen Tier, der ein Fluoreszenzfarbstoff ist. Das marine Tier ist
eine Holothurie, eine Seegurke genannt Holothuria scabra, die eine neue Quelle darstellt. Im
Gegensatz zu den meisten anderen fluoreszierenden synthetischen bekannten Farbstoffen
braucht unser Farbstoff nicht mit anderen Farbstoffen vermischt zu werden, um verschiedene
fluoreszierende Farbschattierungen bei verschiedenen Wellenlängen zu erreichen. Er emittiert
drei verschiedenfarbige Fluoreszenzen bei drei unterschiedlichen Anregungswellenlängen,
was zu vielfachen Verwendungen führen kann. Weiterhin ist selbst unter den natürlich be
kannten Fluoreszenzfarbstoffen wie dem sehr bekannten grünen fluoreszierenden Protein
(GFP) von einer Qualle unser Farbstoff von nicht-proteinöser Natur für Monate bei Raum
temperatur stabiler und wird nicht durch Mikroben kontaminiert. Er hat auch Qualitäten als
biologisches Tensid. Eine andere wichtige Eigenschaft des Farbstoffs ist, daß nach Anregung
im unteren UV-Spektralwellenlängenbereich (UVB) Fluoreszenz im UVA-
Wellenlängenbereich emittiert wird. Es können diese Absorption und Emissionsbereiche als
selektive Appliaktionen, abhängig davon, welches UV-Spektrum in einer speziellen Situation
zu bevorzugen ist, eingesetzt werden.
Ein wichtiger Aspekt des Farbstoffs ist die Herstellung von Zusammensetzungen und Kits für
nicht-radioaktive Markierung molekularer Proben und Gegenfärbung. Bei verschiedenen Anregungswellenlängen
gibt er einen vergleichbaren Effekt wie die Farben von DAPI, FITC und
PI. Obwohl drei in einem, ist es ein einzelner Farbstoff. Der Farbstoff ist drei in einem, ob
wohl er ein einzelner Farbstoff ist. Eigentlich deckt dieser einzelne Farbstoff die Farben des
Wellenlängenspektrums von 123 Fluorochromen ab, die momentan im Markt bekannt sind
(siehe Bitplane products (Fluorochrome) im Internet
http:/ / www.bitplane.ch/public/support/standard/Fluorochrome.htm.).
Noch ein weiterer Aspekt ist seine Verwendung als ein Fluorochromfärbestoff in der Epifluo
reszenzmikroskopie, von dem hier zum aller ersten Mal für einen marinen natürlichen Farb
stoff berichtet wird. Diese Verwendung bietet ein einfaches und schnelles Verfahren zur Un
tersuchung cytogenetischer Präparationen für verschiedene Anwendungen wie molekulare
Diagnostik, die Fluoreszenz für in situ-Hybridisierungstechniken benutzt, schnelle Diagnose
von Biokontaminationen in Gewebekulturen, industrielle Zubereitungen, Wasserqualitätsun
tersuchung im Labor und Freiland.
Ein weiterer Aspekt des Farbstoffs ist seine Verwendung als Bestandteil der nicht-
radioaktiven Markierungskits für fortgeschrittene molekularbiologische Anwendungen.
Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen neu Fluoreszenzfarbstoff, gewonnen
aus der Seegurke Holothuria scabra, zur Verfügung zu stellen.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Extraktion, partiellen Reinigung und
Charakterisierung des besagten natürlichen Farbstoffs/Pigments aus dem marinen Tier Holo
thuria scabra zur Verfügung zu stellen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen,
die den Farbstoff, gewonnen aus den Geweben von Holothuria scabra, verwenden.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, seine insektiziden und pestiziden Effekte zu se
hen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Verwendung für veterinäre Heilungen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, einen Farbstoff zur Verfügung zu stellen, der
Fluoreszenz in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen des UV- und sichtbaren
Lichtspektrums auf bestimmte Anregungswellenlängen hin emittiert.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, die Fluoreszenz, sichtbare spektroskopische Analysen
und den Bereich der Emissionswellenlängen zu beobachten.
Noch ein weiteres Ziel ist es, die drei verschiedenen fluoreszenzgefärbten Emissionen des
Farbstoffs im UV- und sichtbaren Bereich von Epifluoreszenzmikroskopwürfeln zu beobach
ten.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, den Effekt der Fluoreszenzfärbung von cytogene
tischen Schnitten zum Screenen von Chromosomen, Zellen und Gewebe durch die Verwen
dung des Farbstoffs nach der Erfindung, zu beobachten.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Analyse der Biotensidnatur.
Noch ein weiteres Ziel ist es, Kits zu entwickeln, die den Fluoreszenzfarbstoff als nicht-
radioaktive Markierung für molekulare Sonden beinhaltet.
Dementsprechend stellt die Erfindung einen neuen Fluoreszenzfarbstoff zur Verfügung, der
aus der Seegurke Holothuria scabra erhalten wurde. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren
zur Extraktion, Isolierung und Charakterisierung des besagten Farbstoffs zur Verfügung.
Weiterhin stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, die den besagten Farbstoff enthält, zur
Verfügung.
Nach intensiver Forschung haben die Anmelder einen neuen Fluoreszenzfarbstoff, erhalten
aus marinen Tieren, insbesondere den Invertebraten und ganz besonders aus der Seegurke
Holothuria scabra, identifiziert.
Unterreich: Metazoa
Stamm: Echinodermata
Unterstamm: Eleutherozoa
Klasse: Holothuroidea
Unterklasse: Aspidochirotacea
Ordnung: Aspidochirota
Unterreich: Metazoa
Stamm: Echinodermata
Unterstamm: Eleutherozoa
Klasse: Holothuroidea
Unterklasse: Aspidochirotacea
Ordnung: Aspidochirota
Innerhalb dieser Ordnungen gehört die Seegurke Holothuria scabra zu:
Ordnung: Aspidochirota
Familie: Holothuriidae
Gattung: Holothuria
Art: scabra
Ordnung: Aspidochirota
Familie: Holothuriidae
Gattung: Holothuria
Art: scabra
Die Erfindung stellt weiterhin einen neuen Fluoreszenzfarbstoff zur Verfügung, der aus der
Haut des Tieres gewonnen worden ist. Sie beschreibt auch die physikalische und chemische
Natur des Farbstoffs und seine Stabilität im direkten Licht, bei hohen und niedrigen Tempe
raturen. Der besagte Farbstoff hat drei farbige Fluoreszenzemissionen und drei verschiedene
Anregungswellenlängen im UV- und sichtbaren Lichtspektrum. Die Erfindung steht auch im
Zusammenhang mit der Untersuchung von Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop zur
schnellen Untersuchung auf Kontaminationen und für cytogenetische Screenings. Die Erfin
dung betrifft auch die Verwendung des Farbstoffs als nicht-radioaktive Markierung von Pro
tein-, DNA- und RNA- molekularen Sonden für fortgeschrittene molekulare Diagnostik,
Epifluoreszenzmikroskopie für Einzel- und Doppelfärbung von Chromosomen, Zellen und
Gewebe, Fluoreszenz bei den Anwendungen für in situ-Hybridisierung, Biotensid, das Unter
suchen von Biokontaminationen und Lecks, Photochemotherapie, neue Fernerkundungsein
richtungen, Unterwasserproben, lebenssichernde Vorrichtungen, Markierung des Ortes eines
Flugzeugabsturzes, Rettungsboote und militärische Ausrüstung wie zum Beispiel Raketen,
verschiedene Fluoreszenzanwendungen in Temperaturbereichen unter null Grad und vieles
mehr.
Die Erfindung beschreibt einen Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus marinen Tieren, die entwe
der Sonnenlicht für ihre physiologischen Funktionen absorbieren oder über längere Zeiträume
dem Sonnenlicht ausgesetzt sind und scheinbar einen Mechanismus für die Fluoreszenz bei
verschiedenen Wellenlängen entwickelt haben. Wie das Phytoplankton, Picoplankton und
photosynthetische Bakterien Sonnenlicht für ihre photosynthetischen Funktionen absorbieren,
werden die notwendigen Wellenlängen des Lichtspektrums für chemische Wege genutzt und
Extralicht entsprechend des Stokeschen Gesetzes emittiert.
Die invertebraten Tiere, die nicht einen speziellen äußeren Panzer wie eine Schale und deutli
che Verteidigungsorgane besitzen, die eine harte und stachelige Haut haben, die ein festes
Endoskelett, gebildet durch Knöchelchen haben, sind seßhaft oder nur langsam beweglich,
sind viele Stunden dem direkten Sonnenlicht ausgesetzt, leben im Sand oder Spalten, können
Fluoreszenz zeigen.
Die vorliegende Erfindung versucht die Nachteile des Stands der Technik dadurch zu über
winden, daß sie ein hoch effizientes und selektives Verfahren zur Extraktion, Reinigung und
Charakterisierung eines Farbstoffs von einem marinen Invertebraten zur Verfügung stellt und
dessen vielfache Verwendung in der Herstellung von Kits für molekulare Diagnostik, die
nicht-radioaktive Markierungen benutzen, molekularer Marker, Epifluoreszenzmikroskopie,
Photochemotherapeutika, einer Komponente für ein neues Meßinstrument für Land- und Un
terwasserproben, kosmetischen Industrie, Lebensmittelindustrie und bewaffneten Kräfte etc.
beschreibt.
Der besagte marine Invertebrat ist ein Echinoderm, taxonomisch genannt Holothuria scabra,
gehörend zu der Klasse der Holothuroidea. Das Produkt der Erfindung ist ein neuer Farbstoff,
der zum ersten Mal veröffentlicht wird. Die Tiere wurden am Ufer von der Zentralwestküste
Indiens bei Ebbe gesammelt, ins Labor gebracht und in Glasgefäßen, enthaltend Seewasser
mit einer Salzkonzentration von 30-32% pro Nennwert erhalten. Die Tiere waren erwachsen
und sexuell reif. Die taxonomische Stellung wurde wie oben dargestellt identifiziert. Tatsäch
lich sind die meisten zur Verfügung stehenden Farbstoffe synthetischer Natur. Es gibt nur 6
Typen natürlicher Farbstoffe. Das umfaßt Farbstoffe, die von allen lebenden Organismen ge
wonnen werden. Der beschriebene Fluoreszenzfarbstoff der vorliegenden Erfindung ist nur
einer seiner Art von marinen Organismen.
Wie hier eingesetzt, wird der Begriff Farbstoff für ein Pigment verwendet, das nicht durch ein
reduzierendes Agens entfärbt wird. Der besagte Farbstoff färbt Fasern, Cellulose etc. Er wird
natürlicher Farbstoff genannt, da die Quelle ein marines Tier ist, das im allgemeinen in der
Natur entlang den Küsten der Welt gefunden wird und er kein synthetisches Pigment ist. Ein
Fluoreszenzfarbstoff ist derjenige, der durch eine spezielle Wellenlänge angeregt wird, und
während der Transition von einem höheren zu einem niedrigeren elektronischen Stadium in
nerhalb einer kurzen Zeitperiode Licht emittiert.
Verschiedene farbige Fluoreszenz bedeutet die Emission von verschiedenfarbigem Licht nach
Anregung bei verschiedenen Wellenlängenbereichen. Er emittiert blau, gelb und orange ge
färbte Farbschattierungen der Fluoreszenz bei Anregung mit verschiedenen Spektren des UV-
und sichtbaren Lichts. Biotensid bedeutet eine Farbstofflösung, die nach Schütteln einen sei
fenähnlichen Schaum bildet und antimikrobielle Qualitäten zeigt. Die hier verwendete mole
kulare Diagnose bedeutet die Verwendung des Farbstoffs als eine nicht-radioaktive Markie
rung für molekulare Sonden zur Fluoreszenz bei in situ-Hybridisierungsanwendungen in mo
lekularer Cytogenetik und als Marker in Microarrays und molekularbiologischen Studien. Die
Epifluoreszenzmikroskopie gehört zu den Mikroskopiestudien für cytogenetische Präparatio
nen von Schnitten unter Verwendung des vorliegenden Farbstoffs als Färbesubstanz und Auf
nahme verschiedener farbiger Fluoreszenz, wenn sie, beobachtet unter verschiedenen Würfe
leinstellungen, als eine speziell farbige Emission nach Anregung mit bekannten Fluorochro
men emittiert werden. Die Fluorochromenwürfel WUB, WB, WG sind die bestimmten Fil
terwürfelkonfigurationen der Olympus BX-FLA reflektierten Lichtfluoreszenzvorrichtung für
verschiedene Wellenlängen.
Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Extraktion, Reinigung und Charakte
risierung eines natürlichen fluoreszierenden Farbstoffs zur Verfügung, umfassend:
- a) Sammeln des Feldmaterials und Erhaltung unter Laborbedingungen,
- b) Extraktion des Pigments aus der Haut der echinodermen Seegurke Holothuria scabra, und
- c) teilweise Reinigung des Farbstoffs.
Der bioaktive Extrakt der Erfindung wird von der marinen Seegurke Holothuria scabra er
halten. Dieser Extrakt ist verwendbar als ein natürlicher Fluoreszenzfarbstoff und hat folgen
de Charakteristika:
- a) Entfärbung durch ein reduzierendes Agens
- b) keine synthetische Verbindung,
- c) Rohextrakt des Farbstoffs hat eine gelblich-grüne Farbe,
- d) teilweise gereinigter Farbstoff ist ein rot-braun gefärbtes Pulver bei Betrachten mit dem bloßen Auge bei Tageslicht,
- e) unter Kaltlicht werden einige grüne Farbschattierung emittiert,
- f) amorphe Natur,
- g) löslich in Wasser,
- h) unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Methanol und Aceton,
- i) ist negativ geladen,
- j) hat einen pH von 6,5,
- k) Vorhandensein einer phenolischen Gruppe,
- l) Fehlen eines Chinoidrings,
- m) Fehlen aromatischer Amingruppen,
- n) von nicht proteinöser Natur,
- o) Fehlen reduzierenden Zuckers,
- p) Farbstoff hat eine Biotensidnatur,
- q) Farbstoff zeigte auch antimikrobielle Qualitäten und bei Durchführung eines antimi krobiellen Tests traten Inhibitionszonen auf,
- r) Farbstoffpigment ist ein Fluoreszenzfarbstoff und emittiert Fluoreszenz nach Anregen mit verschiedenen Wellenlängen des UV- und sichtbaren Spektrumbereiches eines Spektrophotometers,
- s) bei UV-, sichtbarer Spektroskopie von 300 nm-700 nm und die Peaks liegen bei einer Wellenlänge von 379 nm und 439 nm,
- t) bei UV-, sichtbarer Spektroskopie von 250 nm-350 nm und die Peaks liegen bei einer Wellenlängen von 272 nm und 299 nm,
- u) Fluoreszenzspektroskopie im UV- und sichtbaren Spektrum, wobei nach Anregung mit einer UV-Wellenlänge von 270 nm die Fluoreszenz im Bereich von 324 nm-380 nm emittiert wird, was dem UVA-Wellenlängenbereich in einem Bereich von ultra violetten Strahlen des Sonnenlichtes entspricht,
- v) bei einer Anregungswellenlänge von 450 nm in der Fluoreszenzspektroskopie erschien die Fluoreszenzemission mit maximaler Intensität bei 500 nm-580 nm,
- w) bei einer Anregungswellenlänge von 540 nm in der Fluoreszenzspektroskopie erschien die Fluoreszenzemission mit maximaler Intensität bei 500 nm-620 nm,
- x) bei einer Anregungswellenlänge von S55 nm in der Fluoreszenzspektroskopie erschien die Fluoreszenzemission mit maximaler Intensität bei 575 nm-620 nm,
- y) physikalische Kontrolle von Whatman Filter Nr. 1-Papier, befeuchtet mit einer Farb stoffkonzentrationsverdünnung von 1 : 40000, unter einem UV-Transilluminator und Geldokumentationssystem mit UV-Lampen im Bereich von 260 nm-280 nm emittiert eine Fluoreszenz, die eine bläulich-grüne Farbschattierung aufweist,
- z) emittiert drei verschiedene, farbige Fluoreszenzen bei drei verschiedenen Wellenlän gen im UV- und sichtbaren Bereich der Fluoreszenzwürfel eines Epifluoreszenzmikro skops,
- aa) blaufarbige Fluoreszenzemission tritt in einem Bereich von 380 nm-400 nm des UVA-Bereiches nach Anregen mit Hilfe des ultravioletten Würfels WU - 330 nm- 385 nm Anregungswellenlänge - auf,
- ab) gelbfarbige Fluoreszenzemission tritt im Bereich von 500 nm-570 nm nach Anregen mit dem WB-Würfel bei 450 nm-480 nm Anregungswellenlänge auf,
- ac) orangefarbige Fluoreszenzemission tritt im Bereich von 570 nm-650 nm nach Anre gen mit dem WG-Würfel bei 510 nm-550 nm Anregungswellenlänge auf,
- ad) der Farbstoff emittiert Schattierungen von Grautönen unter einer herkömmlichen Glühbirne des Epifluoreszenzmikroskops bei Betrachtung mit einem 10X-Objektiv,
- ae) der Farbstoff emittierte diese Fluoreszenzfarben selbst in einem Verdünnungsbereich von 1 : 40000 (d. h. 1 g Pulver des Farbstoffs gelöst in 40 Litern ultrareinen Wassers),
- af) die Fluoreszenz des Extraktes hielt selbst nach 1 Jahr bei Raumtemperatur an,
- ag) die Fluoreszenz des Farbstoffs ist hoch fotostabil und verschlechtert sich nicht nach längerem Aussetzen gegenüber direktem Licht, und
- ah) die Fluoreszenz des Farbstoffs ändert sich nicht, selbst bei Einfrieren bei 20°C, einer Temperatur, bei welcher die Moleküle nicht in der Lage sind, die Energie zu erlangen, wie sie zur Aktivierung in Extrakten von lumineszierenden Organismen notwendig ist.
Die physikalischen und andere Charakteristika des Farbstoffs können durch folgende Schritte
bewertet werden:
- a) strukturelle Analyse des Farbstoffs,
- b) Biotensidanalyse,
- c) antimikrobieller Test,
- d) sichtbare Spektroskopie des Farbstoffs,
- e) Fluoreszenzspektroskopie des Farbstoffs,
- f) physikalische Untersuchung der Emission unter einem UV-Transilluminator in einem Bereich von 260-280 nm,
- g) Herstellung von cytogenetischen Schnitten durch ein lufttrocknendes Verfahren, (viii) Färben der Schnitte mit dem Farbstoff,
- h) epifluoreszenzmikroskopisches Screening der cytogenetischen Schnitte unter Fluoro chromwürfeln WU, WB, WG und Hellfeld
- i) Mikrophotographie emittierter Fluoreszenz in den Bereichen der Schnitte ohne cyto gentischem Material,
- j) Mikrophotographie emittierter Fluoreszenz der cytogentischen Schnitte unter Fluoro chromwürfeln WU, WB, WG und Hellfeld, und
- k) Untersuchung von Wellenlängenbereichen der Fluoreszenzschattierung der Emission und Wellenlängenbereiche für die Anregungsbereiche der Fluorochromwürfel.
Somit stellt die Erfindung einen natürlichen Fluoreszenzfarbstoff aus marinen Tieren zur Ver
fügung, der drei verschiedene, farbige Fluoreszenzen in den Farbschattierungen blau, gelb
und orange emittiert, wenn er mit drei verschiedenen Bereichen von Wellenlängen der UV-
und sichtbaren Lichtspektralwürfel eines Epifluoreszenzmikroskops angeregt wird. Die Erfin
dung bezieht sich weiterhin auf Emissionspeaks in annähernd demselben Bereich wie die An
regungswellenlängen durch Messwertaufnahme eines Fluoreszenzspektrophometers und dem
entsprechenden Spektrophotometer im sichbaren Licht. Die Erfindung bezieht sich weiterhin
auf die Epifluoreszenzmikroskopie von cytogenetischem Material auf luftgetrockneten Präpa
rationen unter Verwendung dieses Farbstoffs als die Epifluoreszenzmikroskopie-
Färbesubstanz. Dieser Farbstoff kann für die Herstellung nicht-radioaktiver Markierungskits
für molekulare Diagnostik durch Fluoreszenz bei in situ-Hybridisierung in verschiedenen
molekularen, biomedizinischen und technischen Wissenschaften eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform ist die Quelle des Farbstoffs ein invertebrates, marines Tier, gehö
rend zum Unterreich: Metazoa, Stamm: Echinodermata; Unterstamm: Eleutherozoa, Klasse:
Holothuroidea. Name: Holothuria scabra.
In noch einer anderen Ausführungsform ist die Holothuria scabra ausgewählt aus der Gruppe
umfassend die Seegurken und ist weit an den Küsten, flachen Gewässern, tiefen Wassern
überall auf der Welt, insbesondere im Indopazifik, verbreitet. Die nächsten gut bekannten
Verwandten der Seegurke sind die Seeigel und Seesterne.
In noch einer anderen Ausführungsform wird die Haut der Holothuria scabra abgetrennt und
gewogen. Zu 15 Gramm Haut bei Feuchtgewicht werden 250 ml 50% Alkohol zugefügt und
unter Vakuum mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe bei einer Arbeitsgeschwindigkeit von
200 rpm filtriert.
In noch einer anderen Ausführungsform wird der Extrakt auf ein Drittel seines Volumens ein
gedampft, in dem es auf einem Wasserbad bei 80°C, d. h. von 250 ml auf 80 ml, konzentriert
wird. Die Dauer des Eindampfens beträgt ungefähr 3 Stunden.
In noch einer anderen Ausführungsform werden 100 ml 99,5%igen Ethanols zu den 80 ml des
Konzentrats des Extrakts zugefügt und über Nacht präzipitiert.
In noch einer anderen Ausführungsform wird das Konzentrat mit dem Präzipitat bei 1500 rpm
für 4-5 Minuten zentrifugiert und die obere Schicht dekantiert. Das Präzipitat wird bis zur
Trocknung auf einem Wasserbad bei 80°C für 5 Minuten eingedampft, wobei 250 ml des
50%igen Ethanolextraktes 2,5 Gramm des Farbstoffs nach Eindampfung ergeben.
In noch einer anderen Ausführungsform wird der teilweise reine Farbstoff mit Hilfe eines
Spatels ausgeschöpft und in einem trockenem Glasgefäß bei Raumtemperatur gelagert.
In einem anderen Aspekt ist die physikalische Natur des Farbstoffs aufgenommen. Der reine
trockene Farbstoff ist bei Tageslicht von rötlich-brauner Farbe. Unter Kaltlicht wird ein
Schimmer von grün beobachtet. Der Farbstoff ist in Wasser löslich. Unlöslich in organischen
Lösungsmitteln wie reinem Alkohol, Methanol, Chloroform und Aceton. Er ist von amorpher
Natur. Er hat in wäßriger Lösung einen pH-Wert von 6,5.
In noch einem anderen Aspekt wurde die strukturelle Analyse mit Hilfe chemischer Methoden
durchgeführt. Der Farbstoff wurde in destilliertem Wasser bis zu 2 mg/ml gelöst und auf seine
chemische Natur hin untersucht.
In noch einer anderen Ausführungsform wurde Neutraleisenlchlorid zugefügt und eine pur
purne Färbung beobachtet. Das bewies, daß eine phenolische Gruppe vorhanden ist.
In einer weiteren Ausführungsform wurde β-Mercaptoethanol (Beta-Mercaptoethanol) als
reduzierendes Agens zugefügt. Es erfolgte keine Entfärbung der Verbindung. Das bewies, daß
ein Chinoidring fehlt und das Pigment ein Farbstoff ist.
In einer anderen Ausführungsform wurde die Diazotierung durch Zufügen von 0,1 N HCl und
NaNO2 (Natriumnitrit) durchgeführt und eine alkalische Lösung von Beta(β)-Naphthol zuge
fügt. Es wurden keine Präzipitation beobachtet. Dies bewies das Fehlen von Amingruppen.
In einer anderen Ausführungsform wurde die konzentrierte Farbstofflösung mit 10 mg/ml
erhitzt und keine Präzipitation oder Koagulation wurde beobachtet. Dies bewies, daß die Ver
bindung von nicht proteinöser Natur ist. Zu derselben Lösung wurde ein Tropfen konzen
trierter HCl zugesetzt und Fehlingsche Lösung zugefügt. Das Fehlen eines Farbwechsels be
wies, daß der reduzierende Zucker fehlt.
In einer anderen Ausführungsform wurde die Biotensidnatur des Farbstoffs dadurch beob
achtet, daß er einen Schaum nach Zufügen von Wasser und Durchschütteln bildete.
In einer anderen Ausführungsform wurde ein antimikrobieller Scheibentest durchgeführt und
die Inhibitionszone beobachtet.
Die Anmelder studierten die Natur des Farbstoffs und haben herausgefunden, daß er vielfar
bige Emissionen bei verschiedenen Anregungswellenlängen ergab, welche mit den fluoro
chromen mikroskopischen Färbestoffen, die bereits im Markt vorhanden sind, vergleichbar
ist. Die blau gefärbte Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist vergleichbar mit der Emis
sion derselben Farbe bei DAPI-Fluorochrom bei derselben Anregungswellenlänge, verwendet
als Komponenten von nicht-radioaktiven Markierungskits der Biochemie, Zellbiologie, Im
munchemie und Molekularbiologie. Die gelb gefärbte Fluoreszenz des besagten Farbstoffs im
sichtbaren Bereich ist vergleichbar mit der gleichgefärbten Emission von Auramin, verwendet
als Komponenten nicht-radioaktiver Markeriungs- und Detektionskits der Biochemie, Zell
biologie, Immunchemie und Molekularbiologie. Die gelb gefärbte Fluoreszenz des besagten
Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist vergleichbar mit der gleichgefärbten Emission von FITC,
verwendet als Komponenten für nicht-radioaktive Markierungs- und Detektionskits der Bio
chemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie. Die orange gefärbte Fluoreszen
zemission ist vergleichbar mit der orangenen Fluoreszenzfarbe des Fluorochroms Propidiu
miodid, verwendet als Komponenten von nicht-radioaktiven Markierungs- und Detektionskits
der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie. Ein Farbstoff, bean
sprucht wie in Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die orange gefärbte Fluoreszenze
mission vergleichbar ist zu der orangenen Fluoreszenzfarbe des Fluorochroms TRITC, ver
wendet als Komponenten von nicht-radioaktiven Markierungs- und Detektionskits für Bio
chemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie. Der Farbstoff ist bei Raumtem
peratur stabil und hat eine lange Haltbarkeit. Die molekularen und radioaktiven Kits besagten
Farbstoffs können bei Raumtemperatur exportiert werden. Der Farbstoff hat Charakteristika
von mindestens 123 verschiedenen Fluorochromen, nämlich DAPI, Hoechst 33258, Hoechst
33342, FITC, Acridin-Orange, Auramin, Rhodamin, TRITC und Propidiumiodid, welche sich
momentan im Markt befinden. Der Farbstoff produziert unter normalem Mikroskoplicht
Schattierungen von grau, die einen Phasenkontrasteffekt hervorrufen, welcher für das schnelle
Screening von cytogenetischen, cytologischen und histochemischen Schnitten nützlich ist und
Geld für die Anschaffung von Extraphasenkontrastzubehörteilen für das Mikroskop spart. Die
Fluoreszenzfarbemissionen folgen dem Stokeschen Gesetz für Fluoreszenz. Die Mikrofoto
grafien mit Kodakfilmen zeigen eine Schattierung der angrenzenden Farbemissionswellenlän
gen wie bei blaufarbiger Fluoreszenz unter dem Epifluoreszenzmikroskop in der Mikrofoto
grafie die Schattierung von grün auftaucht. Die Mikrofotografien mit Kodakfilmen zeigen
eine Schattierung der angrenzenden Farbemissionswellenlängen wie bei gelbfarbiger Fluores
zenz unter dem Epifluoreszenzmikroskop in der Mikrofotografie ebenso einen Schimmer von
grün auftaucht. Die orangefarbige Fluoreszenz unter dem Epifluoreszenzmikroskop in der
Mikrofotografie zeigt auch einen aufkommenden Rotschimmer. Die cytogenetischen Schnitte
ergeben in der Fluoreszenz einen Gegenfärbeeffekt der Zellen mit dem Hintergrund, wo keine
Probe, sondern nur Farbstoff vorhanden ist.
In einem anderen Aspekt wurde eine UV-, sichtbare Spektroskopie von 300 nm-700 nm
Wellenlänge (Fig. 3) durchgeführt. Die Peaks liegen bei den Wellenlängen 379 nm und 439 nm.
In einer anderen Ausführungsform wurde die UV-Spektroskopie bei einer Wellenlänge von
250 nm-350 nm (Fig. 4) durchgeführt. Die Peaks liegen bei den Wellenlängen 272 nm und
299 nm.
In noch einem anderen Aspekt der Fluoreszenzspektroskopie wurde die Anregungswellenlän
ge von 270 nm eingesetzt. Die auftretende Fluoreszenz zeigte bei 324 nm-380 nm die maxi
male Intensität (Fig. 5).
In einer anderen Ausführungsform wurde die Fluoreszenzspektroskopie mit einer Anre
gungswellenlänge von 450 nm durchgeführt. Die auftretende Fluoreszenz zeigte bei 500 nm-
580 nm ihre maximale Intensität (Fig. 6).
In einer anderen Ausführungsform wurde die Fluoreszenzspektroskopie mit einer Anre
gungswellenlänge von 540 nm durchgeführt. Die auftretende Fluoreszenz zeigte bei 500 nm-
620 nm die maximale Intensität (Fig. 7).
In einer anderen Ausführungsform wurde die Fluoreszenzspektroskopie mit einer Anre
gungswellenlänge von 555 nm durchgeführt. Die auftretende Fluoreszenz zeigte bei 575 nm-
620 nm ihre maximale Intensität (Fig. 8).
In einer anderen Ausführungsform wurde ein Whatman Nr. 1-Filterpapier mit dem Extrakt
des Farbstoffs getränkt und unter dem UV-Transilluminator mit UV-Lampen von 260 nm-
280 nm Wellenlänge beobachtet. Es emittierte blaue Fluoreszenz.
In noch einem anderen Aspekt wurden die Epifluoreszenzmikroskopiestudien unter Verwen
dung des Farbstoffs als Färbesubstanz in der Verdünnung von 1 : 10000 (1 g pro 10 Liter) ver
wendet und Lichtemission nach Anregen durch verschiedene Würfel gemessen und mit
Farbschattierungen der bekannten Fluorochrome verglichen.
Verschiedene Färbesubstanzen wurden für verschiedene Anregungswürfel des Fluoreszenz
mikroskops benutzt. Zum Beispiel DAPI (DNA-Färbung, emittiert blaue Farbe), Fluorescein-
dUTP; Hoechst 33258, 33342 sind bei Anregung mit 330 nm-385 nm-Anregungswürfeln zu
sehen; FITC, Acridine-Orange (für DNA, RNA, emittiert grünliche/gelbliche Schattierungen),
Auramin bei 450 nm-480 nm-Anregungswürfel und Rhodamin, TRITC und Propidiumiodid
(DNA, emittiert orange Schattierungen) bei 510 nm-550 nm-Anregungswürfel.
In einer Ausführungsform wird das Screening mit Epifluoreszenzmikroskopie der cytogenti
schen Schnitte durch Zufügen eines Tropfens des verdünnten Extraktes und Anregung mit
dem WU-Filter in einem Spektralbereich von Wellenlängen bei 330-385 nm durchgeführt.
In einer anderen Ausführungsform wird das Screening mit Epifluoreszenzmikroskopie der
cytogentischen Schnitte durch Zufügen eines Tropfens des Extrakts und Anregung mit dem
WB-Filter in einem Spektralbereich von Wellenlängen bei 450-480 nm durchgeführt.
In einer anderen Ausführungsform wird das Screening mit Epifluoreszenzmikroskopie der
cytogentischen Schnitte durch Zufügen eines Tropfens des Extrakts und Anregung mit dem
WG-Filter in einem Spektralbereich von Wellenlängen bei 510 nm-500 nm durchgeführt.
In noch einer anderen Ausführungsform wird das Screening der Epifluoreszenzmikroskopie
der cytogentischen Schnitte mit einem Hellfeldobjektiv unter Verwendung des Farbstoffs bei
transmittiertem Licht durchgeführt.
In noch einer anderen Ausführungsform wird das Screening mit Epifluoreszenzmikroskopie
der cytogentischen Schnitte, gefärbt mit dem Farbstoff, durch Beobachten der Fluoreszenz
farbschattierungen, angeregt durch entsprechende Anregungswellenlängen, durchgeführt.
In einer anderen Ausführungsform führt die Anregung mit dem WU 330 nm-385 nm-
Bereich zu einer emittierten Fluoreszenz im Bereich von 380 nm-400 nm.
In einer anderen Ausführungsform führt die Anregung mit dem WB-Filter, der einen Spek
tralbereich von 450 nm-480 nm besitzt, zur emittierten Fluoreszenz in einem Bereich von
550 nm-570 nm.
In noch einer anderen Ausführungsform führt die Anregung mit dem WG-Filter, der ein
Spektralbereich von 510 nm-550 nm besitzt, zu einer emittierten Fluoreszenz im Bereich von
600 nm-650 nm.
In einer anderen Ausführungsform wird das Screening mit Epifluoreszenzmikroskopie der
cytogentischen Schnitte unter Hellfeld bei Verwendung transmittierten Lichts durchgeführt,
was zum Emittieren von Licht im weißen Bereich des Spektrums führt, abhängig von der
Dichte der Zellbestandteile und des gegebenen Phasenkontrasteffekts.
In noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird die Mikrofotografie der emittierten Fluo
reszenz in den Bereichen der Schnitte ohne Zellen im WU 330 nm-385 nm-Bereich mit Hilfe
eines Kodakfilms der 400 ASA-Geschwindigkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 Se
kunden bis 60 Sekunden, durchgeführt. Es wurden Schattierung von Blaufloureszenz emit
tiert.
In einer anderen Ausführungsform wurde die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in
Bereichen der Schnitte ohne Zellen im WB 450 nm-480 nm-Bereich mit einem Kodakfilm
von 400 ASA-Geschwindigkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 Sekunden bis 60 Se
kunden, durchgeführt. Es wurde eine Schattierung gelber Fluoreszenz emittiert.
In einer anderen Ausführungsform wurde die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in
Bereichen der Schnitte ohne Zellen mit im WG 510 nm-550 nm-Bereich mit Hilfe eines Ko
dakfilms, mit 400 ASA-Geschwindigkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 Sekunden
bis 60 Sekunden, durchgeführt. Es wurde eine Schattierung orangener Fluoreszenz emittiert.
In einer anderen Ausführungsform wurde die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz im
Bereich von Schnitten ohne Zellen unter Vollicht, bei Emittierung von Schattierungen von
Grau, durchgeführt.
In einer anderen Ausführungsform wurde die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in
Bereichen von Schnitten mit Zellen im WU 330 nm-385 nm-Bereich mit Hilfe eines Kodak
films mit 400 ASA-Geschwindigkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 Sekunden bis 60
Sekunden, durchgeführt. Es wurde eine Schattierung von blauer Fluoreszenz emittiert.
In einer anderen Ausführungsform wurde die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in
Bereichen von Schnitten mit Zellen im WB 450 nm-480 nm-Bereich mit Hilfe eines Kodak
films mit 400 ASA-Geschwindigkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 Sekunden bis 60
Sekunden, durchgeführt. Es wurde eine Schattierung von gelber Fluoreszenz emittiert.
In einer anderen Ausführungsform wurde die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in
Bereichen von Schnitten mit Zellen im WG 510 nm-550 nm-Bereich mit Hilfe eines Kodak
films mit 400 ASA-Geschwindigkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 Sekunden bis 60
Sekunden, durchgeführt. Es wurde eine Schattierung von orangener Fluoreszenz emittiert.
In einer anderen Ausführungsform wurde die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in
Bereichen von Schnitten mit Zellen im Hellfeld unter Emission einer Schattierung von Grau
durchgeführt.
In noch einem anderen Aspekt der Erfindung erschienen die farbigen Fluoreszenzemissionen,
bei Herstellen der 1 : 10000-fachen Verdünnungen des Farbstoffs und Verwenden als Färbe
substanz, in UV- und sichtbaren Bereichen des Epifluoreszenzmikroskops.
In noch einer anderen Ausführungsform ist der Farbstoff mit Wasser in einem Verhältnis von
1 : 40000-fach verdünnt und ergibt eine Fluoreszenz von drei Farben bei drei verschiedenen
Wellenlängen.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine bioaktive Zusammenset
zung, enthaltend einen Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra im
Verhältnis von 1 : 40000 in ultrareinem Wasser zur Verfügung, um Fluoreszenz von drei Far
ben bei drei verschiedenen Wellenlängen und einen Phasenkontrasteffekt unter transmittier
tem Licht zu erzielen.
Die Erfindung stellt weiterhin eine Zusammensetzung zur Verfügung, umfassend einen bio
aktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit her
kömmlichen Additiven, die für die Herstellung eines flexiblen Polyvinylchloridfilms nützlich
ist und Fluoreszenzfarben zeigt.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend einen bio
aktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit her
kömmlichen Additiven zur Verfügung, die zur Herstellung von Beschichtungszusammenset
zungen und Tinten verwendbar ist.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend
einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen
mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, das zur Detektion von Lecks verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die bei Unterseeproben verwendbar
ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die in der Photochemotherapie von
Hautkrebs verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine kosmetische Zusammenset
zung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria
scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die als Fluoreszenzsonde bei in situ-
Hybridisierungskits für molekulare Diagnosen verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die als eine Komponente eines nicht-
radioaktiven Markierungs- und Detektionskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie
und Molekularbiologie verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die für Immunfluoreszenzdetektionen
verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die als Gegenfärbung von DIG-
markierten Oligonukleotidsonden und Anti-DIG-Fab-Fragementen verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die für quantitative bei Einzel- und
Vielfachzellfluoreszenz der Flußzytometrie verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die als fluorochrome Färbesubstanz
zur Epifluoreszenzmikroskopie verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die für eine schnelle Untersuchung
von Biokontamination in der Gesunheitsnahrungsmittelindustrie, kosmetischen Industrie,
pharmazeutischen und chemischen Industrie verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die für schnelle Bestimmungen von
Biokontaminationen in Laborkulturen verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die für die schnelle Untersuchung von
Bioverunreinigungen unter Feldbedingungen verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die als ein kompetitiver Inhibitor von
Cholinesterasen verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen
mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die bei antimikrobiellen Zusammen
setzungen verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die als Biotensid in Toilettenartikel-
Zusammensetzungen verwendbar ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfas
send einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zu
sammen mit herkömmlichen Additiven zur Verfügung, die als natürliche Färbesubstanz ver
wendbar ist.
Tabelle 1 (a) & (b) Strukturelle Analyse des Farbstoffs durch chemische Verfahren auf Vor
handensein oder Fehlen eines Chinoidrings, phenolischer Gruppen und Amingruppen.
Tabelle 2 Strukturelle Analyse des Farbstoffs durch chemische Verfahren zur Untersu
chung der Abwesenheit eines Chinoidrings, der proteinösen/nicht-proteinösen Natur und dem
Vorhandensein/Fehlen reduzierenden Zuckers.
Tabelle 3 Die Farbe der verschiedenfarbigen Fluoreszenz des Farbstoffs, verwendet als
Färbesubstanz, nach Anregung mit verschiedenen Wellenlängenwürfeln des Olympus Epif
luoreszenzmikroskops.
Fig. 1 Seegurke Holothuria scabra, direkt aus der Natur vor Extraktion des Farb
stoffs.
Fig. 2 Seegurke Holothuria scabra nach 4-facher Extraktion des Farbstoffs.
Fig. 3 Abtasten im UV sichtbaren Bereich.
Fig. 4 Abtasten im UV-Bereich.
Fig. 5 Fluoreszenzspektrophotometrie. Anregungswellenlänge 270 nm.
Fig. 6 Fluoreszenzspektrophotometrie. Anregungswellenlänge 450 nm.
Fig. 7 Fluoreszenzspektrophotometrie. Anregungswellenlänge 540 nm.
Fig. 8 Fluoreszenzspektrophotometrie. Anregungswellenlänge 270 nm.
Fig. 9 Rundgeschnittenes Whatman Filterpapier Nr. 1, mit der Spitze in den ver
dünnten Rohextrakt des Farbstoffs getaucht und unter UV-Bestrahlung in einen
Geldokumentationssystem betrachtet. Der Pfeil zeigt auf die Fluoreszenz, foto
grafiert durch einen UV-Filter. Der untere Teil ist die Kontrolle ohne Farbstoff.
Fig. 10 Whatman Filterpapiere, verwendet zur Filtration des Extrakts und betrachtet
unter einem UV-Transilluminator (Birnen in einem Wellenlängenbereich von
260 nm-280 nm). Die Pfeile zeigen auf die Fluoreszenz. Das untere Filterpa
pier ist als Kontrolle ohne jeden Extrakt.
Fig. 11-14 Blaue Fluoreszenzemissionen der Epifluoreszenzmikroskopie mit WU-
Würfel mit einer Anregungswellenlänge im Bereich von 330 nm-385 nm.
Fig. 11 zeigt die Fluoreszenz des Farbstoffs ohne jegliche Proben. Fig. 12
zeigt Zellen, betrachtet unter einem 10X-Objektiv. Fig. 13: dasselben unter
einem 40X-Objektiv betrachtet und Fig. 14 zeigt Zellen, betrachtet unter ei
nem 100X-Objektiv mit Ölimmersion.
Fig. 15-18 Epifluoreszenzmikroskopische grün/gelbliche Fluoreszenzemissionen mit
WB-Würfel in einem Anregungsbereich von 450 nm-480 nm. Fig. 15 zeigt
die Fluoreszenz des Farbstoffs ohne jegliche Probe. Fig. 16 zeigt Zellen,
betrachtet unter einem 40X-Objektiv. Fig. 17 & 18: dasselbe, betrachtet un
ter einem 100X-Objektiv mit Ölimmersion.
Fig. 19-22 Epifluoreszenzmikroskopische Farbschattierungen von orangener Fluores
zenzemission mit WG-Würfel, in einem Anregungsbereich von 510 nm-
550 nm. Fig. 19 zeigt die Fluoreszenz des Farbstoffs ohne jegliche Probe.
Fig. 20 zeigt die Fluoreszenz mit Zellen unter einem 10X-Objektiv. Fig. 21:
dasselbe, betrachtet unter einem 40X-Objektiv und Fig. 22: Zellen, be
trachtet unter einem 100X-Objektiv mit Ölimmersion.
Fig. 23 Zellen gesehen bei Hellfeld unter einem 10X-Objektiv. Die Schattierungen
von grau - ein Phasenkontrasteffekt wurde gesehen.
Fig. 24 Dieselben Zellen wie im Vollichtfeld unter 100X-Vergrößerung mit Ölim
mersion.
Diese Erfindung betrifft das Verfahren der Extraktion, Reinigung und Charakterisierung eines
neuen Pigments, welches ein natürlicher Farbstoff aus einem Echinoderm (Holothuroidea:
Holothuria scabra) ist, der weit entlang der Zentralwestküste Indiens und den Indopazifischen
Regionen der Welt verbreitet ist.
Die Erfindung stellt weiterhin einen neuen fluoreszierenden reinen Farbstoff aus dem Haut
pigment des Tieres zur Verfügung, welches wiederholt 3-4 Mal aus derselben Probe bei Lage
rung unter -20°C extrahiert werden kann und somit vor einer Ausbeutung der natürlichen
Ressourcen schützt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls, daß der besagte Farbstoff drei farbige Fluores
zenzemissionen bei drei verschiedenen Anregungswellenlängen im UV- und sichtbaren
Lichtspektrum aufweist, die äquivalent zu den Emissionen von drei verschiedenen Fluoro
chromen (DAPI, FITC und PI), die zur Zeit im Markt für Fluoreszenzmikroskopie verkauft
werden, sind.
Somit kann der Farbstoff als drei-in-ein-Fluorochromfarbstoff für Epifluoreszenzmikroskopie
für Einzel- und Doppelfärbungen von Chromosomen, Zellen und Geweben nach einfachen
Protokollen kommerzialisiert werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls die Verwendung des Farbstoffs in nicht-
radioaktiven Markierungen von Protein-, DNA- und RNA-Sonden für fluoreszierende in situ-
Hybridisierungsanwendungen in der Molekularbiologie.
Somit kann in einem bevorzugten Verwendungsverfahren der Farbstoff als eine Komponente
für molekulare Markierungs- und Detektionskits verwendet werden, von denen die meisten
importiert und für viel Geld verkauft werden.
Diese Markierungskits unterliegen einer großen Nachfrage für molekulare Diagnostik, die
schnelle molekulare Cytogenetik- und Microarray-Techniken verwenden.
In noch einer weiteren bevorzugten Verwendungsweise kann der Farbstoff vorteilhaft zur
Herstellung von Zusammensetzungen für Kosmetika zur Absorption von UVB des Sonnen
lichtes sein.
Ein weiterer Vorteil des Farbstoffs ist, das seine Fluoreszenz selbst bei sehr starken Verdün
nungen (1 : 40000) sichtbar ist.
Diese Eigenschaft kann in lebensrettenden Vorrichtungen als Teil einer Rettungsweste und
zur Markierung des Absturzortes von Flugzeugen, Rettungsbooten und Militärausrüstung wie
zum Beispiel Raketen und Leckuntersuchungen in der Industrie verwendet werden.
Die Erfindung würde für quantitative Messungen der Fluoreszenz im Flußzytometern für Ein
zel- und Vielfachzellen verwendbar sein.
Die Erfindung würde ebenfalls zur schnellen Bestimmung von Biokontaminationen in natürli
cher und kontrollierter Umgebung wie Gewebekulturen, Umweltverschmutzung, industrielle
Kontaminationen in Gesundheits-, Nahrungsmittel- und Kosmetikindustrie vorteilhaft sein.
Die Fähigkeit des Farbstoffs, Fluoreszenz im UVA-Bereich nach Anregung mit niedrigen
Wellenlängen durch UV-Bestrahlung zu emittieren, ist zur selektiven Photochemotherapie
von Hautkrebs verwendbar.
In einer anderen bevorzugten Nutzungsform kann der Farbstoff als Bestandteil von Sonnen
schutzzusammensetzungen in der kosmetischen Industrie eingesetzt werden.
Noch eine weitere Verwendung ist die, daß der Farbstoff ein Biotensid ist und in anti
mikrobiellen Zusammensetzungen und für Toilettenartikel-Zusammensetzungen eingesetzt
werden kann.
In einer anderen bevorzugten Nutzungsform hat der Farbstoff bei Raumtemperatur eine lange
Haltbarkeit, wie durch fluoreszenzspektrophotometrische Analysen gezeigt wurde.
In noch einer weiteren bevorzugten Nutzungsform verleihen die vorliegenden Fluorochrome
Kosmetika eine natürliche Farbe und sparen die Ausgaben für Farbzusätze.
Ein anderer Nutzen des Fluoreszenzfarbstoffs liegt im Gebrauch als Komponente neuer Fer
nerkundungsvorrichtungen und Unterseeproben, wo Daten, basierend auf einer Lichtwellen
längensensitivität, notwendig sind.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele verdeutlicht, welche nicht als Einschränkung
des erfinderischen Umfangs der Erfindung in irgend einer Hinsicht verstanden werden sollen:
Das Verfahren zur Extraktion, partiellen Reinigung, Charakterisierung des Farbstoffs und die
Details des durchgeführten Experiments zur Untersuchung der Fluoreszenzeffekte des Farb
stoffs durch spektroskopische Analysen und Epifluoreszenzmikroskopie umfassen:
Unterreich: Metazoa
Stamm: Echinodermata
Unterstamm: Eleutherozoa
Klasse: Holothuroidea
Unterklasse: Dendrochirotacea
Ordnung: Dendrochirotida
Gattung: Holothuria
Art: scabra
Stamm: Echinodermata
Unterstamm: Eleutherozoa
Klasse: Holothuroidea
Unterklasse: Dendrochirotacea
Ordnung: Dendrochirotida
Gattung: Holothuria
Art: scabra
Die dazugehörigen Tiere wurden an den Ufern der Zentralwestküste Indiens während Ebbe
gesammelt. Sie wurden in das Labor gebracht und in Glasbehältern, enthaltend Seewasser mit
einem Salzgehalt von 30-32 pro Nennwert (30%) bis zur taxonomischen Identifikation und
weiteren Verwendung gehalten. Die Tiere waren erwachsen und sexuell reif.
Zwei Verfahren wurden erprobt.
- 1. Bei unseren anfänglichen Experimenten wurden die Tiere nach dem Sammeln bei -20°C gefroren und beim Antauen traten Pigmente auf die Ablage aus. Dies wurde weitergeführt und auf diesem Wege konnte von einem Tier 3-4 Mal Pigment entnommen werden. Die Fig. 1 & 2 zeigen das frische und 4-Mal zur Extraktion verwendete Tier.
- 2. In dem zweiten Verfahren wurden die Tiere zunächst mit Leitungswasser und anschlie
ßend mit Milliqwasser (ultrareinem Wasser) gewaschen. Der Körper wurde mit einer
scharfen Schere geöffnet und die Körperwand von den Eingeweiden getrennt. Von der
Körperwand wurde mit Hilfe scharfer Rasiermesser ein Teil der epidermalen Haut abge
schabt und bei -20°C im Gefrierschrank gelagert, soweit sie nicht direkt weiterverarbeitet
wurde. Sie wurde anschließend in ein Becherglas gegeben und 50% vol/vol Ethanol und
MQ-Wasser-Gemisch wurde in folgenden Verhältnissen zugegeben.
15 g Tierhaut: 250 ml 50% Ethanol.
Dieser Schritt wurde durchgeführt, um Zelltrümmer und einige der suspendierten und präzi
pitierten Unreinheiten zu entfernen. Zum Erhalt einer klaren Lösung wurden sie abzentrifu
giert und alle suspendierten Teile präzipitiert.
Die farbige Lösung wurde dekantiert und mit einer Mikrofiltrationseinheit (Marke Vensil) in
einem Glasfilter mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe filtriert. Das Filtrat wurde auf einen
Orbitalschüttler gegeben und dort für eine halbe Stunde bei 200 rpm belassen.
Die farbige Lösung wurde anschließend in ein Wasserbad bei 80°C gegeben und auf ein
Drittel ihres Volumens eingeengt. Dabei verdampfte ebenfalls der vorhandene Alkohol. Das
Konzentrat wurde wieder mit derselben Filtratationsanlage einer Filtration unterworfen.
Die Pigmentlösung wird Verunreinigungen wie NaCl, MgCl2, MgSO4 und andere wasserlös
liche Bestandteile enthalen. Es wurde beobachtet, daß polare organische Lösungsmittel wie
Alkohol (dehydriert) und Aceton, wenn zu der konzentrierten Pigmentlösung dazugegeben,
das Pigment rasch präzipitierten. Dann kann es von den Seewassersalzen getrennt werden.
Dies dient der Reinigung des Pigments für spektroskopsiche Analysen.
Die nach dem oben beschriebenen Beispiel 5 hergestellte Lösung wurde in einen 500 ml-
Scheidetrichter gegeben und Ethanol hinzugefügt (80 ml des konzentrierten Überstandes +
100 ml 99,5%igen Ethanols). Der Scheidetrichter wurde gekippt, um vorsichtig den Inhalt zu
Durchmischen und das Präzipitat über Nacht gesammelt. Das Konzentrat mit dem Präzipitat
wurden bei 1500 rpm für 4-5 Minuten zentrifugiert und die obere Schicht dekantiert. Das Prä
zipitat wurde in 5 ml MQ-Wasser erneut aufgelöst und wieder 100%iger Ethanol zugefügt,
bis die Präzipitation vollständig ist. Dies wurde erneut zentrifugiert und das Präzipitat ge
sammelt. Dieser Schritt wurde 3-4 Mal wiederholt, um das Pigment zu reinigen.
Das Präzipitat wurde bis zur Trockenheit auf einem Wasserbad bei 80°C für 5 Minuten einge
dampft. Der reine Farbstoff wurde mit Hilfe eines Spatels ausgeschöpft und in einem trocke
nen Glasgefäß bei Raumtemperatur gelagert.
250 ml eines 50% Ethanol-Rohextraktes aus Beispiel 2 ergaben 2,5 Gramm des partiell ge
reinigten Farbstoffs nach Eindampfen in Pulverform.
Der Rohextrakt ist von gelblich-grüner Farbe. Die physikalische Natur des reinen trockenen
Farbstoffs, betrachtet mit bloßem Auge, ist bei Tageslicht von rötlich-brauner Farbe. Unter
Kaltlicht wird ein grünlicher Schimmer beobachtet. Der Farbstoff ist in Wasser löslich und in
organischen Lösungsmitteln wie reinem Alkohol, Methanol und Aceton unlöslich. Er ist von
amorpher Natur. Er hat einen pH von 6,5 und eine negative Ladung.
Experiment 1: Eine CHNS-Elementaranalyse des Farbstoffs wurde durchgeführt und die Er
gebnisse werden in der Tabelle 1 (a) und (b) wiedergegeben.
Experiment 2: Der Farbstoff ist in MQ-Wasser mit 2 mg/ml gelöst und wird auf seine chemi
sche Natur hin untersucht. Das Vorhandensein und Fehlen von bestimmten Gruppen wurden
untersucht und die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 wiedergegeben. Wann immer ein Test
negative Ergebnisse zeigte, wurde die höhere Konzentration des Farbstoffs verwendet, um das
Experiment erneut durchzuführen.
Zum Beispiel wurde zu der 2 mg/ml-Lösung des Farbstoffs Beta-Mercaptoethanol (reduzie
rendes Agens) zugefügt. Es trat keine Entfärbung der Verbindung auf. Das zeigte, daß ein
Chinoidring fehlt und das Pigment ein Farbstoff ist.
In Experiment 3 wurde eine konzentrierte Farbstofflösung von 10 mg/ml erhitzt und keine
Präzipitation oder Koagulation wurde beobachtet. Das zeigte, daß die Verbindung nicht von
proteinöser Natur ist.
In Experiment 4 wurde derselben Lösung ein Tropfen konzentrierter HCl zugesetzt und
Fehlingsche Lösung zugegeben. Das Ausbleiben eines Farbwechsels zeigte, daß der reduzie
rende Zucker fehlt ist.
Die Ladung der Verbindung wurde durch Gelelktrophorese untersucht.
Farbstoffproben (10 ml) wurden auf ein 1%iges Agarosegel, hergestellt mit 0,5 × TBE, gela
den. Das Gel lief für eine Stunde bei 65 Volt. Es wurde aus der Gelgießvorrichtung entnom
men und sowohl mit bloßem Auge als auch unter dem UV-Transilluminator beobachtet. Es
zeigte sich, daß der Farbstoff der positiv geladenen Elektrode entgegen wanderte, so daß der
Farbstoff selbst eine negativ geladene Verbindung ist. Deshalb wurde er zu der positiv gela
denen Elektrode hingezogen.
Die Biotensidnatur des Farbstoffs wurde dadurch beobachtet, daß er Schaum bildet, wenn
Wasser zugefügt und geschüttelt wird. Die Lösung ergab ein seifiges Gefühl.
Da der marine Farbstoff eine phenolische Verbindung ist und phenolische Komponenten im
allgemeinen antimikrobielle Aktivität zeigen, wurde ein antimikrobieller Test mit dieser Ver
bindung durchgeführt und eine Inhibitionszone beobachtet.
Eine E. coli (Wildtyp)-Kultur wurde in einer konischen Flasche (100 ml) über Nacht in 50 ml
MacConkey's-Flüssigmedium gezogen. Antibiotisches Testagarmedium wurde hergestellt und
sterilisiert. Es wurde anschließend auf eine Temperatur von 50°C gebracht und 1 ml der E. coli
(Wildtyp)-Kultur wurde hinzugefügt. Die Kultur wurde mit antibiotischem Testagarmedium
versetzt und härtete aus. 10 mg/ml der Probe wurden hergestellt und in Filterpapierscheiben
gesogen. Diese wurden anschließend auf das antibiotische Testagarmedium mit ausgesähten
E. coli plaziert.
Es wurden anschließend bei 37°C in einem Inkubator für 24 Stunden inkubiert. Es wurden
Inhibitionszonen, umgebend die Filterscheiben, beobachtet. Das zeigte, daß der Farbstoff eine
antimikrobielle Aktivität gegen Gram-negative Organismen wie E. coli hat.
Das verwendete Gerät: Genesys2 UV-Spektrophotometer
Es wurde eine 2 mg/10 ml-Lösung in einer volumetrischen Flasche hergestellt und spektro
photometrische Werte wurde im UV-, sichtbaren Bereich unter Verwendung einer Quarzkü
vette und Zufügen von 2 ml der Lösung genommen. Die Kontrolle war ultrareines Wasser.
UV-, sichtbare Spektroskopie von 300 nm-700 nm Wellenlänge (Fig. 3 & 4) wurde durchge
führt. Die Peaks lagen bei den Wellenlängen 379 nm und 439 nm.
Die UV-, sichtbare Spektroskopie wurde bei einer Wellenlänge von 250 nm-350 nm (Fig. 3
& 4) durchgeführt. Die Peaks lagen bei den Wellenlängen 272 nm und 299 nm.
Der verwendete Apparat: Hitachi Fluoreszenzspektrophotometer
Die Fluoreszenzspektroskopie wurde bei verschiedenen Wellenlängenbereichen des sichtba
ren- und UV-Spektrums durchgeführt und Emissionsbereiche notiert. Es zeigte sich, daß mit
einer Anregungswellenlänge von 270 nm die Fluoreszenz bei 324-380 mit maximaler Inten
sität auftrat (Fig. 5).
Bei der Fluoreszenzspektroskopie mit einer Anregungswellenlänge von 450 nm trat die Fluo
reszenz mit maximaler Intensität bei 500-580 auf (Fig. 6).
Bei der Fluoreszenzspektroskopie mit einer Anregungswellenlänge von 540 nm trat die Fluo
reszenz mit maximaler Intensität bei 500-620 nm auf (Fig. 7) und bei der Fluoreszenzspek
troskopie mit der Anregungswellenlänge von 555 nm trat die Fluoreszenz mit maximaler In
tensität bei 575-620 nm auf (Fig. 8).
Ein Whatman Nr. 1-Filterpapier wurde geschnitten, in verdünnten Rohextrakt getaucht und
unter einem Geldokumentations-UV-Licht betrachtet. Es war deutlich zu sehen, daß der Farb
stoff bei fortschreitendem Aufsaugen im Fluoreszenzbereich weiter fortschritt (Fig. 9).
In einem anderen Test wurden die Filterpapiere, verwendet für die Filtration, unter dem UV-
Transilluminator mit Birnen im UV-Bereich von 260-280 nm betrachtet. Eine bläu
lich/gründlich schimmernde Fluoreszenz wurde beobachtet (Fig. 10).
Die epifluoreszenzmikroskopischen Studien wurden unter Verwendung des Farbstoffs als eine
Färbesubstanz in der Verdünnung von 1 : 40000 durchgeführt und Lichtemissionen nach Anre
gung mit verschiedenen Würfeln aufgenommen und die Farbschattierungen mit bekannten
Fluorochromen verglichen. Es wurde die cytogenetische, luftgetrocknete Präparation fixierten
Gewebes hergestellt. Dazu wurde ein Tropfen der Färbesubstanz und ein Deckgläschen darauf
gegeben. Die Untersuchung wurde unter Anregung von UV-Licht und sichtbarem Lichtspek
tren mit Hilfe der WU-, WB- und WG-Würfel des Olympus reflektierten Lichts durchgeführt.
WU-Würfelwellenlängenbereich war 330 nm-385 nm.
WB-Würfelwellenlängenbereich war 450 nm-480 nm.
WG-Würfelwellenlängenbereich war 510 nm-550 nm.
WU-Würfelwellenlängenbereich war 330 nm-385 nm.
WB-Würfelwellenlängenbereich war 450 nm-480 nm.
WG-Würfelwellenlängenbereich war 510 nm-550 nm.
Es wurden die Emissionsbereiche bei verschiedenen Anregungsbereichen herausgefunden. Es
wurde beobachtet, daß: Anregung im WU 330 nm-385 nm-Bereich zu einer emittierten Fluo
reszenz im Bereich von 380 nm-400 nm führte. Anregung mit dem WB-Filter mit einem
Spektralbereich von 450 nm-480 nm zu einer emittierten Fluoreszenz im Bereich von 500 nm-570 nm
führte. Die Anregung mit dem WG-Filter mit einem Spektralbereich von
510 nm-550 nm führte zu einer emittierten Fluoreszenz im Bereich von 570 nm-650 nm.
Das Screening mit Hilfe der Epifluoreszenzmikroskopie von cytogenetischen Schnitten im
Hellfeld durch Verwendung von Durchlicht führte zum emittierten Licht im vollweißen Be
reich des sichtbaren Spektrums und gab abhängig von der Dichte der Zellbestandteile durch
einen Grauschimmer einen phasenkontrastähnlichen Effekt.
Die Schattierungen der emittierten Farben wurden in den Bereichen registriert, wo aus
schließlich Farbstoff vorhanden war und in den Bereichen, wo einige Proben vorhanden wa
ren. Der Anregungsspektralbereich und die emittierte Fluoreszenz folgten streng dem Stoke
schen Gesetz (Tabelle 3).
Die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in Bereichen der Schnitte ohne Zellen und
mit Probenzellen im WU 330 nm-385 nm-Bereich, WB 450 nm-480 nm-Bereich, WG 510 nm-550 nm-Bereich
und Hellfeld, wurden mit Hilfe von Kodakfilmen mit 400 ASA-
Geschwindigkeit mit einer Belichtung, variable von 50 bis 60 Sekunden, durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 11 bis 24 dargestellt.
Der besagte Farbstoff ist stabil und bleibt bei Raumtemperatur aktiv und bleibt dies bis zu
einer Temperatur von 120°C und dies wurde dadurch nachgewiesen, daß keine Veränderung
der spektralen Eigenschaft nach solcher Behandlung auftraten. Die Verbindung behielt ihre
Stabilität für ungefähr 1 Jahr ohne jegliche Kontamination oder chemischen Verfall. Der be
sagte marine Farbstoff ist nach Lichtbehandlung nicht der Photolyse unterworfen. So benötigt
der besagte marine Farbstoff keine stabilisierenden Mittel.
Die Verbindung war toxisch für Insekten. Die Toxizität wurde bei Insekten wie Ameisen ge
zeigt. Das mit Farbstoff vollgesaugte Filterpapier wurde unbeobachtet auf der Werkbank be
lassen. Am nächsten Tag wurde beobachtet, daß es voller toter Ameisen war.
Der Farbstoff wurde an Zelllinien und beobachtete Aktivität hin untersucht.
Das mit Eisessig und Methanol aus verschiedenen Quellen fixierte Gewebe wurde auf den
Objektträger gegeben und die Farbstofflösung wurde ohne Vorbehandlung hinzugegeben. Es
wurde beobachtet, daß verschiedene Zellteile die Farbstofflösung in unterschiedlicher Weise
aufnehmen. Der Nucleus wurde deshalb gefärbt, da sich die arginin- und lysinreichen Protei
ne, die im Zellkern vorhanden sind, färben (besonders Histone). Die anderen Zellorganellen
wurden auch gefärbt. Da der marine Farbstoff folglich die Proteine von Chromosomen färbt,
wurde Wert auf die Untersuchung des Karotyps der Zelle gelegt.
Der bioaktive Extrakt des Farbstoffs wurde in ein Mikrozentrifugationsgefäß gegeben, bei
-20°C eingefroren und im gefrorenen Zustand unter UV-Licht betrachtet. In einem anderen
Experiment wurde das in die Färbelösung getauchte Filterpapier bei -20°C gelagert und unter
dem UV-Transilluminator beobachtet.
Das Extrakt wurde als veterinäres Heilmittel zur Tötung von Zecken/Fliegen auf Hunden ein
gesetzt. Eine 1 : 200-fachen Verdünnung des Rohextraktes tötete Zecken und Fliegen in weni
ger als 40 Sekunden.
- 1. Der Farbstoff ist nicht-radioaktiv, da er ein Farbstoff aus einer natürlichen Quelle und nicht synthetisch ist.
- 2. Dieser Farbstoff ist als Einzelform äquivalent zu drei verschiedenen synthetischen Fluoro chromen, die dieselbe Emission an Fluoreszenzfarben ergeben.
- 3. Der Farbstoff kann als schneller mikroskopischer Färbestoff verwendet werden, ergibt einen Phasenkontrasteffekt ohne Extrakosten durch Phasenkontrastzubehör für das Mikro skop und kann ohne übermäßig lange Protokolle für Fixierungen und Konservierungen von Proben angewandt werden. Insbesondere für eine sofortige Qualitätsuntersuchung von Lebendproben.
- 4. Da er für eine längere Zeitperiode in der Fluoreszenzqualität nicht degradiert, ist ein Ein frieren während des Exports nicht notwendig. Die zur Zeit vermarkteten Fluoreszenzfarb stoffe werden mit Gefrieräquivalenten bei -20°C exportiert.
- 5. Im Gegensatz zum früher bekannten grünen fluoreszierenden Protein (GFP) von einer marinen Qualle, ist unser Farbstoff kein Reportergen. Die Ergebnisse sind direkt. GFP absorbiert blaues Licht bei 395 nm und emittiert Licht mit einem kleinen Peak bei 470 nm. Unser Farbstoff emittiert drei fluoreszierende Farben bei drei verschiedenen fluoreszie renden Wellenlängen. Der Farbstoff ist in Wasser löslich - und so kann er bei Kompo nenten eingesetzt werden, wo lösliche Farbstoffe notwendig sind. Der Farbstoff ist unlös lich in organischen Lös 08810 00070 552 001000280000000200012000285910869900040 0002010117303 00004 08691ungsmitteln wie Ethanol, Methanol und Aceton.
- 6. Der Farbstoff ist negativ geladen.
- 7. Der Farbstoff hat einen pH von 6,5, welcher beinahe neutral ist und daher nicht die end gültigen pH-Eigenschaften in Zusammensetzungen drastisch beeinflussen wird.
- 8. Der Farbstoff ist von nicht proteinöser Natur und daher unter natürlichen Bedingungen nicht degradierbar.
- 9. Der Farbstoff hat eine Natur als Biotensid und kann daher in Seifen und bei Toilettenarti kel-Zusammensetzungen eingesetzt werden.
- 10. Der Farbstoff hat antimikrobielle Eigenschaften.
- 11. Der Farbstoff emittiert diese Fluoreszenzfarben selbst bei einem Verdünnungsbereich von 1 : 40000-fach (d. h. 1 Gramm Pulver des Farbstoffs gelöst in 40 Litern ultrareinen Was sers). Die Fluoreszenz des Extrakts hält selbst nach mindestens einem Jahr bei Raumtem peratur an. Diese vielfarbigen Emissionen des Farbstoffs bei verschiedenen Anregungs wellenlängen sind vergleichbar mit den fluorochromen Mikroskopfarbstoffen, wie sie be reits im Markt sind.
- 12. Die blaugefärbte Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist vergleichbar mit der Emissi on derselben Farbe durch das Fluorochrom DAPI bei derselben Anregungswellenlänge, verwendet als Komponente für nicht-radioaktive Markierungskits der Biochemie, Zell biologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
- 13. Die blaugefärbte Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist auch vergleichbar mit der Emission der Farbe von Hoechst 33258, verwendet als Komponente für nicht-radioaktive Markierungs- und Detektionskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Mole kualrbiologie.
- 14. Die blaugefärbte Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist auch vergleichbar mit der Emission der Farbe beim Hoechst 33342-Fluorochrom bei derselben Anregungswellen länge, verwendet als Komponente für nicht-radioaktive Markierungs- und Detektionskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
- 15. Die gelbgefärbte Fluoreszenz des besagten Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist vergleich bar mit derselben farbigen Emissionen von Acridin-Orange, verwendet als Komponente für nicht-radioaktive Markierungs- und Detektionskits der Biochemie, Zellbiologie, Im munchemie und Molekularbiologie.
- 16. Die gelbgefärbte Fluoreszenz des besagten Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist vergleich bar mit derselben farbigen Emissionen von Auramin, verwendet als Komponente für nicht-radioaktive Markierungs- und Detektionskits der Biochemie, Zellbiologie, Immun chemie und Molekularbiologie.
- 17. Die gelbgefärbte Fluoreszenz des besagten Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist vergleich bar mit denselben farbigen Emissionen von FITC, verwendet als Komponente für nicht- radioaktive Markierungs- und Detektionskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
- 18. Die orangefärbte Fluoreszenzemission ist vergleichbar mit der orangenen Fluoreszenzfar be des Fluorochroms Propidiumiodid, verwendet als Komponente für nicht-radioaktive Markierungs- und Detektionskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Mole kularbiologie.
- 19. Die orangefärbte Fluoreszenzemission ist vergleichbar mit der orangenen Fluoreszenzfar be des Fluorochroms Rhodamin, verwendet als Komponente für nicht-radioaktive Markie rungs- und Detektionskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekular biologie.
- 20. Die orangefärbte Fluoreszenzemission ist vergleichbar mit der orangenen Fluoreszenzfar be des Fluorochroms TRITC, verwendet als Komponente für nicht-radioaktive Markie rungs- und Detektionskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekular biologie.
- 21. Im Gegensatz zu synthetischen, herkömmlichen Farbstoffen, eingesetzt für dieselben Verwendungszwecke, ist der vorliegende Farbstoff bei Raumtemperatur stabil und hat ei ne lange Haltbarkeit. Molekulare nicht-radioaktive Kits des besagten Farbstoffs können bei Raumtemperatur exportiert werden.
- 22. Der besagte einzelne Farbstoff hat Charakteristika von mindestens 123 verschiedenen Fluorochromen (DAPI, Hoechst 33258, Hoechst 33342, FITC, Acridin-Orange, Auramin, Rhodamin, TRITC und Propidiumiodid etc.), wie sie bisher im Markt sind. Unter norma lem Mikroskoplicht erzeugen die Grauschattierungen einen Phasenkontrasteffekt, der für die schnelle Untersuchung von cytogenetischen, cytologischen und histochemischen Schnitten nützlich ist und Geld für Extraphasenkontrastzubehörteile des Mikrosokops spart. Die Fluoreszenzfarbemissionen folgen dem Stokeschen Gesetz der Fluoreszenz.
- 23. Die Mikrofotografien mit Kodakfilm zeigen Schattierungen der angrenzenden Farbemis sionswellenlängen. So zeigt die blaufarbige Fluoreszenz unter dem Epifluoreszenzmikro skop in der Mikrofotografie auch die Schattierungen von Grün.
- 24. Die Mikrofotografien mit Kodakfilm zeigen Schattierungen der angrenzenden Farbemis sionswellenlängen. So zeigt die gelbfarbige Fluoreszenz unter dem Epifluoreszenzmikro skop in der Mikrofotografie auch die Schattierungen von Grün. Der Farbstoff zeigt bei orangener Fluoreszenzfarbe unter dem Epifluoreszenzmikroskop in der Mikrofotografie auch die Schattierungen von Rot.
- 25. Die cytogenetischen Schnitte, gesehen unter allen Fluoreszenzen, zeigen einen Gegenfär beeffekt der Zellen mit dem Hintergrund, wenn kein Probenmaterial, sondern nur Farb stoff vorhanden ist.
- 26. Der Farbstoff kann für die Herstellung von Polyvinylchloridfilmen verwendet werden, die Fluoreszenzfarben zeigen. Er kann auch in Fluoreszenzfarben in einer Reihe von Farben, Tinten und Textilien benutzt werden.
- 27. Der Farbstoff kann in Fluoreszenzfarbstoffzusammensetzungen zum Bleichen und Auf hellen von Polymeren eingesetzt werden. Der Farbstoff kann in der Detektion von Lecks mit einem Vollspektrumfluoreszenzfarbstoff eingesetzt werden. Er kann auch in automati sierten, chemischen Dosiersystemen verwendet werden. Er kann auch zur Markierung der Absturzstelle von Flugzeugen, Rettungsbooten und Ausrüstung wie zum Beispiel Raketen verwendet werden. Weiterhin kann er für Unterseeproben benutzt werden. Der Farbstoff kann bei der Photochemotherapie von Hautkrebs eingesetzt werden.
- 28. Der Farbstoff kann als chromatophore Sonnenschutzkomponente für kosmetische Cremes und Lotionen verwendet werden.
- 29. Die wassermischbare Eigenschaft des Farbstoffs kann die Mischbarkeit in Feuchtigkeit scremes erleichtern. Er kann als Fluoreszenzkomponente in einem in situ- Hybridisierungsanwendungskit für molekulare Diagnostik verwendet werden. Er kann auch als Komponente für nicht-radioaktive Markierungs- und Detektionskits der Bioche mie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie zur Markierung von DNA, RNA, Proteinen und Enzymen, Immunfluoreszendetektionen, Gegenfärbung von DIG- markierten Oligonukleotidsonden und Anti-DIG Fab-Fragementen, einzel- und vielfach- zell-quantitative Fluoreszenz der Flußzytometrie und als Fluorochromfärbestoff für Epif luoreszenzmikroskopie verwendet werden.
- 30. Der Farbstoff zur Schnelluntersuchung für Biokontaminationen in der Gesundheitsnah rungsmittelindustrie, der kosmetischen Industrie, pharmazeutischen und chemischen Indu strie, für schnelle Bestimmungen von Biokontaminationen in Laborkulturen, zur Schnel luntersuchung von Bioverunreinigungen unter Feldbedingungen verwendet werden. Er kann auch ein kompetetiver Inhibitor für Cholinesterasen sein.
- 31. Der Farbstoff kann in antimikrobiellen Zusammensetzungen verwendet werden.
- 32. Der Farbstoff kann als Biotensid bei Toilettenartikel-Zusammensetzungen eingesetzt wer den.
- 33. Der Farbstoff kann als natürliche Färbesubstanz einer bioaktiven Zusammensetzung des marinen Farbstoffs im Verhältnis von 1 : 40000 in ultrareinem Wasser eingesetzt werden, um Fluoreszenz von drei Farben bei drei verschiedenen Wellenlängen und einen Phasen kontrasteffekt bei Durchlicht zu erzielen.
- 34. Die Reinigung des Farbstoffs kann in 250 ml 50%igen Ethanolrohextrakts durchgeführt werden, bei Eindampfen auf einem Wasserbad bei 80°C für 5 Minuten, um 2,5 Gramm des gereinigten Farbstoffs in Pulverform zur Verfügung zu stellen. Zur spektrophotometri schen, strukturellen Analyse des Farbstoffs wurde eine 2 mg/10 ml- Lösungszusammensetzung verwendet, zum chemischen Verfahren wurde eine Konzentra tion von 10 mg/ml eingesetzt. Eine bioaktive Zusammensetzung des Farbstoffs im Ver hältnis von 1 : 40000-fachen Verdünnungen mit Wasser, wobei die Verbindung eine Fluo reszenz von drei Farben bei drei verschiedenen Wellenlängen ergibt.
Claims (54)
1. Bioaktiver Extrakt, gewonnen aus einem marinen Organismus und verwendbar als ein
natürlicher Fluoreszenzfarbstoff, mit folgenden Charakteristika:
- a) Entfärbung durch ein reduzierendes Agens,
- b) keine synthetische Verbindung,
- c) Rohextrakt des Farbstoffes hat eine gelblich-grüne Farbe,
- d) gereinigter Farbstoff ist ein rot-braun gefärbtes Pulver bei Betrachten mit dem bloßen Auge bei Tageslicht,
- e) unter Kaltlicht werden einige grüne Farbschattierung emittiert,
- f) amorphe Natur,
- g) löslich in Wasser,
- h) unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Methanol und Aceton,
- i) ist negativ geladen,
- j) hat einen pH von 6,5,
- k) Vorhandensein einer phenolischen Gruppe,
- l) Fehlen eines Chinoidrings,
- m) Fehlen aromatischer Amingruppen,
- n) von nicht proteinöser Natur,
- o) Fehlen reduzierenden Zuckers,
- p) Farbstoff hat eine Biotensidnatur,
- q) Farbstoff zeigte auch antimikrobielle Eigenschaften und bei Durchführen eines anti mikrobiellen Tests traten Inhibitionszonen auf,
- r) Farbstoffpigment ist ein Fluoreszenzfarbstoff und emittiert Fluoreszenz nach Anregen mit verschiedenen Wellenlängen des UV- und sichtbaren Spektralbereiches eines Spektrophotometers,
- s) bei UV-, sichtbarer Spektroskopie von 300 nm-700 nm und die Peaks liegen bei einer Wellenlänge von 379 nm und 439 nm,
- t) bei UV-, sichtbarer Spektroskopie von 250 nm-350 nm und die Peaks liegen bei einer Wellenlängen von 272 nm und 299 nm,
- u) Fluoreszenzspektroskopie im UV- und sichtbaren Spektrum, wobei nach Anregen mit einer UV-Wellenlänge von 270 nm die Fluoreszenz im Bereich von 324 nm-380 nm emittiert wird, was dem UVA-Wellenlänge in einem Bereich von ultravioletten Strah len des Sonnenlichtes entspricht,
- v) bei einer Anregungswellenlänge von 450 nm in der Fluoreszenzspektroskopie erschien die Fluoreszenzemission mit maximaler Intensität bei 500 nm-580 nm,
- w) bei einer Anregungswellenlänge von 540 nm in der Fluoreszenzspektroskopie erschien die Fluoreszenzemission mit maximaler Intensität bei 500 nm-620 nm,
- x) bei einer Anregungswellenlänge von 555 nm in der Fluoreszenzspektroskopie erschien die Fluoreszenzemission mit maximaler Intensität bei 575 nm-620 nm,
- y) physikalische Untersuchung von Whatman Filter Nr. 1-Papier, befeuchtet mit einer Farbstoffkonzentrationsverdünnung von 1 : 40000, unter einem UV-Transilluminator und Geldokumentationssystem mit UV-Lampen im Bereich von 260 nm-280 nm emittiert eine Fluoreszenz, die eine bläulich-grüne Farbschattierung aufweist,
- z) emittiert drei verschiedene, farbige Fluoreszenzen bei drei verschiedenen Wellenlän gen im UV- und sichtbaren Bereich der Fluoreszenzwürfel eines Epifluoreszenzmikro skops,
- aa) blaufarbige Fluoreszenzemission tritt in einem Bereich von 380 nm-400 nm des UVA-Bereichs nach Anregen mit Hilfe des ultravioletten Würfels WU - 330 nm-385 nm Anregungswellenlänge auf,
- ab) gelbfarbige Fluoreszenzemission tritt im Bereich von 500 nm-570 nm nach Anregen mit dem WB-Würfel bei 450 nm-480 nm Anregungswellenlänge auf,
- ac) orangefarbige Fluoreszenzemission tritt im Bereich von 570 nm-650 nm nach Anre gen mit dem WG-Würfel bei 510 nm-550 nm Anregungswellenlänge auf,
- ad) der Farbstoff emittiert Schattierungen von Grautönen unter einer herkömmlichen Glühbirne des Epifluoreszenzmikroskops bei Betrachtung mit einem 10X-Objektiv,
- ae) der Farbstoff emittierte diese Fluoreszenzfarben selbst in einem Verdünnungsbereich von 1 : 40000 (d. h. 1 g Pulver des Farbstoffes gelöst in 40 Litern ultrareinen Wassers),
- af) die Fluoreszenz des Extrakts hielt selbst nach 1 Jahr bei Raumtemperatur an,
- ag) die Fluoreszenz des Farbstoffs ist hoch fotostabil und verschlechtert sich nicht nach längerem Aussetzen gegenüber direktem Licht, und
- ah) die Fluoreszenz des Farbstoffs ändert sich nicht, selbst bei Einfrieren bei 20°C, einer Temperatur, bei der die Moleküle nicht in der Lage sind, die Energie zu erlangen, wie sie zur Aktivierung in Extrakten von lumineszierenden Organismen notwendig ist.
2. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff aus einem marinen
Organismus wie Holothuria scabra gewonnen ist, vorkommend in Gezeitenregionen, un
ter Wasser, in seichtem und tiefem Wasser, im allgemeinen reichlich in beschatteten Ge
bieten sowie Höhlen, Spalten, Felsvorsprüngen, Überhängen und steinigen wie sandigen
Habitaten; ausdruckslos bis leuchtend gefärbt mit oder ohne Exo- und Endoskelett, sessil,
durch Strömung beweglich, nektonisch mit unterschiedlichem Schwimmantrieb, im all
gemeinen nachtaktiv und ein unregelmäßiger bis aktiver Räuber.
3. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die vielfarbigen Emissionen des
Farbstoffes bei verschiedenen Anregungswellenlängen mit den fluorochromen Färbesub
stanzen für Mikroskopie, die bereits auf dem Markt sind, vergleichbar sind.
4. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die blaugefärbte Fluoreszenz des
vorliegenden Farbstoffes vergleichbar mit der Emission derselben Farbe des DAPI Fluo
rochroms bei derselben Anregungswellenlänge ist, verwendet als Komponenten für nicht-
radioaktive Markierungskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekular
biologie.
5. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gelbgefärbte Fluoreszenz des
besagten Farbstoffes im sichtbaren Bereich vergleichbar mit den gleichgefärbten Emissio
nen von Auramin ist, verwendet als Komponenten für nicht-radioaktive Markierungs- und
Detektionskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
6. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gelbgefärbte Fluoreszenz des
besagten Farbstoffes im sichtbaren Bereich vergleichbar mit den gleichgefärbten Emissio
nen von FITC ist, verwendet als Komponenten für nicht-radioaktive Markierungs- und
Detektionskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
7. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die orangegefärbte Fluoreszen
zemission vergleichbar mit der orangenen Fluoreszenzfarbe des Fluorochroms Propidiu
miodid ist, verwendet als Komponenten für nicht-radioaktive Markierungs- und Detekti
onskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
8. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die orangegefärbte Fluoreszen
zemission vergleichbar mit der orangenen Fluoreszenzfarbe des Fluorochroms Rhodamin
ist, verwendet als Komponenten für nicht-radioaktive Markierungs- und Detektionskits
der Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
9. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die orangegefärbte Fluoreszen
zemission vergleichbar mit der orangenen Fluoreszenzfarbe des Fluorochroms TRITC ist,
verwendet als Komponenten für nicht-radioaktive Markierungs- und Detektionskits der
Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
10. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff bei Raumtempe
ratur stabil ist und einen lange Haltbarkeit aufweist.
11. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die molekularen und radioakti
ven Kits des besagten Farbstoffs bei Raumtemperatur exportiert werden können.
12. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der einzelne Farbstoff Charakte
ristika von mindestens 100 verschiedenen Fluorochromen aufweist (nämlich DAPI;
Hoechst 33258, Hoechst 33342, FITC, Acridin-Orange, Auramin, Rhodamin, TRITC und
Propidiumiodid etc.), welche momentan im Markt sind.
13. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er in allen Verwendungen, bei
denen momentan Phycobiliproteine verwendet werden, eingesetzt werden kann, wobei der
Farbstoff im Gegensatz zu diesen keinen Verlust in der Fluoreszenz durch Einfrieren auf
weist.
14. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Hellfeld des Fluoreszenzmi
kroskops bei Betrachtung unter einem 10X-Objektiv die blaugrauen Schattierungen einen
Phasenkontrasteffekt hervorrufen, der für das schnelle Screening von cytogenetischen,
cytologischen und histochemischen Schnitten nützlich ist und Ausgaben für die Anschaf
fung von Extraphasenkontrastzubehör des Mikroskops einspart.
15. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß unter einem 100X-
Ölimmersionsobjektiv eines herkömmlichen Durchlichtmikroskops die Proteine von Ei
gelb, Nukleoplasma und Chromatin von sich aktiv teilenden Zellen verschiedene Farben
der Anfärbungen in Schattierungen von bräunlich/gelb im Falle des ersteren, gelb für das
darauffolgende und dunkelblau für die letzte Zellkomponente aufweisen. Dies kann in
schnellen Bioassays nützlich sein, wo dieser Effekt an verschiedenen histochemischen
Komponenten der Zellen beobachtet werden kann.
16. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzfarbemissionen
dem Stokeschen Gesetz für Fluoreszenz folgen.
17. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrofotografien mit Ko
dakfilm Schattierungen der angrenzenden Farbemissionswellenlängen zeigen, wie bei
spielsweise blaufarbige Fluoreszenz bei der Epifluoreszenz.
18. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrofotografien mit Ko
dakfilm Schattierungen der angrenzenden Farbemissionswellenlängen zeigen, wie bei
spielsweise gelbfarbige Fluoreszenz unter dem Epifluoreszenzmikroskop in der Mikrofo
tografie auch Schattierungen von grün aufweist.
19. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Betrachtung orangener Fluo
reszenzfarbe unter dem Epifluoreszenzmikroskop in der Mikrofotografie Schattierungen
von rot auftreten.
20. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß cytogenetische Schnitte, be
trachtet unter sämtlichen Fluoreszenzen einen Gegenfärbeeffekt von Zellen und Zellkom
ponenten gegenüber der Hintergrundfarbe ergeben, wo keine Probe, sondern nur Farbstoff
vorhanden ist.
21. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff mit Wasser in ei
nem Verhältnis von 1 : 10000-fach verdünnt wird und dieser eine Fluoreszenz von drei
Farben bei drei verschiedenen Wellenlängen aufweist.
22. Farbstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff mit Wasser in ei
nem Verhältnis von 1 : 40000-fach verdünnt wird und dieser eine Fluoreszenz von drei
Farben bei drei verschiedenen Wellenlängen aufweist.
23. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar zur
Herstellung eines flexiblen Polyvinylchloridfilms, der Fluoreszenzfarben zeigt.
24. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar zur
Herstellung von Beschichtungszusammensetzungen und Tinten.
25. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar zur
Detektion von Lecks.
26. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar bei
Unterseeproben.
27. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar in
der Photochemotherapie von Hautkrebs.
28. Kosmetische Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der
marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven.
29. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar als
eine Fluoreszenzmolekularsonde bei in situ-Hybridisierungskits für molekulare Diagno
stik.
30. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar als
eine Komponente von nicht-radioaktiven Markierungs- und Detektionskits der Biochemie,
Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
31. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar bei
Immunofluoreszenzdetektionen.
32. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar als
eine Gegenfärbesubstanz von DIG-markierten Oligonukleotidsonden und anti-DIG-Fab-
Fragmenten.
33. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar bei
quantitativer Einzel- und Vielzellenfluoreszenz in einzel- oder vielfarbigen Flußzytome
trieanwendungen.
34. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, das in Experimenten verwendet werden kann, die mit verschie
denen Verwendungen von Fluoreszenzfarbstoffen an Versuchsstandorten durchgeführt
werden müssen, die in Gebieten mit Temperaturen unter null Grad liegen.
35. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar als
fluorochrome Färbesubstanz für die Epifluoreszenzmikroskopie.
36. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar für
eine Schnelluntersuchung von Biokontamination in der Gesundheitslebensmittelindustrie,
kosmetischen Industrie, pharmazeutischen und chemischen Industrie.
37. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar zur
schnellen Abschätzung von Biokontaminanten in Laborkulturen.
38. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar als
Schnelluntersuchung auf Bioverunreinigungen unter Feldbedingungen.
39. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar als
ein kompetitiver Inhibitor für Cholinesterasen.
40. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar in
anti-mikrobiellen Zusammensetzungen.
41. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar als
Biotensid in Toilettenartikelzusammensetzungen.
42. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar in
Pestizid-Zusammensetzungen.
43. Zusammensetzung, umfassend einen bioaktiven Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Additiven und verwendbar als
ein natürlicher Färbestoff.
44. Bioaktive Zusammensetzung, umfassend einen Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, im Verhältnis von 1 : 40000 in ultrareinem Wasser, um Fluores
zenzen in drei Farben bei drei verschiedenen Wellenlängen zu erhalten.
45. Bioaktive Zusammensetzung, umfassend einen Extrakt, gewonnen aus der marinen See
gurke Holothuria scabra, um einen Phasenkontrast und histochemische Gegenfär
beeffekte für verschiedene biochemische Bestandteile von Zellen unter Durchlicht zu er
halten.
46. Eine Hautschutzzusammensetzung, erhaltend den Farbstoff zusammen mit physiologisch
und kosmetisch vertretbaren Bestandteilen wie Verdünnungsmittel, Dispersionsmittel oder
Träger.
47. Farbstoff nach Anspruch 1, verwendbar für:
- a) die Herstellung von flexiblem Polyvinylchloridfilm, der Fluoreszenzfarben zeigt;
- b) Verwendung als Fluoreszenzfarben in verschiedenen Farben, Tinten, Textilien;
- c) eine Zusammensetzung des Fluoreszenzfarbstoffes zum Bleichen und Aufhellen von Po lymeren,
- d) Leckdetektion mit einem Fluoreszenzfarbstoff mit vollem Spektrum;
- e) Verwendung in automatisierten chemischen Dosiersystemen;
- f) zur Markierung einer Flugzeugabsturzstelle, von Rettungsbooten und Ausrüstung wie z. B. Raketen;
- g) Unterseeproben;
- h) UVA wird verwendet zur Photochemotherapie von Hautkrebs;
- i) chromatophore Sonnenschutzkomponente für kosmetische Cremes und Lotionen;
- j) die wassermischbare Eigenschaft des Farbstoffes macht ihn leicht mischbar in Feuchthal temitteln;
- k) Fluoreszenzkomponente für molekulare Diagnostika in einem Anwendungskit für in situ- Hybridisierung;
- l) Komponente für nicht-radioaktive Markierungs- und Detektionskits der Biochemie, Zell biologie, Immunchemie und Molekularbiologie zur Markierung von DNA, RNA, Protei nen und Enzymen;
- m) Immunfluoreszenzdetektionen;
- n) Gegenfärben von DIG-markierten Oligonukleotidproben und anti-DIG-Fab-Fragmenten; und
- o) einzelne oder vielfache flußzytometrische Anwendungen;
- p) fluorochrome Färbesubstanz zur Epifluoreszenzmikroskopie;
- q) für eine schnelle Untersuchung von Biokontaminationen der Gesundheitsnahrungsmitte lindustrie, kosmetischen Industrie,
- r) pharmazeutischen und chemischen Industrie;
- s) zur schellen Abschätzung von Biokontaminanten in Laborkulturen;
- t) zur schnellen Untersuchung von Bioverunreinigungen unter Feldbedingungen;
- u) kompetitiver Inhibitor von Cholinesterasen;
- v) in anti-mikrobiellen Zusammensetzungen;
- w) als ein Biotensid für Toilettenartikel-Zusammensetzungen;
- x) eine natürliche Färbesubstanz;
- y) eine bioaktive Zusammensetzung des marinen Farbstoffes im Verhältnis von 1 : 40000 in ultrareinem Wasser;
- z) zum Erhalten von Fluoreszenzen in drei Farben bei drei verschiedenen Wellenlänge und einen Phasenkontrasteffekt bei Durchlicht;
- aa) ein Farbstoff für verschiedene Fluoreszenzanwendungen zur Durchführung in Gebieten mit Temperaturen unter null Grad.
48. Verfahren zur Extraktion eines natürlichen Fluoreszenzfarbstoffes aus der Seegurke Ho
lothuria scabra, welches folgende Schritt umfaßt:
- a) Sammeln des Materials von der Meeresküste, Austausch des Seewassers und Erhalt in Labortanks ohne jegliche mechanische Belüftung über Nacht,
- b) Einfrieren der Tiere bei -20°C,
- c) Auftauen des Tieres, um das Pigment zu erhalten; und
- d) Wiederholen der Schritte (b) und (c) 3-4 mal, um das Pigment zu entfernen und, wenn gewünscht, die Pigmente zu reinigen.
49. Verfahren zur Extraktion eines natürlichen Fluoreszenzfarbstoffes aus der Seegurke Ho
lothuria scabra, umfassend die Schritte der Extraktion des Pigments aus der Haut der
Seegurke Holothuria scabra durch osmotischen Schock, bevorzugt durch Zufügen von
50% Ethanol zum ultrareinen Wasser zum ersten Mal und Wiederholung desselben min
destens 4-mal zum Erhalt des Farbstoffes.
50. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff mit Wasser im
Verhältnis 1 : 40000-fach verdünnt wird und dieser eine Fluoreszenz in drei Farben bei drei
verschiedenen Wellenlängen aufweist.
51. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß 250 ml des 50%igen Ethanol-
Rohextraktes auf einem Wasserbad bei 80°C für 5 Minuten zur Reinigung eingedampft
werden und 2,5 g des partiell gereinigten Farbstoffes in Pulverform ergeben.
52. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff mit Wasser in
einem Verhältnis von 1 : 10000-fach verdünnt wird und dieser eine Fluoreszenz in drei
Farben bei drei verschiedenen Wellenlänge ergibt.
53. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß die physikalische Eigenschaft
des Farbstoffes durch Einsetzen von 2 mg/10 ml Lösung zur Spektrophotometrie einge
setzt wurde.
54. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff in einer Kon
zentration von 10 mg/ml zur Analyse des Farbstoffes unter Verwendung chemischer Me
thoden verwendet wird.
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