DE69330818T2

DE69330818T2 - Fluoreszenzfarbstoff, Pyryliumsalze oder ähnhliche Salze enthaltend, Nachweisverfahren von Nukleinsäure durch Verwendung desselben

Info

Publication number: DE69330818T2
Application number: DE69330818T
Authority: DE
Inventors: Masahiro Kawaguchi; Takeshi Miyazaki; Tadashi Okamoto; Yoshinori Tomida; Nobuko Yamamoto
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1992-12-21
Filing date: 1993-12-20
Publication date: 2002-03-28
Anticipated expiration: 2013-12-21
Also published as: US5624798A; JPH07174759A; EP0603783A1; EP1052291B1; ATE206210T1; JP3247001B2; DE69334079T2; DE69334079D1; DE69330818D1; EP0603783B1; US6022961A; EP1052291A3; SG65577A1; ATE343643T1; EP1052291A2

Description

Fluoreszierender Farbstoff, der ein Pyryliumsalz oder ein ähnliches Salz davon enthält, Nachweisverfahren für Nukleinsäuren unter Anwendung desselben und fluoreszierendes Färbungsverfahren einer biologischen Probe.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Pyryliumsalz, das für den Nachweis einer Nukleinsäure unter Anwendung einer optischen Vorrichtung geeignet ist. Sie betrifft ebenfalls einen Farbstoff, der ein Pyryliumsalz enthält, für die Anwendung beim Nachweis einer Nukleinsäure unter Verwendung einer optischen Vorrichtung und ein Nachweisverfahren für eine Nukleinsäure unter Verwendung des Farbstoffs. Sie betrifft weiterhin einen Farbstoff für eine Nukleinsäure, der ein Pyryliumsalz enthält, das für den Nachweis eines Hybrids durch ein Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer Sonde für den Nachweis einer Veränderung auf Nukleinsäureebene geeignet ist und ein Nachweisverfahren für eine Nukleinsäure durch ein Hybridisierungsverfahren unter Verwendung des Farbstoffs für die Nukleinsäure.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Färbungsverfahren und ein Beobachtungsverfahren für Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen, Erde, Algen und Protozon und Zellen, Gewebe und Chromosomen eines Tieres oder einer Pflanze. Des weiteren betrifft sie ein Nachweisverfahren für eine Nukleinsäure durch eine in situ Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die ein Pyryliumsalz enthält, als Markierung für den Nachweis und die Identifizierung einer spezifischen Sequenz der Nukleinsäure in biologischen Proben.

Verwandter Stand der Technik

Man kennt als Methode, bei der eine Substanz mit der Doppelhelix einer DNA in Wechselwirkung treten kann, einen Fall, bei dem die Substanz in das Basenpaar einer Nukleinsäure als Einfügungselement hineingeht, einen Fall, bei dem die Substanz in die Rillen der Doppelhelix eingegraben ist und einen Fall, bei dem sich die Substanz nähert, um sich an die Doppelbindung anzuschmiegen.
Das oben erwähnte Einfügungselement ist in der Regel eine Lamellenverbindung mit einer ausgebreiteten Elektronenwolke, und es ist auf einer verlängerten Linie der übereinanderliegenden Basenpaaren der Nukleinsäuren angeordnet, das heißt, auf der Achse der Doppelhelix bei der gleichen Entfernung wie die Entfernung zwischen den Basenpaaren der Nukleinsäuren parallel zu den Basenpaaren der Nukleinsäure. Wenn das Einfügungselement einmal in der DNA aufgenommen ist, dann kommt es charakteristischerweise dazu, dass ein optisches Absorptionsspektrum zur Seite höherer Wellenlängen verschoben wird, die Absorptionsintensität geringer wird oder sich die Fluoreszenzintensität erhöht. Es wird beispielsweise ein Farbstoff, bei dem die Fluorenszenzintensität stärker wird, wenn die Wechselwirkung mit der DNA stattfindet (bei der Aufnahme) und die Wechselwirkung mit der DNA im freien Zustand oder dergleichen nicht auftritt, für verschiedene Nachweisverfahren von Nukleinsäuren, wie die Agarosegelelektrophorese, aufgrund der Nutzbarmachung seiner Eigenschaften verwendet.
Beispiele für ausreichend bekannte Einfügungselemente umfassen Acridinorange, Proflavin, Ethidiumbromid, Donomycin und Actinomycin. Insbesondere sind Ethidiumbromid und Acridinorange sehr gut bekannt.
Allerdings haben die meisten dieser Farbstoffe Anregungswellenlängen im Ultraviolettbereich, und deswegen muss eine intensive Ultraviolettlampe verwendet werden, so dass eine besondere Sorgfalt erforderlich ist, um beteiligte Personen vor der Lampe zu schützen. Beispielsweise sind zum Zeitpunkt des Nachweises von DNA einige Geräte erforderlich, um die Augen und die Haut einer beteiligten Person vor den Ultraviolettstrahlen zu schützen, und diese Geräte sind auf dem Markt vorhanden. Des weiteren wird normalerweise eine Vorrichtung, wie ein Durchleuchtungsgerät verwendet, um die Photographien der Elektrophoresemuster der DNA aufzunehmen, allerdings kann die Belichtungseinstellung einer Kamera in diesem Fall nicht direkt durch das bloße Auge gesehen werden, so dass dieses oftmals zu einer komplizierten Ausführung kommt, die auf Versuch und Irrtum basiert. Wenn darüber hinaus das Schneiden der DNA aus dem Agarosegel direkt mit dem bloßen Auge gesehen werden soll, kann die beteiligte Person nicht gänzlich vor der Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen auch bei Anwendung der Schutzgeräte geschützt werden. Beim Nachweis von DNA in flüssigem Zustand durch die Verwendung eines Farbstoffs, der durch Ultraviolettstrahlen angeregt werden kann, ist zusätzlich die Bestrahlung mit intensivem Ultraviolett immer kontinuierlich gegeben, so dass ebenfalls das gefährliche Ozon oder dergleichen erzeugt wird. In bestimmten Fällen kann auch die DNA selbst durch die Ultraviolettbestrahlung geschädigt werden. Große Aufmerksamkeit gilt eine in situ Hybridisierung, worin die Hybridisierung mit lebenden Zellen durchgeführt wird, um die lebenden Zellen nachzuweisen, wenn allerdings ein Farbstoff, der durch Ultraviolettstrahlen angeregt wird, als Markierung verwendet wird, werden die Zellen selbst durch die Ultraviolettstrahlung beim Nachweis oftmals geschädigt.
Andererseits werden auf den Gebieten der Medizin, Biologie und dergleichen biologische Proben von Mikroorganismen, menschlichen Zellen oder tierischen Zellen mittels eines Mikroskops oder anderen Vorrichtungen für die Forschung, Diagnose und dergleichen beobachtet, allerdings wird in der Regel für eine solche Beobachtung ein Färbungsverfahren in großem Maße durchgeführt. Färbungsverfahren, die für diesen Zweck angewendet werden, können normalerweise grob in zwei Kategorien eingeteilt werden. In der ersten Kategorie gibt es ein Färbungsverfahren, bei dem ein spezifischer Bestandteil, der für die Färbung eines zu betrachtenden Teils, der in der biologischen Probe vorhanden ist, verwendet werden kann, mit einem Farbstoff gefärbt wird. Prinzipiell gilt für die Färbung ein Fall, bei dem ein Zielmolekül mit dem Farbstoff selbst gefärbt wird und ein Fall, bei dem ein Färbungsmittel auf den vorliegenden Teil eines spezifischen Bestandteils durch verschiedene chemische Reaktionen abgelagert wird. Sie können oftmals für pathologische Tests angewendet werden, und verschiedene Färbungsmethoden sind bereits für verschiedene Zielkomponenten entwickelt worden. Diese Färbungsmethoden sollen hauptsächlich einen spezifischen Bestandteil, eine spezifische Morphologie oder eine spezifische Region sichtbar machen, und sie werden oftmals für die Betrachtung von relativ makroskopischen Zielmolekülen verwendet.
Das Färbungsverfahren der zweiten Kategorie wird dem gegenüber als Fluoreszenzfärbungsmethode bezeichnet. Grundsätzlich wird bei der Fluoreszenzfärbungsmethode zunächst ein Fluoreszenzfarbstoff in eine gegebene Stelle einer spezifischen Komponente, die gefärbt werden soll, eingeführt. Als Einführungstechnik kennt man den Fall, bei dem eine zielspezifische Affinität des Farbstoffs selbst genutzt wird (die Färbung einer Nukleinsäure mit Ethidiumbromid), und einen Fall, worin eine Substanz mit einer Zielspezifität, wie ein Antikörper, an den Farbstoff gebunden wird, und seine spezifische Affinität wird genutzt, um den Farbstoff in die Zielkomponente, die gefärbt werden soll, einzuführen. Diese Fluoreszenzfärbungsmethoden werden oftmals in der Forschung, wie in der Biologie, angewandt. Bei dem Fluoreszenzfärbungsverfahren, worin das zu betrachtende Ziel fluoreszenzierend ist, ist die Nachweisempfindlichkeit eines Signals hoch, und die Genauigkeit ist ebenfalls höher als bei den vorher erwähnten Färbungsmethoden, wie die Färbung, und es können auch mikroskopische Zielkomponenten gehandhabt werden. Im allgemeinen besteht der Hauptzweck der Fluoreszenzfärbungsmethode darin, eine spezifische Komponente nachzuweisen.
Bei der herkömmlichen Färbungsmethode und der Fluoreszenzfärbungsmethode wird die Probe, die die zu färbende Zielkomponente darstellt, wie Zellen, normalerweise mit einem Aldehyd oder dergleichen vor der Färbung fixiert. Dieses hat die Wirkung, dass die Permeabilität des Farbstoffs für die Färbung oder eines anderen Reagenz in die Probe verbessert wird und die Wirkung, dass verhindert wird, dass die Probe während verschiedener Arbeitsschritte, die für die Färbung notwendig sind, bricht. So ist zusätzlich zur Fixierung und zur Färbung ein Waschschritt erforderlich, um überschüssigen Farbstoff, Reagenz und dergleichen, zu entfernen. Dieses ist wesentlich, um den Hintergrund zu vermindern und verlässliche Ergebnisse zum Zeitpunkt des Färbens zu erreichen.
Da in den letzten Jahren andererseits Karzinogenesemechanismen und Metastasemechanismen von Krebsarten Bedeutung erlangt haben, ist bekannt worden, dass die Translokation eines Chromosoms und die Deletion des Chromosoms eng mit diesen Mechanismen verknüpft ist. Zelluläre Krebsgene sind solche, die an der Regelung des Empfangs, der Übertragung oder Transkription eines Wachstumssignals in normalen Zellen teilnehmen, und es ist festgestellt worden, dass diese Gene als Krebsgene durch Mutation oder annormale Amplifikation dieses Gens, die Translokation dieses Gens in die Nachbarschaft des Gens, das in starkem Ausmaß transkribiert wird oder die Bindung an ein anderes Gen aktiviert werden. Es wird außerdem in Betracht gezogen, dass die Deletion eines Krebsinhibitorgens aus dem Chromoson ebenfalls in den Karzinogenemechanismus involviert ist. Des weiteren ist bei verschiedenen Arten von Erbkrankheiten die Deletion und Translokation zutage getreten. Wie oben beschrieben wurde, kann, falls die Diagnose durch den Nachweis eines annormalen Gens auf Chromosomebene möglich ist, das Tumorwachstum inhibiert werden, indem das normale Chromosom in das annormale Chromosom eingeführt wird, und die Möglichkeit der Heilung von Krebs und einer Erbkrankheit kann ebenfalls ausgeweitet werden, indem der Nachweis des Gens ermöglicht wird.
Als Verfahren zur Feststellung eines annormalen Chromosoms kennt man das FISH-Verfahren (in situ Fluoreszenzhybridisierung). Diese Methode umfasst die Betrachtung des Bildungsvermögens eines Hybrids mit einer Sonde, die einem Gen entspricht, das untersucht werden soll und einem Gen des Chromosoms, und gegenwärtig ist dieses wohl das Verfahren, das am genauesten ist. Bei diesem Verfahren ist das zu untersuchende Gen auf die zu verwendende Sonde eingeschränkt, und wenn die nachzuweisende Zielkomponente definiert ist, kann dieses Verfahren direkt angewendet werden. Wenn allerdings das gesamte Chromosom überprüft werden soll, dann ist dieses Verfahren nicht immer geeignet. Das gesamte Chromosom muss daher zunächst überprüft werden, und die Stellen, wo Abnormalitäten, wie eine Translokation, die möglicherweise von einer abnormalen Konformation herrührt oder eine Deletion, die möglicherweise von einer annormalen Länge kommt, stattfinden, können dann durchgeprüft werden, um die Zielkomponenten an der annormalen Stelle zu finden. Danach kann FISH angewendet werden, womit wohl eine genaue genetische Diagnose in großem Ausmaß möglich wird.
Um eine solche Überprüfung durchzuführen, ist es notwendig, vorher das Chromosom deutlich zu unterscheiden oder zu identifizieren. Für die Abgrenzung oder Identifizierung des Chromosoms wird ein Differenzialfärbungsverfahren mit dem Chromosom durchgeführt. Die Unterscheidung des Chromosoms mit diesem Differenzfärbungsverfahren macht sich zu Nutze, dass, wenn das Chromosom in einem Bandenzustand durch Verwendung eines spezifischen Farbstoffs oder eines Fluoreszenzfarbstoffs nach verschiedenen Vorbehandlungen gefärbt wird, das Verhältnis zwischen seiner Verteilung und Dichte für jedes Chromosom und die Eigenschaften in jedem Chromosom konstant ist. Diese Technik wird für die Unterscheidung des Chromosoms oder den Nachweis einer Abnormalität angewandt.
Als übliche Differenzialfärbungsmethoden für das Chromosom sind beispielsweise die Giemsa-Färbung (G-Bande), die Chinacrin-Färbung (Q-Bande) und die R-Banden-Färbung bekannt. Bei der Giemsa-Färbungsmethode wird die Färbung der Struktur der höheren Ordnung des Chromosoms, was durch eine Trypsinbehandlung verursacht wird, als loser Zustand des Chromosoms differenziert und beobachtet. Bei der Färbung mit Chinacrin, das ein Fluoreszenzfarbstoff ist, wird das Chromosom des weiteren in einem dunklen und hellen Streifenmuster entlang seiner vertikalen Achse gefärbt und dieses kann mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet wird. Dieses Fluoreszenzmuster ist inhärent in jedem Chromosom vorhanden, und damit kann dann die Unterscheidung oder die Identifizierung des Chromosoms erreicht werden. Der Teil, der mit Chinacrin gefärbt ist, ist der Teil, der reich an A-T-Paaren ist, und die Chinacrin-Färbung unterscheidet sich von der oben erwähnten Giemsa-Färbung hinsichtlich des gefärbten Zustands. Bei der R-Banden-Färbung wird das Chromomycin A&sub3;, das ein Fluoreszenzfarbstoff ist, an die G-C- Paare gebunden, und dann mit Distamycin A, das ein nicht fluoreszierender Farbstoff ist und spezifisch für die A-T-Paare ist, behandelt. In diesem Fall wird der Bereich, der reich an G-C-Paaren ist, nur in Form der R-Banden gefärbt, und die Färbung wird charakteristischerweise im Dunkel- und Hellzustand im Gegensatz zur Q-Bandenfärbung und der G-Bandenfärbung durchgeführt. Bei der Q-Bandenfärbung und R-Bandenfärbung dieser Differenzialfärbungsmethoden ist die Nachweisempfindlichkeit eines Signals höher im Vergleich zum G-Bandenfärbungsverfahren mit einem Färbungsmittel, und sie sind ebenfalls effektiv bei der Handhabung einer genaueren mikroskopischen Zielkomponente.
Bei diesen Differenzialfärbungsmethoden des Chromosoms wird die genauere Unterscheidung oder Identifizierung des Chromosoms möglich, indem die Anzahl der Arten von Farbstoffen, die spezifisch für die Stellen des Chromosoms sind, vergrößert wird, und deswegen ist es für die genauere Unterscheidung oder Identifizierung des Chromosoms wichtig, einen Farbstoff zu entwickeln, der die Differenzialfärbung, die spezifisch für eine bestimmte Stelle ist, zusätzlich zu den bereits existierenden Reagenzien (Farbstoffen) für die Differenzialfärbung ermöglicht.
Andererseits sind bereits viele Salze von Pyrylium oder Thiopyryliumverbindungen, worin die 2-, 4- und 6-Positionen des Pyryliumrings oder Thiopyryliumrings durch substituierte oder unsubstituierte Phenylgruppen substituiert sind, vorgeschlagen worden. Die meisten dieser Salze sind als Aufzeichnungsmedien geeignet, und beispielsweise beschreibt das US-Patent Nr. 4,341,894, dass sie als Sensibilisatoren für elektrophotoleitende Zusammensetzungen geeignet sind. Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 76,7,1992, 800-886 berichtet über die Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften von Pyryliumsalzen. Applied Physics 3, 1974, 81-88 beschreibt Pyrylium-Laserfarbstoffe. Auf dem biologischen Gebiet wird in der japanischen Patentanmeldung Nr. 59-133460 beschrieben, dass eine 2,4,6-Triphenylpyrylium- oder Thiopyryliumverbindung oder eine Verbindung, worin eine der Phenylgruppen, die am Pyryliumring oder dem Thiopyryliumring dieser Verbindung substituiert ist, durch eine substituierte Styrylgruppe ersetzt ist, als Farbstoff zum Färben von Zellen in einer biologischen Probe verwendet wird. Des weiteren ist in der japanischen Patentanmeldung Nr. 1- 153683 beschrieben, dass eine Verbindung, worin mindestens zwei dieser phenylsubstituierten Gruppen Aminosäuren aufweisen, eine gute Wirkung für die Heilung von Krebs aufweist.
In Cytometry 5(4), Seiten 339 bis 347 (1984) sind drei Fluorochromverbindungen beschrieben, die an DNA und RNA binden. Die einzige Pyryliumverbindung ist ein weniger wirksames Fluorochrom, es zeigt eine außerordentlich niedrige Lumineszenzeffizienz und weist keine Spezifität gegenüber DNA im Vergleich zu RNA auf.
Die EP-A-0 131 830 beschreibt markierte Nukleinsäuresonden, die hergestellt werden können, indem eine doppelsträngige DNA mit einem markierten photoreaktiven Einfügungselement umgesetzt wird oder ein Komplex aus einer doppelsträngigen DNA mit einem photoreaktiven Einfügungselement markiert wird. Gemäß dem Verfahren dieses Dokuments ist die Umsetzung von mindestens drei Bestandteilen erforderlich, um eine markierte DNA zu bekommen. Dieses Dokument erwähnt keine Pyryliumverbindungen als Einfügungselemente für doppelsträngige DNA oder einem Fluoreszenznachweisschritt. Eine Photoreaktion wird für die Bindung eines photoreaktiven Nukleinsäure bindenden Liganden an die DNA verwendet.
Wenn ein Farbstoff mit einer Anregungswellenlänge im Ultraviolettbereich für den Nachweis einer Nukleinsäure verwendet wird, kommen die oben erwähnten Probleme auf, und deswegen kann zur Beseitigung dieser Probleme in Betracht gezogen werden, einen Farbstoff zu verwenden, der durch sichtbares Licht anregbar ist. Allerdings ist bei den meisten Farbstoffen, die eine Anregung bei sichtbarem Licht zeigen und bisher für die Färbung von Nukleinsäuren verwendet wurden, die Stokes- Verschiebung nur in einem Bereich von 20-30 nm, so dass sie den Nachteil aufweisen, dass das S/N-Verhältnis am Zeitpunkt des Nachweises schlecht ist.
Bei der Agarosegelelektrophorese oder dergleichen ist, wenn der Grad der Erhöhung der Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt der Wechselwirkung mit einer Nukleinsäure größer ist im Vergleich zu keiner Wechselwirkung mit der doppelsträngigen Nukleinsäure, das S/N-Verhältnis beim Nachweis gut, und es ist möglich, die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Allerdings sind bisher keine Farbstoffe, die eine Anregung bei sichtbaren Licht zeigen und ausreichend die Floureszenzintensität erhöhen können, bekannt.
Wie oben beschrieben wurde, besteht zur Lösung der Probleme, die die Farbstoffe aufweisen, die bei Ultraviolettlicht anregbar sind, ein verstärkter Bedarf an Farbstoffen, die bei sichtbarem Licht angeregt werden können und eine große Stokes- Verschiebung und eine sehr viel höhere Fluoreszenzintensität bei der Wechselwirkung mit Nukleinsäuren im Vergleich zu keiner Wechselwirkung aufweisen.
Darüber hinaus sind bei dem herkömmlichen Färbungsverfahren von biologischen Proben, wie Zellen, Vorgänge, wie die Fixierung der Probe durch Verwendung von Formaldehyd oder dergleichen und das Waschen/Entfernen von überflüssigem Farbstoff wesentlich, um reproduzierbare und stabile Ergebnisse zu erhalten.
Beispielsweise ist der Vorgang der Probenfixierung wichtig, um die Permeabilität von Reagenzien des Farbstoffs oder dergleichen zu verbessern oder die Morphologie der erhaltenen Probe zu erhalten. Außerdem werden in der Regel der Farbstoff für die Färbung, ein anderes Reagenz und dergleichen in großem Überschuss in der Probe verwendet. Dieses weist Wirkungen bei der Verkürzung einer Behandlungs- (Färbungs)dauer und dergleichen auf, jedoch wird gleichzeitig ein starker Hintergrund verursacht. Deswegen ist der Waschvorgang zwischen den jeweiligen Vorgängen wichtig, um den Hintergrund zum Zeitpunkt der Betrachtung oder Messung zu verringern, und damit eine genauere Bewertung zu erreichen. Aus diesen Gründen ist bisher immer der Waschvorgang durchgeführt worden. Allerdings sind diese Vorgänge kompliziert und sie kosten Zeit, und wenn daher eine große Anzahl von Proben behandelt wird, wird damit eine schnelle Behandlung nicht gewährleistet.
Daher ist das Weglassen oder die Vereinfachung von Vorgängen, wie die Fixierung und das Waschen der Proben, die kompliziert sind und viel Zeit in Anspruch nehmen, aufs Höchste erwünscht.
Die meisten Fluoreszenzfarbstoffe, die bisher verwendet wurden, zeigen darüber hinaus ein verstärktes Verblassungsphänomen, und nach der Bestrahlung mit dem Anregungslicht verschwindet die Fluoreszenz schnell. Demzufolge ist es im Gegensatz zu der herkömmlichen Färbung schwierig, ein Fluoreszenzbild für einen langen Zeitraum zu beobachten, und die Herstellung einer permanenten Probe durch Fluoreszenzfärbung ist daher fast unmöglich. Aus diesen Gründen bestand auch ein großer Bedarf dahingehend, ein Herstellungsverfahren von fluoreszenzgefärbten Proben zu entwickeln, die für einen langen Zeitraum aufbewahrt werden können.
Auf dem Gebiet der Differenzialfärbung des Chromosoms ist, wie oben beschrieben wurde, ein Farbstoff, der ein gefärbtes Muster erzielen kann, das von denen verschieden ist, die durch herkömmliche Farbstoffe erzeugt werden, in hohem Maße erwünscht. Für den Fall der oben erwähnten Färbung der biologischen Probe und auch für die Differenzialfärbung eines Chromosoms sind darüber hinaus Vorgänge, wie die Fixierung der Probe durch Aldehyd und das Auswaschen von überschüssigem Farbstoff Zeit- und arbeitsaufwendig und sie führen bei der schnellen Durchführung einer Behandlung, wie die Massenüberprüfung einer großen Menge von Proben, zu Störungen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Farbstoff für eine Nukleinsäure zur Verfügung zu stellen, der als wirksamen Bestandteil einen Farbstoff enthält, der bei sichtbarem Licht anregbar ist, wobei eine große Stokes-Verschiebung und eine viel höhere Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt der Wechselwirkung mit der Nukleinsäure im Vergleich zum Zustand ohne Wechselwirkung erreicht werden.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein spezifisches Nachweisverfahren für eine doppelsträngige Nukleinsäure unter Verwendung des Farbstoffs zur Verfügung zu stellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein 2-Methyl-4,6-bis-(4-N,N-dimethylamino)pyrylium- oder -thiopyryliumsalz zur Verfügung zu stellen, das als wirksamer Bestandteils des Farbstoffs für die Nukleinsäure geeignet ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Färbungsverfahren oder ein Differenzialfärbungsverfahren zur Verfügung zu stellen, das eine reproduzierbare und stabile Färbung und die schnelle Behandlung einer großen Anzahl von Proben ermöglicht.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Differenzialfärbungsverfahren für ein Chromosom zur Verfügung zu stellen, das ein Differenzialfärbungsmuster ergibt, das sich von den bekannten Färbungen unterscheidet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Fluoreszenzfärbungsverfahren oder ein Differenzialfärbungsverfahren zur Herstellung von lagerungsfähigen Proben zur Verfügung zu stellen, bei dem die gefärbten Bereiche weder verblassen noch verschwinden.
Diese Aufgaben werden mit der vorliegenden Erfindung gelöst.
Der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein Verfahren zum spezifischen Nachweis einer doppelsträngigen Nukleinsäure gerichtet, das durch die Schritte charakterisiert ist, die in Patentanspruch 1 definiert sind.
Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf einen Farbstoff für eine biologische Probe gerichtet, der in den Patentansprüchen 8 oder 9 definiert ist.
Der dritte Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein Salz von 2-Methyl-4,6-bis(4-N,N-dimethylaminophenyl)pyrylium oder -thiopyrylium nach Anspruch 6 gerichtet, das durch folgende Formel [VII] dargestellt ist:
oder auf die Verbindung nach Anspruch 7, (worin X O oder S ist und Y&supmin; ClO&sub4;&supmin; oder I&supmin; bedeuten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Kurve, die die Verschiebung eines Absorptionspeaks in Beispiel 3 zeigt, und A bedeutet ein Absorptionsspektrum in Abwesenheit von DNA und B bedeutet ein Absorptionsspektrum in Gegenwart von DNA (50 ug/ml).
Fig. 2 ist eine Kurve, die das Fluoreszenzspektrum, das in Beispiel 3 erhalten wurde, zeigt, und A bedeutet das Fluoreszenzspektrum in Abwesenheit von DNA und B bedeutet das Fluoreszenzspektrum in Anwesenheit von DNA (50 ug/ml).
Fig. 3 ist eine Kurve, die die Änderung der Fluoreszenzintensität in Bezug auf die in Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen DNA-Konzentrationen.
Fig. 4 ist eine Kurve, die die Änderung der Fluoreszenzintensität mit Bezug auf die in Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen DNA-Konzentrationen zeigt.
Fig. 5 ist eine Kurve, die die Verschiebung eines Absorptionspeaks in Beispiel 8 zeigt und A bedeutet ein Absorptionsspektrum in Abwesenheit von DNA und β bedeutet ein Absorptionsspektrum in Gegenwart von DNA (50 ug/ml).
Fig. 6 ist eine Kurve, die die Fluoreszenzspektren, die in Beispiel 8 erhalten wurden, zeigt, und A bedeutet das Fluoreszenzspektrum in Abwesenheit von DNA und B bedeutet das Fluoreszenzspektrum in Abwesenheit von DNA (50 ug/ml)
Fig. 7 ist eine Kurve, die die Verschiebung eines Absorptionspeaks in Beispiel 9 zeigt, und A bedeutet ein Absorptionsspektrum in Abwesenheit von DNA und B bedeutet ein Absorptionsspektrum in Gegenwart von DNA (50 ug/ml).
Fig. 8 ist eine Kurve, die die Fluoreszenzspektren, die in Beispiel 9 erhalten wurden, zeigt. Hier bedeutet A das Fluoreszenzspektrum in Abwesenheit von DNA, B bedeutet das Fluoreszenzspektrum in Gegenwart von DNA (10 ug/ml) und C bedeutet das Fluoreszenzspektrum in Gegenwart von DNA (5 ug/ml).
Fig. 9 ist eine Kurve, die die Änderung der Fluoreszenzintensität mit Bezug auf DNA-Konzentration, die in Beispiel 9 erhalten wurde, zeigt.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Das oben definierte Verfahren wendet einen Farbstoff für eine doppelsträngige Nukleinsäure an, die dadurch charakterisiert ist, dass sie eine Pyryliumverbindung enthält, die aus der Gruppe, die in Patentanspruch 1 definiert ist, gewählt ist.
Die Einführung von substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen in die Verbindungen der Erfindung ist dafür geeignet, gute Eigenschaften als Einfügungselement in das Basenpaar der Nukleinsäure zu erreichen.
Diese Verbindungen sind in der unten angegebenen Tabelle 1 gezeigt. Des weiteren sind besonders bevorzugte Beispiele Verbindungen, die durch die Formel [VII] dargestellt sind:
(worin X O oder S bedeutet und Y&supmin; CO&sub4;&supmin; oder I&supmin;) bedeutet, und Verbindungen, die durch die Formel [VIII] dargestellt sind:
(worin X O oder S bedeutet und Y&supmin; CO&sub4;&supmin; oder I&supmin; bedeutet.
In diesem Zusammenhang sind die Verbindungen, die durch die Formel [VII] dargestellt sind, das heißt, 2-Methyl-4,6-bis-(4- N,N-dimethylaminophenyl)pyryliumsalze und 2-Methyl-4,6-bis-(4- N,N-dimethylaminophenyl)thiopyryliumsalze neue Verbindungen.
Dieses bedeutet, dass jedes dieser Pyryliumsalze eine Methylgruppe an der 2-Position aufweist und deswegen sind sie unterschiedlich in der Struktur von Verbindungen, die bisher als Sensibilisatoren für Aufzeichnungsmaterialien bekannt sind und die substituierte oder unsubstituierte Phenylgruppen an den 2-, 4- und 6-Positionen des Pyryliumrings und Thiopyryliumrings besitzen. Sie sind darüber hinaus ebenfalls unterschiedlich in der Struktur von Verbindungen, die in den japanischen Patentanmeldungen Nrn. 59-133460 und 1-153683 beschrieben sind und worin die 2-, 4- und 6-Positionen des Pyryliumrings oder des Thiopyryliumrings durch substituierte oder unsubstituierte Phenylgruppen substituiert sind oder zwei der 2-, 4- und 6- Positionen des Pyryliumrings oder Thiopyryliumrings durch substituierte oder unsubstituierte Phenylgruppen substituiert sind und die verbleibende Position durch eine substituierte Styrolgruppe substituiert ist.
Des weiteren ist in diesen Publikationen nicht beschrieben, dass das Pyryliumsalz oder das Thiopyryliumsalz der vorliegenden Erfindung als Einfügungselement fungiert, das spezifisch zur doppelsträngigen Nukleinsäure ist, was auf die Struktur zurückzuführen ist, in der die Arten der substituierten Positionen der Substituenten des Pyryliumsalzes oder des Thiopyryliumsalzes spezifiziert sind, das heißt, die Struktur, worin die 4- und 6-Positionen des Pyryliumrings oder des Thiopyryliumrings durch Phenylgruppen mit einer Dimethylaminogruppe an der para-Position substituiert sind und die 2-Position mit einer Methylgruppe substituiert ist, so dass die Fluoreszenzintensität erhöht werden kann. Darüber hinaus beträgt der Grad der Fluoreszenzerhöhung durch die Aufnahme in die doppelsträngige Nukleinsäure des Pyryllumsalzes oder des Thiopyryliumsalzes [VII] der vorliegenden Erfindung etwa das 5- bis etwa das 10-fache als die Fluoreszenzerhöhung mit einem 4-(4-N,N-Dimethylaminophenyl)-2,6-diphenylpyryliumsalz oder einem 4-(4- N,N-Dimethylaminophenyl)-2,6-diphenylthiopyryliumsalz, das heißt, [VIII], und die Stokes-Verschiebung ist ebenfalls groß, etwa 100 nm. Deswegen ist das Pyryliumsalz oder Thiopyryliumsalz [VII] der vorliegenden Erfindung insbesondere als Farbstoff für den Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäure geeignet.
Die Verbindungen der Erfindung können direkt oder gelöst oder dispergiert in einem geeigneten Lösungsmittel oder Dispergiermittel verwendet werden, um somit die Färbung für die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung zu erreichen. Beispiele für das Lösungsmittel oder Dispergiermittel umfassen Wasser, Acetonitril, Dimethylsulfoxid und verschiedene Arten von Pufferlösungen, wie Phosphorsäurepufferlösung und Essigsäurepufferlösung. In diesem Fall kann der Gehalt der Verbindungen der Erfindung in geeigneter Weise im Hinblick auf ihre Verwendung und die Empfindlichkeit des Messgerätes gewählt werden, und beispielsweise liegt für den Nachweis der doppelsträngigen Nukleinsäure in einer wässrigen Nukleinsäurelösung der Gehalt der Verbindung in einem Bereich von etwa 1 · 10&supmin;&sup6; bis etwa 1 · 10&supmin;&sup4; M.
Die Verbindungen der Erfindung können verwendet werden, um doppelsträngige Nukleinsäure (DNA und RNA) zu färben, und da die Verbindung eine Funktion als Einfügungselement hat, hat sie den Vorteil, dass sie vornehmlich die doppelsträngige Nukleinsäure färbt. Das bedeutet, dass wenn diese Verbindung in die Doppelhelix aufgenommen ist, ihre Fluoreszenzintensität sich mehr erhöht als im freien Zustand, und wenn die Verbindung, die eine große Stokes-Verschiebung aufweist, gewählt wird, kann eine Analyse mit einem hohen S/N-Verhältnis durchgeführt werden.
Da darüber hinaus die Anregungswellenlänge der Verbindungen der Erfindung 550 nm oder mehr auf der Seite langer Wellenlängen liegt, kann ein ausreichender Anregungszustand durch Verwendung einer Quelle für sichtbares Licht, wie eine Wolframlampe, erreicht werden. Deswegen können die oben erwähnten Probleme für den Fall der Verwendung von Ultraviolettstrahlen umgangen werden.
Die Probe, die aus einem Organismus stammt, enthält weiterhin oftmals eine Komponente mit einer Absorption/Fluoreszenz in einem Wellenlängenbereich von 550 nm oder weniger, und falls Licht in diesem Wellenlängenbereich als Anregungslicht verwendet wird, erniedrigt sich ungünstigerweise das S/N-Verhältnis, was auf den Anstieg des gemessenen Hintergrund, der dieser Komponente zugesprochen wird, zurückzuführen ist. Die Anregungswellenlänge der Verbindungen der Erfindung ist andererseits auf der Seite langer Wellenlängen von 550 nm oder mehr vorhanden, und deswegen kommt es nicht zu einer Verstärkung des Hintergrunds, so dass eine hochempfindliche Messung möglich ist. Das bedeutet, dass, selbst wenn die Reinigung der Nukleinsäure unzureichend ist, eine hochempfindliche Messung erreicht werden kann. Sie ist insbesondere effektiv für eine effiziente Ausführung, so dass ein Reinigungsschritt bei der Behandlung von vielen Proben, wie in einem Bluttest, weggelassen werden kann.
Wenn des weiteren die Verbindungen der Erfindung, die eine Absorption im nahen Infrarotbereich aufweisen, verwendet werden, kann ein kleiner kostengünstiger Halbleiterleser in vorteilhafter Weise als Lichtquelle für die Anregung verwendet werden.
Wenn, wie oben beschrieben, die Verbindungen der Erfindung in die Doppelhelix aufgenommen werden, ist die Fluoreszenzintensität beträchtlich größer im Vergleich mit dem freien Zustand (das heißt, ein Zustand ohne Wechselwirkung mit der Doppelhelix), und wenn ein DNA-Muster, das mit einem Restriktionsenzym verdaut ist, in einer Agarosegelelektrophorese nachgewiesen wird, kann der Hintergrund bis auf einen geringen Grad heruntergesetzt werden, so dass die Nachweisempfindlichkeit von DNA relativ erhöht werden kann. Da des weiteren die Stokes- Verschiebung etwa 100 nm und höher ist, kann der Einfluss des Anregungslichts vollständig zum Zeitpunkt des Fluoreszenznachweises eliminiert werden, wodurch eine direkte visuelle Betrachtung möglich ist.
Des weiteren sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung stabil, wenn sie an die doppelsträngige Nukleinsäure gebunden sind, und das Verblassungsphänomen, das oftmals im Fall des Fluoreszenzfarbstoffs gesehen wird, wird kaum noch beobachtet. Dieses Merkmal kann erhalten werden, auch wenn das Gel getrocknet ist, und deswegen ist ebenfalls eine lange Lagerungsdauer des Gels möglich.
Darüber hinaus wird bei Ethidiumbromid, das ein typisches Fluoreszenzeinfügungselement ist, eine Fluoreszenz auch in Abwesenheit von DNA beobachtet, aber im Fall der Verbindungen der Erfindung wird unter diesen Bedingungen eine Fluoreszenz kaum beobachtet. Der Anstieg der Fluoreszenzintensität, die von der Konzentration der DNA abhängt, kann außerdem bis zu einer bestimmten hohen Konzentration von DNA im Gegensatz zum Ethidiumbromid beobachtet werden.
Das bedeutet, dass die Verbindungen der Erfindung eine höhere Nachweisempfindlichkeit als Ethidiumbromid aufweisen und dass sie ein ausgezeichnetes S/N-Verhältnis zeigen, so dass der Nachweis von DNA in einem breiten Konzentrationsbereich möglich ist.
Sogar beim Nachweis der Nukleinsäure durch eine Hybridisierungsreaktion im einem Lösungssystem ist die Fluoreszenzintensität der Verbindung, wenn die Verbindungen der Erfindung für die Färbung (Markierung) eines Hybrids verwendet werden, außerdem ausreichend hoch in dem Zustand, in dem sie in den Doppelstrang (Doppelhelix) aufgenommen sind, im Gegensatz zu dem Fall, wenn sie frei oder an den Einzelstrang gebunden vorliegen. Deswegen können der Hybrid aus einer Sonde und der Zielnukleinsäure direkt nachgewiesen werden, ohne dass der Hybrid der Sonde und die Zielnukleinsäure von der nicht umgesetzten Sonde getrennt werden.
Da darüber hinaus die Verbindungen der Erfindung die Funktion als Einfügungselement ausüben, haben sie ebenfalls den Vorteil, das Hybrid der Zielnukleinsäure und der Sonde zu stabilisieren, und selbst wenn ein kurzes Oligonukleodid als Sonde verwendet wird, kann ein stabiles Hybrid gebildet werden, so dass eine Stabilisierung der Messung erreicht werden kann.
Wenn, wie oben beschrieben, die Verbindungen der Erfindung, die eine große Stokes-Verschiebung aufweisen, gewählt werden, können die Fluoreszenz und das Anregungslicht vollständig voneinander getrennt werden. Infolgedessen ist der Vorgang der Subtraktion des Einflusses des Anregungslichts vom Fluoreszenzspektrum nicht notwendig, was für die Automatisierung des Nachweises günstig ist und was zu dem Vorteil führt, dass die Nachweisempfindlichkeit erhöht werden kann.
Diese Merkmale der Verbindungen der Erfindung basieren auf dem heterozyklischen Ring und die daran gebundenen spezifischen Substituenten, und es kann angenommen werden, dass die Verbindung in dem Bereich der Nukleinsäurenpaarung aufgenommen wird, wo die Bereiche des heterozyklischen Rings und der Substituenten übereinander liegen, so dass sie mit beiden Bereichen in Wechselwirkung ist, um somit die Fluoreszenzintensität zu erhöhen. Dieser Verstärkungseffekt der Fluoreszenzintensität ist größer, wenn die Substituenten substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen aufweisen und er ist weiterhin größer, wenn die Substituenten durch zwei oder mehr der substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen substituiert sind, so dass diese substituierten Bereiche nicht zueinander in Nachbarschaft vorliegen müssen. Darüber hinaus kann durch teilweise Änderung der Struktur der Verbindungen der Erfindung ein Derivat mit verschiedener Absorptionswellenlänge, Anregungswellenlänge und Fluoreszenzwellenlänge synthetisiert werden, und beispielsweise kann eine Verbindung hergestellt werden, auf die der Halbleiterlaser als Anregungswellenlänge angewendet werden kann. Wenn der heterozyklische Ring oder ein kondensierter Ring als Substituent zusätzlich eingeführt werden, können die Eigenschaften der eingeführten Ringstruktur für eine chemische Reaktion oder biochemische Reaktion in Kombination mit dem Einfügungselement und einem anderen Mechanismus genutzt werden.
Um weiterhin die Wasserlöslichkeit der Verbindungen der Erfindung zu verbessern, kann eine hydrophile Gruppe, wie eine Aminogruppe, eine Dimethylaminogruppe oder eine Sulfonatgruppe, in einen geeigneten Bereich eingeführt. Wenn die Verbindung als Markierung für die Nukleinsäuresonde verwendet wird und wenn eine ausreichende hydrophile Natur bei der Bindung an die Nukleinsäure erreicht werden kann, kann die Verbindung direkt verwendet werden, ohne dass irgendeine hydrophile Gruppe eingeführt wird.
Die Nukleinsäurefärbung der vorliegenden Erfindung kann als Färbung für die Nukleinsäure, beispielsweise zum Nachweis einer Nukleinsäure, die durch Elektrophorose aufgetrennt wurde, verwendet werden. Dieser Nachweis kann im Prinzip gemäß nach einem herkömmlichen Verfahren durch Anwendung der Nukleinsäurefärbung der vorliegenden Erfindung anstelle von Ethidiumbromid oder dergleichen durchgeführt werden. Dieses bedeutet, dass nach der üblichen Elektrophorese, das Gel in eine Farbstofflösung eingetaucht wird, wonach dann der Nachweis folgt. In diesem Fall wird allerdings sichtbares Licht anstelle der Ultraviolettlampe verwendet, so dass ein Aufbau für das Nachweissystem, der sich von dem herkömmlichen Fall unterscheidet, notwendig wird. Das heißt also, dass in dem Nachweissystem ein Anregungsfilter und ein Fluoreszenzfilter zusätzlich zur Lichtquelle erforderlich sind.
Beispiele für eine verwendbare Lichtquelle umfassen eine Halogenlampe, eine Wolframlampe, eine Xenonlampe und einen Halbleiterlaser. Wenn die Quelle für das sichtbare Licht, die eine Lichtmenge von einem Schlitzprojektor (100 V, 300 W) oder dergleichen erzeugen kann, verwendet wird, kann der Nachweis mit einer Empfindlichkeit durchgeführt werden, die höher als beim Ethidiumbromid ist. Ein Strobeimpuls, der in der Photographie mit einer Kamera verwendet werden kann, ist ebenfalls effektiv bei der Aufnahme einer Photographie. Wenn des weiteren der Halbleiterlaser verwendet wird, kann ein Dichtemesser in Kombination mit einem Lichtvervielfacher vorgesehen werden, ohne dass irgendein Filter für das Anregungslicht verwendet wird.
Als Anregungslichtfilter und Nachweisfilter sind darüber hinaus Filter notwendig, die den jeweiligen Farbstoffen entsprechen, das bedeutet, dass ein Filter, der die optische Absorption eines jeden Farbstoffs abdeckt und den Fluoreszenzbereich schneidet, auf der Seite des Anregungslichts verwendet wird, und der Filter, der die Übertragung des Anregungslichts verhindert und durch den die Fluoreszenz allein geht, wird auf der Nachweisseite verwendet.
Beispielsweise wird eine Quelle für sichtbares Licht anstelle der Ultraviolettlampe in einem Durchleuchtungsgerät angebracht, und eine Basis, die mit einem Anregungslichtfilter ausgerüstet ist, wird daraufgesetzt. Das Gel wird auf der Basis angebracht, und der Nachweis wird durch einen Schlitz, der ein Fluoreszenzfilter aufweist, durchgeführt, oder eine Photographie wird durch eine Kamera aufgenommen, die ein Fluoreszenzfilter aufweist.
Demzufolge können die Banden, die in das Gel eingewandert sind, mit dem bloßen Auge ohne irgendeine Schutzvorrichtung beobachtet werden, und das Ausschneiden der Banden aus dem Gel ist ebenfalls einfach. Wenn außerdem ebenfalls die Photographien gemacht werden, kann eine geeignete Belichtung mit dem bloßen Auge ausgewählt werden, im Gegensatz zum Ethidiumbromid, worin die Belichtung durch das Durchleuchtungsgerät gewählt wird, wobei es zu Irrtümern kommen kann und die Ultraviolettstrahlen umgangen werden. Es ist selbstverständlich, dass ein Dichtemesser, der mit einem Lichtvervielfacher ausgerüstet ist, ebenfalls verwendet werden kann. Wenn zusätzlich ein Nachweiskit, das ein Strobeimpuls als Lichtquelle anwendet und gleichzeitig mit der Kamera arbeiten kann, verwendet wird, kann der Nachweis der Nukleinsäure einfach mit einer Stromquelle, wie einer Trockenzelle, durchgeführt werden, ohne dass Nachteile durch erzeugte Hitze entstehen.
Die Nukleinsäurefärbung der vorliegenden Erfindung kann des weiteren verwendet werden, um die Zielnukleinsäure nachzuweisen, die das Nachweisobjekt durch die Hybridisierung mit der Sonde darstellt. Beispielsweise kann der Nachweis durch Verfahrensschritte durchgeführt werden, bei denen die Ziel DNA mit einer Probe umgesetzt wird, die gebildete doppelsträngige Nukleinsäure mit dem Farbstoff der vorliegenden Erfindung gefärbt wird und dann diese optisch nachgewiesen wird. In diesem Fall tritt die Verbindung der Erfindung, die in dem Farbstoff enthalten ist, mit der Doppelhelix in Wechselwirkung, um die Fluoreszenzintensität zu erhöhen, womit ein Nachweis ohne B/F- Trennung möglich wird. Diese Wechselwirkung tritt außerdem kaum mit einer doppelsträngigen Nukleinsäure auf, worin eine falsche Basenpaarung stattgefunden hat, so dass der Einfluss von falschen Basenpaaren in der doppelsträngigen Nukleinsäure bei den gemessenen Werten eliminiert werden kann. Die Färbungstechnik, die den Farbstoff der vorliegenden Erfindung nutzt, kann auf eine Methode angewendet werden, worin die Sonde oder die Probe immobilisiert ist und dann verwendet wird, auf eine Methode, worin die Sonde mit der Probe in einer Lösung umgesetzt wird, auf eine Biopsie und eine in situ Hybridisierung, worin die Sonde in Zellen oder in einen Organismus eingeführt wird. Beispielsweise wird die Probe mit der Sonde umgesetzt, und der Farbstoff der vorliegenden Erfindung wird dann in das Reaktionssystem gegeben, um das erhaltene Zielhybrid zu färben, wonach dann nachgewiesen wird. Die Verwendung eines Mikroskops ermöglicht darüber hinaus die Überprüfung des Bereichs in der jeweiligen Zelle, wo die Sonde hybridisiert ist.
Selbstverständlich kann der Farbstoff der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden, um die Nukleinsäure, die durch PCR oder dergleichen amplifiziert ist, nachzuweisen, und es kann sofort ausgesagt werden, ob die Nukleinsäure amplifiziert ist oder nicht, ohne dass sie einzeln analysiert werden muss. Wenn zu dieser Zeit die PCR-Reaktion auf einer Mikroplatte durchgeführt wird, können viele Proben gleichzeitig überprüft werden.
Wenn des weiteren die Pyryliumverbindungen der vorliegenden Erfindung als Markierung, die kovalent an die in einer Sonde enthaltende Nukleinsäure gebunden werden soll, verwendet wird, werden die Merkmale der Verbindung noch effektiver genutzt. Beispielsweise kann bei der Hybridisierungsreaktion, die in einer Lösung ausgeführt wird, die Verbindung mit dem zu analysierenden Objekt, das heißt, die Zielnukleinsäure, die nicht nur den Einzelstrang, sondern ebenfalls den Doppelstrang aufweist, zusammengebracht werden. Da weiterhin die Verbindung die Funktion eines Einfügungselements in das Nukleinsäurebasenpaar ausübt, kann eine sterische Hinderung der Markierungsverbindung im Hybrid auf der Zielnukleinsäure der Sonde umgangen werden, und das Hybrid kann effektiv durch Übereinanderlagerung stabilisiert werden. Zur Bindung der Verbindung der Formel [I] an die Sonde, können verschiedene Verfahren angewendet werden.
Wie nachfolgend beschrieben wird, zeigen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine hohe Permeabilität gegenüber einer biologischen Probe, wie Zellen, Bakterien, einem Gewebe und einem Chromosom, und deswegen ist es einfach, die Sonde, die mit der Verbindung markiert ist, in die Zellen oder den Organismus einzuführen. Deswegen ist die Verbindung für die in situ Hybridisierung geeignet.
Da, wie nachfolgend beschrieben wird, die Verbindungen der Erfindung bei einer niedrigen Konzentration entsprechend verwendet werden können und geringe Verweileigenschaften aufweisen, kann die Kultur auch nach der Reaktion des Organismus mit der Sonde und der Betrachtung fortgesetzt werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in verschiedenen Nachweisverfahren angewendet werden, und was noch besser ist, sie ermöglichen den Nachweis der Nukleinsäure auf sehr einfache Weise. Deswegen können verschiedene Arten von Nukleinsäurenachweiskits zur Verfügung zu stellen, die die Verbindung, die durch Formel [I] dargestellt ist, als solche oder in Form der Sonde enthalten.
Des weiteren kann der Farbstoff, der die Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthält, mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht werden, um diese zu färben oder differenzial zu färben.
Beispiele für eine biologische Probe, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gefärbt werden kann, umfassen Mikroorganismen, menschliche Zellen, tierische Zellen, ein Gewebe und eine Sektion aus Individuen (einem Menschen, einem Tier und einer Pflanze) und ein Chromosom. Wenn das Chromosom als Probe verwendet wird, kann es in einem scharfen Zustand differenzial gefärbt werden.
In der vorliegenden Erfindung werden eine oder mehr Arten der Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, physiologische Salzlösung oder ein Lösungsmittelgemisch aus Wasser und einem Alkohol, wie Ethanol, gelöst werden und dann für die Fluoreszenzfärbung der biologischen Probe verwendet werden. Wenn darüber hinaus die biologischen Proben lebende Zellen, Mikroorganismen oder dergleichen sind, kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung zu einer bestimmten Lösung, worin sie lebend gehalten werden oder einem Kulturmedium, worin sie wachsen können, zur Bildung einer Färbungslösung hinzugegeben werden.
Die Konzentration der Verbindung der vorliegenden Erfindung in der Färbungslösung liegt in geeigneter Weise im Bereich von einigen 10 ng bis einige mg/ml.
Wenn in der vorliegenden Erfindung die Verbindungen als Farbstoff für die Färbung oder die Differenzialfärbung verwendet werden, kann eine stabile Färbung mit guter Reproduzierbarkeit ohne Ungleichmäßigkeiten erreicht werden, und was noch besser ist, Arbeitsgänge, wie die Fixierung der Probe und das Auswaschen von überschüssigem Farbstoff, die bei herkömmlichen Methoden wesentlich sind, können weggelassen werden, wodurch die Behandlung vereinfacht werden kann und eine große Anzahl von Proben sogleich behandelt werden können.
Ebenfalls beim Diffenzialfärben des Chromosoms können eine bekannte Färbung und ein Differenzialfarbmuster durch Verwendung der Verbindung der vorliegenden Erfindung erhalten werden, und die Unterscheidung und Identifizierung des Chromosoms kann mit hoher Präzision erreicht werden.
Die Verwendung der Verbindung der vorliegenden Erfindung ermöglicht außerdem ebenfalls die Herstellung von lagerfähigen Proben, in denen die gefärbten Bereiche weder verblassen noch verschwinden.
Insbesondere sind die Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ausgezeichnet hinsichtlich ihrer Permeationsfähigkeit in die Probe, und deswegen können Arbeitsgänge zum Eintreten dieser Verbindung in die biologische Probe, z. B. die Fixierung der Probe und das anschließende Auswaschen in vorteilhafter Weise weggelassen werden. Wenn darüber hinaus der Fixierungsarbeitsgang weggelassen wird, kann die Probe im nicht fixierten freien Zustand, das heißt, im natürlichen Zustand oder einem dazu ähnlichen Zustand verwendet werden. Beispielsweise kann sie im lebenden Zustand gefärbt werden. Ebenso kann beim Differenzialfärben des Chromosoms der Fixierungsarbeitsgang mit einer Calneo-Fixierungslösung und das nachfolgende Auswaschen und eine Trocknungsstufe weggelassen werden.
Wie oben beschrieben wurde, erzeugt die Verbindung der vorliegenden Erfindung kaum eine Fluoreszenz, auch bei Bestrahlung mit Anregungslicht, wenn die Verbindung in einem freien Zustand in der Lösung ist, das heißt, wenn keine Nukleinsäure vorhanden ist, allerdings strahlt die Fluoreszenz ab, wenn sie mit vorhandener doppelsträngiger Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt. Dieses bedeutet, dass der Hintergrund extrem schwach ist, was eine hoch präzise Färbung ermöglicht. Es ist außerdem aufgrund der oben erwähnten Eigenschaften hinsichtlich des schwachen Hintergrunds möglich, die Verbindung der vorliegenden Erfindung in einen außerordentlich breiten Konzentrationsbereich zu verwenden.
Wenn beispielsweise die 2-Methyl-4,6-bis-(4-N,N-dimethylaminophenyl)pyryliumjodid (Verbindung 1) direkt in das Kulturmedium von Zellen oder Mikroorganismen gegeben wird und die Betrachtung in einem Zustand durchgeführt wird, worin die Färbungslösung zusammen mit einem üblichen Beugungsfluoreszenzmikroskop verwendet wird, hat sich herausgestellt, dass die Verbindung in einem Farbstoffkonzentrationsbereich von einigen zehn ng/ml bis einigen ug/ml in der Färbungslösung ohne Hintergrund verwendet werden kann. Demzufolge kann das Auswaschen nach dem Färbungsarbeitsgang, das bisher notwendig gewesen war, vollständig weggelassen oder vereinfacht werden.
Selbst wenn die Färbungslösung mit einer hohen Konzentration von einigen zehn ug/ml oder so verwendet wird, um Gewebe oder Sektionen eines Tieres oder Menschen zu färben, kann das Auswaschen nach dem Färbungsschritt, das bisher notwendig war, vollständig weggelassen oder vereinfacht werden.
Im Hinblick auf die gefärbten Bilder färbt die Verbindung der vorliegenden Erfindung scharf den Kern jeder Zelle, und beim Färben von lebenden Zellen, wie Kulturzellen, Kulturbakterien oder verschiedene Gewebe, kann das Chromosom der sich teilenden Zelle deutlich beobachtet werden. Das ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Verbindung der vorliegenden Erfindung eine starke Affinität für die doppelsträngige Nukleinsäure (das heißt, DNA, RNA, doppelsträngige Nukleinsäure, intramolekularer doppelsträngiger Bereich einer einzelsträngigen Nukleinsäure oder dergleichen aufweist, allerdings ermöglicht die Nutzung dieses Merkmals das Zählen der Zellen durch FCM (ein Strömungserkennungsmesser) und die Klassifizierung der Zellen während der Teilungsdauerstufe.
Wenn eine lebende Probe gefärbt wird, ist die Wasserlöslichkeit des Farbstoffs sehr wichtig. Die lebende Probe wird oftmals in einer wässrigen Umgebung behandelt. Dem gegenüber wird der Farbstoff oftmals in einem organischen Lösungsmittelsystem gehandhabt. Wenn eine lebende Probe behandelt werden soll, ist ein Farbstoff, der in einem wässrigen System verwendet werden kann, erforderlich, und er soll auch in einem großen Ausmaß anwendbar sein. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls empfohlen, weil die Wasserlöslichkeit der Verbindung der vorliegenden Erfindung durch Auswählen eines geeigneten Gegenions (z. B. Jod) erhöht werden kann.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben geringe Verweileigenschaften in den Zellen, so dass die lebenden Zellen nicht negativ durch deren Anwesenheit beeinflusst werden. Wenn daher die zu färbende Zielkomponente in Kulturzellen oder Mikroorganismen vorhanden ist, können die Färbung und der gefärbte Zustand ohne Fixierung mit geringer Sorgfalt hinsichtlich der Kontaminierung mit anderen Mikroorganismen und Steuerung der Temperatur betrachtet werden und nach der Betrachtung können sie kontinuierlich kultiviert werden. Dieses bedeutet, dass die Betrachtung der Fluoreszenzfärbung im Verlauf der Zeit mit der gleichen Probe möglich ist.
Wie oben beschrieben wurde, weisen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung ebenfalls das Merkmal auf, dass das Verblassungsphänomen der Fluoreszenz, das bei Fluoreszenzfarbstoffen auftritt, sehr gering ist. Das Zusammenwirken der Merkmale des geringen Hintergrunds und des schwachen Verblassungsphänomens, die die Verbindungen der vorliegenden Erfindung aufweisen, ermöglicht die Herstellung von Proben für eine lange Lagerungsdauer mit dem Fluoreszenzfarbstoff. Wenn daher die Probe zusammen mit einer Aufbewahrungslösung in einen Behälter gegeben wird und dann dieser verschlossen wird und die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in die Aufbewahrungslösung hinzugegeben wurden, wird eine Erneuerung des Farbstoffs in der gelagerten Probe durchgeführt, wobei nur ein schwaches Verblassungsphänomen auftritt. Daher kann die Veränderung der zu betrachtenden Bildern für einen langen Zeitraum unterbunden werden.
Die Herstellung der gelagerten Proben unter Anwendung des Färbungsverfahrens der vorliegenden Erfindung kann erreicht werden, indem die biologische Probe mit der Verbindung der vorliegenden Erfindung gefärbt wird, die gefärbte Probe in einen geeigneten Behälter eingegeben wird und dann dieser fest verschlossen wird. Jeder Behälter beliebiger Form und Größe kann je nach Zweck verwendet werden, soweit er mit der Probe verschlossen werden kann. Ein Behälter, der durch Verschließen des Randes eines Deckglases, das auf einen Objektträger gesetzt wird, mit einem Versiegelungsmaterial, wie einem Harz, erhalten wird, ist in der Kategorie dieses Behälters eingeschlossen.
Die gefärbte biologische Probe wird in den Behälter gegeben, falls notwendig, zusammen mit einem flüssigen Medium, das ein Antiseptikum, wie Natriumazid, enthält, gegeben und der Behälter wird dann verschlossen. Alternativ kann die biologische Probe mit der Färbungslösung im Behälter vermischt werden, wonach dann verschlossen wird. Jedes flüssige Medium kann verwendet werden, soweit es als Färbungslösungsmittel verwendbar ist. Wenn darüber hinaus die biologische Probe zu dem flüssigen Medium, das den Fluoreszenzfarbstoff enthält, in den verschließbaren Behälter gegeben wird, kann ein gefärbter Zustand stabil während der oben erwähnten Langzeitlagerung aufrechterhalten werden.
Als nächstes wird nun die vorliegende Erfindung in Einzelheiten mit Bezug auf die Beispiele beschrieben, allerdings sollte der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt sein.

Beispiel 1

100 ml Essigsäureanhydrid wurden mit 30 ml konzentrierter Schwefelsäure unter Kühlen vermischt, und die erhaltene Mischung wurde dann für drei Stunden auf einem Wasserbad erhitzt, während bei 80ºC gehalten wurde. Als nächstes wurden dazu 20 ml Essigsäureanhydrid und 30 ml p-Dimethylaminoacetophenon bei Raumtemperatur hinzugeben, und die Temperatur der Lösung wurde dann auf 45ºC erhöht, wonach dann für 24 Stunden zur Durchführung der Reaktion gerührt wurde. Danach wurde zu der Reaktionslösung Ethanol gegeben, wobei die Menge Ethanol derjenigen der Reaktionslösung gleich war. Diese Lösung wurde abgekühlt, und eine wässrige Kaliumjodidlösung wurde dann dazu gegeben, um die Rohkristalle auszufällen. Als nächstes wurden die Kristalle durch Filtration gesammelt, und dann aus einem Gemischsystem aus Ethanol und Ether (Volumenverhältnis = 1 : 4) umkristallisiert, um die grünen Kristalle des 2-Methyl-4,6-bis-(4-N,N-diemethylaminophenyl)pyryliumiodid zu erhalten (Verbindung 1 in Tabelle 1, worin Y I ist).
Analytische Ergebnisse der erhaltenen Verbindung 1 (Y = I):
Schmelzpunkt: 254-257ºC
UV/visuell (CH&sub3;CH &epsi; · 10&supmin;&sup4;) λmax: 444 nm (2,43), 550 nm (8,24)
NMR (¹H, DMSO) δ ppm: 8,3737 (1H, s), 8,2729 (1H, d, J = 9,0 Hz), 8,1795 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,8864 (1H, s), 6,9117 (4 H, t, JAB = JBC = 9,77), 3,1829 (6H, s), 3,1340 (6H, s), 2,6809 (3H, s)
FAB-Masse m/z 333
IR (KBr) V cm&supmin;¹: 1645, 1610 (sh), 1580 (s), 1490 (s), 1270, 1200, 1160
Des weiteren wurde das gleiche wie oben beschriebene Verfahren durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die wässrige Kaliumjodidlösung durch wässrige Perchlorsäurelösung ersetzt wurde, wobei 2-Methyl-4,6-bis-(4-N,N-dimethylaminophenyl)pyryliumperchlorat erhalten wurde (Verbindung 1 in Tabelle 1, worin Y ClO&sub4; ist).

Beispiel 2

20 g Natriumsulfidnonahydrat wurden in Ionenausgetauschtem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 50 ml gelöst. Als nächstes wurden 7 g Natriumhydrogencarbonat hinzugegeben und in dieser Lösung aufgelöst, und 50 ml Ethanol wurden weiterhin unter Eiskühlung hinzugeben, wonach bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt wurde. Das gefällte Natriumcarbonat wurde durch Filtration gesammelt und dann mit 25 ml Ethanol gewaschen. Anschließend wurde das Filtrat mit der Waschflüssigkeit vermischt und man erhielt etwa 125 ml der Wasser/Ethanol- Lösung aus Natriumhydrogensulfid.
Als nächstes wurden 0,92 g 2-Methyl-4,6-bis-(4-N,N-dimethylaminophenyl)pyryliumjodid, das in Beispiel 1 hergestellt wurde, in 20 ml DMSO gelöst, und 5 ml der vorher hergestellten Wasser/Ethanol-Lösung aus Natriumhydrogensulfid wurden dann zu der erhaltenen Lösung gegeben, wonach bei Raumtemperatur für 5 Minuten gerührt wurde. Nach dem Rühren wurden 0,75 ml Jodwasserstofflösung dazugegeben, und die Lösung wurde weiterhin für 5 Minuten gerührt. Anschließend wurden auf herkömmliche Weise eine Dichlormethanextraktion und Siliciumoxidgel-Säulenreinigung durchgeführt, wonach dann in einem Ethanol/Ether- Lösungsgemisch (Volumenverhältnis = 1 : 4) umkristallisiert wurde, und man erhielt die Kristalle von 2-Methyl-4,6-bis-(4- N,N-dimethylaminophenyl)thiopyryliumjodid (Verbindung 2 in Tabelle 1, worin Y = I ist).
Analytische Ergebnisse der erhaltenen Verbindung 1 (Y = I):
Schmelzpunkt: 246-248ºC
UV/visuell (CH&sub3;CH &epsi; · 10&supmin;&sup4;) λmax: 495 nm (2,50), 587 nm (4,95)
NMR (¹H, DMSO) δ ppm: 8,5679 (1H, s), 8,4323 (1H, s), 8,2436 (2 H, d, J = 9,27 Hz), 7,9786 (2 H, d, J = 9,28), 6,8959 (4 H, t, JAB = JBC = 9,28), 3,1756 (6H, s), 3,1157 (6H, s), 2,8323 (3H, s) FAB-Masse m/z 349
IR (KBr) V cm&supmin;¹: 1600, (s), 1560 (s), 1460 (s), 1430 (s), 1370 (s), 1260 (s), 1160 (s)
Des weiteren wurde das gleiche wie oben beschriebene Verfahren durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Jodwasserstoffsäure durch eine wässrige Perchlorsäurelösung ersetzt wurde, wobei 2-Methyl-4,6-bis-(4-N,N-dimethylaminophenyl)pyryliumperchlorat erhalten wurde (Verbindung 2 in Tabelle 1, worin Y ClO&sub4; ist).

Vergleichsbeispiel 1

Es wurden die Verbindungen 3 bis 55, die in Tabelle 1 gezeigt sind, hergestellt. In Tabelle 1, ist Φ eine p-Phenylengruppe
oder eine Phenylgruppe. Tabelle 1 Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung)
Diese Verbindungen wurden nach den folgenden bekannten Methoden synthetisiert. In diesem Zusammenhang wurden die typischen Reaktionsschritte gemäß bekannter Verfahren durchgeführt.
Eine Verbindung 7 wurde hergestellt, indem die Verbindung [i]
nach einem Verfahren, das in W. Foerst et al., "New Methods of Preparative Organic Cehmistry", Acad. Press (1964)" beschrieben ist, synthetisiert wird; die synthetisierte Verbindung [i] mit
(p-N,N-Dimethylaminobenzaldehyd) unter Bildung einer Verbindung umgesetzt wird; und dann die gebildete Verbindung mit geeigneten Anionen umgesetzt wird. Eine Verbindung 7 wurde erhalten, indem die oben erwähnte Verbindung [i] mit
(p-Diethylaminostyrylbenzaldehyd) unter Bildung einer Verbindung umgesetzt wurde; und dann die gebildete Verbindung mit geeigneten Anionen umgesetzt wurde. Verbindung 8 wurde hergestellt, indem die oben erwähnte Verbindung [i] mit Natriumhydrogensulfid unter Bildung einer Verbindung [ii]
synthetisiert wurde und dann diese Verbindung [ii] in gleicher Weise wie bei den Verbindungen 7 und 17 behandelt wurde.
Eine Verbindung 5 wurde hergestellt, indem eine Verbindung [iii]
aus Acetophenon und Azetaldehyd gemäß einem Verfahren, das in R. Wizinger et al., Helv. Chim., Acta., 39, Seite 217 (1956) beschrieben ist, über den folgenden Weg:
synthetisiert wurde; diese Verbindung [iii] mit p-Dimethylaminobenzaldehyd unter Bildung einer Verbindung umgesetzt wurde; und dann die gebildete Verbindung mit geeigneten Anionen umgesetzt wurde. Eine Verbindung 15 wurde nach dem gleichen Verfahren wie bei der Synthese von Verbindung 5 hergestellt, mit der Ausnahme, dass p-Dimethylaminobenzaldehyd durch p- Diethylaminostyrylbenzaldehyd ersetzt wurde. Eine Verbindung 9 wurde nach dem gleichen Verfahren wie bei der Synthese der Verbindung 5 hergestellt, mit der Ausnahme, dass p-Dimethylaminobenzaldehyd durch p-Dimethylaminozimtsäurealdehyd ersetzt wurde. Eine Verbindung 11 wurde nach dem gleichen Verfahren wie bei der Synthese der Verbindung 5 hergestellt, mit der Ausnahme, dass p-Dimethylaminobenzaldehyd durch folgende Verbindung ersetzt wurde:
Die Verbindungen 6 und 16 wurden nach den gleichen Verfahren wie bei den Verbindungen 5 und 15 hergestellt, mit der Ausnahme, dass die oben erwähnte Verbindung [iii] durch eine Verbindung [iv] ersetzt wurde:
die durch Umsetzen der oben erwähnten Verbindung [iii] mit hydriertem Natriumsulfid hergestellt wurde.
Eine Verbindung 4 wurde durch Bilden der Verbindung 3 in gleicher Weise wie bei der Synthese der oben erwähnten Verbindung [ii] hergestellt, mit der Ausnahme, dass p-Dimethylaminobenzaldehyd durch ein Azetaldehyd-Rohmaterial ersetzt wurde; wonach die Verbindung 3 mit Natriumhydrogensulfid unter Bildung einer Verbindung umgesetzt wurde und dann die gebildete Verbindung mit geeigneten Anionen umgesetzt wurde.
Verbindung 34 wurde wie nachfolgend gezeigt synthetisiert:

Beispiel 3

Eine Verbindung 1, die in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde in 10 mM Phosphorsäurepufferlösung, die 10% Acetonitril enthielt, gelöst, und die Lösung wurde dann so eingestellt, dass die Endkonzentration der Verbindung 1 3 · 10&supmin;&sup5; M betrug, wobei eine Probe I hergestellt wurde. Das Absorptionsspektrum dieser Probe I wurde in üblicher Weise durch Verwendung eines Teils der Probe I mit einem Spektrometer gemessen, wobei die Ergebnisse, die durch die Kurve A in Fig. 1 gezeigt sind, erhalten wurden.
Als nächstes wurde eine Lachssperma-DNA (hergestellt von Sigma, Co., Ltd.) in einer TE-Pufferlösung (10 mM Tris-1mH EDTA) gelöst und dann durch Phenolextraktion gereinigt. Für eine leichtere Handhabung wurde die gereinigte Lösung weiterhin einer Verdauungsbehandlung unter Verwendung des Restriktionsenzyms EcoRI zur Herstellung einer DNA-Lösung unterworfen. Ein Teil dieser DNA-Lösung wurde mit einem Teil von Probe I vermischt, und die Lösung wurde dann so eingestellt, dass die Endkonzentration der DNA 50 ug/ml betrug und damit die Endkonzentration der Verbindung I zur Herstellung einer Probe II 1 · 10&supmin;&sup4; M betrug. Das Absorptionsspektrum der Probe II wurde in üblicher Weise durch Verwendung eines Teils der Probe II gemessen, wobei die durch Kurve B in Fig. 1 gezeigten Ergebnisse erhalten wurden. Der Absorptionspeak dieser Verbindung verschob sich daraufhin 20-30 nm zur Seite der längeren Wellenlängen durch Wechselwirkung mit der DNA. Dieses war auf die typischen Eigenschaften des Einfügungselements zurückzuführen.
Das Fluoreszenzspektrum der Probe wurde in üblicher Weise durch Verwendung eines Teils von Probe I gemessen, und im Ergebnis wurde bei Abwesenheit von DNA ein schwacher Peak bei etwa 650 nm durch Anregung bei 550 nm (gezeigt in Kurve A in Fig. 2) nachgewiesen. Als nächstes wurde das Fluoreszenzspektrum von Probe II in ähnlicher Weise durch Verwendung eines Teils der Probe II gemessen, und im Ergebnis wurde ein Peak mit Fluoreszenzintensität, die etwa das 100-fache des Falls betrug, bei dem keine DNA vorhanden war, in Nachbarschaft von 650 nm durch Anregung bei der gleichen Wellenlänge (gezeigt in Kurve B in Fig. 2) nachgewiesen. Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen an, dass die Verbindung I ein starkes Einfügungselement war.
Als nächstes wurden Lösungen, die die Verbindung 1 bei einer Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup6; M und verschiedene DNA-Konzentrationen enthielten, durch Verwendung der vorher hergestellten DNA- Lösung, der Verbindung 1 und einer 10 mM-Phosphorsäurepufferlösung, die 10% Acetonitril enthielt, hergestellt. Die Fluoreszenzintensitäten der in dieser Weise hergestellten Lösungen wurden in üblicher Weise zur Bestimmung der Veränderung der Fluoreszenzintensitäten gegenüber den DNA-Konzentrationen gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Die Fluoreszenzintensität verstärkt sich mit der Erhöhung der DNA-Konzentration, und sie war meistens etwa um das 400-fache größer als in dem Fall, wenn keine DNA vorhanden ist. In diesem Fall wurde als Anregungslicht Licht aus einer Xe-Lampe als Lichtquelle, aus der der Ultraviolettanteil durch ein schwaches Schnittfilter von 480 nm entfernt wurde, verwendet.

Vergleichsbeispiel 1

Die Veränderungen der Fluoreszenzintensitäten gegenüber den DNA-Konzentrationen wurden gemäß den gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 durch Verwendung von Ethidiumbromid (EB), das ein bekanntes Einfügungselement ist, bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt.
Wie aus den Ergebnissen in Fig. 3 ersichtlich ist, ist die Fluoreszenzintensität von Verbindung 1 in Gegenwart von DNA im wesentlichen Null, allerdings ist sie im Fall von EB auch in Abwesenheit von DNA stark. Bei einer DNA-Konzentration von 4 uM erhöht sich beispielsweise weiterhin die Fluoreszenz der Verbindung 1 um etwa das 17-fache, während sich die Fluoreszenz von EB um das 4-fache erhöht. Daraus ist ersichtlich, dass in Gegenwart von DNA das S/N der Verbindung 1 viel besser als dasjenige von EB ist. Wenn deshalb die Verbindung 1 als Farbstoff für eine Nukleinsäure verwendet wird, ist ein hochempfindlicher Nachweis für die DNA bei sehr schwachem Hintergrund möglich, und selbst bei einer DNA im Niedrigkonzentrationsbereich ist ein Nachweis mit hoher Empfindlichkeit möglich.
Wie aus den Ergebnissen in Fig. 4 ersichtlich ist, kann die Verbindung 1 eine Fluoreszenzintensität um das 4-fache als das EB erreichen, solange wie sichtbares Licht als Anregungslicht verwendet wird, so dass, wenn die Verbindung 1 verwendet wird, die Nukleinsäure mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann.

Beispiel 4

Eine Verdauung eines DNA Größenmarkers λ/Hind III-Verdauung-φX 174/Hae III (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.), wurde zur Herstellung von Lösungen verwendet, die verschiedene Konzentrationen von 100 ng bis 0,1 ng darin aufweisen, und die Trennung wurde durch 0,8% Agarosegelelektrophorose durchgeführt. Als nächstes wurde eine Acetonitrillösung der Verbindung 1 in destilliertem Wasser gelöst, so dass die Endkonzentration des Farbstoffs 1 · 10&supmin;&sup6; M betrug und die Konzentration des Acetonitrils 10% betrug, und das Gel, auf dem die Elektrophorose durchgeführt worden war, wurde in diese Acetonitrillösung für etwa 2 Minuten eingetaucht.
Eine Seite eines einem Durchleuchtungsgeräts ähnlichen Kastens wurde mit einem Bandpassfilter von 480 bis 590 nm bedeckt, und das gefärbte Gel wurde dann auf das Filter gelegt und ein anderes Filter für den Fluoreszenznachweis (ein Bandpassfilter von 620 bis 710 nm) wurde weiterhin über das Gel gelegt. Danach wurde das Gel mit einer Halogenlampe bestrahlt, und zu diesem Zeitpunkt konnte das entwickelte DNA-Muster direkt mit dem bloßen Auge bestätigt werden und die gefärbte Bande, wo 0,05 ng DNA vorhanden sein sollte, konnte direkt mit dem bloßen Auge bestätigt werden. Des weiteren waren die Photographien, die mit einer Polaroid-Kamera aufgenommen wurden, ebenfalls gut. In diesem Fall war die Empfindlichkeit 10 oder mehr Male besser als in dem Fall, bei dem das Gel, das mit herkömmlichen Ethiodiumbromid gefärbt war, mit Ultraviolettstrahlung (wobei ein Durchleuchtungsgerät verwendet wurde), angeregt war.

Beispiel 5

DNA-Größenmarker mit verschiedenen Konzentrationen wurden mit dem gleichen Verfahren wie in dem Beispiel 4 hergestellt, und die DNA-Fragmente wurden auf einem 1% Agarosegel (5 · 6 cm) unter Verwendung eines Elektrophoresegeräts kleiner Größe aufgetrennt. Als nächstes wurde die Verbindung 1 in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 gelöst, und das Gel, mit dem die Elektrophorese durchgeführt worden war, wurde dann in die Lösung der Verbindung 1 eingetaucht. Danach wurde das gleiche Bandpassfilter wie in Beispiel 4 anstelle eines Glases über die Oberfläche eines Strobes, der eine Anregungsquelle aufweist, gelegt. Das gefärbte Gel wurde auf den Filter gelegt, und es wurden Photographien mit einer Polaroid-Kamera, die mit einem Bandpassfilter für den Fluoreszenznachweis ausgerüstet war, aufgenommen, wobei die Kamera mit dem Strobe verbunden war. Vorzugsweise betrug die Verschlußkappengeschwindigkeit 1 Sekunde und die Öffnung war etwa 1/16. Die Nachweisempfindlichkeit war die gleiche wie in Beispiel 4.

Beispiel 6

Lösungen aus verschiedenen Konzentrationen wurden hergestellt, indem ein DNA-Größenmarker, φX 174/Hae III-Verdauung, (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.), nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 4 verwendet wurde, und die Auftrennung wurde dann 8% Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt. Als nächstes wurde die Verbindung 10 in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 gelöst, und das Gel, mit dem die Elektrophorese durchgeführt worden war, wurde dann in die Lösung der Verbindung 10 eingetaucht. Danach wurde ein Halbleiterlaser (680 nm, hergestellt von Hitachi Ltd.) als Anregungsquelle verwendet, und ein Bandpassfilter (Wellenlängenbereich von 700 bis 800 nm) wurde vor einen Photovervielfacher gesetzt, und die Fluoreszenzintensität wurde dann durch Scannen auf dem Gel bestimmt. Die Intensität von jeder Bande war direkt proportional zur Länge des DNA-Fragments des Größenmarkers, und eine quantitative Handhabung war zur größten Konzentration, 1,3 kB (25 ng) möglich.

Beispiel 7

Eine M13 mp 18 einzelsträngige DNA wurde als Modell für eine Zielnukleinsäure verwendet, und ein 20-mer Oligonukleotid mit folgender Sequenz, die zu der Basensequenz der Ziel-DNA komplementär war, wurde als Sonde I durch Anwendung eines DNA- Synthesegeräts (Handelsname 381 A, hergestellt von ABI Co., Ltd.) synthetisiert:
5'GTTGTAAAACGACGGCCAGT3'
Darüber hinaus wurde ein 20-mer für einen Kontrolltest, das nur aus T bestand, in ähnlicher Weise als Sonde II synthetisiert.
Die Sonde I und die M13 mp 18 einzelsträngige DNA wurden zu einer Lösung aus 1 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 7,0), 145 mM NaCl und 5 mM KCl gegeben, so dass die jeweiligen Endkonzentrationen der Sonde I und der einzelsträngigen DNA 10 ug/ml betrug, und sie wurden miteinander zur Bildung einer Probe I umgesetzt. Zusätzlich wurde eine ähnliche Reaktion durchgeführt, wobei die Sonde II anstelle der Sonde I zur Herstellung einer Probe II verwendet wurde.
Als nächstes wurde eine Acetonitrillösung der Verbindung I zu jeder der Proben I und II gegeben, so dass die Endkonzentration 3 · 10&supmin;&sup5; M betrug und die Lösung wurde mit Licht von einer Wolfram-Lampe bestrahlt. Im Ergebnis wurde im Fall der Probe I eine rote Lumineszenz bestätigt, allerdings wurde im Fall der Probe II ein transparenter Zustand aufrechterhalten. Diese Ergebnisse zeigen an, dass der Nachweis eines Hybrids aus der Sonde und der Zielnukleinsäure im Lösungssystem ohne B/F- Auftrennung erreicht werden kann.

Beispiel 8

Für Verbindung 6 wurde das gleiche Experiment wie in Beispiel 3 durchgeführt. Das bedeutet, eine geeignete Menge der Verbindung wurde in einer 10% wässrigen Acetonitrildimethylsulfoxidlösung gelöst, und die Lösung wurde dann so eingestellt, dass das stärkste Absorptionsmaximum etwa 0,4 betrug. Wie in - Fig. 5 gezeigt ist, wies die Verbindung 6 in Abwesenheit von DNA ein Absorptionsmaximum bei 660 nm auf.
Die in Beispiel 3 hergestellte DNA-Lösung wurde zu der Lösung der Verbindung 6 gegeben, so dass die Endkonzentration auf 50 ug/ml gesetzt wurde und zu diesem Zeitpunkt verschob sich das Absorptionsmaximum um 30 nm auf die Seite längerer Wellenlängen, und die Verbindung 6 zeigte ein Absorptionsmaximum bei 690 nm. Ihre Absorption wurde des weiteren erniedrigt, und es zeigte sich ein Hypochromeffekt, der typisch für ein Einfügungselement ist.
Es wurden Fluoreszenzspektren in Gegenwart und Abwesenheit von DNA in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 gemessen und schließlich wurden die Ergebnisse, die in Fig. 6 gezeigt sind, erhalten. Wie in Fig. 6 gezeigt ist, wurde im Fall von keiner DNA eine schwache Fluoreszenz bei etwa 735 nm beobachtet, als mit einer Xenonlampe angeregt wurde. Als nächstes wurde DNA zur Lösung gegeben, so dass die Endkonzentration 50 ug/ml betrug, und in diesem Fall war die Wellenlänge der Fluoreszenz 800 nm, und die Fluoreszenzintensität erhöhte sich um das 7- fache im Gegensatz zu dem Fall, wo keine DNA vorhanden war. Damit wurde bestätigt, dass die Verbindung 6 ein Einfügungselement war. Unter Verwendung dieser Verbindung 6 konnte der Nachweis der DNAs in den Beispielen 4 und 7 durchgeführt werden.

Beispiel 9

Eine Verbindung 2 wurde in 10 mM Phosphorsäurepufferlösung, die 10% Acetonitril enthielt, gelöst, und die Lösung wurde dann so eingestellt, dass die Endkonzentrationen 5 · 10&supmin;&sup5; M betrug. Wie in Fig. 7 gezeigt ist, wies die Verbindung 2 in Abwesenheit von DNA eine Absorption im Bereich von 520 bis 660 nm auf, und ihr Absorptionsmaximum war bei 580 nm.
Eine DNA-Lösung, die in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 hergestellt war, wurde zu der Lösung der Verbindung 2 gegeben, so dass die Endkonzentration 50 ug/ml betrug, und zu dieser Zeit verschob sich die Absorption um 30-40 nm auf die Seite längerer Wellenlängen, was typisch für ein Einfügungselement ist. Die Fluoreszenzspektren wurden in ähnlicher Weise gemessen, und schließlich wurden die Ergebnisse, die in Fig. 8 gezeigt sind, erhalten. Wie in Fig. 8 gezeigt ist, wurde ein Peak im Fall der Abwesenheit von DNA bei etwa 700 nm beobachtet, wenn mit einer Xenonlampe belichtet wurde.
Als nächstes wurde die Verbindung 2 in einer 10 mM-Phosphorsäurepufferlösung, die 10% Acetonitril enthielt, gelöst, und die Lösung wurde dann eingestellt, so dass die Endkonzentration 1 · 10&supmin;&sup6; M betrug. Es wurde dann DNA zu der Lösung bei verschiedenen Konzentrationen zur Herstellung von Lösungen, die verschiedene DNA-Konzentrationen aufwiesen, hinzugegeben. Die Fluoreszenzintensitäten der auf dieser Weise hergestellten Lösungen wurden in üblicher Weise gemessen, um die Änderungen der Fluoreszenzintensitäten gegenüber den DNA-Konzentrationen zu überprüfen. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt. Die Fluoreszenzintensitäten erhöhten sich mit dem Anstieg der DNA- Konzentration, und sie hat sich am meisten um das etwa 100- fache im Gegensatz zu dem Fall, wenn keine DNA vorhanden ist, erhöht.
Es hat sich aus den oben erwähnten Ergebnissen bestätigt, dass die Verbindung 2 ein starkes Einfügungselement ist.

Beispiel 10

Im Hinblick auf die Verschiebung des Absorptionsmaximums und die Verstärkung der Fluoreszenzintensität der anderen Verbindungen, die in Tabelle 1 gezeigt sind, wurden Messungen in Gegenwart von DNA nach dem gleichen Verfahren wie in den Beispielen 3 und 8 durchgeführt. Typische Beispiele der erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. In diesem Zusammenhang ist der Grad der Verstärkung ein Wert zum Zeitpunkt der Endkonzentration von DNA, die bei 50 ug/ml liegt. Tabelle 2

Beispiel 11

(Färbung von lebenden Zellen von Kulturzellen)

L-Zellen (NCTC-Klon 929, ATCC Nr. CCl1, Sanford, K. K., Earle, W. R. Likely, G. D.: J. Natl. Cancer Inst., 9.229-246, 1948) wurden als Kulturzellen verwendet, und ein übliches Kulturverfahren wurde angewendet, und Eagle-MEM eines Adlers (hergestellt von Nissui Co., Ltd.) + 10% FCS wurden als Kulturmedium verwendet.
Die Kultivierung wurde in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC durchgeführt, und das Kulturmedium, in dem die Zelldichte etwa auf 1,2 · 10&sup6; Zellen/cm² gewachsen war, wurde für die Färbung verwendet.
2-Methyl-4,6-bis-(4-N,N-dimethylaminophenyl)pyryliumjodid [Verbindung I, worin (Y I war)] wurde in Ethanol gelöst (für die Fluoreszenzanalyse), so dass die Konzentration der Verbindung 1 200 ug/ml betrug. Die erhaltene Lösung wurde durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,22 um gegeben, um diese zu stabilisieren und davon Teilchen zu entfernen, wobei eine Vorratslösung für eine Färbungslösung der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Als zu färbende Zellen wurde unfixierte lebende Zellen verwendet. Die oben erwähnte Vorratslösung wurde anschließend direkt aseptisch zu dem Kulturmedium aus den Kulturzellen gemäß üblicher Kulturschritte gegeben. In diesem Experiment wurde das Kulturmedium so eingestellt, dass die Endkonzentration der Verbindung I 100 ng/ml betrug (Endethanolkonzentration = 0,5 %).
Das Kulturmedium wurde für 5 Minuten in einem CO&sub2;-Inkubator atmosphärisch inkubiert und die Fluoreszenzbetrachtung wurde dann durchgeführt. Diese Fluoreszenzbetrachtung wurde in dem Kulturmedium, das noch die Verbindung 1 enthielt, durchgeführt, das heißt, in einem Zustand, indem die Zellen in der Färbungslösung vorhanden waren. Bei dieser Betrachtung wurde ein Brechungsfluoreszenzmikroskop vom Umkehrtyp (Handelsname IMT-2, hergestellt von Olympus Optical Co., Ltd.) verwendet. Im Ergebnis wurden die Zellkerne scharf gefärbt, und es wurden Fluoreszenzbilder, die deutliche Fluoreszenzen emittierten, beobachtet. Darüber hinaus wurde das Verblassungsphänomen der Fluoreszenz nicht beobachtet, und eine Fluoreszenz der Färbungslösung, die zum Hintergrund wurde, wurde kaum beobachtet.
Nach der Beobachtung wurde dann die Färbungslösung durch ein übliches Kulturmedium ersetzt, und die Kultivierung wurde dann fortgesetzt. Man ließ die Zellen normal weiter wachsen, und nach Anlegen von Subkulturen war es möglich, diese zu färben und die Fluoreszenz zu beobachten.
Im Fall der Verbindung 1, die den Farbstoff darstellte und in diesem Beispiel verwendet wurde, befand sich das Anregungslicht und die Fluoreszenz im Bereich relativ langer Wellenlängen, und deswegen konnte für die Fluoreszenzbeobachtung für einen langen Zeitraum in einem visuellen Feld ein schlechter Einfluss, wie eine Wärmeerzeugung auf die Zellen, vorhergesagt werden. Allerdings war kein besonderer Einfluss vorhanden, was auf die sehr geringe Konzentration, die Inhibierung des Anregungslichts durch zu viel Fluoreszenz und dergleichen zurückzuführen ist.

Vergleichsbeispiel 2

[Lebendzellfärbung von kultivierten Zellen durch Ethidiumbromid (EB)]

Die zu färbenden Zellen wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 12 hergestellt.
Ein Farbstoff (EB) wird normalerweise im Zustand einer wässrigen Lösung verwendet, allerdings wurde er in diesem Experiment im Zustand einer Ethanollösung verwendet, um mit Beispiel 11 abgestimmt zu sein. Die Konzentration der Farbstofflösung wurde auf 200 ug/ml wie in Beispiel 11 gesetzt. Die Farbstofflösung wurde durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,22 um gegeben, um diese zu sterilisieren und davon Teilchen zu entfernen, womit eine Vorratslösung für eine Färbungslösung zum Vergleich erhalten wurde.
Die Färbung wurde ebenfalls durch direkte Zugabe der Vorratsfarbstofflösung zum Kulturmedium wie in Beispiel 2 durchgeführt.
Nach der Zugabe des Farbstoffs wurde eine atmosphärische Inkubation für vier verschiedene Zeiträume, das heißt 5 Minuten, 15 Minuten, 1 Stunde und 1,5 Stunden durchgeführt und die Proben wurden dann beobachtet. Das verwendete Beobachtungsgerät war das gleiche wie in Beispiel 11.
Die erhaltenen Ergebnisse waren die folgenden:
(1) Aufgrund des starken Hintergrunds von EB, wurden die Zellen weder bestätigt noch beobachtet, und eine direkte Beobachtung in der intakten Färbungslösung war trotz der Färbungszeit schwierig.
(2) Nachdem die Färbungslösung durch Kulturmedium oder physiologischer Salzlösung ersetzt wurde, wurde eine Beobachtung durchgeführt, und es hat sich dabei gezeigt, dass die Kerne in dem Fall schwach gefärbt waren, bei dem die Färbungszeit 1,5 Stunden oder mehr betrug.

Beispiel 12

(Herstellung von langzeit gelagerten Proben von gefärbten Zellen)

Es wurden praktisch in der gleichen Weise wie in Beispiel 11 Zellen hergestellt. Allerdings wurden zum Zeitpunkt der Kultivierung ein sterilisierter Objektträger (für die Fluoreszenzbeobachtung) in eine Kulturschale eingegraben, und die Zellen wuchsen am Objektträgerglas. Das Objektträgerglas mit den gewachsenen Zellen wurde aus der Kulturschale genommen, und die folgenden Arbeitsgänge wurden dann aseptisch durchgeführt, um die Zellen zu färben.
Als erstes wurde das herausgenommene Objektträgerglas in eine 4% wässrige Formaldehydlösung für 30 Minuten getaucht, um eine Fixierung zu erreichen. Danach wurde das Objektträgerglas durch destilliertes Wasser gegeben, um dieses einfach zu waschen, und eine geeignete Menge einer Färbungslösung (1 ug/ml, 0,5% Ethanollösung, Filtersterilisation), die durch Anwendung einer Vorratslösung der vorliegenden Erfindung hergestellt war, wurde dann darauf getropft. Als nächstes wurde ein Deckglas für die Fluoreszenzbeobachtung auf die Probe gelegt, und überschüssige Färbungslösung wurde dann entfernt. Danach wurde das Deckglas mit einem Haftungsharz befestigt, um eine lagerfähige Probe herzustellen.
Die Beobachtung wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 11 durchgeführt und um Ergebnis wurden die Zellkerne deutlich scharf gefärbt, und es wurden Fluoreszenzbilder, die eine deutliche Fluoreszenz ausstrahlten, wie in Beispiel 11 beobachtet.
Die Proben wurden bei -20ºC, 4ºC und Raumtemperatur (jede Probe wurde in Aluminiumfolie eingepackt, um Lichteinfall auszuschließen) aufbewahrt und nach drei Monaten wurde wieder die Fluoreszenzbeobachtung vorgenommen. Da die Proben in dem wässrigen Lösungsmittel verschlossen waren, waren die Proben, die nicht bei -20ºC aufbewahrt wurden, in einem guten Aufbewahrungszustand, obwohl die Probe, die bei -20ºC aufbewahrt wurde, einen teilweisen Aufbruch der Zellmorphologie zeigten. Des weiteren wurde auch nach der Lagerung ausreichend Fluoreszenz ausgestrahlt, und der Färbungszustand war ebenfalls gut.

Beispiel 13

(Lebendzellfärbung von Blutzellen)

Blutzellen, die nach einer Blutkulturmethode ("All of Staining", Iskuyaku Publishers Inc., S. 366) erhalten wurden, wurden im Zustand nicht fixierter Lebendzellen gefärbt. Dabei wurden zunächst 5 ml von peripherem Probenblut in eine sterilisierte Spitzröhre eingegeben, und man ließ die Röhre auf dem Kopf stehen, um die Blutzellen aufzutrennen. Als nächstes wurden 0,5 ml bovines Serum und 0,1 ml PHAM (hergestellt von Gibco Co., Ltd.) zu 5 ml eines Zellkulturmediums (RPMI 11640, hergestellt von Gibco Co., Ltd.) gegeben und die erhaltene Mischung wurde in eine Kulturschale gegeben. Als nächstes wurden etwa 0,5 ml der überstehenden Flüssigkeit des getrennten Bluts, das heißt, ein Plasmabereich der reich an Leucocyten ist, in die Kulturschale gegeben, und die Zellen wurden für drei Tage in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC kultiviert.
Eine Färbungslösung (Konzentration = 200 ug/ml, Ethanollösung), die in der gleichen Weise wie in Beispiel 11 hergestellt war, wurde zu einem Teil der Suspension der kultivierten Zellen gegeben, und die Lösung wurde dann so eingestellt, dass die Endkonzentration von Verbindung 1 100 ng/ml betrug, und die Endkonzentration des Ethanols 0,5% war, um die Blutzellen zu färben.
Für die Fluoreszenzbeobachtung wurde ein Kulturmedium, das die Verbindung 1 enthielt, als solches verwendet, und es wurde ein Beugungsfluoreszenzmikroskop (Handelsname IMT-2, hergestellt von Olympus Optical Co., Ltd.) vom Umkehrtyp verwendet. Im Ergebnis waren die Zellkerne scharf und deutlich gefärbt, und Fluoreszenzbilder, die eine deutliche Fluoreszenz ausstrahlten, wurden wie in Beispiel 11 beobachtet. Des weiteren wurde kaum das Verblassungsphänomen der Fluoreszenz beobachtet.

Beispiel 14

(Färben von kultiviertem Escherichia coli)

Als Escherichia coli wurde ein JN-109-Stamm, der normalerweise als Wirt für die genetische Rekombination verwendet wird, verwendet.
Etwa 1% Agarose wurde zu einem M-9-Kulturmedium (pH = 7,0) mit folgender Zusammensetzung gegeben, und die Agarose wurde dann in einem Autoklaven geschmolzen und sterilisiert. Als nächstes wurde die Lösung in eine Kulturschale zur Ausbildung einer Platte gegossen.
Zusammensetzung des M-g-Kulturmediums (in einem Liter):
Na&sub2;HPO&sub4;·7H&sub2;O 12,8 g
KH&sub2;PO&sub4; 3 g
NaCl 0,5 g
NH&sub4;Cl 1 g
MgSO&sub4; 1 mM
Glucose 0,2%
CaCl&sub2; 0,1 mM
Rest Wasser
Die Bakterien aus dem Vorrat des JM-109-Stamms (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden in diese M-9-Platte geimpft, und sie würden dann über Nacht in einem Inkubator bei 37ºC inkubiert, um die Bakterien wachsen zu lassen, wobei sich dann Kolonien auf der Platte bildeten. Als nächstes wurden die Bakterien aus einer dieser Kolonien mit einer sterilisierten Platinschleife aufgenommen und dann in 100 ml eines 2 · YT-Kulturmediums mit folgender Zusammensetzung in einem Kulturbehälter geimpft.
Zusammensetzung des 2 · YT-Kulturmediums (in einem Liter):
Bactotrypton 16 g
Bactohefeextrakt 10 g
NaCl 5 g
Rest Wasser
(pH = 7)
Dieses Kulturmedium wurde mit einem Schüttler auf ein Thermostat Wasserbad gesetzt, und die Schüttelkultur wurde bei 37ºC für 10 Stunden durchgeführt. Nach Vervollständigung der Kultur wurden die kultivierten Bakterien vom Kulturmedium durch Zentrifugentrennung geerntet und dann wieder in physiologischer Salzlösung suspendiert, so dass die Konzentration der Bakterien etwa 10&sup8; Bakterien/ml betrug. Als nächstes wurde die erhaltene Suspension in zwei Teile geteilt, und sie wurden in Vergleichstests unter Verwendung von fixierten und nicht fixierten Bakterien verwendet.

(1) Fluoreszenzfärbung von fixierten Bakterien

Eine 4% Formaldehydlösung (pH 7,0) wurde zu einem Teil der Suspension des JM-109-Stamms, der nach den oben erwähnten Schritten hergestellt wurde, gegeben, wobei die Menge der Formaldehydlösung gleich derjenigen der Suspension war. Nach ausreichendem Rühren ließ man die Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um die Bakterien zu fixieren. Die in dieser Weise fixierten Bakterien wurden durch Zentrifugentrennung geerntet und dann wieder in physiologischer Salzlösung resuspendiert. Zum Zeitpunkt dieser Suspension wurde die Konzentration der Bakterien auf einen Bereich von 10&sup7; bis 10&sup8; Bakterien/ml gesetzt, der für die Beobachtung durch ein Fluoreszenzmikroskop geeignet war.
Eine Färbungslösung wurde hergestellt, indem eine Verbindung 1 (Y = I) in Ethanol bis zu einer Konzentration von 200 ug/ml gelöst wurde und dann die Lösung sterilisiert wurde und davon Teilchen durch Verwendung eines Filters entfernt wurden.
Diese Färbungslösung wurde zu der Suspension der vorher hergestellten fixierten Bakterien gegeben, so dass die Endkonzentration der Verbindung 1 0,2 ug/ml war und die Konzentration des Ethanols 0,5% betrug, und man ließ die Lösung dann bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehen, um die Bakterien zu färben. Danach wurde die Fluoreszenzbeobachtung in diesem intakten Zustand, worin die fixierten Bakterien in Suspension waren, das heißt, ohne Entfernung der Verbindung 1, die der Farbstoff aus dem Suspensionslösungsmittel war, durchgeführt.

(2) Fluoreszenzfärbung von lebenden Bakterien

(Unfixierte Bakterien)

Das gleiche Verfahren wie im vorangegangenen Absatz (1) wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Bakterien nicht mit Formaldehyd fixiert waren, und man erhielt eine Suspension von gefärbten lebenden Bakterien. In diesem Fall wurde die Fluoreszenzbeobachtung durchgeführt, ohne dass die Verbindung, die der Farbstoff aus dem Suspensionslösungsmittel war, entfernt wurde.
Jede der Bakteriensuspensionen, die in den oben erwähnten Arbeitsschritten (1) und (2) erhalten wurden, wurde auf ein Objektträgerglas getropft, und ein Deckglas wurde dann darauf gelegt. Danach wurde davon überflüssige Flüssigkeit entfernt, und die Gläser wurden mit einem Haftungsharz verhaftet. Die Fluoreszenzbeobachtung der in dieser Weise erhaltenen Proben wurden durch Anwendung eines Brechungsfluoreszenzmikroskops (Handelsname IMT-2, hergestellt von Olympus Optical Co., Ltd.) durchgeführt. Im Ergebnis wurde beobachtet, dass der Escherichia coli, der ein procaryotischer Mikroorganismus war, insgesamt gefärbt wurde. Ein Unterschied der Färbungseigenschaften zwischen den fixierten Bakterien und den unfixierten Bakterien wurde nicht beobachtet, und in beiden Fällen wurden Fluoreszenzbilder, die eine sehr helle rote Fluoreszenz ausstrahlten, beobachtet. Zusätzlich wurde das Verblassungsphänomen der Fluoreszenz nicht beobachtet.
Nach der Beobachtung wurde die Färbungslösung der unfixierten Bakterien durch ein Kulturmedium ersetzt, und dann wurde eine Kultivierung durchgeführt. In diesem Fall wuchs der Escherichia coli normal und für die in den Subkulturen erhaltenen Bakterien war es möglich, diese wieder zu färben und Fluoreszenz zu beobachten.
Ebenfalls in diesem Fall konnte kein schlechter Einfluß auf den Escherichia coli durch Hitzeerzeugung oder dergleichen beobachtet werden, was auf die Fluoreszenzbeobachtung für einen langen Zeitraum in einem visuellen Feld zurückzuführen ist.

Vergleichsbeispiel 3

[Lebendbakterienfärbung von Escherichia coli durch Ethidiumbromid (EB)]

Escherichia coli, der die zu färbende Zielkomponente darstellte, wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 14 hergestellt. Ein Farbstoff (EB) wird normalerweise im Zustand einer wässrigen Lösung verwendet, aber in diesem Experiment wurde er im Zustand einer Ethanollösung verwendet, um in Übereinstimmung mit dem Beispiel 14 zu sein. Die Konzentration der Farbstofflösung wurde auf 200 ug/ml wie in Beispiel 14 gesetzt. Die Farbstofflösung wurde durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,22 um gegeben, um diese zu sterilisieren und davon Teilchen zu entfernen.
Der Escherichia coli wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 14 durch Anwendung dieser Farbstofflösung (EB) gefärbt. Nach Zugabe der Farbstofflösung wurde eine atmosphärische Inkubation für 4 verschiedene Zeiträume, das heißt 5 Minuten, 30 Minuten, 1 Stunde und 1,5 Stunden, durchgeführt, und der Färbungszustand wurde dann beobachtet. Die erhaltenen Ergebnisse waren die folgenden:
Die erhaltenen Ergebnisse wie folgt:
(1) Wenn die Beobachtung im intakten Zustand, worin die Farbstofflösung zur Bakteriensuspension gegeben wurde, durchgeführt wurde, war das von dem flüssigen Medium ausgesendete Licht sehr stark. Das heißt, dass der Hintergrund sehr stark war, was die Bewertung des Färbungszustands der Bakterien beeinträchtigt.
(2) Die Bakterien wurden aus dem flüssigen Medium herausgetrennt, gewaschen, in einem Kulturmedium oder physiologischer Salzlösung wieder resuspendiert und dann beobachtet. Im Ergebnis hat sich herausgestellt, dass die fixierten Bakterien während einer Standzeit (Färbungszeit) von etwa 30 Minuten gefärbt wurden, und die unfixierten Bakterien wurden in etwa 1 Stunde gefärbt. Allerdings war der Färbungszustand der unfixierten Bakterien schwächer als derjenige der fixierten Bakterien, und er war auch ungleichmäßiger.

Beispiel 15

(Herstellung von langzeitgelagerten Proben von gefärbten Bakterien)

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 14 (1) wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Natriumazid als Antiseptikum hinzugegeben wurde, so dass die Endkonzentration etwa 0,05% betrug, und man führte die Fluoreszenzfärbung der fixierten Bakterien aus. Danach wurde der Färbungszustand beobachtet, und im Ergebnis hat sich herausgestellt, dass das gesamte Bakterium deutlich Fluoreszenz emittiert wie in Beispiel 14.
Viele Proben wurden hergestellt, indem die Proben in Behälter gegeben wurden und dann verschlossen wurden, und sie wurden in einer Aluminiumfolie gewickelt, um sie vor Licht zu schützen. Danach wurden sie bei -20ºC, 4ºC und Raumtemperatur aufbewahrt. Nach einer Zeitdauer von 3 Monaten wurde wieder die Fluoreszenz der Proben beobachtet. Im Ergebnis zeigten die Proben, die bei -20ºC gelagert wurden, einen teilweisen Aufbruch der Morphologie der Bakterien durch das Einfrieren, weil das Suspensionsmedium der Bakterien wässrig war. Allerdings waren die Proben, die bei anderen Lagertemperaturen aufbewahrt wurden, in einem guten Lagerungszustand gehalten. Des weiteren wurde ebenfalls ausreichend Fluoreszenz emittiert, und der Färbungszustand war ebenfalls gut.

Beispiel 16

(Färben von Gewebesektion)

Eine scheibenförmige Sektion aus einer Mausleber, die mit Paraffin auf einem Objektträgerglas bedeckt war und in üblicher Weise präpariert worden war, wurde mit 2-Methyl-4,6-bis-(4-N, N-dimethylaminophenyl)pyryliumjodid (Verbindung 1) nach folgendem Verfahren gefärbt. Allerdings wurden für die Fluoreszenzbeobachtung Objektglasträger, verschiedene Lösungsmittel und Lösungen verwendet, die keine Fluoreszenz aufwiesen.
Als erstes wurde eine geeignete Menge 2-Methyl-4,6-bis-(4-N, N-dimethylaminophenyl)pyryliumjodid (Verbindung 1) in Ethanol gelöst und dann mit physiologischer Salzlösung verdünnt, und die Lösung wurde als nächstes so eingestellt, dass die Endkonzentration des Farbstoffs 1 ug/ml betrug und die Konzentration des Ethanols 0,5% war. Diese Farbstofflösung wurde durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,22 um gegeben, um diese zu sterilisieren und davon Teilchen zu entfernen, wodurch nun die Färbelösung hergestellt wurde.
Zur Erhöhung der Permeabilität der wässrigen Färbungslösung wurde das Paraffin von der scheibenförmigen Sektion, die damit bedeckt war, der Probe vor ihrer Verwendung entfernt. Die Probe wurde dazu in Xylol für 3 bis 5 Minuten getaucht, um das Paraffin zu lösen und zu entfernen. Nachdem die Entfernung des Paraffins wieder mit frischem Xylol durchgeführt worden war, wurde die Probe in reines Ethanol getaucht, um davon das Xylol zu entfernen, und es wurde wieder frisches Ethanol verwendet, um das Xylol vollständig zu entfernen. Danach wurde die Probe in eine 70% Ethanollösung eingetaucht, und dann mit Wasser gewaschen, um den Paraffinentfernungsschritt zu Ende zu führen. Gleichzeitig wurde das Umgebungslösungsmittel der Probe durch ein wässriges System ersetzt.
Als nächstes wurde die Objektträgerglasprobe, von der das Paraffin entfernt worden war, in eine geeignete Menge der Färbungslösung für 5 Minuten getaucht, um diese zu färben. Nach derü Färben wurde ein dünnes Deckglas für die Fluoreszenzbeobachtung auf die Sektion auf dem Objektträgerglas gelegt, ohne das Objektträgerglas zu waschen, und die Gläser wurden an ihren Rändern mit einem Haftmittel miteinander verhaftet. Wenn die Probe in den verhafteten Gläsern zusammen mit der Lösung, die den Farbstoff enthält, ohne Entfernung der Lösung durch Waschen gehalten wird, kann der Färbungszustand der Probe aufrechterhalten werden.
Für die Fluoreszenzbeobachtung wurde ein Beugungsfluoreszenzmikroskop vom Umkehrtyp (Handelsname IMT-2, hergestellt von Olympus Optical Co., Ltd.) verwendet. Ein visuelles Feld wurde durch ein Übertragungsphasenkontrastbild errichtet, und die Gewebeprobe wurde dann mit Anregungslicht bestrahlt. Im Ergebnis wurden die Zellkerne klar und deutlich gefärbt, und das gefärbte Bild sendete eine helle Fluoreszenz aus. Während der Beobachtung wurde kaum ein Hintergrund beobachtet. Diese Tatsache bedeutet, dass das Waschen/Entfernen von überschüssigem Farbstoff nach der Färbung unnötig ist, und es war weniger notwendig, auf die Farbstoffkonzentration während des Färbungsschritts zu achten. Außerdem gab es kein Verblassungsphänomen, und die Arbeitsschritte des Errichtens des visuellen Feldes, der Aufnahme der Photographien und dergleichen konnte ohne Verzögerung durchgeführt werden, ohne dass die Bestrahlung mit dem Anregungslicht beendet werden musste.
Zum Zeitpunkt der Verhaftung nach dem Färben konnte in diesem Zusammenhang Natriumazid als Antiseptikum hinzugegeben werden, bis die Endkonzentration etwa 0,05% betrug, und bei der in dieser Weise verschlossenen Probe veränderte sich nicht das fluoreszenzgefärbte Bild und es konnte auch beobachtet werden, selbst nach einer Lagerung von drei Monaten oder mehr.

Vergleichsbeispiel 4

[Färbung einer Gewebesektion durch Ethidiumbromid (EB)]

Ein Farbstoff (EB) wird normalerweise im Zustand einer wässrigen Lösung verwendet, allerdings wurde er in diesem Experiment im Stadium einer Ethanollösung für die Übereinstimmung mit Beispiel 16 verwendet. Die Konzentration der Farbstofflösung war derart, dass die Endkonzentration wie in Beispiel 16 1 ug/ml betrug (die Endkonzentration von Ethanol war 0,5%). Die Farbstofflösung wurde durch ein Filter mit einer Probengröße von 0,22 um gelassen, um diese zu sterilisieren und davon Teilchen zu entfernen, wodurch dann eine Färbungslösung hergestellt wurde. Die Färbung wurde ebenfalls in der gleichen Weise wie in Beispiel 16 durchgeführt. Nach der Zugabe der Färbungslösung wurde ein Färbungszustand bei Durchgangszeiten von 5 Minuten, 15 Minuten, 1 Stunde und 1,5 Stunden beobachtet. Das gleiche Beobachtungsgerät wie in Beispiel 16 wurde verwendet. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
(1) Im Fall von EB war der Hintergrund so stark, dass das Gewebe im Ganzen gefärbt erschien und es wurde ein Bild ohne Kontrast beobachtet. Es war schwierig, die Zellkerne alleine zu betrachten.
(2) In der Probe, die für 1,5 Stunden gefärbt wurde, mit destilliertem Wasser gewaschen und dann verschlossen wurde, wurde beobachtet, dass die Zellkerne schwach gefärbt waren.

Beispiel 17

(Färbung eines Chromosoms)

(1) Herstellung einer Chromosomenprobe

55 ml peripheres Blut von einem normalen erwachsenen Menschen wurde zunächst in eine sterilisierte Spitz-Röhre eingegeben, und die Röhre wurde auf dem Kopf für zwei Stunden oder mehr bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei sich die Blutzellen auftrennten. Als nächstes wurden 0,5 ml bovines Serum und 0,5 ml PHAM (hergestellt von Gibco Co., Ltd.) zu 5 ml eines Kulturmediums von RPMI 11640 (hergestellt von Gibco Co., Ltd.) hinzugegeben und die erhaltene Mischung wurde in eine Kulturschale gegeben. Als nächstes wurden etwa 0,5 ml eines Plasmas und eine Leukozytenschicht von einem oberen Bereich in der Spitz-Röhre in die Kulturschale gegeben und die Zellen wurden für drei Tage in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC kultiviert. Als nächstes wurde Colcemid in das Kulturmedium gegeben, so dass die Endkonzentration im Bereich von 0,2 bis 0,5 ug/ml war und man ließ das Medium für 2 bis 3 Stunden stehen. Die Kultivierung wurde gestoppt, und die Zellen wurden dann durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 1000 rpm geerntet. Danach wurden 3 ml 0,075 M einer KCl-Lösung zu den geernteten Zellen gegeben, und die Mischung wurde schwach gerührt und dann für 7 Minuten stehen gelassen. Als nächstes wurden diese Zellen durch Zentrifugation geerntet, wonach dann der Überstand entfernt wurde. Danach wurde eine Calnoa-Fixierungslösung (reines Ethanol : Eisessig = 3 : 1) zu den Zellen gegeben, und man ließ die Mischung für 1 Stunde stehen, um sie zu fixieren. Die verwendete Fixierungslösung wurde durch eine frische Fixierungslösung zweimal oder dreimal ersetzt, und schließlich wurden die Zellen in einer kleinen Menge Fixierungslösung suspendiert. Als nächstes wurde zu dieser Lösung eine Färbungslösung, in der eine Ethanollösung aus 2-Methyl-4,6-bis-(4-N,Ndimethylaminophenyl)thiopyryliumjodid (Verbindung 2) so eingestellt war, das die Endkonzentration der Verbindung 2 500 ng/ml betrug, so dass die Konzentration des Ethanols 1% oder weniger betrug, gegeben. Hier wurde die Färbungslösung vorher durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,22 um gegeben, um diese zu sterilisieren und davon Teilchen zu entfernen. Ein oder zwei Tropfen der Mischung der Zellsuspensionslösung und der Färbungslösung wurden auf einen gekühlten fluoreszenzfreien Objektträger durch eine Pasteurpipette getropft und dann an der Luft getrocknet.

(2) Beobachtung eines Chromosoms

Die in dem vorhergehenden Schritt (1) erhaltene Probe auf dem Objektträger wurde mit einem Haftharz verschlossen, und sie wurde auf ein Beugungsfluoreszenzmikroskop (Nikon K.K.), das mit einer hoch empfindlichen CCD-Kamera (hergestellt von Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) gesetzt, um ein Fluoreszenzmuster eines Chromosoms zu analysieren. Im Ergebnis war ersichtlich, dass das Chromosom klar und deutlich differenzial gefärbt war und sein Muster sich von einem Differenzialfärbungsmuster mit Chinacrin unterschied. Mit diesem Differenzialfärbungsmuster konnte das Chromosom klassifiziert werden.

Beispiel 18

Als erstes wurden Zellen in der gleichen Weise wie in Beispiel 17 kultiviert, und sie wurden dann durch Zentrifugation geerntet. Als nächstes wurde zu den geernteten Zellen eine 0,075 M KCl-Lösung (3 ml), in die 2-Methyl-4,6-bis-(4-N,N-dimethylaminophenyl)pyryliumjodid (Verbindung 1) hinzugegeben war, so dass die Endkonzentration 500 ng/ml betrug und die Konzentration des Ethanols 1% oder weniger betrug, gegeben. In diesem Fall wurden die geernteten Zellen nicht einer Fixierungsbehandlung mit der Calnoa-Fixierungslösung unterworfen. Danach wurde ein Chromosom nach der Dampftrockenmethode ("All of Staining", Iskiyaku Publishere Inc., S. 366) diffundiert, und überschüssige Wassertropfen wurden ohne besonderes Trocknen weggewischt. Als nächstes wurde ein Deckglas auf das Chromosom gelegt, und seine Ränder wurden mit einem Haftharz verschlossen. Die Probe wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 17 beobachtet. Im Ergebnis war ersichtlich, dass das Chromosom klar und deutlich differenzial gefärbt war, auch ohne irgendeinen Fixierungsschritt, und es wurden etwa die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 17 erhalten. Nach diesem Schritt war diese Fluoreszenz kaum verblasst. Nach einem Monat wurde diese Probe wieder betrachtet, und zu diesem Zeitpunkt konnte wieder die gleiche Fluoreszenz wie zum Zeitpunkt der Herstellung erhalten werden.

Beispiel 19

(Nachweis eines PCR-amplifizierten Produkts)

Eine PCR wurde durchgeführt mit 16 S-ribosomaler RNA von E. coli als Zielkomponete, und ihr amplifiziertes Produkt wurde durch Anwendung einer Verbindung 1 nachgewiesen.
Zunächst wurde die gesamte DNA eines E. coli JM 109-Stamms wie folgt hergestellt. 2 ml der Bakteriensuspension wurde über Nacht in einem 2 · YT-Kulturmedium kultiviert. Und die Bakterien wurden durch Zentrifugentrennung geerntet und dann in 0,5 ml einer 0,1 M Natriumphosphatpufferlösung (pH = 8,0) suspendiert. Als nächstes wurden 0,05 ml einer 10% SDS-Lösung zu dieser Suspension gegeben, und nach ausreichendem Vermischen wurde die Mischung bei 70ºC für eine Stunde gehalten. Diese Suspension wurde in einem Vortex-Mischer gemischt, um die Bakterien vollständig zu lysieren. Danach wurde Phenol/Chloroform zu dieser Lyselösung gegeben, wobei die Menge des Phenol/Chloroforms gleich derjenigen der Lyselösung war, wonach dann ein Vermischen und eine Zentrifugentrennung folgte. Die erhaltene obere Schicht wurde abgenommen, und Ethanol wurde dazugegeben, wobei die Menge Ethanol zweimal so viel wie die obere Schicht betrug, so dass die DNA in Form eines Niederschlags geerntet wurde. Diese DNA wurde in 100 ul einer TE-Pufferlösung (pH = 8) gelöst, um eine Matrizen-DNA von PCR zu bilden.
Die folgenden zwei Primer wurden bei der PCR verwendet:
Primer 1: 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'
Primer 2: 5'AACCCAACATCTCACGACAC3'
Diese Primer wurden durch Verwendung eines DNA-Synthesegeräts 381 A von ABI Co., Ltd. synthetisiert. Die Reagenzien und Techniken, die für die Synthese notwendig sind, hängen vom Protokoll der ABI-Company, Ltd. ab.
Die Reaktionsbedingungen für die PCR waren wie folgt:
Zusammensetzung einer Reaktionslösung (Volumen 30 ul)
10 · Puffer 3 ul
dNTPs 1 ul
Primer 1 10 pMol
Primer 2 10 pMol
Tag DNA-Polymerase 0,5 Einheiten
Matrizen-DNA 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg und 10 fg.
Man gab sterilisiertes Wasser zu der Reaktionslösung und brachte das Gesamtvolumen auf 30 ul.
Die hier verwendete Taq-DNA-Polymerase ist von Takara Shuzo Co., Ltd., hergestellt worden. Die hier verwendeten 10 · Puffer und dNTPs waren außerdem die gleichen, die bei den Enzymen verwendet worden waren.
Ein Reaktionszyklus war wie folgt:
Vorinkubation bei 92ºC für 5 Minuten
30 Zyklen von 92ºC - 45 s, 60ºC - 60 s und 72ºC - 90 s
Schließlich Inkubation bei 72ºC für 5 Minuten.
Als PCR-Gerät wurde hier das Modell PTC-100-96, hergestellt von MJ-Research, Inc., verwendet, und als Reaktionsbehälter wurde eine Mikrotiterplatte mit 96 Löchern (Falcon Assay Plate 3911 (U-Boden), hergestellt von Becton-Dickinson Co., Ltd.) verwendet.
Die PCR wurde unter den oben erwähnten Bedingungen durchgeführt und das amplifizierte Produkt wurde nachgewiesen.
Der Nachweis wurde wie folgt durchgeführt: 1 ul einer 5 ug/ml- Verbindung (eine Acetonitrillösung) wurde in jedes Loch, in der die Reaktion vorbei war, gegeben, und es wurde ausreichend durch Pipettieren vermischt und anschließend bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehen gelassen. Die in dieser Weise behandelte Probe wurde auf ein Durchleuchtungsgerät gesetzt, das die Probe mit Licht durch die Platte bestrahlen kann, und die Gegenwart/Abwesentheit des amplifizierten Produkts wurde durch die Gegenwart/Abwesenheit von Fluoreszenz überprüft. Des weiteren wurden 10 ul der Reaktionslösung in dem Loch gesammelt, und eine Agarosegelelektrophorese wurde ebenfalls durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Vergleichsbeispiel 5

[Nachweis eines PCR-amplifizierten Produkts durch Verwendung von EB]

Eine PCR wurde durchgeführt unter Verwendung einer 16 S ribosomalen RNA von E coli als Zielkomponete, und dieses amplifizierte Produkt wurde durch die Verwendung von EB nachgewiesen.
Es wurde eine Matrizen-DNA, die in Beispiel 19 hergestellt wurde, verwendet. Außerdem waren die Reaktionslösungszusammensetzungen, der Reaktionszyklus und die Menge der Matrizen-DNA alle die gleichen wie die in Beispiel 19, und nur die nachzuweisende Verbindung wurde verändert.
Der Nachweis wurde wie folgt durchgeführt: 1 ul 5 ug/ml EB wurde in jedes Loch gegeben, worin die Reaktion bereits vorbei war und es wurde ausreichend durch Pipettieren vermischt, wonach dann bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehen gelassen wurde. Die in dieser Weise behandelte Probe mit einer Platte wurde auf ein Durchleuchtungsgerät (Modell TM-10, hergestellt von UVP, Inc.) gesetzt, und die Gegenwart/Abwesenheit des amplifizierten Produkts wurde die Gegenwart/Abwesenheit von Fluoreszenz untersucht. Des weiteren wurden 10 ul der Reaktionslösung in dem Loch als Probe verwendet, und eine Agarosegelelektrophorese wurde ebenfalls durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 3
O: Das PCR-amplifizierte Produkt wurde nachgewiesen.
X: Das PCR-amplifizierte Produkt wurde nicht nachgewiesen. Tabelle 4
O: Das PCR-amplifizierte Produkt wurde nachgewiesen.
X: Das PCR-amplifizierte Produkt wurde nicht nachgewiesen.
Wie in den Tabellen 3 und 4 gezeigt ist, war die Empfindlichkeit des Nachweises des PCR-amplifizierten Produkts um 2 Größenordnungen durch Verwendung der Verbindung der vorliegenden Erfindung erhöht im Gegensatz zur Verwendung von EB, einem herkömmlichen Einfügungselement.
Nachfolgend werden nun die Wirkungen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Die Verbindungen der Erfindung, die ein wirksamer Bestandteil eines Farbstoffs der vorliegenden Erfindung sind, besitzen eine Anregungswellenlänge von 550 nm oder mehr auf der Seite der längeren Wellenlängen, und beispielsweise kann die Anregung mit einer Xenon-Lampe oder einer Wolfram-Lampe erreicht werden, so dass die Verwendung von gefährlichen Ultraviolettstrahlen umgangen werden kann. Da weiterhin das Anregungslicht auf der Seite der längeren Wellenlänge Verwendet wird, kann die Verstärkung des Hintergrunds beim Nachweis einer Probe, die aus einem Organismus stammt, verhindert werden, wodurch eine hoch empfindliche Analyse möglich ist. Beispielsweise ist die Probe, die von dem Organismus stammt, oftmals mit Substanzen kontaminiert, die durch Ultraviolettstrahlen angeregt werden und Fluoreszenz emittieren. Wenn daher Ultraviolettstrahlen als Anregungslicht verwendet werden, ist es notwendig, dass die Probe bis zu einem gewissen Ausmaß gereinigt ist. Wenn dagegen der Farbstoff der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann die Emission von Fluoreszenz aus diesen Substanzen verhindert werden, so dass eine aufwendige Reinigung der Probe nicht mehr erforderlich ist. Beispielsweise kann die Probe als Rohextrakt direkt verwendet werden, und ein Nachweis mit hoher Empfindlichkeit ist möglich.
Darüber hinaus kann eine Verbindung mit einer Absorption im nahen Infrarotbereich gewählt werden und als Verbindung der Erfindung verwendet werden, was die Anwendung eines kleinen kostengünstigen Halbleiterlasers als Lichtquelle für die Anregung ermöglicht, so dass die Kosten für die Messung herabgesetzt werden können. Des weiteren beträgt die Stokes-Verschiebung der Verbindung der Verschiebung etwa 100 nm, und das angeregte Licht kann vollständig vom Fluoreszenzlicht getrennt werden. Daher ist ein hoch empfindlicher Nachweis mit einem hohen S/N-Verhältnis möglich, was insbesondere für die Automatisierung der Messung effektiv ist.
Zusätzlich kann der Nachweis einer Nukleinsäure und eines Nukleinsäurefragments in einem Gel, das durch Elektrophorese aufgetrennt ist, mit einer Lichtquelle, wie einer Wolfram-Lampe, durchgeführt werden, und demzufolge kann ein Nachweis von DNA mit guter Empfindlichkeit ohne Anwendung von Ultraviolettstrahlen, die für Menschen gefährlich sind, erreicht werden. Zu dieser Zeit ist die Nachweisempfindlichkeit 10 · oder mehr höher als es im Fall von Ethidiumbromid ist, das S/N-Verhältnis ist gut, und die Verstärkung der Fluoreszenzintensität, die von der Konzentration der DNA abhängt, kann in einem großen Bereich erhalten werden, was den Nachweis in einem großen Konzentrationsbereich ermöglicht.
Bei einer Hybridisierung in einem Lösungssystem kann der Farbstoff der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ein Hybrid aus einer Probe und einer Zielnukleinsäure nachzuweisen, und in diesem Fall fungieren die Verbindungen der Erfindung als Einfügungselement für das Basenpaar der Nukleinsäure. Demzufolge werden die Verbindungen in doppelsträngige Nukleinsäure aufgenommen, so dass sich die Fluoreszenzintensität erhöht, beispielsweise im Fall der Verbindung 1, bis zum 400-fachen als im freien Zustand, durch die Aufnahme in die doppelsträngige Aminosäure. Daher kann der Nachweis des Hybrids ohne H/F- Trennung erreicht werden, so dass der Nachweis eines amplifizierten PCR-Produkts sehr einfach erreicht werden kann. Außerdem kann das Hybried stabilisiert werden, so dass eine stabile Analyse möglich ist.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Pyryliumverbindungen können als Farbstoff zum Färben einer biologischen Probe nach Anspruch 1 verwendet werden, um spezifisch eine doppelsträngige Nukleinsäure nachzuweisen, womit ein Fluoreszenzfärbungsvefahren zur Verfügung gestellt werden kann, das für viele biologische Proben geeignet ist, worin die Fixierung und der Waschvorgang weggelassen oder beträchtlich vereinfacht können im Hinblick auf herkömmliche Methoden. Außerdem kann gemäß der vorliegenden Erfindung der Fixierungsschritt der biologischen Proben weggelassen werden, so dass die Fluoreszenzbeobachtung im lebenden Zustand oder in einem natürlichen Zustand möglich ist, und die Fluoreszenzbeobachtung ist ebenfalls während der Kultivierung einer Probe möglich. Darüber hinaus kann ebenfalls eine Probe mit langer Lagerungsfähigkeit durch die Fluoreszenzfärbung hergestellt werden. Zum Zweck der Differenzialfärbung eines Chromosoms kann ein Differenzialfärbungsverfahren unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffes zur Verfügung gestellt werden, der sich von einem herkömmlichen Farbstoff in einem Differenzialmuster unterscheidet.

Claims

1. Verfahren für den spezifischen Nachweis einer doppelsträngigen Nukleinsäure, das die Schritte umfasst:

Zur Verfügung stellen einer Pyryliumverbindung, die durch folgende Formel dargestellt ist:

Vermischen der Pyryliumverbindung mit einer biologischen Probe, die eine doppelsträngige Nukleinsäure enthalten kann, um die Pyryliumverbindung in die doppelsträngige Nukleinsäure aufzunehmen;

Bestrahlen der doppelsträngigen Nukleinsäure, worin die Pyryliumverbindung als Einfügungselement eingeschlossen ist, mit Licht, wobei eine Frequenz eingeschlossen ist, bei der die eingeschlossene Pyryliumverbindung eine maximale Absorption aufweist, um die eingeschlossene Pyryliumverbindung anzuregen; und

Messen des fluoreszierenden Lichts, das von der eingeschlossenen Pyryliumverbindung ausgesendet wird, die angeregt ist, um das Vorhandensein der doppelsträngigen Nukleinsäure spezifisch nachzuweisen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe eine doppelsträngige Nukleinsäure oder ein doppelsträngiges Nukleinsäurefragment ist, die bzw. das durch Agarosegelelektrophorese oder Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe einen doppelsträngigen Hybrid umfasst, worin eine Sonde komplementär an eine einzelsträngige Zielnukleinsäure gebunden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe eine doppelsträngige Nukleinsäure ist, die durch eine PCR- Reaktion amplifiziert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Licht von einer Xenon-Lampe ausgestrahlt wird.

6. Pyryliumverbindung, die durch folgende Formel (VII) dargestellt ist:

worin X O oder S ist und Y&supmin; ein Anion darstellt.

7. Pyryliumverbindung, die durch folgende Formel dargestellt ist:

worin X O oder S ist, und Y&supmin; ClO&sub4; oder I&supmin; bedeutet.

8. Farbstoff für eine biologische Probe, dadurch gekennzeichnet, dass er als wirksamen Bestandteil eine Verbindung enthält, die durch folgende Formel (VII) dargestellt ist:

worin X O oder S ist und Y&supmin; ein Anion bedeutet.

9. Farbstoff für eine biologische Probe, dadurch gekennzeichnet, dass er als wirksamen Bestandteil eine Verbindung enthält, die durch folgende Formel dargestellt ist:

worin X O oder S ist und Y&supmin; ClO&sub4; oder I&supmin; bedeutet.