WO2003006684A2 - Vorrichtung und verfahren zum nachweis der photosynthese-hemmung - Google Patents

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WO2003006684A2
WO2003006684A2 PCT/EP2002/007057 EP0207057W WO03006684A2 WO 2003006684 A2 WO2003006684 A2 WO 2003006684A2 EP 0207057 W EP0207057 W EP 0207057W WO 03006684 A2 WO03006684 A2 WO 03006684A2
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cell parts
layer
photosynthesis
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Wolfgang Kreiss
Mark Wilhelm Drewes
Günther EBERZ
Norbert Caspers
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Bayer Cropscience Ag
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5097—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

Definitions

  • the geometry of the test device is an obstacle to massive parallelization and miniaturization. Again, mixtures of substances can only be assessed summarily.
  • EP 588 139 AI describes a test for mixtures of substances. The biological
  • the effect of the substances in a mixture of substances is checked by a combination of chromatographic separation of the mixture of substances into the substances to be tested into chromatographic zones and a subsequent test of the biological effect (toxicity) of the individual separated fractions.
  • the individual fractions are in contact with
  • Luminous microorganisms brought by a local change in their bio luminescence on the individual fractions indicate the biological effect of this fraction.
  • EP 1 043 582 A2 The possibility of parallelizing and miniaturizing effect tests is described in EP 1 043 582 A2.
  • a sensor layer which consists of a diffusion-controlling matrix and effect sensors suspended therein. When this sensor layer comes into contact with samples, the biological activity of the test substances is indicated by optical signals.
  • the object of the invention is to provide a device and a method for the detection of photosynthesis-inhibiting substances, which enables a significantly higher sample throughput and a miniaturization compared to the prior art.
  • the object of the invention is achieved by a method for detecting the photosynthesis-inhibiting action of substances comprising the steps
  • test substance to the planar layer or in the planar
  • the cells can be made from algae, microalgae, bacteria, in particular cyanobacteria with a photosynthesis system, plant cell cultures or plant homogenates come.
  • the procedure also works with cells that are damaged in their vitality as long as an intact Photosystem II (PS II) is present.
  • PS II Photosystem II
  • the cells can also come from selected mutants or from genetically modified organisms.
  • the planar layer is preferably a gel layer.
  • the planar layer preferably has a thickness in the range from 0.1 mm to 10 mm.
  • the introduction of the cells or the cell parts into a planar layer can be done by embedding e.g. of green algae in agarose or acrylate gels or other gel formers or viscous media.
  • test substance is applied to the planar layer or into the planar layer, for example by means of syringe techniques or by pin tools or suitable printing techniques (jet systems etc.), preferably in the form of spots.
  • Luminescence is fluorescence and / or phosphorescence (time-delayed luminescence).
  • the measurement of the phosphorescence offers advantages compared to the fluorescence measurement, since there is no effort for the discrimination of excitation and emission.
  • fluorescence measurement has the advantage of greater sensitivity to detection.
  • Both white light sources are suitable as excitation light sources, e.g. Halogen light or fluorescent tubes as well as light sources that emit in a narrow spectral range, e.g. LEDs.
  • Daylight can also serve as the excitation light source.
  • the excitation can take place continuously or in a pulsed mode (pulse modulation technique).
  • the detection is carried out with instruments which are capable of imaging the emitted luminescence in the wavelength range of> 680 nm with sufficient sensitivity (eg Vidicon system, CCD camera, scanner, phosphor imager, photographic film). Time-resolved light measurements can also be carried out, if necessary, together with pulsed excitation and correlation of excitation and measurement.
  • instruments which are capable of imaging the emitted luminescence in the wavelength range of> 680 nm with sufficient sensitivity (eg Vidicon system, CCD camera, scanner, phosphor imager, photographic film).
  • Time-resolved light measurements can also be carried out, if necessary, together with pulsed excitation and correlation of excitation and measurement.
  • an additional exposure or a dark phase can be used to control the photosynthetic activity.
  • Photosynthesis-inhibiting test substances which are applied to or in the planar layer according to the invention influence the luminescence behavior of the photosynthesis pigment complex. Spots of
  • Photosynthesis inhibitors such as atrazine can be e.g. by significantly weakening the time-delayed luminescence (phosphorescence) with video imaging methods, simply and simultaneously prove its effect for a large number of spots.
  • the increased fluorescence of the photopigments when the photosynthesis system II is inhibited can also serve to image the PS II-active substance spots.
  • the invention further relates to a system for the detection of the photosynthesis-inhibiting action of substances according to the method according to the invention, containing
  • Excitation light source for excitation of the luminescence of the cells or of the cell parts in the planar layer
  • Detector for measuring the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer - evaluation means for assigning the detector signal to the degree of photosynthesis inhibition.
  • the means for applying the test substance to the planar layer or into the planar layer can be, for example, syringe systems, steel needles (pin tools) or suitable pressure stamps and jet systems.
  • the evaluation can be done visually or by means of suitable image processing techniques.
  • the invention further relates to a test strip or sensor chip for detecting the photosynthesis-inhibiting effect of substances according to the inventive method containing a planar layer with cells or cell parts with an intact photosystem, after the application of the test substance to the planar layer or in the planar layer, and subsequent excitation of the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer by an excitation light source, and measurement of the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer with a detector from which the degree of photosynthesis inhibition can be determined from the detector signal.
  • the planar layer of the test strip or sensor chip preferably consists of green algae in agarose or acrylate gels. In this way, stable detection layers can be produced, which retain their function as a test system for the photosynthesis-inhibiting effect even when stored for longer periods.
  • An advantage of the method according to the invention is a high level of miniaturization and parallelization of the detection method for photosynthesis-inhibiting substances.
  • a high sample throughput can be achieved by the parallelization.
  • the spatially resolving action detection enables photosynthesis-inhibiting substances as components of mixtures of substances to be identified without interference in thin-layer chromatograms or electropherograms by first subjecting the mixture of substances to a chromatographic or electrophoretic separation on a thin-layer chromatography plate or an electrophoresis layer and then using the process according to the invention Claim 15 the photosynthesis-inhibiting effect of the fractions is examined.
  • the spatially resolving action detection also makes it possible to apply photosynthesis-inhibiting substances to different locations on a support and to investigate the photosynthesis-inhibiting action of these spots using the method according to the invention.
  • the method according to the invention can be used in drug discovery to optimize photosynthesis inhibitors.
  • Another area of application is, for example, the specific measurement of herbicidal activity in wastewater and environmental samples due to pollutants.
  • a thin agarose layer (approx. 4 mm layer height) in which green algae (Scenedesmus subspicatus) had been suspended was used to detect the photosynthesis-inhibiting effect.
  • the green algae were grown as follows:
  • the algae are inoculated from a preserve of Scenedesmus subspicatus into a sterile 100 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of culture medium.
  • the solution is then incubated at 23 ° C. and at 125 rpm in a climatic cabinet equipped with fluorescent tubes under the action of light for 7 days.
  • the growth medium contains: 58 mg / 1 sodium carbonate
  • 25 ml of the algae suspension (optical density approx. 2 mAU) are homogeneously mixed with 15 ml of 1% agarose MP solution (Boehringer Mannheim GmbH Art. No. 1388983) at temperatures below 40 ° C. Before cooling, this suspension is placed in a single well plate (Nalge Nunc, Omni Tray Single Well 86 x 128 mm).
  • a gel layer with uniformly suspended algae forms there on cooling.
  • This detection layer can be used immediately or after several weeks of storage to measure the photosynthesis inhibitory effect.
  • test substances from a microtiter plate were stamped onto the algal layer using a 96-fold pin tool (Nalge Nunc 96 pin replicator).
  • the sample assignment of the microtiter plate (see Table 1) also defines the position of the respective substance on the algal layer.
  • the test substances were in the microtiter plate as a DMSO solution (100 ⁇ mol
  • Table 1 Parallel detection of the effect of substances by fluorescence imaging on a 96-well microtiter plate with an algae layer
  • a video imaging system (Molecular Light Imager NightOWL from PerkinElmer Life Sciences) was used to record the fluorescence image.
  • the single well plate was placed on a light table, the white light source of which was limited to a wavelength below 475 nm using a filter (Omega 475 RDF 40).
  • the camera lens was equipped with a filter that allows light above 680 nm to pass (Andover P / N: 680FS 10-50). The fluorescence excitation and the camera recording took place simultaneously for a period of 1 second. The evaluation of the
  • the fluorescence image shows 22 bright spots (see Figure 1).
  • the substances deposited there cause an increase in fluorescence due to their interaction with the photosystem.
  • Metamitron a known photosynthesis inhibitor, with the amounts 50 ng, 125 ng and 250 ng was applied to positions F12, G12, H12 as reference substance. All noticed in this parallel assay
  • the algae layer was produced as in Example 1.
  • the same test substances as in Example 1 and in identical positioning were applied to the algal layer.
  • the incubation was also carried out for 15 minutes.
  • a video imaging system (Molecular Light Imager NightOWL from PerkinElmer Life Sciences) was used to record the phosphorescence image.
  • the NUNC plate was placed on a light table that was equipped with a white light source. No filters were used in front of the camera lens to record the phosphorescent light.
  • the algae layer was exposed for 90 seconds to stimulate phosphorescence. After a waiting time of 15 seconds, the camera was recorded with a recording time of 30 seconds.
  • the phosphorescence image was evaluated visually on the screen of the video imaging system.
  • TIFF files were formatted and labeled with suitable graphics programs (Adobe Photoshop 5.0, MS Powerpoint
  • the phosphorescence image shows 22 dark spots (see Figure 2).
  • the substances deposited there cause a faster decay of the phosphorescence due to their interaction with the photosystem.
  • Metamitron a known photosynthesis inhibitor, with the amounts 50 ng, 125 ng and 250 ng was applied to positions F12, G12, H12 as reference substance. The results are in good agreement with the results of fluorescence imaging (see also Example 1). All substances found in this parallel assay are inhibitors of the

Abstract

Verfahren, System und Teststreifen zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen durch Bereitstellung von Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem, Einbringen der Zellen oder der Zellteile in eine planare Schicht, Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht, Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht durch eine Anregungslichtquelle, Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht mit einem Detektor und Zuordnung des Detektorsignals zum Grad der Photosynthese-Hemmung.

Description

Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis der Photosynthese-Hemmung
Die Inhibierung der Photosynthese von Pflanzen durch herbizid wirksame Substan- zen ist ein wichtiger Parameter für die ökotoxikologische Bewertung von Substanzen einerseits und für die Suche nach herbizid wirksamen Substanzen in der Pflanzenschutzforschung andererseits. Leistungsfähige Messtechniken für die rasche Erfassung der Photosynthese-hemmenden Wirkung besitzen daher bei der ökotoxikologischen Bewertung von Substanzen und als Screeningverfahren für die Suche nach neuen Pflanzenschutzwirkstoffen eine große Bedeutung.
Zur Prüfung auf Photosynthese-hemmende Wirkung sind verschiedene Tests sowohl an höheren Pflanzen wie auch an Mikroalgen bekannt. Die bekannten Messprinzipien beruhen dabei u. a. auf der Chlorophyll-Fluoreszenz oder auf der Messung der photo- synthetischen Sauerstoffproduktion (B. Hock, C. Fedtke, R. R. Schmidt, Herbizide,
Georg Thieme Verlag, 1995, 54 u. 112-114; D. Merz, M. Geyer, D. A. Moss, H.-J. Ache, Fresenius J. Anal. Chem, 1996, 354: 299-305). Diese den Stand der Technik repräsentierenden Verfahren weisen durchweg Begrenzungen auf, die Hochdurchsatzmessungen, wie sie beim Wirkstoffscreening durchgeführt werden, Miniaturisie- rungen z.B. Hochparallelisierung oder eine direkte Kopplungen mit analytischen
Separationstechniken zur Wirkungsdetektion in Stoffgemischen nicht zulassen.
Die Messung der Chlorophyll-Fluoreszenz ist als Standard-Verfahren zur Untersuchung des Photosynthese-Prozesses etabliert. Die hier angewendeten Verfahren arbeiten mit Fluorimetern, die wegen ihrer auf Sonden- oder Küvetten-Messungen beruhenden Methodik lediglich serielle Messungen zulassen und damit für Hochdurchsatz-Anwendungen nicht geeignet sind. Darüber hinaus lassen sich solche Verfahren auch nur schwer miniaturisieren. Typische Instrumente für diese Technik werden u. a. von den nachfolgend genannten Herstellern angeboten: ADC BioScientific Ltd., Hansatech Instruments, Heinz Walz GmBH, Qubit Systems Inc. Beim DF-Algentest werden Wasserproben mit Grünalgen versetzt und anschließend luminometrisch vermessen (Methoden der biologischen Wasseruntersuchung, Band 2: Biologische Gewässeruntersuchung, G. Fischer Verlag, 1999, Seite 386-388). Dabei wird zunächst die Abklingkinetik für die zeitverzögerte Lumineszenz des Photosynthese-Pigmentkomplexes ermittelt. Durch Vergleich mit der entsprechenden
Abklingkinetik für eine unbelastete Referenzprobe wird auf die Gegenwart von Photosynthese-hemmenden Substanzen geschlossen. Dieses Verfahren kann Proben lediglich seriell bearbeiten und ist daher für Hochdurchsatzmessungen nicht geeignet.
Eine weitere Einschränkung betrifft das für den DF-Algentest notwendige Probenvolumen, das bedingt durch die Dimensionierung der Messapparatur in der Größenordnung von Millilitern liegt. Eine Miniaturisierung ist mit diesem Verfahren nicht möglich. Weiterhin werden Stoffgemische, wie sie für reale Proben typisch sind, von diesem Verfahren lediglich summarisch erfasst. Auf Grund möglicher Interaktionen zwischen den Probeninlialtsstoffen besteht das Risiko für falsch positive Resultate.
Bekannt sind auch Tests an höheren Pflanzen (siehe z.B. W. Bilger, U. Schreiber, M. Bock, Oecologia 102, 1995, S. 425-432) . Diese Tests machen eine Aussage» zur Photosynthese-Hemmung über ein Fluoreszenz-Messverfahren. Auch hier stellt die
Geometrie der Testvorrichtung ein Hindernis für die massive Parallelisierung und die Miniaturisierung dar. Stoffgemische können wieder nur summarisch beurteilt werden.
In EP 588 139 AI wird ein Test für Stoffgemische beschrieben. Die biologische
Wirkung der Substanzen in einem Stoffgemisch wird geprüft durch eine Kombination von chromatographischer Auftrennung des Stoffgemischs in die zu testenden Substanzen in chromatographische Zonen und einem anschließenden Test der biologischen Wirkung (Toxizität) der einzelnen aufgetrennten Fraktionen. Bei dem Test der biologischen Wirkung werden die einzelnen Fraktionen in Kontakt mit
Leuchtmikroorganismen gebracht, die durch eine lokale Änderung ihrer Bio- lumineszenz an den einzelnen Fraktionen die biologische Wirkung dieser Fraktion anzeigen.
Die Möglichkeit der Parallelisierung und Miniaturisierung von Wirkungstests wird in EP 1 043 582 A2 beschrieben. Nach dem in EP 1 043 582 A2 offenbarten Verfahren wird eine Sensorschicht eingesetzt, die aus einer diffusionskontrollierenden Matrix und darin suspendierten Wirkungssensoren besteht. Beim Kontakt dieser Sensorschicht mit Proben wird die biologische Aktivität der Prüfsubstanzen durch optische Signale angezeigt.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Erfassung von Photosynthese-hemmenden Substanzen bereitzustellen, das einen gegenüber dem Stand der Technik deutlich höheren Probendurchsatz und eine Mmiaturisierung ermöglicht.
Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe besteht in einem Verfahren zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen enthaltend die Schritte
- Bereitstellung von Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem,
Einbringen der Zellen oder der Zellteile in eine planare Schicht,
Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare
Schicht,
Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht durch eine Anregungslichtquelle,
Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren
Schicht mit einem Detektor
Zuordnung des Detektorsignals zum Grad der Photosynthese-Hemmung.
Die Zellen können aus Algen, Mikroalgen, Bakterien insbesondere Cyanobakterien mit einem Photosynthesesystem, Pflanzenzellkulturen oder Pflanzenhomogenisat stammen. Das Verfahren arbeitet auch mit Zellen, die in ihrer Vitalität geschädigt sind, solange ein intaktes Photosystem II ( PS II) vorliegt.
Die Zellen können auch aus selektionierten Mutanten oder aus gentechnisch veränderten Organismen stammen.
Die planare Schicht ist vorzugsweise eine Gelschicht. Die planare Schicht hat vorzugsweise eine Dicke im Bereich von 0,1 mm bis 10 mm. Das Einbringen der Zellen oder der Zellteile in eine planare Schicht kann durch Einbettung z.B. von Grünalgen in Agarose- oder Acrylatgele oder andere Gelbildner oder viskose Medien erfolgen.
Das Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht erfolgt zum Beispiel mittels Spritzentechniken oder durch Pin-Tools oder geeignete Drucktechniken (Jetsysteme etc.), bevorzugt in Form von Spots.
Bei der Lumineszenz handelt es sich um Fluoreszenz und/oder Phosphoreszenz (zeitverzögerte Lumineszenz). Die Messung der Phosphoreszenz bietet im Vergleich zur Fluoreszenzmessung Vorteile, da kein Aufwand für die Diskriminierung von Anregung und Emission entsteht. Andererseits besitzt die Fluoreszenzmessung den Vor- teil größerer Nachweisempfindlichkeit.
Als Anregungslichtquelle eignen sich sowohl Weißlichtquellen, z.B. Halogenlicht oder Leuchtstoffröhren wie auch Lichtquellen, die in einem schmalen Spektralbereich emittieren, z.B. Leuchtdioden. Als Anregungslichtquelle kann auch Tageslicht dienen. Die Anregung kann kontinuierlich oder in einem gepulsten Modus (Pulsmodulationstechnik) erfolgen.
Die Detektion erfolgt mit Instrumenten, die zu einer Abbildung der emittierten Lumineszenz im Wellenlängenbereich von > 680 nm mit hinreichender Empfindlich- keit in der Lage sind (z.B. Vidicon-System, CCD-Kamera, Scanner, Phosphorimager, photographischer Film). Es können auch zeitaufgelöste Lichtmessungen gegebenenfalls zusammen mit gepulster Anregung und Korrelation von Anregung und Messung durchgeführt werden.
Unabhängig von der Anregungsbelichtung kann eine zusätzliche Belichtung oder eine Dunkelphase zur Steuerung der Photosyntheseaktivität eingesetzt wird.
Photosynthese-hemmende Prüfsubstanzen, die auf oder in die erfindungsgemäße planare Schicht aufgebracht werden, beeinflussen das Lumineszenzverhalten des Photosynthese-Pigment-Komplexes. Auf die planare Schicht aufgegebene Spots von
Photosynthese-Hemmern wie Atrazin lassen sich z.B. durch signifikante Schwächung der zeitverzögerten Lumineszenz (Phosphoreszenz) mit Video-Imaging- verfahren einfach und für eine große Zahl von Spots gleichzeitig über ihre Wirkung nachweisen. Alternativ hierzu kann auch die verstärkte Fluoreszenz der Photo- pigmente bei Inhibierung des Photosynthesesystems II zur Abbildung der PS II- aktiven Substanzspots dienen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein System zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen nach dem erfindungsgemäßen Ver- fahren, enthaltend
eine planare Schicht mit Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem, Mittel zum Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht,
Anregungslichtquelle zur Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht,
Detektor zur Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht, - Auswertemittel zur Zuordnung des Detektorsignals zum Grad der Photosynthese-Hemmung. Die Mittel zum Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht können z.B. Spritzensysteme, Stahlnadeln (Pin-Tools) oder geeignete Druckstempel sowie Jet-Systeme sein.
Die Auswertung kann visuell oder mittels geeigneter Bildverarbeitungstechniken erfolgen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Teststreifen oder Sensor-Chip zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren enthaltend eine planare Schicht mit Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem, wobei nach dem Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht, und nachfolgender Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht durch eine Anregungslichtquelle, und Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht mit einem Detektor, aus dem Detektorsignal der Grad der Photosynthese-Hemmung bestimmbar ist.
Die planare Schicht des Teststreifens oder Sensor-Chips besteht bevorzugt aus Grünalgen in Agarose- oder Acrylatgelen. Auf diese Weise lassen sich stabile Detek- tionsschichten herstellen, die ihre Funktion als Testsystem für die Photosynthese- Hemmwirkung auch bei Lagerung über längere Zeiträume beibehalten.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine hohe Miniaturisierung und Parallelisierung des Nachweisverfahrens für Photosynthese-hemmende Substanzen.
Durch die Parallelisierung kann ein hoher Probendurchsatz erzielt werden. Durch die
Miniaturisierung kann ein erheblich geringerer Verbrauch an Materialien erreicht werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, mehrere tausend Substanzspots auf einer Fläche von 9 cm * 12 cm aufzubringen und damit neben der Paralleli- sierung einen Miniaturisierungsgrad von < 10 ng Prüfsubstanz in weniger als 500 nl Testvolumen zu erreichen.
Die ortsauflösende Wirkungserfassung erlaubt es, Photosynthese-hemmende Sub- stanzen als Komponenten von Stoffgemischen störungsfrei in Dünnschichtchromato- grammen oder Elektropherogrammen zu identifizieren, indem zunächst das Stoffgemisch einer chromatographischen oder elektrophoretischen Trennung auf einer Dünnschichtchromatographieplatte oder einer Elektrophoreseschicht unterworfen wird und anschließend nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Anspruch 15 die Photosynthese-hemmende Wirkung der Fraktionen untersucht wird.
Die ortsauflösende Wirkungserfassung erlaubt es auch, Photosynthese-hemmende Substanzen auf verschiedene Orte eines Trägers aufzugeben und Photosynthese- hemmende Wirkung dieser Spots mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zu untersuchen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der Wirkstoffforschung zur Optimierung von Photosynthese-Hemmern eingesetzt werden. Ein weiteres Einsatzfeld bildet zum Beispiel die spezifische Messung der auf Schadstoffe zurückzuführenden herbiziden Aktivität in Abwässern und Umweltproben.
Figuren und Beispiele
Beispiel 1
In Beispiel 1 wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren der spezifische Nachweis photosynthesehemmender Substanzen mittels induzierter Fluoreszenz in dem erfindungsgemäßen Schichtsystem gezeigt.
Zur Detektion der Photosynthese-Hemmwirkung wurde eine dünne Agaroseschicht (ca. 4 mm Schichthöhe), in die Grünalgen (Scenedesmus subspicatus) suspendiert worden waren, eingesetzt.
Die Grünalgen wurden folgendermaßen angezüchtet:
Aus einer Stammkonserve Scenedesmus subspicatus werden die Algen in einen sterilen 100 ml Erlenmeyerkolben, der 50 ml Anzucht-Medium enthält überimpft.
Anschließend wird die Lösung bei 23 °C und bei 125 rpm in einem mit Leuchtstoffröhren ausgerüsteten Klimaschrank unter Lichteinwirkung für 7 Tage inkubiert.
Das Anzucht-Medium enthält: 58 mg/1 Natriumcarbonat
496 mg/1 Natriumnitrat
39 mg/1 Kaliumhydrogenphosphat
75 mg/1 Magnesiumsulfatheptahydrat
36 mg/1 Calciumchloriddihydrat 10 mg/1 Titriple III
3 mg/1 Zitronensäure und wird mit Hilfe von 1 N HC1 bzw. 1 N NaOH auf pH 7,5 ± 0,2 eingestellt. Das
Medium wird vor Gebrauch bei 121 °C für 20 min autoklaviert. Herstellung der Algenschicht:
25 ml der Algensuspension (optische Dichte ca. 2 mAU) werden bei Temperaturen unter 40°C mit 15 ml 1 % Agarose MP -Lösung (Boehringer Mannheim GmbH Art. Nr. 1388983) homogen gemischt. Diese Suspension wird vor dem Erkalten in eine Single Well-Platte (Nalge Nunc, Omni Tray Single Well 86 x 128 mm) gegeben.
Dort bildet sich beim Abkühlen eine Gelschicht mit gleichförmig suspendierten Algen aus. Diese Detektionsschicht kann sofort oder auch nach mehreren Wochen Lagerung zur Messung der Photosynthese-Hemmwirkung eingesetzt werden.
Substanztransfer auf Detektionsschicht und Inkubation:
Für den erfindungsgemäßen parallelen Wirkungstest wurden Testsubstanzen aus einer Mikrotiterplatte mit einem 96-fach Pintool (Nalge Nunc 96 Pin Replicator) auf die Algenschicht gestempelt. Die Probenbelegung der Mikrotiterplatte (siehe Tabelle 1) legt damit auch die Position der jeweiligen Substanz auf der Algenschicht. Dabei lagen die Testsubstanzen in der Mikrotiterplatte als DMSO-Lösung (100 μMol
Substanz in 100 μl je Well) vor. Mit dem Pin Tool wurden jeweils ca. 0,5 μl Probelösung je Pin auf die Detektionsschicht übertragen. Vor der Fluoreszenzmessung wurde die bestempelte Detektionsschicht bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert.
Tabelle 1: Parallele Detektion der Wirkung von Substanzen durch Fluoreszenzimaging auf 96er-Mikrotiterplatte mit Algenschicht
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Parallele Detektion der Wirkung durch Fluoreszenzimaging:
Zur Aufnahme des Fluoreszenz-Bildes wurde ein Videoimaging System (Molecular Light Imager NightOWL von PerkinElmer Life Sciences) eingesetzt. Für die Messung wurde die Single Well-Platte auf einen Leuchttisch plaziert, dessen Weißlichtquelle mit einem Filter (Omega 475 RDF 40) auf Wellenlängen unterhalb von 475 nm begrenzt wurde. Zur selektiven Erfassung des Fluoreszenzlichts wurde das Kameraobjektiv mit einem Filter ausgerüstet, der Licht oberhalb 680 nm passieren lässt (Andover P/N: 680FS 10-50). Die Fluoreszenzanregung und die Kameraauf- nähme erfolgten simultan für einen Zeitraum von 1 Sekunde. Die Auswertung des
Fluoreszenzbildes erfolgte visuell am Bildschirm des Videoimagingsystems. Zur Dokumentation wurden TIFF-Files mit geeigneten Grafikprogrammen formatiert und beschriftet (Adobe Photoshop 5.0, MS Powerpoint 97).
Ergebnisse:
Das Fluoreszenz-Image zeigt 22 helle Spots (siehe Figur 1). Die dort deponierten Substanzen bewirken auf Grund ihrer Wechselwirkung mit dem Photosystem eine Steigerung der Fluoreszenz. Auf den Positionen F12,G12, H12 war als Referenzsubstanz Metamitron, ein bekannter Photosynthesehemmer, mit den Mengen 50 ng, 125 ng und 250 ng aufgetragen worden. Alle in diesem Parallelassay aufgefallenen
Substanzen und in Tabelle 1 mit X gekennzeichneten Substanzen sind als Hemmstoffe des Photosystems II bekannt.
Beispiel 2
In Beispiel 2 wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren der spezifische Nachweis photosynthesehemmender Substanzen mittels Phosphoreszenz in dem erfindungsgemäßen Schichtsystem gezeigt.
Die Algenschicht wurde analog Beispiel 1 hergestellt. Es wurden die gleichen Testsubstanzen wie in Beispiel 1 und in identischer Positionierung auf die Algenschicht aufgebracht. Die Inkubation erfolgte ebenfalls für 15 Minuten.
Parallele Detektion der Wirkung durch Phosphoreszenzimaging:
Zur Aufnahme des Phosphoreszenz-Bildes wurde ein Videoimaging System (Molecular Light Imager NightOWL von PerkinElmer Life Sciences) eingesetzt. Für die Messung wurde die NUNC-Platte auf einen Leuchttisch plaziert, der mit einer Weißlichtquelle ausgerüstet war. Zur Erfassung des Phosphoreszenzlichts wurden keine Filter vor dem Kameraobjektiv eingesetzt. Zur Phosphoreszenzanregung wurde die Algenschicht für 90 Sekunden belichtet. Nach einer Wartezeit von 15 Sekunden erfolgte die Kameraaufiiahme mit einer Aufhahmezeit von 30 Sekunden. Die Auswertung des Phosphoreszenzbildes erfolgte visuell am Bildschirm des Videoimagingsystems. Zur Dokumentation wurden TIFF-Files mit geeigneten Grafikprogrammen formatiert und beschriftet (Adobe Photoshop 5.0, MS Powerpoint
97).
Ergebnisse:
Das Phosphoreszenz-Image zeigt 22 dunkle Spots (siehe Figur 2). Die dort deponierten Substanzen bewirken auf Grund ihrer Wechselwirkung mit dem Photosystem ein rascheres Abklingen der Phosphoreszenz. Auf den Positionen F12,G12, H12 war als Referenzsubstanz Metamitron, ein bekannter Photosynthesehemmer, mit den Mengen 50 ng, 125 ng und 250 ng aufgetragen worden. Die Resultate stimmen gut mit den Ergebnissen des Fluoreszenzimagings überein (siehe auch Beispiel 1). Alle in diesem Parallelassay aufgefallenen Substanzen sind als Hemmstoffe des
Photosystems II bekannt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen enthaltend die Schritte
Bereitstellung von Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem,
Einbringen der Zellen oder der Zellteile in eine planare Schicht, Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht,
Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht durch eine Anregungslichtquelle, Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht mit einem Detektor und - Zuordnung des Detektorsignals zum Grad der Photo synthese-
Hemmung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen aus Algen, Mikroalgen, Cyanobakterien, anderen Bakterien mit einem Photo- synthesesystem, Pflanzenzellkulturen, Pflanzenhomogemsat, selektionierten
Mutanten oder aus gentechnisch veränderten Organismen stammen.
3. Verfahren nach Ansprach 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Zellen um avitale Zellen handelt, bei denen das Photosynthese U-System noch intakt ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix der planaren Schicht bevorzugt aus Agarose oder Acrylat, oder anderen Gelbildnern oder anderen viskosen Medien besteht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die planare Schicht eine Dicke im Bereich von 0,1 mm bis 10 mm hat.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Einbringen der Zellen oder der Zellteile in die planare Schicht durch Einbettung von Grünalgen in Agarose erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht durch Pin-Tools, Spritzensysteme oder geeignete Drucktechniken in
Form von Spots erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Lumineszenz um Fluoreszenz und/oder Phosphoreszenz handelt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtquelle eine Weißlichtquelle oder aber eine Lichtquelle mit enger spektraler Verteilung (z.B. Leuchtdioden) darstellt und für die konti- nuierliche Anregung und/oder für Pulsmodulationstechniken eingesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtquelle Tageslicht ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor auch in einem Wellenlängenbereich von > 680 nm empfindlich ist und bildgebende Eigenschaften hat.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Detektor z.B. ein Vidicon-System, eine CCD-Kamera, ein Scanner, ein
Phosphorimager oder ein photographischer Film eingesetzt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass zeitaufgelöste Lichtmessungen gegebenenfalls zusammen mit gepulster Anregung und Korrelation von Anregung und Messung durchgeführt werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass unabhängig von der Anregungsbelichtung eine zusätzliche Belichtung oder eine Dunkelphase zur Steuerung der Photosyntheseaktivität eingesetzt wird.
15. Verfahren zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von
Substanzen enthaltend die Schritte
Bereitstellung von Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem,
Bereitstellung einer Dünnschichtchromatographieplatte oder einer Elektro- phoreseschicht oder eines anderen Trägers mit darauf deponierten
Substanzzonen,
Einbringen der Zellen oder der Zellteile in eine planare Schicht,
Aufbringen der planaren Schicht mit den Zellen oder Zellteilen auf die bereitgestellte Dünnschichtchromatographieplatte oder Elektrophoreseschicht oder den anderen Träger,
Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren
Schicht durch eine Anregungslichtquelle,
Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren
Schicht mit einem Detektor und - Zuordnung des Detektorsignals zum Grad der Photosynthese-Hemmung.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzzonen durch chromatographische oder elektrophoretische Trennung erzeugt worden sind.
17. System zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen, enthaltend
eine planare Schicht mit Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem,
Mittel zum Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht oder auf einen Träger, der die planare Schicht trägt, Anregungslichtquelle zur Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht, - Detektor zur Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht,
Auswertemittel zur Zuordnung des Detektorsignals zum Grad der Photosynthese-Hemmung.
18. System nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum
Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht oder auf den Träger der planaren Schicht ein Spritzensystem, ein Pin- Tool oder ein geeigneter Drackstempel sowie ein Jet-System sein kann.
19. System nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Detektor z.B. ein Vidicon-System, eine CCD-Kamera, ein Scanner, ein Phosphor- imager oder ein photographischer Film eingesetzt wird.
20. System nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung mittels Bildverarbeitung oder visuell erfolgt.
21. System nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Träger für die planare Schicht eine Dünnschichtchromatographieplatte oder einer Elektrophoreseschicht mit darauf deponierten Substanzzonen ist.
22. Teststreifen oder Sensor-Chip zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen enthaltend eine planare Schicht mit Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem, wobei nach dem Aufbringen der Prüfsubstanz auf den Teststreifen oder Sensor-Chip, und nachfolgender Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren
Schicht durch eine Anregungslichtquelle, und Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht mit einem Detektor, aus dem Detektorsignal der Grad der Photosynthese-Hemmung der Prüfsubstanz bestimmbar ist.
23.' Teststreifen oder Sensor-Chips nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die planare Schicht des Teststreifen oder Sensor-Chips aus Grünalgen in Agarose- oder Acrylatgelen oder anderen Gelmatrices oder viskosen Lösungen besteht.
24. Teststreifen oder Sensor-Chips nach Ansprach 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Zellen um avitale Zellen handelt, bei denen das Photosynthese II-System noch intakt ist.
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