DE4125904C2 - Verfahren zum Analysieren von Nucleinsäuren - Google Patents

Verfahren zum Analysieren von Nucleinsäuren

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren von Nucle­ insäuren, mit dem beispielsweise durch Fluoreszenz Nucleinsäu­ ren wirksam nachgewiesen werden können.
Auf den Fachgebieten der Medizin und der Biologie wird ein Ver­ fahren, bei dem beispielsweise eine DNA- (oder RNA-)Prüfsub­ stanz mit einem radioaktiven Isotop markiert wird, die markier­ te Prüfsubstanz mit einer Probenucleinsäure hybridisiert wird und die Probenucleinsäure dann durch Autoradiographie nachge­ wiesen wird, gegenwärtig in weitem Umfang durchgeführt.
Das Isotopenverfahren bringt jedoch viele Nachteile mit sich, die die Anwendung und die Entwicklung dieser Technik in bedeu­ tendem Maße behindern.
Das Isotopenverfahren hat die folgenden Nachteile:
  • (a) Bei der Nucleinsäurehybridisierung fehlt dem Verfahren eine räumliche Auflösung, die ausreicht, um die Lagebeziehung zwi­ schen benachbarten Signalen zu zeigen.
  • (b) Versuchsverfahren, bei denen Isotope verwendet werden, kön­ nen nur in Isotopenlaboratorien durchgeführt werden, die mit besonderen Einrichtungen ausgestattet sind. Dies ist eine Ursa­ che dafür, daß die Anwendung des Hybridisierungsverfahrens ins­ besondere auf klinische Untersuchungen behindert ist.
  • (c) Die Verwendung von Isotopen ist auch für Personen, die in Isotopenlaboratorien arbeiten, gefährlich. Außerdem besteht z. B. wegen Abfallsubstanzen auch immer eine Gefahr für Außen­ stehende.
  • (d) Für den Nachweis kann eine lange Zeit (mehrere Wochen bis mehrere Monate) erforderlich sein, so daß die Anwendung auf schnelle klinische Diagnosestellung schwierig ist.
  • e) Radioaktivität zerfällt mit einer bestimmten Halbwertszeit, so daß Versuche zeitlich derart angesetzt werden sollten, daß sie zu dem Kaufdatum des Isotops passen. Wenn man den Zeitplan ein wenig verändern würde, würde die Gefahr bestehen, daß in großem Maße Isotop vergeudet wird oder Versuchsergebnisse un­ brauchbar werden.
  • (f) Zum Erhöhen der Nachweisempfindlichkeit ist es erforder­ lich, in eine Nucleinsäureprüfsubstanz Radioaktivität in mög­ lichst hohem Grade einzubauen. Eine Nucleinsäure, die in genü­ gendem Maße markiert ist, um ihre Radioaktivität zu erhöhen, erfährt jedoch leicht radioaktiven Zerfall.
  • (g) Isotope sind im allgemeinen äußerst kostspielig, und es ist nicht ungewöhnlich, daß für eine Versuchsreihe Isotope im Wert von mehreren hundert Yen verwendet werden. Dies verhindert eine allgemeine Verbreitung des Hybridisierungsverfahrens.
Im Hinblick auf diese Voraussetzungen sind bisher einige Ver­ fahren zum Markieren von DNA oder RNA entwickelt worden, bei denen kein radioaktives Isotop verwendet wird. Es ist bei­ spielsweise BLU GENE KIT bekannt, das im Handel von Bethesda Research Laboratories Inc. (BRL Inc.) erhältlich ist. Ferner ist aus der JP-OS 60-226888 eine "Nucleinsäureprüfsubstanz und ihre Anwendung" bekannt.
Durch diese Verfahren wird jedoch nur ein Teil der vorstehend beschriebenen Nachteile beseitigt. Insbesondere ist die Nach­ weisempfindlichkeit mit der des Isotopenverfahrens nicht ver­ gleichbar.
D.h., bei der vorstehend erwähnten Markierung beträgt die Nach­ weisempfindlichkeit "10-12 g DNA" und ist daher etwas schlech­ ter als die "10-13 g DNA", die beim Isotopenverfahren erzielt werden.
In der DE-A- 40 41 880, eine nach Paragraph 3, Absatz 2, Nr. 1 PatG zu berücksichtigenden Dokument, wird ein Verfahren zur Prü­ fung von Nukleinsäuren unter Verwendung von Naphtol-AS-Derivat-Phosphat beschrieben, wobei jedoch 3-Hydroxy-2-Naphtoesäure-2′-Phenyl­ anilidphosphat nicht genannt ist.
In dem USP Nr. 48 89 798 ist ein Verfahren zum Nachweis von DNA und anderen biologischen Materialien vorgeschlagen, gemäß dem an eine DNA-Sonde ein Enzym, wie z. B. saure oder alkalische Phos­ phatase, gebunden wird. Der Nachweis der DNA-Probe erfolgt durch Umsetzung des Enzyms mit einem geeigneten Substrat. Die Verwendung von Naphtol-AS-Derivat-Phosphat kann dieser Druck­ schrift nicht entnommen werden.
Aus A. Vaughan at al.; Analytical Chemistry 43 (6) 1971, Seiten 721-724, ist der Einsatz von Naphthol-AS-Derivaten für die fluorometrische Analyse von saurer oder alkalischer Phosphatase bekannt. Jedoch wird auch hier nicht die Verwendung von 3-Hydroxy-2-Naphthoesäure-2′-Phenylanilidphosphat vorgeschlagen.
In Chemical Abstract 110 (1989): 228120q; H. Mullink et al. J. Histochem. Cytochem. 37 (5), 1989, Seiten 603-609, ist ein Ver­ fahren zum Analysieren von Nukleinsäuren bekannt, wobei eine Probe an Phosphatase gebunden und die Phosphatase mit Naphthol- AS-B I-Phosphat umgesetzt wird. Auch in dieser Druckschrift ist 3-Hydroxy-2-Naphthoesäure-2′-Phenylanilidphosphat nicht genannt.
Im Hinblick auf solche Probleme liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Analysieren von Nucleinsäuren be­ reitzustellen, das die Nachteile des Isotopenverfahrens wie z. B. die Notwendigkeit von Sicherheitsmaßnahmen beseitigt und ei­ ne ausgezeichnete Nachweisempfindlichkeit liefert.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Analysieren von Nucleinsäuren gelöst, gemäß dem eine Nukleinsäureprobe an Phosphatase gebun­ den, die Phosphatase mit einem Naphthol-AS-Derivat-Phosphat zur Reaktion gebracht, das Reaktionsprodukt mit einem anregenden Licht bestrahlt und eine daraus emittierte Fluoreszenz nachge­ wiesen wird, wobei als Naphthol-AS-Derivat-Phosphat 3-Hydroxy-2- Naphthoesäure-2′-phenylanilidphosphat eingesetzt wird.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nachstehend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläu­ tert.
Fig. 1 zeigt in Beispiel 1 ermittelte Versuchsergebnisse.
Fig. 2 zeigt weitere in Beispiel 1 ermittelte Versuchsergebnis­ se.
Das Hauptmerkmal der Erfindung besteht darin, daß ein 3-Hydro­ xy-2-naphthoesäure-2′-phenylanilidphosphat verwendet wird, an das Phosphatase gebunden ist, und daß Fluoreszenz nachgewiesen wird, die mittels einem angeregten Licht emittiert wird.
Zu Beispielen für die Phosphatase gehören alkalische Phosphata­ se und saure Phosphatase.
Zum Nachweis einer Probe im Rahmen der Erfindung gehören z. B. der Nachweis von Nucleinsäure (DNA oder RNA), der Nachweis von Protein und der immunologische Nachweis einer chemischen Ver­ bindung unter Anwendung von Antikörpern.
Ein Beispiel für ein 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-2′-phenylanilid­ phosphat ist das Grundgerüst, das durch folgende Formel gezeigt wird:
Bei dem erfindungsgemäßen Analysierverfahren wird das 3-Hydro­ xy-2-naphthoesäure-2′-phenylanilidphosphat mit der vorstehend beschriebenen Phosphatase zur Reaktion gebracht, worauf mit ei­ nem angeregten Licht bestrahlt wird, wodurch das Dephosphatie­ rungsprodukt des 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-2′-phenylanilidphos­ phats Fluoreszenz emittiert. Dann kann die emittierte Fluores­ zenz nachgewiesen werden.
Das vorstehend erwähnte 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-2′-phenylani­ lidphosphat wird mit der Phosphatase, die auf einem aus Nylon bzw. Polyamid hergestellten Membranfilter mit einer Probe (z. B. Nucleinsäuren) vereinigt ist, zur Reaktion gebracht, um ein De­ posphatierungsprodukt des 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-2′-phenyl­ anilidphosphats herzustellen, das an dem Polyamid-Membranfilter anhaftet und Fluoreszenz zeigt. Dann werden die Fluoreszenz und ihr Muster (Flecken und Streifen, die durch Elektrophorese er­ zeugt werden) durch Bestrahlen mit dem angeregten Licht nachge­ wiesen.
Im Rahmen der Erfindung kann durch Anwendung des vorstehend be­ schriebenen 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-2′-phenylanilidphosphats eine intensive Fluoreszenz erhalten werden, so daß die Nach­ weisempfindlichkeit verbessert werden kann; es sind beispiels­ weise 3·10-14 g (0,03 pg) DNA nachweisbar.
Im Rahmen der Erfindung wird kein Isotop verwendet, und deshalb können die Nachteile der bekannten Verfahren vermieden werden.
Folglich kann gemäß der Erfindung ein Verfahren zum Analysieren von Nucleinsäuren usw. bereitgestellt werden, das eine ausge­ zeichnete Nachweisempfindlichkeit liefern kann.
Ferner kann das Dephosphatierungsprodukt von 3-Hydroxy-2-naph­ thoesäure-2′-phenylanilidphosphat durch das erfindungsgemäße Verfahren in hoher Ausbeute hergestellt werden.
Beispiel 1
Um die Wirksamkeit von 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-2′-phenylani­ lidphosphat als Prüfsubstanz für Nucleinsäuren zu bestätigen, wurden eine DNA-Markierungs- und Nachweisausrüstung und das nachstehend beschriebene 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-2′-phenylanilid­ phosphat angewendet, um auf einem Polyamid-Membranfilter DNA nachzuweisen.
DNA wurde mit Digoxigenin (Dig) markiert, verdünnt und in Form von Flecken, auf das Polyamid-Membranfilter aufgetragen. Jeder der Flecke enthielt DNA von Heringsspermien in der Menge von 50 ng (50·10-9 g) als DNA ohne Besonderheiten.
Der vorstehend erwähnte Versuch wurde mit 0,08 bis 25 pg der Dig-markierten DNA durchgeführt, wie es in Fig. 1 gezeigt ist. In der Figur zeigt 0 pg einen Blindversuch. Die Versuchsergeb­ nisse sind in Fig. 1 gezeigt. Die Bezugszahl 1 bezeichnet ein Trägerfilter für eine Probe von Nucleinsäuren, und 11 bezeich­ net fluoreszenzsensibilisierte Bereiche. "+" bedeutet, daß die DNA nachgewiesen werden kann. "±" bedeutet, daß die DNA nicht deutlich nachgewiesen werden kann. "-" bedeutet, daß die DNA nicht nachgewiesen werden kann. Wie aus vorstehendem ersicht­ lich ist, konnte DNA sogar in der geringen Menge von 0,08 pg zufriedenstellend nachgewiesen werden.
Dann wurde in derselben Weise wie vorstehend beschrieben ein weiterer Versuch unter Verwendung geringerer Mengen der vorste­ hend erwähnten DNA, d. h., mit 0,015 bis 0,25 pg der Dig-mar­ kierten DNA, durchgeführt. Die Versuchsergebnisse sind in Fig. 2 in derselben Weise wie in Fig. 1 gezeigt. Wie in Fig. 2 ge­ zeigt ist, konnte bei 0,03 pg (30 fg) DNA ′ein zufriedenstellen­ der Nachweis erzielt werden.
Bei dem vorhergehenden Versuch wurde ein üblicher Farbentwick­ lungsnachweis unter Anwendung eines Azofarbstoffs, Fast Blue BB, durchgeführt. Als Ergebnis dieses Nachweises wurde erhalten, daß der nachweisbare Fleck 0,5 pg (0,5·10-12 g) der DNA enthielt.
Beispiel 2
Ein 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-2′-phenylanilidphosphat, wie es im Rahmen der Erfindung verwendet wird, wurde durch die folgen­ den Verfahrensschritte hergestellt:
Entsprechend er Beschreibung in Enzyme Histochemistry Burstone, M.S., S. 64-67, 83 (1962) wurden 5 g (0,027 mol) 2-Hydroxy-3-naphthoesäure, 40 ml wasserfreies Xylol und 0,023 mol 2-Aminobiphenyl in einem 100 ml fassenden, mit einem Grahamkühler ausgestatteten Rundkolben 10 min lang bei 80°C gerührt.
Dann wurden 0,01 mol Phosphortrichlorid dazugegeben. Die erhal­ tene Mischung wurde 2 h lang unter Rückfluß erhitzt. Danach wurde die Reaktionslösung in heißem Zustand dekantiert, um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Nach Abkühlen der Flüs­ sigkeit bei 4°C wurde die Flüssigkeit filtriert. Die auf diese Weise erhaltenen Niederschläge wurden mit Xylol und dann mit Wasser eluiert. Ferner wurden die Niederschläge mit 2%iger wäßriger Natriumcarbonatlösung neutralisiert, und Xylol wurde durch Kochen daraus entfernt.
Dann wurde der pH-Wert der Niederschläge mit 2%iger wäßriger Natriumcarbonatlösung auf 9 eingestellt, und die Niederschläge wurden filtriert und gekühlt. Die auf diese Weise erhaltenen Niederschläge wurden mit Wasser eluiert. Die Niederschläge wur­ den 3%iger HCl-Lösung zugesetzt, erhitzt, filtriert und dann gekühlt. Dann wurden die Niederschläge mit heißem Wasser gewa­ schen und getrocknet.
Die Niederschläge wurden dann umkristallisiert, wodurch 3-Hy­ droxy-2-naphthoesäure-2′-phenylanilid erhalten wurde, das durch die folgende Formel gezeigt wird:
1 g dieses Naphthol-AS-Derivats wurde in 8 ml Pyridin gelöst. Nach 30minütigem Rühren dieser Lösung bei 0°C wurde in dersel­ ben Weise gekühltes Phosphoryl(V)-chlorid (2,5 Äquivalente) da­ zugegeben und 4 h lang bei 0°C gerührt. Dann wurde der Lösung Eis zugesetzt, um die Reaktion zu beenden.
Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsprodukt wurde mit einer Kieselgelsäule mit umgekehrter Phase und dann mit einer Kiesel­ gelsäule mit normaler Phase gereinigt, wodurch 3-Hydroxy-2- naphthoesäure-2′-phenylanilidphosphat erhalten wurde, das durch die folgende Formel gezeigt wird:

Claims (1)

  1. Verfahren zum Analysieren von Nucleinsäuren, wobei eine Nu­ cleinsäureprobe an Phosphatase gebunden, die Phosphatase mit einem Naphthol-AS-Derivat-Phosphat zur Reaktion gebracht, das Reaktionsprodukt mit einem anregenden Licht bestrahlt und eine daraus emittierte Fluoreszenz nachgewiesen wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Naphthol-AS-Derivat-Phosphat 3-Hydroxy- 2-naphthoesäure-2′-phenylanilidphosphat eingesetzt wird.
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