DE69825758T3

DE69825758T3 - Annäherungs-szintillationstest

Info

Publication number: DE69825758T3
Application number: DE69825758T
Authority: DE
Inventors: A. Robert JESSOP
Original assignee: GE Healthcare Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1997-08-18
Filing date: 1998-08-17
Publication date: 2011-01-13
Anticipated expiration: 2018-08-18
Also published as: DE69825758T2; US7214539B2; WO1999009415A1; US20030152978A1; AU756423B2; DE69825758D1; ATE274189T1; US20070207547A1; US6524786B1; EP1007971B1; DK1007971T3; ES2227869T3; AU8742998A; JP3719932B2; EP1007971B2; US7081365B2; JP2001516028A; EP1007971A1; US20060141536A1

Description

Diese Erfindung betrifft Szintillationsproximitätstests, das heißt, Assays oder andere Experimente, die das Szintillationsproximitätsprinzip beinhalten.
Die gegenwärtige Szintillationsproximitätsassay(SPA)-technologie beinhaltet die Verwendung von Szintillanskügelchen, die aus entweder Cer-dotiertem Yttriumsilikat (Y₂SiO₅:Ce) (im folgenden einfach als Yttriumsilikat oder YSi bezeichnet) oder Polyvinyltoluol (PVT) erzeugt sind, das ein organisches Szintillans, wie PPO, enthält. Assays werden in wässrigen Puffer ausgeführt unter Verwenden von Radioisotopen, wie ³H, ¹²⁵I, ¹⁴C, ³⁵S oder ³³P, die eine Strahlung niedriger Energie emittieren, deren Energie in einer wässrigen Umgebung leicht abgeführt wird. Zum Beispiel besitzen die Elektronen, die von ³H emittiert werden, eine durchschnittliche Energie von nur 6 keV und besitzen eine sehr kurze Weglänge (~1 μm) in Wasser. Falls ein mit einem dieser Isotope gelabeltes (markiertes) Molekül an die Kügelchenoberfläche gebunden wird, entweder direkt oder über eine Wechselwirkung mit einem anderen, zuvor an das Kügelchen gekoppelten Molekül, wird die emittierte Strahlung das Szintillans aktivieren und Licht erzeugen. Die erzeugte Lichtmenge, die proportional zu der Menge von gelabelten, an die Kügelchen gebundenen Molekülen ist, kann leicht mit einem Flüssigkeitsszintillations(LS)zähler gemessen werden. Falls das gelabelte Molekül nicht an die Kügelchenoberfläche gebunden wird, wird seine Strahlungsenergie von dem umgebenden wässrigen Lösungsmittel absorbiert, bevor es das Kügelchen erreicht, und es wird kein Licht erzeugt. So ergeben gebundene Liganden ein Szintillationssignal, aber freie Liganden nicht, und die Notwendigkeit für einen zeitaufwändigen Trennschritt, der für die herkömmlichen Radioliganden-Bindungsassays kennzeichnend ist, wird eliminiert. Die in den Assays erforderlichen Manipulationen werden auf ein paar einfache Pipettierschritte reduziert, was zu einer besseren Präzision und Reproduzierbarkeit führt. Die Verwendung eines SPA-Assays wird zum Beispiel von Baum et al., Anal. Biochem. 237, 129–134, 1996 beschrieben.
PCT WO 91/08489 (Packard Instrument Company Inc.) beschreibt einen Trägerkörper zur Verwendung in einem Szintillationsproximitäts-Radioimmunoassay, wobei der Trägerkörper aus einem szintillierenden Material konstruiert ist, an dessen Oberfläche eine Vielzahl von Liganden, wie Antigene, Antikörper, etc. gekoppelt sind, die fähig sind, selektiv an einen Reaktanten von Interesse zu binden. Bevorzugt bestehen die Trägerkörper aus Yttriumsilikat, das mit einem anorganischen Cersalz, wie das Oxid, Carbonat oder Chlorid, aktiviert ist.
WO 94/26413 betrifft das Studium zellulärer und biochemischer Prozesse in lebenden Zellen oder in Komponenten von Zellen. Speziell sind Vorrichtungen und Verfahren zum Studium zellulärer und biochemischer Prozessen beschrieben, die das Szintillationsproximitätsprinzip verwenden.
Die Einfachheit des Szintillationsproximitätsformates ermöglicht eine fast vollständige Automatisierung von Assays unter Verwenden von Roboterprobenprozessoren und Mikrotiterplatten-Szintillationszählern. Folglich ist die SPA-Technologie zu hohem Durchsatz fähig, was im Falle von Arzneimittel- oder Proben-Sceeningassays besonders von Wert ist. SP-Assays wurden routinemäßig in 96-Wellmikrotiterplatten ausgeführt, die mit 6 Vertiefungen (wells) gleichzeitig in speziell entworfenen Mikrotiterplatten-Szitillationszählern gezählt werden. Die Suche nach einen zunehmend höheren Durchsatz führte die Hersteller dieser Zähler dazu, Instrumente zu erzeugen, die fähig sind, 12 Vertiefungen gleichzeitig zu zählen, und so den Durchsatz zu verdoppeln. Es wurden auch 384-Wellplatten eingeführt, obwohl diese zur Zeit immer noch nur mit 12 Vertiefungen gleichzeitig gezählt werden können.
Ein Problem assoziiert mit SPA ist dasjenige des Farbquenchens, verursacht durch die Anwesenheit von gefärbten Verbindungen im Assaymedium, die das durch die gegenwärtigen SPA-Kügelchenarten emittierte Licht absorbieren. Farbquenchen schwächt das Signal ab, wodurch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis und daher die Empfindlichkeit abnimmt. Viele der Proben, die mit SPA-Assays gescreent werden, sind gefärbt und die Mehrzahl davon sind gelb oder braun in Farbe und absorbieren Licht im blauen Bereich des sichtbaren Spektrums. Sowohl auf PVT, wie auch auf Y₂SiO₅:Ce basierende SPA-Kügelchen emittieren Licht im blauen Bereich (maximale Emission normalerweise im Bereich von 350 nm–450 nm) und sind so für diesen Effekt empfänglich.
Ein alternatives Detektionssystem, das zur Verwendung in Bildgebungsanwendungen niedriger oder ultraniedriger Lichtniveaus in den biologischen und biomedizinischen Wissenschaften geeignet ist, ist CCD(Charge Coupled Device)-Detektion, die zum Beispiel in Assays verwendet wurde, die chemilumineszente, biolumineszente und Fluoreszenz-Detektion beinhalten. Anwendungen umfassen Immunoassays (Hooper er al., J. Biolum. Chemilum., 9, 113–122, (1994)), und die Analyse spezifischer, Fluoreszenzfarbstoffgelabelter Nukleinsäuren durch Hybridisierung nach der Elektrophoresetrennung von Nukleinsäureproben ( EP 214713 für Astromed Ltd.). Ultraniedrig-Licht-Bildgebung unter Verwenden der CCD-Technologie ist quanitativ und schnell und die neue Generation von Bildgebungsinstumenten, die CCD-Kameras für Detektoren verwenden, können eine ganze Platte gleichzeitig zählen und besitzen so ein großes Potential für einen steigenden Probendurchsatz im Vergleich zu Mikrotiterwellplatten-Szintillationszählern. Flächenbildgebung, d. h. die gleichzeitige Bildgebung aller Vertiefungen in einer Mikrotiterwellplatte durch CCD wird als besonders vorteilhaft betrachtet, wenn sie im Zusammenhang mit Platten hoher Vertiefungsdichte verwendet wird, die 96, 384, 864 oder mehr Vertiefungen enthalten, da die Zeit, die zum Erstellen von Messungen erforderlich ist, beträchtlich verringert ist im Vergleich zu herkömmlichen Szintillationszähltechniken.
Bildgebungstechnologie, insbesondere Flächenbildgebung, wurde auch auf mit Isotopen gelabelten Materialien als eine Alternative zur Autoradiographie angewandt. Dieser Ansatz wurde am meisten weit in Anwendungen verwenden, wie die quantitative Analyse von Proteinen durch 2D-Gelelektrophorese (Patterson, et al., Biotechniques 15(6), 1076(1993)) und Rezeptorlokalisation (Tang, et al., Biotechniques, 18(5), 886, (1995)). Eine Bildgebungsplatte, die mit einem strahlungsempfindlichen Mittel (z. B. Strontiumsulfid/Samarium/Cer oder Bariumfluorbromid/Europium) beschichtet ist, wird einer radiogelabelten Probe ausgesetzt und ein Bild wird aufgrund der Strahlung gebildet, die auf der Lanthanidenmetallbeschichtung der Platte auftrifft. Nach der Bestrahlung wird das Bild mittels eines Bildgebungsplattenlesers gelesen.
Es wurde auch von der CCD-Detektion von SPA-Counts berichtet (Englert, D., Society for Biomolecular Screening, Second Annual Conference October 14–17 (1996), Seiten 209–221) unter Verwenden von auf PVT basierenden Mikrokugeln. Jedoch war die Photonenzählung aus den SPA-Vertiefungen nicht empfindlich genug, um zu ermöglichen, dass nutzbare Ergebnisse erhalten wurden, aufgrund der niedrigen Lichtausbeute der Kügelchen, suboptimaler Signaldetektionsfähigkeit des Systems, wie auch des Quenchens durch gefärbte Proben. Für herkömmliches Szintillationszählen können Instrumente kalibriert werden, um Farbquenchen zu berücksichtigen. Jedoch im Falle der CCD-Detektion unter Verwenden herkömmlicher SPA-Kügelchen und unter normalen Assaybedingungen war die Anzahl über einen Zerfall detektierter Photonen unzureichend, um die Bestimmung von Quenchausmaßen zu ermöglichen und eine Quenchkorrektur war nicht möglich. Bis heute scheint es keine Berichte von Arbeitsassays zu geben, in denen eine Probendetektion und -messung unter Verwenden dieser Technik erhalten wurde.
Die vorliegende Erfindung strebt danach, die doppelten Probleme der niedrigen Empfindlichkeit der gegenwärtigen, auf CCD basierenden Detektion, wie auch des Farbquenchens in der herkömmlichen SPA-Kügelchen-Technologie zu überwinden. Die Erfindung stellt die Verwendung eines Leuchtstoffs, der ein Emissionsmaximum von 480 nm–900 nm besitzt, und eines Ladungskoppelelements zum Detektieren einer Strahlung, die durch den Leuchtstoff emittiert wird, in einem Szintillationsproximitätstest bereit.
Ein Szintillationsproximitätstest ist ein Test, in dem eine Oberfläche, die einen Leuchtstoff trägt, mit einem Fluidkörper, der ein Radioisotop enthält, in Kontakt gebracht wird. Ein Teil des Radioisotops wird an der Oberfläche angrenzend immobilisiert; der Rest des Radiosisotops bleibt im Fluid verteilt oder gelöst. Die mittlere freie Weglänge von Elektronen oder anderen Teilchen oder Strahlung, die aus radioaktiven Zerfällen der Radioisotope resultiert, ist klein im Verhältnis zu den Abmessungen des Fluidkörpers, wodurch jener Teil des Radioisotops, der an der Oberfläche angrenzend immobilisiert ist, fähig ist, den von den Oberfläche getragenen Leuchtstoff auzuregen, aber jener Teil des Radioisotops, der im Fluid verteilt oder gelöst ist, ist allgemein zu weit von der Oberfläche entfernt, um fähig zu sein, von der Oberfläche getragenen Leuchtstoff anzuregen.
Die Oberfläche kann massiv sein, wie zum Beispiel die Wand eines Gefäßes oder Vertiefungen einer Multiwell- oder Mikrotiterplatte; oder teilchenförmig, wie zum Beispiel Fäden oder Kügelchen. Der Leuchtstoff kann als eine Beschichtung aufgebracht auf einer vorgeformten Oberfläche vorhanden sein; oder kann in der Oberfläche verteilt oder ein Teil von dieser sein.
Der Test kann ein chemischer oder biochemischer Assay sein, zum Beispiel ein Kompetitionsassay, wie ein Immunoassay oder ein immunmetrischer Assay. Oder der Test kann eine Studie von lebenden Zellen beinhalten, die an die Oberfläche, die den Leuchtstoff trägt, gebunden sind oder werden. Jedes Testsystem, in dem ein Radioisotop zwischen einer festen Phase und einer flüssigen Phase aufgeteilt wird, ist im Prinzip für das Verfahren der Erfindung geeignet.
Ein Radioisotop kann in freier Form oder kombinierter Form vorhanden sein, z. B. als ein Atom oder Ion; dies kann nützlich sein zum Beispiel wenn es erwünscht ist, die Aufnahme des Radioisotops durch Zellen, die an der den Leuchtstoff tragenden Oberfläche haften, zu überwachen. Oder das Radioisotop kann verwendet werden, um ein Assayreagens zu markieren; dies kann zum Beispiel nützlich sein, wenn ein gelabeltes Reagens dazu veranlasst wird, mit einem nicht gelabelten Reagens um das Binden an ein anderes Reagens, das auf der den Leuchtstoff tragenden Oberfläche immobilisiert ist, zu konkurrieren.
Ein Szintillationsproximitätstest kann in einer qualitativen oder üblicher in einer quantitativen Weise ausgeführt werden. Zum Beispiel können Messungen in einem statischen Modus ausgeführt werden, wie wenn das Ergebnis eines Kompetitionsassays nach einer festgesetzten Zeit oder im Gleichgewicht bestimmt wird. Alternativ kann ein Szintillationsproximitätstest in einem dynamischen Modus ausgeführt werden, wie wenn die Aufnahme von Radiolabeln durch Zellen in Echtzeit überwacht wird. WO 94/26413 beschreibt eine Szintillationsmikrotiterplatte und Verfahren zum Studieren zellulärer Prozesse in Echtzeit. Die Szintillationsmikrotiterplatte wird durch Amersham Lifescience unter dem Namen Cytostar-T^TM vermarktet.
Das Fluid ist allgemein eine wässrige oder eine andere Flüssigkeit. Das Radioisotop ist bevorzugt eines, das Elektronen mit einer mittleren freien Weglänge bis zu 2000 μm in wässrigem Medium emittiert. Diese schließen Isotope ein, die üblicherweise in der Biochemie verwendet werden, wie ³H, ¹²⁵I, ¹⁴C, ³⁵S, ⁴⁵Ca, ³³P und ³²P, schließen aber nicht die Verwendung anderer Radioisotope, wie ⁵⁵Fe, ⁸⁶Rb, ¹⁰⁹Cd und ⁵¹Cr, die auch Elektronen innerhalb dieses Bereiches emittieren, aus.
Der Szintillationsproximitätstest wird bevorzugt in den Vertiefungen einer Multiwellplatte, z. B. einer Mikrotiterplatte ausgeführt. Der Leuchtstoff kann als Kügelchen, die in die Vertiefungen einer derartigen Platte ausgegeben werden, bereitgestellt werden. Oder der Leuchtstoff kann in die Platte selbst eingebaut sein, entweder durch direkten Einbau in das Plastik der Platte oder durch Beschichten, zusammen mit einem Bindemittel. Beispiele möglicher Bindemittel sind Calciumsulfat, wie in der Herstellung der TLC-Platten verwendet, und niedrig schmelzende Plastikarten, wie Polystyrol oder Copolymere von α-Methylstyrol und Vinyltoluol. Diese Vorrichtungen können 24, 96 oder 384 Vertiefungen besitzen, wie in existierenden Platten oder können höhere Dichten von Vertiefungen haben, wie 864, 1536, 2400, 3456 oder tatsächlich jede erwünschte Anzahl. Sie können verwendet werden, um auf Zellen basierende oder Liganden-Bindungsassays im Zusammenhang mit auf einer CCD-Kamera basierenden Bildgebern auszuführen. Der Leuchtstoff besitzt bevorzugt ein Emissionsmaximum von 500 nm–700 nm, das heißt, um es auszusprechen, im grünen oder gelben oder roten Bereich des Spektrums. Die Leuchtstoffe werden von Elektronen niedriger Energie oder anderen Teilchen oder Strahlung stimuliert, die aus radioaktiven Zerfällen des Radioisotops resultieren. Diese Leuchtstoffe haben eine höhere Lichtausbeute als auf PVT basierende SPA-Kügelchen oder Y₂SiO₅:Ce-Kügelchen und ermöglichen, dass SPA-Assays erfolgreich abgebildet werden können. Außerdem können alle Probenvertiefungen einer Mikrotiterwellplatte gleichzeitig mittels einer CCD-Detektion abgebildet werden. Die längerwelligen grünen oder roten Emissionen schwächen das Farbquenchproblem ab, das im blauen Bereich des Spektrums am größten ist.
Manche Leuchtstoffe sind für industrielle Anwendungen kommerziell erhältlich, zum Beispiel in der Kathodenstrahlröhrentechnologie, Lampenleuchtstoffe und Röntgenstrahlungsleuchtstoffe. Siehe zum Beispiel Blasse und Grabmaier, Luminescent Materials, Springer-Verlag, Berlin, (1994) und US 5,435,937 . Die Herstellung von Ladungs-stabilisierten Suspensionen kleiner Leuchtstoffteilchen (z. B. Yttriumoxysulfid-Eu³⁺, Yttriumoxysulfid-Tb³⁺) und ihre Kopplung an Antikörper, um immunreaktive Konjugate zu ergeben, wurde beschrieben (Beverloo et al., Cytometry, 13, 561–570 (1992)). Die Leuchtstoffkonjugate wurden in immunocytochemischen Anwendungen durch Binden an Zellen verwendet, gefolgt von Visualisierung unter Verwenden eines Fluoreszenzmikroskops unter UV-Lichtanregung. Bis heute wurden jedoch derartige Leuchtstoffe nicht zur Verwendung in Zählanwendungen, in denen radioaktive Tracer involviert sind, insbesonderee SPA, beschrieben.
Es gibt viele geeignete Leuchtstoffe, die verwendet werden können. Manche bestehen aus einem anorganischem Wirtsmaterial dotiert mit einem Aktivator. Beispiele derartiger Wirtsmaterialien sind Yttriumsilikat, Yttriumoxid, Yttriumoxysulfid, Yttriumaluminiumgalliumoxid (YAG), Yttriumaluminiumgranat, Natriumyttriumfluorid (NaYF₄), Lanthanfluorid, Lanthanoxysulfid, Yttriumfluorid (YF₃), Yttriumgallat, Gadoliniumfluorid (GdF₃), Bariumyttriumfluorid (BaYF₅ oder BaY₂F₈), Gadoliniumoxysulfid, Zinksilikat, Zinksulfid und Yttriumvanadat. Der Aktivator ist allgemein eine Lanthaniden- oder Actinideneinheit.
Andere Leuchtstoffe sind organische Chelate von Lanthaniden- oder Actinideneinheiten. Die Lichtemission kann durch Kombinieren oder Mischen der Lanthaniden- oder Actinidenchelate mit einem Lewisbasenverstärker, wie zum Beispiel ein Imidophosphoran verstärkt werden. Beispiele von Leuchtstoffen dieser Art sind in EP A 556005 beschrieben. Sie können leicht in Lösung oder Dispersion in Polystyrol oder einem anderen organischen Polymer verwendet werden.
Die Identität der Lanthaniden- oder Actinideneinheit bestimmt die Emissionswellenlänge des Leuchtstoffes. Bevorzugte Einheiten sind ausgewählt aus Terbium, Europium, Erbium, Thulium, Holmium, Dysprosium, Samarium, Ytterbium, Lutetium, Gadolinium, Uran und Uranyl UO₂, allgemein in der Form von +2- oder +3-Ionen.
Es wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen.
1 zeigt ein mit CCD detektiertes Signal von anorganischen Leuchtstoffteilchen mit PVT-SPA-Kügelchen (PVT SPA) und Yttriumsilikatteilchen zum Vergleich.
2 zeigt ein mit CCD detektiertes Signal von Kügelchen aus organischem Chelat mit PVT-SPA-Kügelchen zum Vergleich.
3 zeigt Absorbanzspektren für Farbstoffe, die in Beispiel 2 verwendet wurden.
4 zeigt Emissiomsspektren für PVT-SPA-, Yttriumsilikatteilchen, Y₂O₃:Eu- und YAG:Tb-Teilchen.
5 zeigt eine Bewertung von mit Streptavidin beschichteten anorganischen Leuchtstoffteilchen in einem Reverse-Transkriptions-Szintillationsproximitätsassay detektiert durch ein CCD-Bildgebungssystem.
6 zeigt die Inhibierung der HIV Reverse Transkriptase durch Aurintricarbonsäure unter Verwenden von mit Streptavidin beschichteten Polystyrolkügelchen und CCD-Bildgebung.
7 zeigt einen Vergleich eines mit CCD detektierten Signales; von PST-WGA-beschichteten Kügelchen und ChOA1-Rezeptor/PIA-Agonist im [³⁵S]GTP_γS-G-Protein-Gekoppelt-Rezeptorassay mit einem Szintillationszählsignal von PVT-WGA-beschichteten SPA-Kügelchen.
8 zeigt die Inhibierung der [¹²⁵I]EGF-Bindung an WGA-beschichtete Polystyrolkügelchen unter Verwenden einer CCD-Bildgebung.
9 zeigt einen Vergleich der Signal-zu-Rausch-Verhältnisse, die von PST-Streptavidin-beschichteten Kügelchen und Streptavidin-beschichteten Leuchtstoffteilchen mit CCD-Bildgebung und PVT-Streptavidin-beschichteten SPA-Kügelchen und Szintillationszählung erhalten wurden.
10 zeigt einen Vergleich der Verwendung von 2% Gew./Gew. ALP-1-Mikroplatten und Cytostar-T-Platten, die verwendet wurden, um die Aufnahme von [¹⁴C]Thymidin in sich vermehrende Zellen zu überwachen, unter Verwenden eines CCD-Bildgebungssystems.
11 zeigt einen Vergleich der Verwendung von 2% Gew./Gew. ALP-1-Mikroplatten und Cytostar-T-Platten, die verwendet wurden, um die Aufnahme von [¹⁴C]Methionin in sich vermehrende Zellen zu überwachen, unter Verwenden eines CCD-Bildgebungssystems.
Beispiel 1
Vergleich eines mit CCD detektierten Signals von [3H]Biotin gebunden an mit Streptavidin beschichteten Leuchtstoffteilchen, mit Streptavidin beschichteten Polystyrolkügelchen, die organische Chelate von Europium und Terbium enthalten, und Streptavidin-SPA-Kügelchen.
Einleitung
Anorganische Leuchtstoffe Y₂O₃:Eu, Y₂O₂S:Eu und YAG:Tb und organische Chelatkügelchen hergestellt aus Polystyrol, das Tris(2,2,6,6-tetramethyl-3,5-heptandionat)terbium-III-diphenylphosphonimidotriphenylphosphoran (im Folgenden ALP-1 genannt) oder Tris(naphthoyltrifluoracetonat)europium-III-(diphenylphosphonimidotriphenylphosphoran)1 oder 2 (im Folgenden ALP-7 bzw. ALP-7-diphos genannt) enthielt, wurden mit Streptavidin oberflächenbeschichtet und wurden mit Streptavidin beschichteten Polyvinyltoluol(PVT)-SPA-Kügelchen und Streptavidin-beschichteten Yttriumsilikatteilchen in einem [³H]Biotin-Bindungsassay verglichen. Das Beschichten von Teilchen mit Proteinen, wie Streptavidin und anderen bioreaktiven Spezies entweder kovalent oder durch physikalische Adsorption wird durch traditionelle Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, ausgeführt.
Materialien und Verfahren
Anorganische Leuchtstoffe, die in Beispielexperimenten verwendet wurden, sind bekannte Materialien und wurden von kommerziellen Lieferanten in modifizierten Formen erhalten, um ihre Verwendung in Szintillationsproximitätsassays zu vereinfachen. Organische Chelatkügelchen wurden durch traditionelle Verfahren hergestellt, die den Fachleuten bekannt sind. Die für dieses Experiment verwendeten Teilchen sind für die CCD-Detektion der verschiedenen Reagenzien beispielhaft, sind aber nicht notwendigerweise optimale Formulierungen der genannten Reagenzien. Der CCD-Bildgeber, der in den folgenden Beispielen verwendet wurde, ist ein Prototypsystem geliefert von Molecular Devices Inc. und hat eine mit flüssigem Stickstoff gekühlte CCD-Kamera geliefert von Princeton Instruments Inc. eingebaut. Es wird erwartet, dass alternative CCD-Bildgebersdetektionssysteme in Entwicklung ähnliche relative Responsen mit den verschiedenen Arten von Teilchen und Platten mit erhöhter Empfindlichkeit ergeben. Für Beispiele, die Mikrotiterplatten mit weissen Wänden einsetzten, wurde ein geeigneter Bandpassfilter verwendet, um eine Phosphoreszenz von den Platten zu eliminieren.
Biotin-Bindungsassay
Streptavidin-beschichtete Teilchen und PVT-SPA-Kügelchen wurden in phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,4, die 0,01% Gew./Vol. Natriumazid (im Folgenden PBS-Azid genannt) mit 5 mg/ml enthielt, suspendiert. Stammlösungen von [³H]Biotin (Amersham TRK753) wurden in PBS-Azid aufgefüllt, um 5,1, 10,3 und 20,7 pmol Biotin in 100 μl zu enthalten. In die Vertiefungen einer schwarzen Mikroplatte wurden 100 μl-Proben von Teilchensuspensionen pipettiert. Teilchensuspensionen wurden mechanisch gemischt, um die Homogenität der Proben zu sichern. 100 μl jeder der drei [³H]Biotin-Lösungen wurden in die Vertiefungen, die die verschiedenen Teilchen enthielten, gegeben. Nach den Zugaben wurde die Platte verschlossen und dann auf einem Mikroplattenschüttelapparat 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das SPA-Signal wurde unter Verwenden eines CCD-Kamera-Bildgebungssystems detektiert. Eine nicht-spezifische Bindung von [³H]Biotin an Teilchen wurde durch Messen eines Signals, das in der Anwesenheit eines großen Überschusses nicht gelabelten Biotins detektiert wurde, untersucht. Für alle getesteten Teilchen war nicht-spezifisches Binden des [³H]Biotins nicht signifikant (nicht größer als 3% und typischerweise nicht größer als 1% des Signals von Kontrollvertiefungen).
Ergebnisse
Die Ergebnisse in 1 und 2 zeigen das Bildgebersignal, das unter Verwenden dreier Gehalte von [³H]Biotin, das an mit 500 μg Streptavidin beschichteten Leuchtstoffteilchen, Polystyrolteilchen, die organische Chelate von Europium und Terbium enthielten, und herkömmliche SPA-Teilchen gebunden war, erzeugt wurde.
Schlussfolgerungen
Die Daten in Beispiel 1 zeigen, dass das CCD-Bildgebersignal, das aus der [³H]Biotin-Bindung an mit Streptavidin beschichtetes Y₂O₂S:Eu, Y₂O₃:Eu und YAG:Tb erzeugt wurde, mindestens 10 mal höher war als das PVT-SPA-Signal. Polystyrol/ALP-7-diphos-Kügelchen erzeugen annähernd 3 mal das Signal der PVT-SPA-Kügelchen.
Beispiel 2
Farbquencheffekte von gelben, orange-farbenen und roten Farbstoffen in einem Modell-[³H]Biotin-Bindungsassay
Einleitung
Das Quenchen eines Signals (Counts) durch gefärbte Verbindungen ist ein gut bekanntes Phänomen in herkömmlichen Szintillationszählungen. Der spektrale Überlapp der Emissionen von szintillierenden Materialien mit den Absorbtionsspektren gefärbter Materialien ist eine Voraussetzung dafür, dass dies beobachtet wird. Farbstoffe wurden gewählt, um den Bereich der Probenfarben, die üblicherweise in SPA-Screeningassays angetroffen werden, abzudecken (siehe Farbstoffabsorptionsspektren in 3 mit den Emissionspektren von PVT-SPA, Yttriumsilikat, Y₂O₃:Eu und YAG:Tb in 4 als Referenz). Ein Modellassay wurde aufgebaut, um einen der Vorteile der Verwendung von langwellig emittierenden Teilchen für die Signaldetektion zu veranschaulichen, in der Anwesenheit von gefärbten Verbindungen mit einem CCD-Bildgeber.
Ein [³H]Biotin-Bindungsassay wurde verwendet, um den Effekt von gefärbten Verbindungen auf das Bildgebersignal zu bestimmen, das unter Verwenden von Leuchtstoffteilchen Y₂O₂S:Eu, Y₂O₃:Eu und YAG:Tb verglichen mit Yttriumsilikat und PVT-SPA-Kügelchen erzeugt wurde. Zusätzlich wurde das relative Quenchen von Organisch-Chelat-Polystyrol-Kügelchen mit PVT-SPA-Kügelchen verglichen.
Materialien und Verfahren
Mit Streptavidin beschichtete anorganische Leuchtstoffteilchen, organisches Chelat enthaltendes Polystyrol-, Yttriumsilikat- und PVT-SPA-Kügelchen wurden in PBS-Azid mit 5 mg/ml suspendiert.
Acid Yellow (Sigma A-4520) wurde in PBS-Azid mit 360 μg/ml aufgelöst.
Tartrazin (Sigma T-0388) wurde in PBS-Azid mit 214 μg/ml aufgelöst.
Methylorange (Sigma M-3132) wurde in PBS-Azid mit 196 μg/ml aufgelöst.
Neutral Red (Raymond and Lamb Charge 5769) wurde in PBS-Azid mit 234 μg/ml aufgelöst.
[³H]Biotin (Amersham TRK753) wurde in PBS-Azid auf 107 nM verdünnt.
Assayprotokoll
100 μl aliquote Teile jeder Kügelchensuspension (500 μg) wurde in die geeignete Anzahl von Vertiefungen schwarzer Mikroplatten pipettiert, gefolgt von 100 μl der Stammlösung von [³H]Biotin. Die Platten wurden annähernd 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert, um eine vollständige Bindung des Biotins an Teilchen zu ermöglichen. 10 μl der 4 Farbstofflösungen wurde in die Vertiefungen für jedes den getesteten Teilchen gegeben, wobei 10 μl Puffer in Kontrollvertiefungen zugegeben wurde. Die Platten wurden auf einem Mikroplattenschüttelapparat 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das SPA-Signal wurde unter Verwenden des CCD-Bildgebungssystems detektiert.
Die Farbstoffkonzentrationen in den Vertiefungen wurde auf Niveaus eingestellt, die eine Absorbanz im Bereich von 0,3 bis 0,5 bei der maximalen Absorptionswellenlänge für jeden Farbstoff ergab, wenn in einem 1 cm-Weglängen-Spektrometer gemessen wurde.
Ergebnisse

Die Ergebnisse, die in Tabelle 1 gezeigt sind, zeigen an, dass die Europium enthaltenden Leuchtstoffteilchen oder organische Chelatkügelchen kein Quenchen des Signals durch die in dem Experiment getesteten Farbstoffe zeigen. PVT-SPA-Kügelchen und Yttriumsilikatteilchen, wie sie in herkömmlichen SPA-Assays eingesetzt werden, zeigen ein merkliches Quenchen des Signals durch diese Farbstoffe. Terbium enthaltende Leuchtstoffteilchen und organische Chelatkügelchen werden in einem kleinen Ausmaß durch Neutral-Red-Farbstoff gequencht. Diese letztere Beobachtung würde aus dem Teilüberlapp des Absorptionsspektrums von Neutral Red mit dem Emissionsspektrum von Terbium erwartet werden. Tabelle 1

Vergleich des Quenchens eines mit CCD detektierten Signals von anorganischen Leuchtstoffen, organischen Chelatteilchen und PVT-SPA-Kügelchen und Yttriumsilikat durch gelbe, orangefarbene und rote Farbstoffe
Kügelchenart	Acid Yellow 25	Tartrazin	Methylorange	Neutral Red
Y₂O₃:Eu	Kein Quenchen	Kein Quenchen	1%	Kein Quenchen
YAG:Tb	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen
Y₂O₂S:Eu	3%	4%	Kein Quenchen	Kein Quenchen
YSi-SPA	26%	41%	23%	9%
PVT-SPA	19%	10%	11%	25%
ALP-7 (Eu-Chelat)	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen
ALP-1 (Tb-Chelat)	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen	10%
ALP-diphos-polystyrol (Eu-Chelat)	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen

Schlussfolgerung
Dieses Beispiel zeigte, dass Farbstoffe, die ein Absorptionsspektrum besitzen, das mit dem Emissionsspektrum der Szintillanzien in PVT-SPA-Kügelchen oder Yttriumsilikat überlappt, ein Quenchen des emittierten Lichtes von den genannten Spezien verursachen können, wenn sie durch gebundene Radiolabel angeregt werden. Das mit CCD detektierte Signal von Europium oder Terbium enthaltenden Leuchtstoffteilchen oder organischen Chelaten der genannten Materialien, die in polymeren Matrizen eingebaut sind, wurde nicht signifikant in Anwesenheit dieser Farbstoffe gequencht.
Beispiel 3
Bewertung der Konzentrationsabhängigkeit des Signalquenchens durch Tartrazin für anorganische Leuchtstoffteilchen, ALP-7-diphos-Kügelchen und PVT-SPA-Kügelchen und Yttriumsilikatteilchen
Einleitung
Ein Experiment wurde aufgebaut, um das Konzentrations-abhängige Quenchen eines Signals von den verschiedenen überprüften Teilchen zu vergleichen, wie sie durch einen CCD-Bildgeber und einen herkömmlichen Szintillationszähler detektiert werden.
Materialien und Verfahren
Mit Streptavidin beschichtete anorganische Leuchtstoffteilchen, ALP-7-diphos-(polystyrol)kügelchen, PVT-SPA-Kügelchen und Yttriumsilikatteilchen wurden in PBS-Azid mit 10 mg/ml suspendiert.
Tartrazin (Sigma T-0388) wurde in PBS-Azid mit 1070 μg/ml aufgelöst. [³H]Biotin (Amersham TRK 753) wurde in PBS-Azid auf 103 nM verdünnt.
Assayprotokoll
100 μl aliquote Teile von Teilchensuspensionen wurden die die geeignete Anzahl von Vertiefungen schwarzer Mikrotiterplatten pipettiert. 100 μl der Stammlösung von [³H]Biotin (10,3 pmol) wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden bei Umgebungstemperatur 60 Minuten lang inkubiert, um eine vollständige Bindung des Biotins an die Teilchen zu ermöglichen. Tartrazinlösung (1, 2, 4 oder 8 μl) wurde in geeignete Vertiefungen der Platte pipettiert, wobei PBS-Azid zugegeben wurde auf ein Endvolumen von 208 μl pro Vertiefung. Dreifache Datenpunkte wurden gebildet, um 5,1, 10,2, 20,4, bzw. 40,8 μg/ml Tartrazin zu enthalten. Die Platten wurden auf einem Mikroplattenschüttelapparat 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das SPA-Signal wurde unter Verwenden eines CCD-Bildgebungssystem detektiert. Die Platte wurde dann auf einem Wallac MicroBeta^TM-Szintillationszähler gezählt.
Ergebnisse

Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in Tabelle 2 gezeigt. Für Yttriumsilikatteilchen wird beobachtet, dass hohe Ausmaße des Signalquenchens bei der CCD-Detektion (33–58%) und auch unter herkömmlichen SPA-Zählbedingungen (54–82%) beobachtet wurden. Das beobachtete Ausmaß des Signalquenchens steht in Beziehung zu der Konzentration des vorhandenen Tartrazins, wobei steigende Quenchausmaße bei steigenden Gehalten von zugegebenem Tartrazin beobachtet wurden. Ein mit CCD detektiertes Signal für anorganische Leuchtstoffteilchen zeigt ein nicht signifikantes Quenchen des Signals beim höchsten Gehalt des verwendeten Farbstoffs (äquivalent zu annähernd einer Absorbanz, die mit 2 abzulesen ist, bei einem Wellenlängenmaximum in einem 1 cm-Weglängenspektrometer). Das Quenchen des mit CCD detektierten Signals von PVT-SPA-Kügelchen (2–15%) ist weniger ausgeprägt als dasjenige für Yttriumsilikatteilchen, ist aber noch signifikant. Herkömmliches Szintillationszählen von PVT-SPA-Kügelchen mit den 4 Gehalten des vorhandenen Tartrazins zeigt ein sehr starkes Signalquenchen (37–87%) und veranschaulicht das Erfordernis für eine Farbquenchkorrektur für herkömmliche SPA-Assays. ALP-7-diphospolystyrolkügelchen zeigen kein signifikantes Quenchen des mit CCD detektierten Signals in diesem Experiment (nicht größer als 4%). Tabelle 2

Quenchemission von SPA-Teilchen durch Tartrazin bei 4 verschiedenen Gehalten des Farbstoffs. Vergleich des Quenchens des Signals detektiert mit CCD-Detektion und durch einen Szintillationszähler.
Tartrazinkonzentration, μg/ml
CCD-Detektion	5,1	10,2	20,4	40,8
Y₂O₂S:Eu	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen
Y₂O₃:Eu	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen
YAG:Tb	Kein Quenchen	Kein Quenchen	Kein Quenchen	3%
YSi-SPA	33%	44%	52%	58%
ALP-7-diphos-polystyrol	Kein Quenchen	1%	4%	Kein Quenchen
PVT-SPA	2%	4%	6%	15%
Mikrobeta, SPA-Modus	5,1	10,2	20,4	40,8
YSi-SPa	54%	61%	73%	82%
PVT-SPA	37%	46%	69%	87%

Schlussfolgerungen
Farbquenchkorrektur ist notwendig, um erfolgreich SPA-Assays unter Verwenden von PVT-SPA-Kügelchen oder Yttriumsilikatteilchen auszuführen. Für anorganische Leuchtstoffe oder organische Chelatkügelchen, die Europium und Terbium enthalten, werden nicht signifikante Ausmasse des Quenchens beobachtet. Das Erfordernis für eine Farbquenchkorrektur mit diesen Materialien, falls CCD-Detektion eingesetzt wird, wird deshalb vermieden.
Beispiel 4
Assay der Reversen Transkriptase unter Einsatz von Streptavidin-beschichteten Leuchtstoffteilchen
Einleitung
Der Reverse-Transkriptase-Enzym-SPA-Assay (Amersham NK 8972) ist ein homogenes Assaysystem, das ein biotinyliertes DNS/RNS-Oligonukleotidenzymsubstrat verwendet, das auf Streptavidin-PVT-SPA-Kügelchen für eine Quantifizierung eingefangen ist. Streptavidinbeschichtete Y₂O₃:Eu- und YAG:Tb-Teilchen wurden mit Streptavidin-PVT-SPA-Kügelchen in diesem Assay verglichen.
Materialien und Verfahren
Reverse-Transkriptase-Assay
Biotinyliertes, fertig erhitztes Primer/Templat wurde in die Vertiefungen einer schwarzen Mikroplatte gegeben. Darauf folgte [³H]TTP (Amersham TRK576) in einer 75 nM Mischung von dATP, dCTP, dGTP und TTP gepuffert in 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 80 nM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 0,05% Gew./Vol. Nonidet P40. Die Reaktionen wurden mit der Zugabe von 0,075, 0,15 oder 0,3 Einheiten von HIV Reverse Transkriptase (Amersham T3610Y) initiiert. Die Platten wurden bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert und es wurde mit der Zugabe eines Stopreagens abgebrochen. 0,5 mg des geeigneten Streptavidin-beschichteten Leuchtstoffes oder PVT-SPA-Kügelchen wurden zugegeben und die Platten wurden bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubiert. Das erzeugte Signal wurde unter Verwenden des CCD-Bildgebungssystems detektiert.
Ergebnisse
Die Ergebnisse, veranschaulicht in 5, zeigen, dass der Einbau des radiogelabelten Nukleotids von der Menge des verwendeten Reverse-Transkriptase-Enzyms abhängig war. Die Daten zeigen, dass maximale Signale bei 3.200, 3.100 und 300 beobachtet wurden unter Verwenden von 0,3 Einheiten HIV Reverse Transkriptase in einem 30 Minuten-Assay mit Y₂O₃:Eu- und YAG:Tb- bzw. PVT-SPA-Kügelchen.
Schlussfolgerung
Dieses Beispiel zeigt, dass das CCD-Bilderzeugersignal, das im Reverse-Transkriptase-SPA-System erzeugt wurde, mindestens 10 mal höher war unter Verwenden von Y₂O₃:Eu- und YAG:Tb- als mit PVT-SPA-Kügelchen.
Beispiel 5
Assay der Inhibierung der Reversen Transkriptase durch Aurintricarbonsäure, unter Einsatz von Streptavidin-beschichteten Polystyrolkügelchen
Einleitung
Der Reverse-Transkriptase-Enzym-SPA-Assay (Amersham NK8972) ist ein homogenes Assaysystem, das ein biotinyliertes DNS/RNS-Oligonukleotidenzymsubstrat verwendet, das auf Streptavidin-PVT-SPA-Kügelchen für eine Quantifizierung eingefangen ist. In diesem Assay wurden Streptavidin-beschichtete organische Chelatkügelchen hergestellt aus Polystyrol (PST), das Europium enthielt, verwendet und die Inhibierung der Reversen Transkriptase durch Aurintricarbonsäure bestimmt.
Materialien und Verfahren
Reverse-Transkriptase-Assay
Biotinyliertes, fertig erhitztes Primer/Templat wurde in die Vertiefungen einer weissen Mikroplatte gegeben. Darauf folgte [³H]TTP (Amersham TRK576) in einer 127 nM Mischung von dATP, dCTP, dGTP und TTP gepuffert in Tris/HCl pH 8,0, 80 nM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 0,05% Gew./Vol. Nonidet P40. Aurintricarbonsäure mit Konzentrationen zwischen 0,05 und 1 μM wurde zugegeben und die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 0,05 Einheiten der HIV Reversen Transkriptase (Amersham T3610Y) initiiert. Die Platten wurden bei 37°C 20 Minuten lang inkubiert und es wurde mit der Zugabe eines Stopreagens abgebrochen. 0,1 mg Streptavidin-beschichtete PST-Kügelchen wurden zugegeben und die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Das erzeugte Signal wurde unter Verwenden des CCD-Bildgebungssystems detektiert.
Ergebnisse
Die Ergebnisse, veranschaulicht in 6, zeigen die Inhibierung der Aktivität der Reversen Transkriptase durch Aurintricarbonsäure. Die Daten zeigen, dass eine 85%-ige Inhibierung mit 1 μM des Inhibitors und ein IC₅₀-Wert von 0,23 μM bestimmt wurde. Dies ist vergleichbar mit dem Wert von 0,18 μM, der für den SPA-Assay bestimmt wurde.
Schlussfolgerung
Dieses Beispiel zeigt, dass Polystyrol-Europium-Kügelchen und ein bekannter Inhibitor der Reversen Transkriptase verwendet werden können, um IC₅₀-Werte im Reverse-Transkriptase-SPA-Assay mit CCD-Bildgebung zu bestimmen.
Beispiel 6
Bewertung des GTP_γS-G-Protein-Gekoppelt-Rezeptor-Assays unter Verwenden von Weizenkeim-Agglutinin(WGA)-beschichteten Polystyrolkügelchen
Einleitung
Der GTP_γS-G-Protein-Gekoppelt-Rezeptor-SPA-Assay (Amersham RPNQ0210) ist ein homogenes Assaysystem, das Weizenkeim-Agglutinin(WGA)-beschichtete PVT-SPA-Kügelchen verwendet, um einen Rezeptor zu binden. Agonist-induzierte oder Inverser-Agonist-induzierte Aktivität für Rezeptoren, die an GTP-Bindungsproteine (G-Proteine) gekoppelt sind, können direkt in Anwesenheit zugegebener [³⁵S]GTP_γS und GDP quantifiziert werden. Beschichtete organische Chelatkügelchen hergestellt aus Polystyrol (PST), das Europium enthielt, wurden daher mit WGA-beschichteten PVT-SPA-Kügelchen in diesem Assay verglichen.
Materialien und Verfahren
GTP_γS-G-Protein-Gekoppelt-Rezeptor-SPA-Assay
3,75 μg geklonter Rattenadenosin-A1-Rezeptor (BioSignal BSR-MA1R), 0,375 mg geeignete WGA-beschichtete Kügelchen, 10 μM (–)-N⁶-(2-phenylisopropyladenosin)(PIA)-Agonist, 5 μM GDP, +/–10 μM GTP_γS (um nicht spezifisches Binden zu bestimmen) und 0,2–0,4 nM [³⁵S]GTP_γS wurden in die Vertiefungen einer weißen Mikroplatte in ein Endvolumen von 50 μl des Assaypuffers gegeben, der 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 100 mM MgCl₂ und 1 mM EDTA pH 7,4 aufwies. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert und dann 10 Minuten lang bei 1200 UpM und 15°C zentrifugiert. Das erzeugte Signal wurde unter Verwenden des CCD-Bildgebungssystems detektiert.
Ergebnisse
Die Ergebnisse, veranschaulicht in 7, zeigen die Szintillationszähler- und Bildgebersignale, die in dem GTP_γS-G-Protein-Gekoppelt-Rezeptor-Assay in Anwesenheit und in Abwesenheit des PIA-Agonisten unter Verwenden WGA-beschichteter PST-Bildgeberkügelchen und PVT-SPA-Kügelchen erzeugt wurden. Die Daten zeigen, dass ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis im abgebildeten Assay erreicht werden kann, das ähnlich jenem ist, das in dem SPA-Assay erreicht wurde.
Schlussfolgerung
Dieses Beispiel zeigt, dass Polystyrol-Europium-Kügelchen mit einem [³⁵S]Radiolabel in einem miniaturisierten Rezeptorassay verwendet werden können, um ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu ergeben, das mit jenem, das mit herkömmlichem SPA erhalten wird, vergleichbar ist.
Beispiel 7
Assay der Bindung des Epidermalwachstumsfaktors (EGF) an den EGF-Rezeptor, unter Verwenden von Weizenkeim-Agglutinin(WGA)-beschichteten organischen Polystyrolkügelchen, die organische Chelate des Europiums enthalten
Einleitung
Die Wechselwirkung von [¹²⁵I]EGF (Amersham IM 196) mit dem EGF-Rezeptor (EGF-R) exprimiert durch die menschliche A431-Zelllinie kann unter Verwenden von SPA in einem homogenen Assaysystem studiert werden, in dem der Rezeptor auf WGA-beschichteten PVT-SPA-Kügelchen eingefangen ist. In diesem Assay wurden WGA-beschichtete organische Chelatkügelchen hergestellt aus Polystyrol (PST), das Europium enthielt, verwendet und die Inhibierung der [¹²⁵I]-Bindung durch nicht gelabeltes EGF bestimmt.
Materialien und Verfahren
EGF-Rezeptor-Assay
25 μg A431-Membran (inhouse-Herstellung) wurde an 0,25 mg WGA-beschichtete PST-Kügelchen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur vorgekoppelt. Dies wurde dann in eine weiße Mikroplatte übertragen und 400 pM [¹²⁵I]EGF (Amersham IM196) wurde in einem Assaypuffer zugegeben, der 20 mM HEPES pH 7,5, 2 mM CaCl₂, 0,1% (Gew./Vol.) BSA Fraktion V enthielt, mit nicht gelabeltem EGF bei Konzentrationen zwischen 0 und 100 nM. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 3 Stunden lang inkubiert und das erzeugte Signal unter Verwenden des CCD-Bildgebungssystems detektiert.
Ergebnisse
Die Ergebnisse, veranschaulicht in 8, zeigen die Inhibierung der [¹²⁵I]Bindung an WGA-beschichtete PST-Kügelchen. Von den Daten wurde ein IC₅₀-Wert von 5 nM bestimmt, was mit dem Wert von 2 nM bestimmt durch den SPA-Assay vergleichbar ist.
Schlussfolgerung
Dieses Beispiel zeigt, dass die Polystyrol-Europium-Kügelchen und nicht gelabeltes EGF verwendet werden können, um IC₅₀-Werte im [¹²⁵I]EGF-Rezeptor-Bindungsassay mit CCD-Bildgebung zu bestimmen.
Beispiel 8
Assay des Mitogen-Aktiviertes-Protein(MAP)-Kinase-Enzymassays unter Einsatz von Streptavidin-beschichteten organischen Polystyrolkügelchen und Streptavidinbeschichteten anorganischen Leuchtstoffteilchen
Einleitung
Der Mitogen-Aktiviertes-Protein(MAP)-Kinase-SPA-[³³P]Assay (Amersham RPNQ0220) ist ein homogenes Assaysystem, das Streptavidin-beschichtete PVT-SPA-Kügelchen verwendet, um [³³P]-gelabeltes biotinyliertes Myelin-Basic-Protein(bMBP)-Substrat zu binden. In diesem Assay wurden Streptavidin-beschichtete organische Chelatkügelchen, die aus Polystyrol (PST), das Europium enthält, hergestellt waren, und anorganische Leuchtstoffteilchen, die mit Europium dotiert waren, mit Streptavidin-beschichteten PVT-SPA-Kügelchen in diesem Assay verglichen.
Materialien und Verfahren
MAP-Kinase-Assay
Reaktionspuffer, der 50 pmol bMBP-Substrat, 25 pmol ATP, 250 nmol MgCl₂ und 50 mM MOPS enthielt, wurde in die Vertiefungen einer weißen Mikroplatte gegeben. 0,1 μCi [³³P]ATP (BF1000) und ERK-1-Enzym, mit 0,01 μg bis 2 μg, wurden dann zugegeben. Die Platten wurden bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert und die Reaktion durch Zugabe eines Stoppuffers abgebrochen, der 50 mM ATP und 0,25 mg jeder Kügelchenart enthielt. Die Platten wurden dann 10 Minuten lang bei 800 UpM und 15°C zentrifugiert. Das erzeugte Signal wurde unter Verwenden des CCD-Bildgebungssystems detektiert.
Ergebnisse
Die Ergebniusse, veranschaulicht in 9, zeigen die Signal-zu-Rausch-Verhältnisse, die in dem MAP-Kinase-Enzymassay unter Verwenden von Streptavidin-beschichteten PST und Leuchtstoffbildgeberkügelchen und PVT-SPA-Kügelchen erzeugt wurde. Die Daten zeigen, dass ein ähnliches oder besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis im abgebildeten Assay erreicht werden kann gegenüber jenem, das im SPA-Assay erreicht wurde.
Schlussfolgerung
Dieses Beispiel zeigt, dass sowohl Leuchtstoffteilchen, als auch Polystyrol-Europium-Kügelchen mit [³³P]-Radiolabeln in einem miniaturisierten Enzymassay verwendet werden können, um ein vergleichbares oder besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis gegenüber jenem, das mit herkömmlichem SPA erhalten wird, zu ergeben.
Beispiel 9
Vergleich von 2% Gew./Gew. ALP-1- und Cytostar-T-Mikroplatten, um die Aufnahme von [¹⁴C]Thymidin in sich vermehrende Zellen unter Verwenden eines CCD-Bildgebungssystems zu überwachen
Einleitung
Weiße 96-Wellmikroplatten, die hergestellt wurden, um das Szintillans ALP-1 in den Plattenboden einzubauen, wurden in Cytostar-T-Anwendungen bewertet. 2% Gew./Gew.-ALP-1-Platten wurden mit Cytostar-T-Platten in einem [¹⁴C]Thymidin-Aufnahmeassay unter Verwenden von adhärenten Zellen verglichen.
Materialien und Verfahren
Routine-Zellwachstumsbedinungen
V-79-Zellen (ECACC Nr. 86041102) ließ man routinemäßig bei 37°C in einem befeuchteten 5% CO₂-Inkubator in DMEM (ICN/FLOW 12-332-54), dem 10% FBS (GIBCO/BRL 10099-117), 2 mM L-Glutamin (ICN/FLOW 16-801-49), 50 IU/ml Penicillin und 200 μg/ml Streptomycin (ICN/FLOW 16-700-49) zugesetzt waren, wachsen. Für eine Routinesubkultur wurden Zellen bei einer Verdünnung von 1:20 bis 1:40 passagiert.
Thymidin-Aufnahmeassay
V-79-Zellen wurden mit 1 × 10⁴/Vertiefung in 2% Gew./Gew. ALP-1- und Cytostar-T-Platten geimpft und 24 Stunden lang bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert. Nach dieser anfänglichen Inkubierung wurde 0,5 μCi [¹⁴C]Thymidin (Amersham CFA532) zu den Zellen gegeben. Die Thymidinaufnahme wurde über 24 Stunden durch Zählen den Platten in Intervallen verfolgt. Die Platten wurden bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert, wenn sie nicht gezählt wurden. Das erzeugte Signal wurde unter Verwenden des CCD-Bildgebungssystems gezählt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse in 10 zeigen, dass die [¹⁴C]Thymidinaufnahme durch V-79-Zellen von der Zeitdauer der Inkubation abhing. Die maximalen Signale der [¹⁴C]Thymidinaufnahme von 5437 und 6953 wurden für 2% Gew./Gew. ALP-1- bzw. Cytostar-T-Platten nach 24 Stunden beobachtet.
Schlussfolgerung
Die Daten in diesem Beispiel zeigen, dass das CCD-Bildgebersignal, das in einem [¹⁴C]Thymidin-Aufnahmeassay unter Verwenden einer 2% Gew./Gew. ALP-1-Platte erzeugt wurde, mit dem Cytostar-T-Plattensignal vergleichbar war.
Beispiel 10
Vergleich von 2% Gew./Gew. ALP-1- und Cytostar-T-Mikroplatten, um die Aufnahme von [¹⁴C]Methionin in sich vermehrende Zellen unter Verwendung eines CCD-Bildgebungssystems zu überwachen
Einleitung
2% Gew./Gew. ALP-1-Platten wurden mit Cytostar-T-Platten in einem [¹⁴C]Methionin-Aufnahmeassay verglichen. Die Prozeduren und Bedingungen des Beispiels 9 wurden in diesem Experiment verwendet.
Materialien und Verfahren
Methionin-Aufnahmeassay
V-79-Zellen wurden mit 5 × 10³/Vertiefung in 2% Gew./Gew. ALP-1- und Cytostar-T-Platten geimpft und 24 Stunden lang bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert. Nach dieser anfänglichen Inkubierung wurde das Medium von den Vertiefungen abgesaugt und die Zellenmonolage wurde einmal mit steriler Phophatpuffersalzlösung gewaschen, 200 μl Methionin-verarmtes DMEM (ICN/FLOW 16-422-49), das 0,5 μCi [¹⁴C]Methionin enthielt, wurde zu den Zellen gegeben. Der Aufnahme folgte über 24 Stunden ein Zählen der Platten in Intervallen. Die Platten wurden bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert, wenn sie nicht gezählt wurden. Das erzeugte Signal wurde unter Verwenden des CCD-Bildgebungssystems gezählt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse in 11 zeigen, dass die [¹⁴C]Methioninaufnahme von der Zeitdauer der Inkubation abhing, wobei maximale Aufnahmesignale von 15865 und 18455 für 2% Gew./Gew. ALP-1- bzw. Cytostar-T-Platten nach 24 Stunden beobachtet wurden.
Schlussfolgerung
In diesem Beispiel zeigen die Ergebnisse, dass das CCD-Bildgebersignal, das in einem [¹⁴C]Methionin-Aufnahmeassay unter Verwenden einer 2% Gew./Gew. ALP-1-Platte beobachtet wurde, mit dem Cytostar-T-Plattensignal vergleichbar war.

Claims

Verwendung eines Leuchtstoffs in Szintillationsproximitätstests, der ein Emissionsmaximum von 480 nm–900 nm aufweist, und einer gekühlten ladungsgekoppelten Vorrichtung zum Detektieren vom Leuchtstoff ausgesendeter Strahlung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Szintillationsproximitätstest in Wells einer Multiwellplatte durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die ladungsgekoppelte Vorrichtung eingesetzt wird, um alle Wells der Multiwellplatte gleichzeitig abzubilden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Leuchtstoff ein Emissionsmaximum von 500 nm–700 nm aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Leuchtstoff ein anorganisches Wirtsmaterial ist, das mit einem Aktivator dotiert ist, der eine Lanthanid- oder Actinid-Einheit ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Leuchtstoff ein organisches Chelat einer Lanthanid- oder Actinid-Einheit ist.
Verwendung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei die Lanthanid- oder Actinid-Einheit ausgewählt ist aus Terbium, Europium, Erbium, Thulium, Holmium, Dysprosium, Samarium, Ytterbium, Lutetium, Gadolinium, Uran und Uranyl UO³⁺ ₂.
Verfahren zur Durchführung eines Szintillationsproximitätstests, durch Bereitstellen einer festen Oberfläche, die einen Leuchtstoff umfasst, in einem fluiden Medium, Bewirken, dass ein radiomarkiertes Reagens in zwei Fraktionen geteilt wird, die eine gebunden an die feste Oberfläche und die andere im fluiden Medium, und Detektieren der Fraktion des radiomarkierten Reagens, die an die feste Oberfläche gebunden ist, gekennzeichnet durch Verwenden eines Leuchtstoffs, der ein Emissionsmaximum von 480 nm–900 nm aufweist, und einer gekühlten ladungsgekoppelten Vorrichtung zum Detektieren vom Leuchtstoff ausgesendeter Strahlung.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Szintillationsproximitätstest in Wells einer Multiwellplatte durchgeführt wird und die ladungsgekoppelte Vorrichtung eingesetzt wird, um alle Wells der Multiwellplatte gleichzeitig abzubilden.
Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei der Leuchtstoff ein organisches Europiumchelat oder ein anorganisches Wirtsmaterial ist, das mit Europium dotiert ist.