JPH0627023A - 光バイオセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 励起光と、この励起光により発生する蛍光等
との分離を完全に行い、ノイズのない測定結果を得るこ
とのできる光センサーを提供する、 【構成】屈折率nd＝1.523の透明ガラス基板１３上にス
パッタ法により金属薄膜８として白金膜を5nmの膜厚で
形成し、これを作用極として電解重合を行った。参照電
極に飽和カロメル電極を用い、0.8V vs SCEの条件で、
グルコースオキシダーゼ 200mg/dl、ピロール 0.1M、
[Ｒu(phen)₃]Ｃl₂ 1M、及びＫＣl 1Mを含有する水溶液
を、通電量25C/cm²で電解し、2cm×3cmの面積に膜厚0.1
μmの薄膜を形成した。この透明基板１３を図２のよう
に配置し、励起光発生器１１としてハロゲンランプを用
い、入射角約75度で光照射を行った。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は発光物質の発光強度変化
により、特定物質の濃度を検出する光学的バイオセンサ
ーに関し、例えば生体液中の特定物質量を測定する臨床
化学分析に有用である。

【０００２】

【従来の技術】生体は無機物や有機物を高い選択性で認
識する能力を有している。その高い選択性を有する機能
性分子、或いは細胞、組織を始め生体そのものを物質選
択機能部位として、試料溶液中の検体を迅速に簡単に検
出するデバイスがバイオセンサーである。

【０００３】上記バイオセンサーの機能は、特定の検体
を選択的に認識して反応させる部分と、この反応による
検体の導伝性、発熱、発光等の変化を捉らえて信号に変
換する部分に分割して考える事ができる。検体を認識し
てこれと反応する生体高分子としては、酵素、抗体、受
容体等の蛋白質などが知られており、これらは天然高分
子や合成高分子から成る膜中や、ラングミュアーブロジ
ェット（ＬＢ）膜等の中に分散・固定化して用いられ
る。一方、反応を捉らえて信号に変換する部分には、一
般的に酸素電極、過酸化水素電極、イオン電極、ガス電
極などの電極が用いられている。また最近は光を利用し
たセンサー等が数多く提案されてきている。

【０００４】一方、光学的測定法は上記の電極を用いる
電気化学的測定法に比べて有利であり、(1)近年の技術
革新により微量の光を極めて高感度に検出することが可
能になったこと、(2)測定に際して電気的、磁気的ノイ
ズが発生しにくいこと等の特徴がある。中でも例えば特
開平3-128449号公報に見られるように蛍光、燐光（化学
発光、生物発光等）の検出が広く試みられている。また
励起光の照射や蛍光、燐光を検出する光伝導体として
は、(1)検体量が微少で済むこと、(2)装置の小型化が可
能になること、等から光ファイバーが多く用いられてい
る。

【０００５】光ファイバーを用いた光センサーとしては
図５に示したような構成が用いられる。即ち同図(a)は
１本の光ファイバー１の先端に分子認識機能膜２を設け
た構造であって、励起光３の照射と蛍光４の発光検出を
１本のファイバーで行う方法である。また(b)はＹ型の
光ファイバー１の先端に分子認識機能膜２を設けた構造
であって、一方のファイバーで励起光３を照射し、もう
一方のファイバーで蛍光４を検知する方法である。また
(c)は、励起光の分子認識機能膜への照射を他の手段で
行い、蛍光４のみを光ファイバー１の束で検知器５へ伝
導する方法である。さらに(d)は１本の光ファイバーの
コア部６の外壁に分子認識機能膜２を設け、コア部６内
に照射された光３の透過光量の変化やファイバー外への
発光を検知器５で検出する方法である。励起光と検出光
との分離は多種のカットフィルターを組合わせて行われ
る。

【０００６】また、前記分子認識機能膜を作成する際の
酵素等の固定化は、高分子膜担体への吸着、架橋、共有
結合、包括固定等の方法が行われてきた（「固定化生体
触媒」千畑著 講談社サイエンティフィック）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上述のカットフィルタ
ーによる方法では、照射する励起光と分子認識機能膜か
ら発生する蛍光、燐光等の検出光との分離は手間も掛か
り、しかも一般的にカットフィルターでは励起光よりも
波長の長い光しか検出できないといった難点があった。
また上述の酵素固定化方法では、膜を均一にしかも薄く
成膜することが困難であり、その結果、励起光が膜全体
に十分に達しなかったり、蛍光の検出が困難であった
り、膜の密着性が弱いといった難点があった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決すべく本
発明に係る光バイオセンサーは、透明基材上に、金属薄
膜、及び分子認識物質の作用によって蛍光、燐光等の発
光強度が変化する発光物質を含有する分子認識機能膜を
この順に積層し、この複合材の透明基材側に励起光発生
器を配置し、前記分子認識機能膜側に試料溶液の流路を
隔てて光検出器を配置した構造として、励起光と検出光
との完全分離を行うものである。

【０００９】

【作用】励起光によって薄膜金属裏面に発生したエバネ
ッセント波、及びこの波によって更に励起された表面プ
ラズモンの作用で、分子認識機能膜中に含まれる発光物
質から蛍光又は燐光が発せられる。分子認識機能物質が
試料中の特定物質を触媒すると、上記の蛍光等の発光強
度が変化するので、この変化を検知して特定物質の濃度
を測定する。

【００１０】

【実施例】以下に本発明の実施例を添付図面に基づいて
説明する。ここで、図１は本発明に基づく光センサーの
第１実施例を示す概要図である。透明基材として高屈折
率プリズム７を用い、このプリズムの一面には金属薄膜
８を蒸着させている。またこの金属薄膜８には更に分子
認識機能物質及び発光物質を含む分子認識機能膜９を電
解重合法によって形成し、分析試料液の流れる流路１０
に直接接して設置している。試料の測定時には、励起光
発生器１１から発せられた角度分布を持った光を、高屈
折率プリズム７によって全反射角以上の角度をもって金
属薄膜８へ照射する。このとき金属薄膜８の裏面に図示
しないエバネッセント波が発生し、この波及びこの波に
励起された表面プラズモンの作用によって発光物質から
蛍光が発生する。この蛍光を、流路１０を隔てて設置し
た光検出器１２によって検知する。光検出器１２は、エ
バネッセント波及び表面プラズモンの両波が直接受光さ
れない程度に離れて設置することにより、分子認識機能
膜９から発生した蛍光や燐光のみを検出することができ
る。

【００１１】上述の光検知機構を更に詳述すると以下の
通りである。即ち、励起光が透明基材を透過して全反射
角又はそれ以上の角度で金属薄膜８に入射するとき、エ
バネッセント波が発生してこの金属薄膜８を透過し、分
子認識機能膜９及び（場合によっては）分子認識機能膜
９に接触している測定物質を含む溶液中に弱い電界分布
を形成する。このエバネッセント波による電場が上記発
光物質の発光を誘起する。更に、励起光の入射角を調整
すると、上記エバネッセント波によって金属薄膜８と分
子認識機能膜９との界面に表面プラズモンを励起するこ
とができる（「表面プラズモンセンサー」No.112・O plu
s E p133）。この表面プラズモンの励起によって、エバ
ネッセント波による電場よりもさらに強い電場が形成さ
れ、蛍光等の発光強度を増大させることが可能である。
表面プラズモンを励起させるための入射角度は、温度や
誘電体の誘電率等の変動の影響を受けて大きく変化する
が、仮にこれらの変動に対応して入射角を変える機能を
持つ構成をとった場合、この機器は複雑且つ高価なもの
になると予想される。従って、本発明では、上記全反射
又はそれ以上の角度で、角度分布を持った光、即ち平行
光でない光を入射させることが好ましい。

【００１２】上記透明基材としては上述のような高屈折
率プリズムが好ましく、金属薄膜８は高屈折率プリズム
の一面に形成するのが便利である。また金属薄膜８と分
子認識機能膜９とを積層した平板を透明基材の１つとし
て用い、屈折率調整オイルを介して高屈折率プリズムと
接するようにすると、分子認識機能膜９の交換が容易に
行える利点があるためこの構成も好ましい。上記エバネ
ッセント波は事実上数百nm迄にしか及ばないため、金属
薄膜８と分子認識機能膜９との合計厚さが余り厚いと、
表面プラズモンを励起することができなくなり、蛍光等
の検出も困難になる。従って、本発明に用いられる金属
薄膜８と分子認識機能膜９は、エバネッセント波が十分
に到達するように極めて薄くする必要がある。金属薄膜
８の形成方法としては公知の真空蒸着法、スパッタ法等
がある。金属は種類は問わないが、例えば分子認識機能
膜９を隣接して形成する関係で、金属表面の親水性、疎
水性や、酸化膜の形成され易さ等を考慮する必要があ
り、また基材との密着性等も考えて選択する必要があ
る。このような金属としては例えば金、銀が挙げられ
る。

【００１３】分子認識機能膜９には公知の酵素、抗体等
のタンパク質を分子認識機能物質として使用することが
できる。また発光物質としては、公知の蛍光又は燐光を
発する物質を使用することができる。発光物質の例を挙
げると、フルオレセイン、チオフラビン、エオシン、ロ
ーダミンＢ等がある。励起光の照射は、使用する発光物
質の光学特性に合わせた光源を選択する必要がある。こ
れらの発光物質はエバネッセント波及びこれに励起され
た表面プラズモンによって発光するが、分子認識機能物
質が特定物質を触媒した際に、発光強度が低下又は増加
する。

【００１４】分子認識機能膜９に酵素等を固定するに
は、上記金属薄膜８を電極として電気的に吸着させる方
法、電極の表面を白金黒やパラジウム黒で改質して吸着
させる方法、フォトレジストによる方法、電解重合法、
ラングミュアーブロジェット（ＬＢ）法等が実施されて
いる。上記の電気的に吸着させる方法は、分子認識機能
物質に色素で標識する対処法はあるものの、強い電位依
存性があるため複数成分を吸着させるには適さない。ま
た上記改質法では吸着の制御が困難となる。更にフォト
レジスト法では酵素薄膜の端部の仕上りが悪くなる。従
って本発明では、特に電解重合法又はＬＢ法を用いるこ
とが、丈夫な極薄の分子認識機能膜９を形成できるとい
う理由から好ましい。

【００１５】上記電解重合法は、分子認識機能膜９の材
料となるモノマーの電気化学的酸化又は還元によって重
合を開始させ、上記金属薄膜電極表面に強く吸着した形
で薄膜を形成する方法である。金属薄膜８は作成する分
子認識機能膜９によって陽極、陰極のどちらにも用いる
ことができ、ポテンションスタットによる定電位条件や
ガルバノスタットによる定電流条件によって成膜され
る。本発明に係る上記モノマーとしてはピロール、チオ
フェン、アニリン及びその誘導体等が挙げられる。この
モノマー溶液に分子認識機能物質を溶解して共重合させ
たり、膜内に包括したりすることができる。この電解重
合法を採用すると、溶液の酸性度、モノマーの溶解性、
電解条件等によって、分子認識機能物質の包括状態、膜
の導電性や透過性などに種々の特性を持たせることがで
きる。また、必要な部位だけに膜を形成できること、膜
厚を通電量で制御できること、電極の形状や大きさに依
存しないこと等の有利な特徴がある。

【００１６】一方ＬＢ法は、分子内に親水性部位と疎水
性部位とを有する成膜成分を用いて、気液界面上に形成
された単分子膜を固体表面に累積する方法である。この
方法には、膜厚の調整を成膜成分分子の長さと累積膜数
とで制御できるため超薄膜が形成できること、成膜成分
分子を選択することにより分子配列を制御した層状組織
体を形成できること、複数の種類の成膜成分を使用して
多成分系の膜を形成できること等、形成される薄膜の機
能を分子のレベルで設計、制御できるという利点があ
る。ＬＢ法で気液界面状に展開、圧縮した単分子膜を金
属薄膜８上に転写する方法には、水平付着法と垂直浸漬
法とがあるが、金属薄膜８がプリズムに形成されている
場合には水平付着法が望ましい。一方金属薄膜８が透明
平板に形成されている場合は垂直浸漬法が適しており、
操作も単純化することができる。金属薄膜面はその表面
を親水性、疎水性のどちらにすることもでき、疎水性に
した場合には、成膜成分分子はその疎水性部位を基板に
向けて並び、親水成にした場合にはその親水性部位を基
板に向けて並ぶ。

【００１７】本発明に係る励起光発生器１１としては、
例えばハロゲンランプ、水銀ランプ、半導体レーザー、
ガスレーザー、ＬＥＤ等が好ましい。また発する光は可
視光線、紫外線、赤外線等上記エバネッセント波を生ず
るものであればどのようなものでもよい。また本発明に
係る光検出器１２としては蛍光、燐光の強度を検出でき
る例えば光電子倍増管、ＣＣＤ、フォトダイオードのよ
うなものが好ましい。

【００１８】図２は本発明に基づく光センサーの第２実
施例を示す概略図である。透明基材として高屈折率プリ
ズム７及び透明基板１３を用い、両者の間を屈折率調整
オイル１４で満たした。この透明基板１３の一面には前
もって金属薄膜８を蒸着させ、更に分子認識機能物質及
び発光物質を含む分子認識機能膜９をＬＢ法によって形
成しておいた。次に透明基板１３の分子認識機能膜９側
が、分析試料液の流れる流路１０に直接接するように設
置した。試料の測定時には、励起光発生器１１から発せ
られた角度分布を持った光を、高屈折率プリズム７、屈
折率調整オイル１４及び透明基板１３を透過させて全反
射角以上の角度をもって金属薄膜８へ照射した。このと
き発生した図示しないエバネッセント波及びこの波に励
起された表面プラズモンの作用によって、発光物質から
蛍光が発生した。この蛍光を、流路１０を隔てて設置し
た光検出器１２によって検知した。

【００１９】ところで、上記透明ガラス基板１３として
屈折率nd＝1.523のものを使用し、この上にスパッタ法
により金属薄膜８として白金膜を5nmの膜厚で形成し
た。次にこの金属薄膜８を作用極として電解重合を行っ
た。参照電極に飽和カロメル電極（ＳＣＥ）を用い、0.
8V vs SCEの条件で、分子認識機能物質としてのグルコ
ースオキシダーゼ 200mg/dl、膜材料としてのピロール
0.1M、発光物質としての[Ｒu(phen)₃]Ｃl₂ 1M、及び緩
衝剤としてのＫＣl 1Mを含有する水溶液を、通電量25C/
cm²で電解し、2cm×3cmの面積に膜厚0.1μmの薄膜を形
成した。

【００２０】この透明基板１３を図２のように配置し、
励起光発生器１１としてハロゲンランプを用い、入射角
約75度で光照射を行った。こうして得られた試料溶液中
のグルコース濃度の変化に対する発光量変化を図３に示
した。この結果グルコース濃度と発光量とは相関性があ
ることが分った。なおグルコース濃度の高い液ほど反応
による酸素消費量が多く、発光量が減少するため、図３
縦軸の発光量変化は、グルコース濃度０のときの発光量
（最大値）からグルコース濃度が高くなるに連れて減少
する発光量を差引いた値を用いたものである。

【００２１】更に今度は、屈折率nd＝1.523の透明ガラ
ス基板１３上に真空蒸着法により、金属薄膜８としてＣ
r（5nm厚さ）とＡu（50nm厚さ）をこの順に積層した。
次にこの金属薄膜８上にＬＢ法によってＹ型２層膜を形
成した。成膜成分としては、ジヘキサデシル-Ｎ-トリメ
チルアミノメチルカルボニルグルタメートブロマイド
（dihexamethyl-N-trimethylaminomethylcarbonylgluta
mate bromide）に発光物質としてのオクタデシル フル
オレッセン（octadecylfluorescein）及び分子認識機能
物質としてのペニシリナーゼを加えてクロロホルムを展
開液とした。また下水相は、導電率約17μS/cmの純水を
用い、表面圧25mN/mとした。

【００２２】この透明基板１３を図２のように配置し、
励起光発生器１１として水銀ランプを用い、入射角約75
度で光照射を行った。こうして得られた試料溶液中のペ
ニシリン濃度の変化に対する発光量変化を図４に示し
た。この結果ペニシリン濃度は発光量と相関性があるこ
とが分った。なおペニシリナーゼによってペニシリンが
ペニシロイック酸に変化するに伴って、水素イオン濃度
が高くなり発光量が低下する。従って図４縦軸の発光量
変化は、ペニシリン濃度０のときの発光量（最大値）か
らペニシリン濃度が高くなるに連れて減少する発光量を
差引いた値を用いたものである。

【００２３】

【発明の効果】以上に説明した如く本発明によれば、励
起光の入射側と発生する蛍光等の出射側とは金属薄膜で
完全に遮断されているため、励起光と、蛍光等との分離
を完全に行い、ノイズのない測定結果を得ることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に基づく光センサーを示す概要図

【図２】同、光センサーを示す概要図

【図３】本発明に基づく光センサーによって測定した、
発光量変化−グルコース濃度線図

【図４】同、発光量変化−ペニシリン濃度線図

【図５】従来の光センサーを示す概要図

【符号の説明】

１…光ファイバー、２…分子認識機能膜、３…励起光、
４…蛍光、５…検知器、６…コア部、７…高屈折率プリ
ズム、８…金属薄膜、９…分子認識機能膜、１０…流
路、１１…励起光発生器、１２…光検出器、１３…透明
基板、１４…屈折率調整オイル。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 透明基材上に、金属薄膜、及び分子認識
   物質の作用によって発光強度が変化する発光物質を含有
   する分子認識機能膜がこの順に形成され、前記透明基材
   側に励起光発生器が配置され、前記分子認識機能膜側に
   試料溶液の流路を隔てて光検出器が配置されていること
   を特徴とする光バイオセンサー。
2. 【請求項２】 前記分子認識機能膜は、電解重合法によ
   って前記金属薄膜上に形成されているを特徴とする請求
   項１に記載の光バイオセンサー。