JP2001516028A - シンチレーションプロキシミティー試験 - Google Patents

シンチレーションプロキシミティー試験

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、電荷結合素子をウェルのイメージに使用する、多ウェルプレートで行うシンチレーションプロキシミティーアッセイに関する。慣用の燐光体は青色光(３５０−４５０nm)を放出し、これは黄色または茶色アッセイ成分により吸収される。より長い波長(４８０−９００nm)の放射を放出する燐光体の使用により、この問題に取り組んだ。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、シンチレーションプロキシミティー試験、即ち、シンチレーション
プロキシミティー原理が関与するアッセイまたは他の実験に関する。
【０００２】 現在のシンチレーションプロキシミティーアッセイ(SPA)法は、セリウムドー プ処理したケイ酸イットリウム(Y2SiO5:Ce)(以後、単にケイ酸イットリウムまた
はYSiと呼ぶ)またはPPOのような有機シンチラントを含むポリビニルトルエン(PV
T)から製造されたシンチラントビーズの使用を含む。アッセイは、水性緩衝液中
、低いエネルギー放射を発し、そのエネルギーが水性環境中に容易に分散する3H
、125I、14C、35Sまたは33Pのような放射性同位体を使用して行う。例えば、3H により発せられる電子は、平均６KeVのエネルギーしか有さず、水中で非常に短 いパス長(〜１μm)である。これらの同位体の一つで標識されている分子がビー ズ表面に結合している場合、直接、または先にビーズに結合していた他の分子と
の相互作用を介して、発せられた放射がシンチラントを活性化し、光を産生する
。ビーズに結合した標識分子の量と比例した、産生された光の量は、簡便には液
体シンチレーション(LS)カウンターで測定できる。標識分子がビーズ表面に結合
していない場合、その放射エネルギーはそれがビーズに届く前に周りの水性溶媒
に吸収され、光は産生されない。従って、結合リガンドはシンチレーションシグ
ナルを発するが、遊離リガンドは発せず、慣用の放射性リガンド結合アッセイの
特徴である時間のかかる分離段階の必要性が除かれる。本アッセイに必要な操作
は、数回の単純なピペット操作段階にまで減少され、良好な正確さおよび再現性
を導く。
【０００３】 PCT WO91/08489(Packard Instrument Company Inc.)は、シンチレーションプ ロキシミティー放射免疫アッセイに使用する支持体を記載し、該支持体は、目的
の反応物と選択的に結合できる抗原、抗体等の多数のリガンドがその表面に結合
したシンチレーティング物質からなる。好ましくは、本支持体はオキサイド、カ
ーボネートまたはクロライドのような無機セリウム塩で活性化されたケイ酸イッ
トリウムを含む。
【０００４】 WO94/26413は、生存細胞または細胞の成分内の細胞性および生化学的過程の研
究に関する。具体的に、シンチレーションプロキシミティー原理を使用した細胞
性および生化学的過程の研究のための装置および方法が記載されている。
【０００５】 シンチレーションプロキシミティー形式の簡素性は、ロボットサンプルプロセ
ッサーおよびマイクロタイタープレートシンチレーションカウンターを使用した
アッセイの殆ど完全な自動化を可能にする。結果として、SPA法は、高い処理量 が可能であり、それは医薬−またはサンプル−スクリーニングアッセイで特に有
益である。SPアッセイは、慣用的に９６ウェルマイクロタイタープレートで行わ
れ、それは特に設計されたマイクロタイタープレートシンチレーションカウンタ
ーで同時に６ウェル計数される。より高い処理量の探求は、カウンターの製造者
に同時に１２ウェル計数できる、即ち、２倍の処理量の装置を製造させた。３８
４ウェルプレートの出現も見られるが、現在まだ同時に１２ウェルしか計数でき
ない。
【０００６】 SPAに付随する問題は、現在のSPAビーズタイプにより発せられる光を吸収する
着色化合物がアッセイ培体中に存在することによりもたらされる、色消失である
。色消失はシグナルを弱め、それによりシグナル対ノイズ比、従って感受性を減
少させる。SPAアッセイによりスクリーニングされるサンプルの多くが着色され 、これらの大半は色が黄色または茶色であり、可視スペクトルの青色領域の光を
吸収する。PVT−およびY2SiO5:Ce−ベースのSPAビーズは青色領域の光を発し(最
大放出は通常３５０nm−４５０nmの範囲である)、この効果に感受性である。
【０００７】 生物学的、および生物医学的科学における低から超低光レベルイメージング適
応への使用に感受性の別の検出システムは、例えば、化学ルミネセンス、バイオ
ルミネセンスおよび蛍光検出が関与するアッセイで使用されている、CCD(Charge
Coupled Device；電荷結合素子)検出である。適応は、免疫アッセイ(Hooper et
al., J. Biolum. Chemilum., 9, 113-122, (1994))、および核酸サンプルの電 気泳動的分離に続くハイブリダイゼーションによる特異的蛍光色素標識核酸の分
析(EP 214713, Astromed Ltd.)を含む。CCD法を使用した超低光イメージングは 、定量的であり、速く、新しい世代のイメージング装置であり、検出器のCCDカ メラは、同時にプレートの全体をイメージでき、マイクロタイターウェルプレー
トシンチレーションカウンターと比較して、サンプルの処理量増加に大きな可能
性を有する。領域イメージング、即ちマイクロタイターウェルプレートの全ての
ウェルのCCDによる同時のイメージングは、９６、３８４、８６４またはそれ以 上のウェルを含む高ウェル密度プレートと組合わせて使用するとき、測定をする
のに必要な時間が慣用のシンチレーション計数法と比較して有意に減少されるた
め、非常に有利であると見なされる。
【０００８】 イメージング法、特に領域イメージングはまたオートラジオグラフィーの別法
として、同位体標識物質にも適用される。この試みは、２−Dゲル電気泳動によ るタンパク質の定量的分析(Patterson, et al., Biotechniques, 15(6), 1076,
(1993))およびレセプター位置測定(Tang, et al., Biotechniques, 18(5), 886,
(1995))のような適用に最も広く使用されている。放射感受性試薬(例えば、硫 化ストロンチウム／サマリウム／セリウムまたはバリウムフルオロブロミド／ユ
ーロピウム)で被覆したイメージングプレートを、放射標識サンプルに暴露し、 イメージが、プレートのランタニド金属コーティング上の放射付随事象により形
成される。暴露に続き、イメージをイメージングプレートリーダーの手段で読む
。
【０００９】 PVT−ベースのマイクロスフェアを使用したSPA計数のCCD検出はまた報告され ている(Englert, D., Society for Biomolecular Screening, Second Annual Co
nference October 14-17, (1996), pp209-221)。しかし、ビーズの低い光放出、
システムの最適状態に及ばない検出能ならびに着色サンプルによる消失のために
、SPAウェルからの光子計数は、利用可能な結果を得るのに十分なほど感受性で はなかった。慣用のシンチレーション計数のために、装置は色素消失を考慮に入
れて補正できる。しかし、慣用のSPAビーズを通常のアッセイ条件下で使用したC
CD検出の場合、１崩壊当りに検出される光子の数は、消失レベルの検出を可能に
するには不十分であり、消失補正は不可能であった。今日まで、サンプル検出お
よび測定が、本方法を使用して得られた作業アッセイの報告はない。
【００１０】 本発明は、現在のCCD−ベースの検出の低感受性および慣用のSPAビーズ法の色
消失の二つの問題に打ち勝つために探求された。本発明は、４８０nm−９００nm
の放出最大を有する燐光体のシンチレーションプロキシミティー試験への使用、
および該燐光体により放出される放射を検出するための電荷結合素子の使用を提
供する。
【００１１】 シンチレーションプロキシミティー試験は、燐光体を担持する表面を放射性同
位体を含む一定容積の液体と接触させる、試験である。放射性同位体の一部が表
面に隣接して固定化される；残りの放射性同位体は液体中に分散または溶解した
ままである。電子または他の粒子の平均自由行程または放射性同位体の放射活性
崩壊に由来する放射は、液体の容積に比して小さく、それにより表面に隣接して
固定化された放射性同位体部分が表面が担持する燐光体を発光できるが、液体中
に分散または溶解した放射性同位体部分は、表面が担持する燐光体を発光するに
は、一般的に表面から遠すぎる。
【００１２】 表面は、例えば、管壁または多ウェルまたはマイクロタイタープレートの壁の
ように；または特に、例えば糸またはビーズのように塊であり得る。燐光体は、
予め形成された表面に適応されたコーティングとして存在し得る；または表面に
分散され、または表面を構成し、またはまたは形作り得る。
【００１３】 試験は、化学的または生化学的アッセイ、例えば、免疫アッセイまたはイムノ
メトリックアッセイのような競合アッセイであり得る。または、試験は、燐光体
を担持する表面と結合しているか、または結合するようになる生存細胞の研究に
関与し得る。放射性同位体が固相と液相の間で分布される試験系が、原則として
本発明の方法に適している。
【００１４】 放射性同位体は、遊離形でまたは、結合した形で、例えば、原子またはイオン
として存在し得る；これは、例えば、燐光体を担持する表面に接着した細胞によ
り取りこまれる放射性同位体の追跡が望ましい場合、有用であり得る。または、
放射性同位体は、アッセイ試薬の標識に使用し得る；これは、例えば、標識試薬
が燐光体を担持した表面に固定化された他の試薬への結合に関して、非標識試薬
と競合する場合、有用であり得る。
【００１５】 シンチレーションプロキシミティー試験は、定性的、またはより普通には定量
的方法で行い得る。例えば、測定は、静止モードで、競合アッセイの結果が一定
時間後または平衡で決定される場合のように、行い得る。あるいは、シンチレー
ションプロキシミティーアッセイは、動的モードで、細胞による放射標識がリア
ルタイムで追跡される場合のように行い得る。WO94/26413は、リアルタイムでの
細胞性処置の研究のためのシンチレーティングマイクロタイタープレートおよび
方法を記載する。シンチレーティングマイクロタイタープレートは、Amersham L
ifescienceから、Cytostar-T(商標)の名前で販売されている。
【００１６】 液体は、一般に水性または他の液体である。放射性同位体は好ましくは水性媒
体で２０００μmまでの平均自由行程を有する電子を放出するものである。これ らは、3H、125I、14C、35S、45Ca、33Pおよび32Pのような生化学で通常使用され
る同位体を含むが、またこの範囲の電子を放出する55Fe、86Rb、109Cdおよ51Cr のような他の放射性同位体を除外するものではない。
【００１７】 シンチレーションプロキシミティー試験は、好ましくは、例えば、マイクロタ
イタープレートのような多ウェルプレートのウェルで行う。燐光体はこのような
プレートのウェルに分配されたビーズとして提供される。または、燐光体は、プ
レートのプラスチックへの、結合剤との、直接挿入またはコーティングのいずれ
かによりプレートに取りこまれ得る。可能な結合剤の例は、tlcプレートの製造 に使用されるような硫酸カルシウム、およびポリスチレンまたはα−メチルスチ
レンとビニルトルエンのコポリマーのような低融点プラスチックである。これら
の装置は、プレートに存在する２４、９６または３８４ウェルを有し得るか、８
６４、１５３６、２４００ ３４５６、または実際任意の所望の数のような高密
度のウェルを有し得る。それらは、細胞−ベースのまたはリガンド結合アッセイ
を、CCDカメラベースのイメージャーにより行うために使用できる。燐光体は好 ましくは５００nm−７００nmの、即ち、緑色または黄色または赤色のスペクトル
内の放出最大を有する。燐光体は、低エネルギー電子または他の粒子により、ま
たは放射性同位体の放射性崩壊によりもたらされる放射により刺激される。これ
らの燐光体は、PVTベースSPAビーズまたはY2SiO5:Ceビーズよりも高い光アウト プットを有し、SPAアッセイが十分にイメージすることを可能にする。更に、マ イクロタイターウェルプレートの全てのサンプルウェルは、CCD検出の手段によ り同時にイメージできる。長い波長の緑色または赤色放出は、スペクトルの青色
領域で最大であった色消失問題を軽減する。
【００１８】 ある燐光体は、例えば、陰極線管法、ランプ燐光体およびX線燐光体における 、産業的適応のために商業的に入手可能である。例えば、BlasseおよびGrabmaie
r, Luminescent Materials, Springer-Verlag, Berlin, (1994)および米国特許 第5,435,937号参照。小燐光体粒子の電荷安定化懸濁液(例えば、イットリウム酸
硫化物−Eu3+、イットリウム酸硫化物−Tb3+)および免疫反応性複合体を得るた めのその抗体との結合が記載されている(Beverloo, et al., Cytometry, 13, 56
1-570 (1992))。燐光体複合体は、細胞への結合、続くUV光励起下での蛍光顕微 鏡の使用による可視化により免疫細胞化学的適用に使用されていた。今日まで、
しかしながら、このような燐光体は、放射活性トレーサー、特にSPAが関与する 計数適用への使用に関して記載されていない。
【００１９】 使用し得る多くの適当な燐光体が存在する。幾つかは、活性剤でドープ処理さ
れた無機宿主物質からなる。このような宿主物質の例は、ケイ酸イットリウム、
酸化イットリウム、イットリウム酸硫化物、イットリウムアルミニウムガリウム
オキサイド(YAG)、イットリウムアルミニウムガーネット、ナトリウムイットリ ウムフロライド(NaYF4)、ランタンフルオリド、サンタン酸硫化物、イットリウ ムフルオリド(YF3)、没食子酸イットリウム、ガドリニウムフルオリド(GdF3)、 バリウムイットリウムフルオリド(BaYF5またはBaY2F8)、ガドリニウム酸硫化物 、ケイ酸亜鉛、硫化亜鉛およびバナジウム酸イットリウムである。活性剤は、一
般にランタニドまたはアクチニド部分である。
【００２０】 他の燐光体は、ランタニドまたはアクチニド部分の有機キレートである。光放
出は、ランタニドまたはアクチニドキレートと、例えば、イミドホスホランのよ
うなルイス塩基エンハンサーと合わせるまたは混合することにより促進され得る
。この種の燐光体の例は、EPA556005に記載されている。それらは、簡便にはポ リスチレンまたは他の有機ポリマー中の溶液または分散として使用し得る。
【００２１】 ランタニドまたはアクチニド部分の同一性は、燐光体の放出波長により測定す
る。好ましい部分は、一般に、＋２または＋３イオンの形のテルビウム、ユーロ
ピウム、エルビウム、スリウム、ホルミウム、ジスプロシウム、サマリウム、イ
ッテルビウム、ルテシウム、ガドリニウム、ウラニウムおよびウラニルUO2から 選択される部分である。
【００２２】 添付の図面を言及する。 図１はPVT SPAビーズを有する無機燐光体粒子、および比較のためのケイ酸イ ットリウム粒子のCCD検出シグナルを示す。 図２は、比較のためのPVT SPAビーズを有する有機キレートビーズのCCD検出シ
グナルを示す。 図３は、実施例２で使用した色素の吸収スペクトルを示す。 図４は、PVT SPA、ケイ酸イットリウム粒子、Y2O3:EuおよびYAG:Tb粒子の放出
スペクトルを示す。 図５は、CCDイメージングシステムにより検出された逆転写シンチレーション プロキシミティーアッセイにおけるストレプトアビジン被覆無機燐光体粒子の評
価を示す。 図６は、ストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズおよびCCDイメージング を使用したアウリントリカルボン酸によるHIV逆転写酵素の阻害を示す。 図７は、[35S]GTPγS G-タンパク質結合レセプターにおけるPST WGA被覆ビー ズとChOA1レセプター／PIAアゴニスト由来のCCD検出シグナルと、PVT WGA被覆SP
Aビーズのシンチレーション計数シグナルの比較を示す。 図８は、CCDイメージングを使用したWGA−被覆ポリスチレンビーズへの[125I]
EGF結合の阻害を示す。 図９は、PSTストレプトアビジン−被覆ビーズおよびストレプトアビジン−被 覆燐光体粒子のCCDイメージングにより得た、およびPVTストレプトアビジン−被
覆SPAビーズおよびシンチレーション計数により得たシグナル対ノイズ比の比較 を示す。 図１０は、CCDイメージングシステムを使用した、増殖細胞における[14C]チミ
ジンの取りこみの追跡に使用した、２％w/w ALP-1マイクロプレートおよびCytos
tar-Tプレートの使用の比較を示す。 図１１は、CCDイメージングシステムを使用した、増殖細胞における[14C]メチ
オニンの取りこみの追跡に使用した、２％w/w ALP-1マイクロプレートおよびCyt
ostar-Tプレートの使用の比較を示す。
【００２３】 (実施例) 実施例１ ストレプトアビジン被覆燐光体粒子、ユーロピウムおよびテルビウムの有機キレ
ートを含むストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズならびにストレプトアビ
ジンSPAビーズに結合した[３H]ビオチン由来のCCD検出シグナルの比較 導入 無機燐光体Y2O3:Eu、Y2O2S:EuおよびYAG:Tbならびにトリス(２,２,６,６−テ トラメチル−３,５−ヘプタンジオナート)テルビウムIII−ジフェニル−ホスホ ノイミド−トリフェニルホスホラン(以後、ALP-1と呼ぶ)またはトリス(ナフトイ
ルトリフルオロアセトナート)ユーロピウムIII−(ジフェニル−ホスホンイミド トリフェニルホスホラン)１または２(以後、各々ALP-7またはALP-7-ジホスと呼 ぶ)を含むポリスチレンから製造した有機キレートビーズを、ストレプトアビジ ンで表面被覆し、ストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエン(PVT)SPAビーズと
ストレプトアビジン被覆ケイ酸イットリウム粒子を、[３H]ビオチンアッセイで 比較した。ストレプトアビジンのようなタンパク質および他の生物反応性種での
粒子の共有結合的または物理的吸着によるコーティングは、当業者に既知の伝統
的な方法で達成される。
【００２４】 材料および方法 実施例の実験に使用する無機燐光体は、既知の物質であり、シンチレーション
プロキシミティーアッセイへの使用を容易にするために、修飾形で販売業者から
得られる。有機キレートビーズは、当業者に既知の伝統的方法で製造されている
。本実験で使用する粒子は、異なる試薬のCCD検出を例示するが、必ずしも該試 薬の最良の調合物ではない。以下の実施例に使用するCCDイメージャーは、Molec
ular Devices Inc.により供給されるプロトタイプであり、Princeton Instrumen
ts Inc.により供給される液体窒素冷却CCDカメラを搭載する。開発中の別のCCD イメージャー検出システムは、異なるタイプの粒子およびプレートと増加された
感受性で同等な相関的な反応をすると予期される。例えば、白壁マイクロタイタ
ープレートの使用において、適当な帯域フィルターをプレートからの燐光の除去
に使用した。
【００２５】 ビオチン結合アッセイ ストレプトアビジン−被覆粒子およびPVT SPAビーズを、０.０１％w/vアジ化 ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水pH７.４(以後、PBSアジド)に５mg／mlで懸濁
させた。[３H]ビオチン(Amersham TRK753)の貯蔵は、５.１、１０.３および２０
.７pmoleのビオチンを１００μlに含むようにPBSアジド中に作った。黒色マイク
ロタイタープレートのウェル中に、粒子懸濁液の１００μlサンプルをピペット で移動させた。粒子懸濁液を機械的に撹拌して、サンプルの均質性を確実にした
。３種の[３H]ビオチン溶液各１００μlを異なる粒子を含むウェルに添加した。
添加に続いて、プレートを密封し、次いでマイクロプレートシェーカーで６０分
、室温でインキュベートした。SPAシグナルを、CCDカメライメージングシステム
を使用して検出した。粒子への[３H]ビオチン粒子の非特異的結合を、大過剰の 非標識ビオチンの存在下検出されるシグナルの測定により試験した。試験した全
ての粒子に関して、[３H]ビオチンの非特異的結合は微々たるものであった(コン
トロールウェルのシグナルの３％を超えず、典型的に１％を超えなかった)。
【００２６】 結果 図１および２の結果は、５００μgのストレプトアビジン被覆燐光体粒子、ユ ーロピウムおよびテルビウムの有機キレートを含むポリスチレン粒子および慣用
のSPA粒子に結合した３種のレベルの[３H]ビオチンを使用して発生したイメージ
ャーシグナルを示す。
【００２７】 結論 実施例１のデータは、ストレプトアビジン被覆Y2O2S:Eu、Y2O3:EuおよびYAG:T
bに結合した[３H]ビオチンから発生したCCDイメージャーシグナルが、PVT SPAシ
グナルより少なくとも１０倍高かったことを証明する。ポリスチレン／ALP-7ジ ホスビーズは、PVT SPAビーズの約３倍のシグナルを発生させる。
【００２８】 実施例２ モデル[３H]ビオチン結合アッセイにおける黄色、オレンジ色および赤色色素の 色消失効果 導入 着色化合物によるシグナル(計数)の消失は、慣用のシンチレーション計数では
既知の現象である。シンチレーション物質の放出と着色物質の吸収スペクトルの
スペクトル重複が、これが観察されるための必要条件である。色素は、SPAスク リーニングアッセイで通常遭遇するサンプル色の範囲をカバーするように選択さ
れる(参考として、図３の色素吸収スペクトルと図４のPVT SPA、ケイ酸イットリ
ウム、Y2O3:EuおよびYAG:Tbの放出スペクトルを参照)。モデルアッセイは、CCD イメージャーによる、着色化合物存在下の、シグナル検出のための長波長放出粒
子の使用の利点の一つを説明するために調整した。
【００２９】 [3H]ビオチン結合アッセイは、ケイ酸イットリウムおよびPVT SPAビーズと比 較した、燐光体粒子Y2O2S:EuおよびYAG:Tbを使用して発生したイメージャーシグ
ナルにおける着色化合物の効果の測定に使用した。更に、有機キレートポリスチ
レンビーズの相対的消失を、PVT SPAビーズと比較した。
【００３０】 材料および方法 ストレプトアビジン被覆無機燐光体粒子、ポリスチレンを含む有機キレート、
ケイ酸イットリウムおよびPVT SPAビーズを、５mg／mlでPBSアジドに懸濁させた
。 アシッドイエロー(Sigma A-4520)を３６０μg／mlでPBSアジドに溶解した。 タートラジン(Sigma T-03888)を２１４μg／mlでPBSアジドに溶解した。 メチルオレンジ(Sigma M-3132)を１９６μg／mlでPBSアジドに溶解した。 ニュートラルレッド(Raymond and Lamb lot 5769)を２３４μg／mlでPBSアジ ドに溶解した。 [3H]ビオチン(Amersham TRK753)を１０７nMまでPBSアジドで希釈した。
【００３１】 アッセイプロトコール 各ビーズ懸濁液(５００μg)の１００μlアリコートを、適当な数の黒色マイク
ロプレートにピペットで移し、続いて１００μlの[3H]ビオチンのストックをピ ペットで移した。プレートを約３０分、環境温度でインキュベートし、ビオチン
の粒子への結合を完了させた。４種の色素溶液の１０μlを、試験する粒子の各 々のウェルに添加し、１０μlの緩衝液をコントロールウェルに添加した。プレ ートをマイクロプレートシェーカーで、６０分、室温でインキュベートした。SP
AシグナルをCCDイメージングシステムを使用して検出した。 色素のウェル内濃度は、１cmパス長分光光度計で測定したとき、各色素の吸収
最大波長で０.３から０.５の範囲の吸収となるレベルに設定した。
【００３２】 結果 第１表に示す結果は、ユーロピウム含有燐光体粒子または有機キレートビーズ
が、本実験で試験した色素によるシグナルの消失は示さなかったことを示す。PV
T SPAビーズおよびケイ酸イットリウム粒子は、慣用のSPAアッセイで用いられる
ように、これらの色素によるシグナルの著しい消失を示す。テルビウム含有燐光
体粒子および有機キレートビーズは、ニュートラルレッド色素により僅かな程度
消失される。この後者の観察は、ニュートラルレッドの吸収スペクトルと、テル
ビウムの放出スペクトルの部分的重複により予期される。
【００３３】 第１表 黄色、オレンジ色および赤色色素による、無機燐光体、有機キレート粒
子およびPVT SPAビーズおよびケイ酸イットリウムからのCCD検出シグナルの消失
の比較
【表１】
【００３４】 結論 本実験は、PVT SPAビーズまたはケイ酸イットリウムにおいてシンチラントの 放出スペクトルと重複する吸収スペクトルを有する色素が、結合した放射性標識
により放出されるとき、該種の放出光の消失をもたらすことができることを証明
する。ユーロピウムまたはテルビウム含有燐光体粒子または重合物質内に包含さ
れた該物質の有機キレートのCCD検出シグナルは、これらの色素の存在下で有意 に消失されなかった。
【００３５】 実施例３ 無機燐光体粒子、ALP-7ジホスビーズおよびPVT SPAビーズならびにケイ酸イット
リウム粒子に関する、タートラジンによるシグナル消失の濃度依存性の評価 導入 実験は、CCDイメージャーおよび慣用のシンチレーションカウンターにより検 出されるものとして、調査中の異なる粒子由来のシグナルの濃度依存的消失の比
較のために調整した。
【００３６】 材料および方法 ストレプトアビジン被覆無機燐光体粒子、ALP-7-ジホス(ポリスチレン)ビーズ
、PVT SPAビーズおよびケイ酸イットリウム粒子を、１０mg／mlでPBSアジドに懸
濁させた。タートラジン(Sigma T-0388)をPBSアジドに1070Tg／mlで溶解させた 。[3H]ビオチン(Amersham TRK 753)をPBSアジドで１０３nMまで希釈した。
【００３７】 アッセイプロトコール 粒子懸濁液の１００μlアリコートを、黒色マイクロタイタープレートの適当 な数のウェルにピペットで移した。[3H]ビオチン(１０.３pmole)の貯蔵溶液１０
０μlを各ウェルに添加した。プレートを環境温度で６０分インキュベートし、 ビオチンの粒子への結合を完了させた。タートラジン溶液(１、２、４または８ μl)をプレートの適当なウェルにピペットで移し、PBSアジドを最終量２０８μl
／ウェルとなるように添加した。トリプリケートのデータ点を、各々５.１、１ ０.２、２０.４および４０.８μg／mlのタートラジンを含むように調整した。プ
レートをマイクロプレートシェーカーで、６０分、室温でインキュベートした。
SPAシグナルをCCDイメージングシステムを使用して検出した。次いで、プレート
をWallac MicroBeta(商標)シンチレーションカウンターで計数した。
【００３８】 結果 本実施例の結果を第２表に示す。ケイ酸イットリウム粒子に関して、高いレベ
ルのシグナル消失がCCD検出で(３３−５８％)およびまた慣用のSPA計数条件下で
(５４−８２％)見られた。シグナルの消失の観察されたレベルは、存在するター
トラジンの濃度と関連し、増加したレベルの消失が、添加したタートラジンの増
加したレベルで観察された。無機燐光体粒子のCCD検出シグナルは、使用した色 素の最高レベルで、シグナルの有意差のない消失を示した(１cmパス長分光光度 計において波長最大でほぼ２の吸光度読取と同等)。PVT SPAビーズからのCCD検 出シグナルの消失(２−１５％)は、ケイ酸イットリウムで観察されるものより明
らかではないが、まだ有意である。存在するタートラジンの４つのレベルでのPV
T SPAビーズの慣用のシンチレーション計数は、非常に高いシグナル消失(３７−
８７％)を示し、慣用のSPAアッセイに関する色消失補正の必要性を例示する。AL
P-7-ジホスポリスチレンビーズは、本実験でCCD検出シグナルの有意な消失を示 さない(４％より大きくない)。
【００３９】 第２表 ４つの異なるレベルの色素でのタートラジンによるSPA粒子の放出の消 失。CCD検出およびシンチレーションカウンターによる検出シグナルの消失の比 較。
【表２】
【表３】
【００４０】 結論 色消失補正は、PVT SPAビーズまたはケイ酸イットリウム粒子を使用したSPAア
ッセイを十分に行うために必要である。ユーロピウムおよびテルビウムを含む無
機燐光体または有機キレートビーズに関して、微々たるレベルの消失しか観察さ
れない。これらの物質での色消失補正の必要性が、CCDイメージャーを用いた場 合、従って除かれる。
【００４１】 実施例４ ストレプトアビジン被覆燐光体粒子を使用した逆転写酵素のアッセイ 導入 逆転写酵素SPAアッセイ(Amersham NK 8972)は、定量のためにストレプトアビ ジンPVT SPAビーズ上に捕獲されたビオチニル化DNA/RNAオリゴヌクレオチド酵素
基質を使用する、相同アッセイシステムである。ストレプトアビジン−被覆Y2O3 :EuおよびYAG:Tb粒子を、ストレプトアビジンPVT SPAビーズと本アッセイで比較
した。
【００４２】 材料および方法 逆転写酵素アッセイ ビオチニル化した、アニールの準備がされたプライマー／テンプレートを黒色
マイクロプレートのウェルに添加した。この後、５０mMトリス／HCl pH８.０、
８０mM KCl、１０mM MgCl2、１０mM DTTおよび０.０５％w/v Nonidet P40で
緩衝化したdATP、dCTP、dGTPおよびTTPの７５nM混合物中の[3H]TTP(Amersham TR
K576)に続いた。反応を、０.０７５、０.１５または０.３単位のHIV逆転写酵素(
Amersham T3610Y)の添加により開始した。プレートを３７℃で３０分インキュベ
ートし、停止試薬の添加により終了させた。０.５mgの適当なストレプトアビジ ン−被覆燐光体またはPVT SPAビーズを添加し、プレートを室温で１０分インキ ュベートした。産生したシグナルをCCDイメージングシステムを使用して検出し た。
【００４３】 結果 図５に図説する結果は、放射標識ヌクレオチドの取りこみが、使用した逆転写
酵素の量に依存したことを示す。データは、各々Y2O3:EuおよびYAG:TbおよびPVT
SPAビーズでの０.３単位のHIV逆転写酵素を使用した３０分のアッセイにおいて
、３,２００、３,１００および３００の最大シグナルが観察されたことを示した
。
【００４４】 結論 本実施例は、逆転写酵素SPAシステムで産生されたCCDイメージャーシグナルが
、Y2O3:EuおよびYAG:Tbを使用してPVT SPAビーズよりも少なくとも１０倍高かっ
たことを示す。
【００４５】 実施例５ ストレプトアビジン−被覆ポリスチレンビーズを使用した、アウリントリカルボ
ン酸による逆転写酵素阻害のアッセイ 導入 逆転写酵素SPAアッセイ(Amersham NK8972)は、定量のためにストレプトアビジ
ンPVT SPAビーズに捕獲されたビオチニル化DNA/RNAオリゴヌクレオチド酵素基質
を使用する、相同アッセイシステムである。本アッセイにおいて、ユーロピウム
を含むポリスチレン(PAT)から製造したストレプトアビジン−被覆有機キレート ビーズを使用し、アウリントリカルボン酸による逆転写酵素の阻害を測定した。
【００４６】 材料および方法 逆転写酵素アッセイ ビオチニル化した、アニールの準備がされたプライマー／テンプレートを白色
マイクロプレートのウェルに添加した。この後、トリス／HCl pH８.０、８０mM
KCl、１０mM MgCl2、１０mM DTTおよび０.０５％w/v Nonidet P40で緩衝化
したdATP、dCTP、dGTPおよびTTPの１２７nM混合物中の[3H]TTP(Amersham TRK576
)に続いた。０.０５から１μMの間の濃度のアウリントリカルボン酸を添加し、 ０.０５単位のHIV逆転写酵素(Amersham T3610Y)の添加により開始した。プレー トを３７℃で２０分インキュベートし、停止試薬の添加により終了させた。０. １mgのストレプトアビジン−被覆PSTビーズを添加し、プレートを一晩室温でイ ンキュベートした。産生したシグナルをCCDイメージングシステムを使用して検 出した。
【００４７】 結果 図６に図解する結果は、アウリントリカルボン酸による逆転写酵素活性の阻害
を示す。データは、１μMの阻害剤で８５％阻害が達成できることを示し、０.２
３μMのIC50値が決定された。これは、SPAアッセイで決定された０.１８μMの値
と同等である。
【００４８】 結論 本実施例は、ポリスチレンユーロピウムビーズと逆転写酵素の既知の阻害剤が
、CCDイメージングによる逆転写酵素SPAアッセイにおけるIC50値の決定に使用で
きることを示す。
【００４９】 実施例６ 小麦胚芽凝集素(WGA)−被覆ポリスチレンビーズを使用したGTPγS G−プロテイ ン結合レセプターアッセイの評価 導入 GTPγS G−プロテイン結合レセプターSPAアッセイ(Amersham RPNQ0210)は、レ
セプターの結合に小麦胚芽凝集素(WGA)−被覆PVT SPAビーズを使用する相同アッ
セイシステムである。GTP−結合タンパク質(G−プロテイン)に結合するレセプタ
ーのアゴニスト誘導またはインバースアゴニスト誘導活性を、直接、添加した[3 5 S]GTPγSおよびGDP存在下で定量できる。ユーロピウム含有ポリスチレン(PST) から製造した被覆有機キレートビーズを、従って、本アッセイで、WGA−被覆PVT
SPAアッセイと比較した。
【００５０】 材料および方法 GTPγS G−プロテイン結合レセプターSPAアッセイ ３.７５μgのクローン化ラットアデノシンA1レセプター(BioSignal BSR-MA1R)
、０.３７５mgの適当なWGA−被覆ビーズ、１０μMの(−)−N6−(２−フェニルイ
ソプロピル−アデノシン)(PIA)アゴニスト、５μMのGDP、±１０μMのGTPγS(非
特異的結合を測定するため)および０.２−０.４nMの[35S]GTPγSを白色マイクロ
プレートのウェルに、２０mM HEPES、１００mM NaCl、１０mM MgCl2および１
mM EDTA pH７.４を含むアッセイ緩衝液最終量５０μl中に添加した。プレート
を室温で３０分インキュベートし、次いで１０分、１２００rpmおよび１５℃で 遠心した。産生したシグナルは、CCDイメージングシステムを使用して検出した 。
【００５１】 結果 図７に図解する結果は、WGA−被覆PSTイメージャービーズおよびPVT SPAビー ズを使用したPIAアゴニストの存在下および非存在下のGTPγS G−プロテイン結 合レセプターSPAアッセイにおいて産生されたシンチレーションカウンターおよ びイメージャーシグナルを示す。データは、SPAアッセイで達成されるのと同等 なシグナル対ノイズ比が達成できることを示す。
【００５２】 結論 本実施例は、ポリスチレンユーロピウムビーズが、小型化レセプターアッセイ
において[35S]放射標識と共に使用でき、慣用のSPAで得られるのと同等なシグナ
ル対ノイズ比を得ることを示す。
【００５３】 実施例７ ユーロピウムの有機キレートを含む小麦胚芽凝集素(WGA)−被覆有機ポリスチレ ンビーズを使用した、EGFレセプターに結合した表皮成長因子(EGF)のアッセイ 導入 A431ヒト細胞系で発現される[125I]EGF(Amersham IM196)とEGFレセプター(EGF
-R)の相互作用は、レセプターがWGA−被覆PVT SPAビーズ上に捕獲された相同ア ッセイシステムで、SPAを使用して研究できる。本アッセイにおいて、ユーロピ ウムを含むポリスチレン(PST)から製造したWGA−被覆有機キレートビーズを使用
し、非標識EGFによる[125I]EGF結合の阻害を測定した。
【００５４】 材料および方法 EGFレセプターアッセイ ２５μgのA431膜(自家調製物)を、０.２５mgのWGA−被覆PSTビーズと、２時間
、室温で予備結合させた。次いで、これを白色マイクロプレートに移し、４００
pMの[125I]EGF(Amersham IM196)を、２０mM HEPES pH７.５、２mM CaCl2、０
.１％(w/v)BSAフラクションVを含むアッセイ緩衝液に、０から１００nMの間の濃
度のEGFと共に添加した。プレートを室温で３時間インキュベートし、産生した シグナルをCCDイメージングシステムを使用して測定した。
【００５５】 結果 図８に図解する結果は、WGA−被覆PSTビーズへの[125I]EGF結合の阻害を示す 。データから、５nMのIC50値が決定され、これはSPAアッセイで決定された２nM の値と同等である。
【００５６】 結論 本実施例は、ポリスチレンユーロピウムビーズおよび非標識EGFが、CCDイメー
ジングによる[125I]EGFレセプター結合アッセイにおけるIC50の測定に使用でき ることを示す。
【００５７】 実施例８ ストレプトアビジン−被覆有機ポリスチレンビーズおよびストレプトアビジン−
被覆無機燐光体粒子を使用した、マイトージェン活性化タンパク質(MAP)キナー ゼ酵素アッセイの評価 導入 マイトージェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼSPA[33P]アッセイ(Amersham R
PNQ0220)は、[33P]標識ビオチニル化ミエリン塩基性タンパク質(bMBP)基質に結 合するストレプトアビジン−被覆PVT SPAビーズを使用した相同アッセイシステ ムである。本アッセイにおいて、ユーロピウムを含むポリスチレン(PST)から製 造したストレプトアビジン−被覆有機キレートビーズおよびユーロピウムでドー
プ処理した無機燐光体粒子を、本アッセイでストレプトアビジン−被覆PVT SPA ビーズと比較した。
【００５８】 材料および方法 MAPキナーゼアッセイ ５０pmolのbMBP基質、２５pmolのATP、２５０nmol MgCl2および５０mM MOPS
を含む反応緩衝液を、白色マイクロプレートのウェルに添加した。０.１μCiの[ 33 P]ATP(BF1000)および０.０１μgから２μgのERK-1酵素を次いで添加した。プ レートを３７℃で３０分インキュベートし、５０mM ATPおよび０.２５mgの各ビ
ーズタイプを含む停止緩衝液の添加により反応を停止させた。プレートを次いで
１０分、８００pmで１５℃で遠心した。産生したシグナルをCCDイメージングを 使用して検出した。
【００５９】 結果 図９に図説する結果は、ストレプトアビジン−被覆PSTおよび燐光体イメージ ャービーズおよびPVT SPAビーズを使用したMAPキナーゼ酵素アッセイで産生され
るシグナル対ノイズ比を示す。データは、SPAアッセイで達成されるのと同等か 、それより良好なシグナル対ノイズ比が本アッセイで達成できることを示す。
【００６０】 結論 本実施例は、両方の燐光体粒子およびポリスチレンユーロピウムビーズが、小
型化酵素アッセイで[33P]放射標識と共に使用でき、慣用のSPAで得られるのと同
等な、または良好なシグナル対ノイズ比を得ることを示す。
【００６１】 実施例９ CCDイメージングシステムを使用した、増殖している細胞における[14C]チミジン
の取りこみの追跡における２％w/w ALP-1およびCytostar-Tマイクロプレートの
比較 導入 シンチラントALP-1をプレート基底に挿入するように製造した白色９６ウェル マイクロプレートを、Cytostar-T適応において評価した。２％w/w ALP-1プレー
トを、接着性細胞を使用した[14C]チミジン取りこみにおいてCytostar-Tプレー トと比較した。
【００６２】 材料および方法 慣用の細胞生育条件 V-79細胞(ECACC no.86041102)を慣用的に３７℃で、加湿した５％CO2インキュ
ベーターで、１０％FBS(GIBCO/BRL 10099-117)、２mM L−グルタミン(ICN/FLOW
16-801-49)、５０IU／mlペニシリンおよび２００μg／mlストレプトマイシン(I
CN/FLOW／ 16-700-49)を添加したDMEM(ICN/FLOW 12-332-54)中で生育させた。慣
用的植え継ぎに関して、細胞を１：２０から１：４０希釈で継代した。
【００６３】 チミジン取り込みアッセイ V-79細胞を、１×１０4／ウェルで２％w/w ALP-1およびCytostar-Tプレート に蒔き、２４時間、３７℃で５％CO2でインキュベートした。この最初のインキ ュベーションに続いて、０.５μCi[14C]チミジン(Amersham CFA532)を細胞に添 加した。チミジン取り込みを、一定間隔でプレートを計数することにより２４時
間にわたり追跡した。プレートを計数しないときは、３７℃で５％CO2でインキ ュベートした。産生されたシグナルを、CCDイメージングシステムを使用して計 数した。
【００６４】 結果 図１０の結果は、V-79細胞による[14C]チミジン取りこみが、インキュベーシ ョンの時間に依存することを示した。５４３７および６９５３の最大[14C]チミ ジン取りこみが、各々２％w/w ALP-1およびCytostar-Tプレートで２４時間後に
観察された。
【００６５】 結論 本実験のデータは、２％w/w ALP-1プレートを使用した[14C]チミジン取りこ みアッセイで産生されるCCDイメージャーシグナルが、Cytostar-Tプレートと同 等であったことを示す。
【００６６】 実施例１０ CCDイメージングシステムを使用した、増殖している細胞における[14C]メチオニ
ンの取りこみの追跡における２％w/w ALP-1およびCytostar-Tマイクロプレート
の比較 導入 ２％w/w ALP-1プレートを、[14C]メチオニン取りこみにおいてCytostar-Tプ レートと比較した。実施例９の方法および条件を本実験で使用した。
【００６７】 材料および方法 メチオニン取り込みアッセイ V-79細胞を、５×１０3／ウェルで２％w/w ALP-1およびCytostar-Tプレート に蒔き、２４時間、３７℃で５％CO2でインキュベートした。この最初のインキ ュベーションに続いて、培地をウェルから吸引し、細胞単層を１回滅菌リン酸緩
衝化食塩水で洗浄した。０.５μCi[14C]メチオニンを含む２００μlのメチオニ ン枯渇DMEM(ICN/FLOW 16-422-49)を細胞に添加した。取り込みを、一定間隔でプ
レートを計数することにより２４時間にわたり追跡した。プレートを計数しない
ときは、３７℃で５％CO2でインキュベートした。産生されたシグナルを、CCDイ
メージングシステムを使用して計数した。
【００６８】 結果 図１１の結果は、[14C]メチオニン取りこみがインキュベーションの時間に依 存し、１５８６５および１８４５５の最大取りこみシグナルが、各々２％w/w A
LP-1およびCytostar-Tプレートで２４時間後に観察されたことを示す。
【００６９】 結論 本実験において、結果は、２％w/w ALP-1プレートを使用した[14C]メチオニ ン取りこみアッセイにおいて観察されるCCDイメージャーシグナルが、Cytostar-
Tプレートと同等であったことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 PVT SPAビーズを有する無機燐光体粒子、および比較のためのケ イ酸イットリウム粒子のCCD検出シグナルを示す。
【図２】 比較のためのPVT SPAビーズを有する有機キレートのCCD検出シグ
ナルを示す。
【図３】 実施例２で使用した色素の吸収スペクトルを示す。
【図４】 PVT SPA、ケイ酸イットリウム粒子、Y2O3:EuおよびYAG:Tb粒子の
放出スペクトルを示す。
【図５】 CCDイメージングシステムにより検出された逆転写シンチレーシ ョンプロキシミティーアッセイにおけるストレプトアビジン被覆無機燐光体粒子
の評価を示す。
【図６】 ストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズおよびCCDイメージ ングを使用したアウリントリカルボン酸によるHIV逆転写酵素の阻害を示す。
【図７】 [35S]GTPγS G-タンパク質結合レセプターにおけるPST WGA被覆 ビーズとChOA1レセプター／PIAアゴニスト由来のCCD検出シグナルと、PVT WGA被
覆SPAビーズのシンチレーション計数シグナルの比較を示す
【図８】 CCDイメージングを使用したWGA−被覆ポリスチレンビーズに結合
した[125I]EGF結合の阻害を示す。
【図９】 PSTストレプトアビジン−被覆ビーズおよびストレプトアビジン −被覆燐光体粒子のCCDイメージングにより得た、およびPVTストレプトアビジン
−被覆SPAビーズのシンチレーション計数により得たシグナル対ノイズ比の比較 を示す。
【図１０】 CCDイメージングシステムを使用した、増殖細胞における[14C]
チミジンの取りこみの追跡に使用した、２％w/w ALP-1マイクロプレートおよびC
ytostar-Tプレートの使用の比較を示す。
【図１１】 CCDイメージングシステムを使用した、増殖細胞における[14C]
メチオニンの取りこみの追跡に使用した、２％w/w ALP-1マイクロプレートおよ びCytostar-Tプレートの使用の比較を示す。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ４８０nm−９００nmの放出最大を有する燐光体のシンチレー
    ションプロキシミティー試験への使用および該燐光体により放出される放射を検
    出するための電荷結合素子(CCD)の使用。
  2. 【請求項２】 シンチレーションプロキシミティー試験を多ウェルプレート
    のウェルで行う、請求項１記載の使用。
  3. 【請求項３】 電荷結合素子(CCD)を、多ウェルプレートの全てのウェルを 同時にイメージするために使用する、請求項２記載の使用。
  4. 【請求項４】 ５００nm−７００nmの放出最大を有する燐光体である、請求
    項１から３のいずれかに記載の使用。
  5. 【請求項５】 燐光体がランタニドまたはアクチニド部分である活性剤でド
    ープ処理された無機宿主物質である、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
  6. 【請求項６】 燐光体がランタニドまたはアクチニド部分の有機キレートで
    ある、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
  7. 【請求項７】 ランタニドまたはアクチニド部分が、テルビウム、ユーロピ
    ウム、エルビウム、スリウム、ホルミウム、ジスプロシウム、サマリウム、イッ
    テルビウム、ルテシウム、ガドリニウム、ウラニウムおよびウラニルUO2 3+から 選択される部分である、請求項５または６に記載の使用。
  8. 【請求項８】 ４８０nm−９００nmの放出最大を有する燐光体および該燐光
    体により放出される放射を検出するための電荷結合素子(CCD)を使用することを 特徴とする、 液体媒体中に燐光体を含む固体表面を提供し、放射標識試薬が一方が固体表面に
    結合し、他方が液体媒体中である二つのフラクションに分かれ、固体表面に結合
    した放射標識試薬結合のフラクションを検出することによる、シンチレーション
    プロキシミティー試験を行う方法。
  9. 【請求項９】 シンチレーションプロキシミティー試験が多ウェルプレート
    のウェルで行われ、電荷結合素子(CCD)が多ウェルプレートの全てのウェルを同 時にイメージするために使用される、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 燐光体がユーロピウムの有機キレートまたはユーロピウム
    でドープ処理した無機宿主物質である、請求項８または９に記載の方法。
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