JPH07503325A - バイオアフィニティー検定法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バイオアフィニティー検定法及び装置 本発明は、バイオアフィニティーに基く検定方法を行い且つ自動化するための方 法及び装置に関する。この方法及び装置は、特に米国特許第５．０２８．５４５ 号等の中に記載されているようなものの中における微粒子の使用に基き多変数検 定を行い且つ自動化するために、特に使用される。

本発明の背景を明らかにするために本明細書中で使用される刊行物及び他の材料 、並びに特に、その実施に関する追加の詳細を提供するための事件を、引用によ り取り込む。

イムノアッセイは、バイオアフィニティーに基く検定法であり、そして臨床的診 断及び研究機関において生物学的活性分子のために広く使用される。バイオアフ ィニティーに基く他の重要な検定方法は、ＤＮＡハイブリダイゼーション検定で ある。パイオアフィーニティー検定における不可欠な反応体は、例えば、抗体又 はＤＮＡプローブであって、これは、固体支持体、例えば、試験管の壁にもっと もしばしば結合している。この反応体か検定されるべき分子（分析物）に結合し 、そしてその検定の特異性がとりわけその反応体の特徴により測定される。バイ オアフィニティー検定（ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ　ａｓｓａｙｓ）は、これを以 下にバイオ特異的検定（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｓｓａｙｓ）ともいうか、 しばしば、例えば、蛍光分子により標識された第二抗体又はＤＮＡプローブを含 む。固相に結合し、そして両方の反応体、すなわち分析物分子及び標識を含んで 成るバイオ特異的反応において生しる複合体か、遊離の標識反応体、又は遊離の 両分から、例えば、遊離の画分を洗浄することにより、標識により作られたシグ ナル強度か好適なマイクロ光度計の方法であって蛍光標識の場合には蛍光計そし て化学発光照射標識の場合には光度計により測定された後に、分離される。

診断においては、同一サンプル中の多数の分析物の同時測定か、必要であること ができ、これが、用語”多変数検定（ｍｕｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒａｓｓａｙ） “といねれている。これまで文献中に記載されてきた多変数検定は、そのシグナ ルが十分な分光光度の解像度を許容するところの２〜４の異なる標識を使用する ことにより、それぞれ２〜４の分析物の同時検定に限定されてきた。

米国特許第５．０２８．５４５号において、新規の多変数検定法が、４を超える 分析物の同時測定について記載している。この方法は、固体担体として微粒子（ 例えば、１０〜２００マイクロメーターのラテックス粒子）を、それぞれの分離 粒子がそれぞれの反応体溶液中の別々の化学量論的な測定基礎を形成しながら、 利用している。

それぞれの特定の分析のために、微粒子が、異なる量の染料が微粒子のカテゴリ ーの同定を目的としてその粒子の異なるバッチ（カテゴリー）に添加されるよう に別々のハツチ内で製造される。この染料は蛍光染料であることもできる。この 染料は、その微粒子の内部容量中に又はそれらの表面上に均一に分散されること ができる。

多変数検定法において使用される反応体は、異なるカテゴリーの微粒子の混合物 である。この微粒子は、さらに、特定の分析物のためのバイオアフィニティー反 応体によりコートされる。

米国特許第５．０２８．５４５号中に記載されているように、バイオ特異的結合 反応は、蛍光標識により測定されることができる。この蛍光標識は、背景蛍光の 寿命又は微粒子を同定するために使用される慣用の有機染料の蛍光励起状態の寿 命に比へて長い寿命（ＩミＩＪ秒を超える）の蛍光励起状態をもつランタニド・ キレートであることができる。ランタニド・キレートにより作られる蛍光は、時 間分解蛍光計であってそのランタニド・キレートにより放射される蛍光を背景蛍 光及び他の有機染料による蛍光から効率よく分離することを可能にするものによ り、測定される。

蛍光ランタニド・キレートによる分析物濃度の測定のために、時光パルスにより 励起される。ランタニド・キレートの長寿命蛍光の測定並びに微粒子の背景蛍光 からの、散乱からの、及びそれぞれのカテゴリーに関連した染料により放射され たシグナルからの、その分離のために、光検出装置が、励起光パルス後の特定の 遅れ時間の後にのみ活性化され、そして短寿命蛍光は、その光検出装置に到達し ない。他方において、微粒子の同定は、励起光パルスの間に直ちに起こり、又は その系は、光吸収又は短寿命蛍光を測定する別の光度検出装置を取り込んでいる 。

時間分解蛍光計の利点は、同定のために使用される染料からのシグナルが、その 測定が異なる時点において起こるために、いかようにも、ランタニド・キレート からのシグナルの測定を妨害しないという事実に在る。この理由により、その系 は、同一懸濁液中の微粒子を使用して複数の分析物の測定を可能にしている。

バイオアフィニティー反応の検出のための他の標識は、燐光性分子の使用である 。白金−コプロポルフィリン及びパラジウムーコプロボルフィリンを含む特定の メタロポルフィリンが水溶液中で燐光を放射することが最近発見され、そして生 体分子の標識のための使用について紹介されている（Ａ、　Ｐ、　５ａｖｉｔｓ ｋｙ　＆　ａｌ、　Ｄｏｋｌ、　Ａｃａｄ、　Ｎａｕｋ、　ＵＳＳＲ，３０４， １００５，１９８９）。燐光の検出のために必要な時間分解測定原理及び装置は 、ランタニド・キレートの長壊変時間蛍光の検出のために正常に使用される装置 と本質的に同じである。

あるいは、バイオ特異的結合反応を、そのランタニド・キレートを発光標識によ り置き換えながら、発光標識により、測定することもできる。この発光標識は、 多数の既知の化学発光又は生物発光分子の形態であることてきる。これらの例は 、とりわけ、ルシフェラーゼ酵素、ルミノールの誘導体、等である。この場合に おいては、微粒子は、その発光反応の活性化の前に、光吸収又は蛍光を測定する 別々の検出装置により、同定される。同定のために使用される染料は、発光測定 をいかようにも妨害しない、なぜなら、励起及び照射機構は、その２つの事件に おいて全体として異なり、そして異なる時点において生じるからである。

それぞれの微粒子はその自身の化学量論に基づき反応するので、その粒子が正確 に同一サイズを有していることが重要である。この目的のために正確な同一サイ ズの微粒子を製造することは、今日可能となっている。しかしながら、そのサイ ズ分布があまりに広い場合には、画像形成光検出装置（例えば、ＣＣＤ素子）が 、それぞれの微粒子の直径の別々の測定により、その微粒子を同定するために使 用れることかできる。その結果を、次に、その測定データの適当な補正を行うた めに利用する。

先に述へた米国特許第５．０２８．５４５号は、バイオアフィニティーの基くこ の多変数検定を行い且つ自動化するための実際のやり方については記載していな い。一般的には、今日の使用における臨床的又は他の分析装置（゛自動分析装置 ”）における液体の取扱いは、試験管又はマイクロタイター・プレートの使用に 基づき、又は液体は、螺動及びピストン・ポンプ並びに各種の機械的バルブによ り制御されたチュービング内で取り扱われ、そのチュービングの中で、異なるサ ンプルが液体の小分は及び輸送の間に、気泡により互いに他と分離される。これ らの装置は、１０マイクロリッター未満の液体容量の取扱い及び輸送又は特定の 速度における一度の微粒子の輸送のための準備を欠くことにより特徴ずけられる 。これらの装置において、そのチュービングの内径がその微粒子の外径にほとん ど等しく減少された場合には、これらの微粒子は、機械的バルブの信頼できる操 作に匹敵することができる。これらの装置内で取り扱われる液体容量は、一般的 には少なくとも１０マイクロリツターであり、そして交差汚染は、０．１−１％ のオーダーの内にある。バイオアフィニティーに基く検定において要求される濃 縮動態は、少なくとも１０００倍又は、もっともしばしば、１００００倍であり 、そして本発明の用途の分野における慣用の液体取扱い要素及びチュービングの 使用は、このような交差汚染レベルにより不許容とされる。

慣用の分析装置内で取り扱われる液体の一部は、開放系内でも行われる。この関 係のおける開放系は、サンプル又は反応体が検定のある点においてそこからそれ らが小分は又は希釈され、又はその内でそれらがインキュベートされ又は測定さ れるところの開放容器内にあるような系をいう。一般的な開放分析系の例は、サ ンプルが試験管又はマイクロタイター・プレート内で取り扱われるようなもので ある。この関係における閉じた分析系は、サンプル又は反応体が検定の間に開放 容器内に入れられておらず、それらがその系の外側の空気と又は空気により平衡 化された気相と接触していないような系をいう。開放系に伴う問題は、そのサン プル及び反応体が化学的環境因子に晒されそして蒸発すること、並びに担当者が サンプル中の可能性のある病原体にさらされることである。さらに、その液体の 表面張力は、１マイクロリツタ一未満のマイクロ容量を小分けするための可能性 を限定し、そして実施に際して、その工程の間のすへての開放系内のサンプル容 量は、ＩＯマイクロリッター又はさらに１００マイクロリツターを超えるもので ある。

米国特許第５．０２８．５４５号中に記載されている、バイオアフィニティー及 び微粒子の使用に基く多変数検定法は、先に述べた従来の原理を適用することに より自動化されることができない。なぜなら、開放液体取扱い系が、１マイクロ リツターよりも少ない容量中に含まれた単−又は少数の微粒子の正確な移転又は 小分けを許容しないからである。本発明の目的は、固体反応支持体として微粒子 を含んで成る自動化多変数バイオアフィニティー・マイクロ検定系並びに液体取 扱いのためのマイクロチャンネルの系を解釈するためのやり方について記載する ことである。この関係におけるマイクロチャンネルの系は、例えば、この目的の ために使用される微粒子の外径の２倍程広いチャンネルをいい、そのチャンネル がエツチング又は彫刻により又は他のいくつかの好適な方法により固体支持体の 内部に作られた細いチューブ又は細いチャンネルのいずれかの形態にあり、その チャンネルが別々の液体取扱い操作を連絡し、そしてそのチャンネルに沿って、 微粒子の懸濁液が１点から他の点まで移される。

マイクロチャンネルは、その粒子によるチャンネルの系の妨害又はチャンネルの 系のポケット内へのそれらの残存を避けながら、液体懸濁液の形態における微粒 子の運搬及び取扱いを可能にするような幾何学的なデザインをもつ。マイクロチ ャンネルの系の内径は、マイクロチャンネルの系内の微粒子の動きが、層流によ り、そのマイクロチャンネルの中心において単独に並んで、中心に置かれること ができるように選ばれる。サンプルを保存し又はインキュベーションするために 意図されるようなマイクロチャンネルの系の部分、例えば、サンプル・レジスタ ーは、しかしながら、より広い内径を有することができる。むしろより大きな微 粒子、例えば、１００マイクロメーターよりも大きいものか使用される場合には 、好適な内径は、微粒子の懸濁液の運搬のために意図されたマイクロチャンネル のために２５０マイクロメーターである。例えば、１０マイクロメーターのサイ ズのより小さい微粒子が使用される場合には、好適な内径は、微粒子の懸濁液の 運搬のために意図されたマイクロチャンネルのために、例えば、５０マイクロメ ーターである。

マイクロチャンネルの系の使用の目的は、微小容量を使用し、そして同時に試薬 のための費用において節約をすることである。費用削減は、画分への特異的反応 体の量を減少させること、例えば、最近の開放系において使用される容量の１０ ０分の１、によるものと理解される。本発明に従ってデザインされた閉じた分析 系においては、マイクロチャンネルの系に基づいて、１マイクロリツタ一未満又 はさらに１００ナノリッター未満の容量のサンプルが、良好な正確さをもって定 量的に取り扱われることができる。さらに、本発明は、複数の同時に異なるバイ オアフィニティー測定、すなわち、特定の診断パネル、又は例えば、同一容量に おいて行われるべき特定の診断兆候に関係する分析物の全ての組み合わせ、を可 能にする。実際に、１０の分析物の能力がたぶん十分である。但し、その系は、 おそらくさらに多数の分析物が同時に測定されることを可能にしている。上記の マイクロ検定系の改良は、たぶん、日常的診断が単純化され。

そして手動的取扱いの程度及び反応体の量及び包装材料を減少させることができ る。試薬の製造においては、この系は、かなりの経済性をも可能にするであろう 。開放系のための診断テスト・キットの製造は、バルク液体、被覆試験管及びそ れらの包装を包含し、そしてまた高標準の衛生を必要とする。本明細書中に記載 するような閉じたマイクロ検定系のための反応体の製造系は、閉じた工程として 解釈されることができる。

本発明の目的は、前記の特徴の検定方法がマイクロチャンネルの系の概念を適用 することにより完全に自動化されるようなやり方を記載することである。微粒子 は、マイクロチャンネル内で、層流により中心に集められながら、そのチャンネ ルの中心軸上で、次から次に、制御されたやり方で、動くことが観察された。微 粒子の取扱いのすべての段階は、少なくともカテゴリーの同定及び測定、そして その装置の容量に従って、おそらく、小分け、混合、インキュベーション、及び 遊離画分の分離を含む本発明に係るマイクロチャンネルの系内で行われる。サン プル・レジスターは、複数のサンプルの同時インキュベーションを可能にするマ イクロチャンネル及びバルブにより形成される。

本発明の特徴を、請求項Ｉ中に述へる。

小分けに関連する及びインキュベーションの間のサンプルと反応体との混合は、 マイクロチャンネル内の水圧パルスにより作られた乱流により行われ、これは、 先に述べた液体、その圧力パルスを受けるための弾性クッションを提供する気相 を含む。混合は、その液体が磨耗を受けやすい部分の動きと接触しないようなや り方で行われる。遊離の及び結合標識反応体は、微粒子を含むマイクロチャンネ ル内の液相を交換することにより分離される。

先に述べた要求を満足されるマイクロチャンネルの１つの系は、”マイクロフル イブイスティックス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｔｉｃｓ）”の系であり、その 操作原理及び成分は、とりわけ、以下のフィンランド国特許：第５６５９１号、 第５７８４９号、第５７８５０号、第６４０１２号、第６７４９０号、第７０３ ３１号、第７１１０２号、第７２６６０号及び第８６２２９号中に記載されてい る。前記の特許の公開の後、マイクロフルイブイスティックスに基く、より良好 な取扱い方法、成分及びそれらの製造方法、例えば、最初のサンプル・チューブ からサンプルの無菌的回収のための小分は針、及びその針の製造方法、その小分 は針による小分けの間の容器内の液体容量の混合方法、そのディスペンサーの精 度がすべての容量において一定であるような金属ベローの基く非線型ディスペン サー、が開発された。

前記特許中に記載されているマイクロフルイブイスティックス系は、マイクチャ ンネルの閉じた系内の、正確な取扱い及び反応体の小容量（１マイクロリツタ一 未満）及び少数の微粒子の又はさらに単一粒子の輸送を可能にする。この系は、 必要な場合には無菌で、密閉され、液体取扱いのための定量的な系であり、不活 性金属の薄い壁のマイクロチャンネルから構成されている。液体取扱いは、電気 的に制御された氷バルブ（ｉｃｅ　ｖａｌｖｅｓ）を通して向けられ。このバル ブ内では、液体（サンプル、反応体又は補助液体）が凍らされ又は解凍され、マ イクロチャンネルのためのゲートとして機能するような部分を閉じ又は開ける。

このバルブの容量は、はんの、例えば、５０ナノリツターであり、これは、それ らが減少された熱容量をもち、そしてその結果としてそれらの操作が速くなるこ とを意味す−る。本発明に従ってデザインされた系内の上記氷バルブの重要な利 点は、それらの外径がマイクロチャンネルの内径に殆ど等しいにもかかわらず、 その微粒子がその氷バルブの機能を機械的に妨害しないという事実により提供さ れる。

マイクロフルイブイスティックスの製造の他の技術は、固体支持体として結晶性 シリコンを使用することである。このマイクロチャンネル及び他の必要な構造は 、マイクロエレクトロニクス産業により開発された平面リトグラフ・マイクロマ シニング技術を使用してコノシリコン内で削られることかできる（Ｍ、　５ａｌ ｏｎｅｎ　ａｎｄ　Ｔ、　Ｒｏｐｐ。

ｎｅｎ、　Ｍｉｋｒｏｍｅｋａｎｉｉｋｋａ、　Ｈｅ１ｓｉｎｋｉ　Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　ｎｏ、 　Ｃ２３４，１９９＋）。好適な結晶配向及び直径、例えば、１００ｍｍ以上を もつ標準的なシリコン・ウェーファーを、使用することができる。連絡は、いず れの側上のシリコン・ウェーファー中に削られることができ、そして液体は、垂 直孔を通してマイクロチャンネル系から供給又は取り出される。

シリコン・ウェーファーの上面は、標準的な加熱技術を使用してシリコンに溶け て付着した細かい石英ガラスから成る。この石英カバーは、流れの観察及びその 微粒子上の反応体の発光、蛍光又は燐光標識からの光子放射の検出に向けられて いる。半導体産業により使用されるシリコン・ウェーファーは、化学的に非常に 純粋であり、そして我々のテスト結果に従えば、いかなる不純物、例えば、ラン タニド・キレートの蛍光検出を妨害するであろう重金属を含まない。

石英の特定のタイプも、純度の要求を満たしている。

液体取扱いのためのマイクロチャンネルは、０．１マイクロメーターの精度をも ってシリコン内に削られることができる（Ｊ、　Ｐｈａｌｅｒ　＆ａ１．．　Ｌ ｉｑｕｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｉｎ　ｍ１ｃｒｏｎ　ａｎｄ　ｓｕｂｍｉｃ ｒｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌｓ、　５ｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ、 　Ａ２１　Ａ２３　（１９９０）　４３１−４３４）　ｏこの精度は、その壁が フィルターであるマイクロチャンネルの幾何学的に精密に定められた部分の内側 にその微粒子が保たれている反応チャンバーの構築を可能にする。このような反 応チャンバーの基本的な構造を図１中に示す。この構造は、微粒子を動かすこと なく標識反応体の遊離の両分の洗浄を可能にする。この微粒子は、入口（１）を 通して供給され、そして出口（２）を通して排出される。洗浄は、単に、入口（ ３）から出口（４）までのフィルターを通しての洗浄溶液の流れにより、行われ る。フィルター（５）は、微粒子（６）が洗浄流れの方向に動くことを防ぐ。こ のフィルターは、いずれかの最適な形態及び寸法をもつシリコンの部分から樽成 される。その部分間の空間は、微粒子の直径よりも小さくなければならないこと は明らかである。

先に述べた特許中に記載したマイクロフルイブイスティクス機構のほとんどが、 例えば、氷バルブを含むシリコン内の構築によっても行われることができる。シ リコン技術は、シリコンを金属構築物に組み込むことを可能にし、そして高い熱 伝導度をもつ金属を、氷バルブの操作のための′コールド・フィンガー（ｃｏｌ ｄ　ｆｉｎｇｅｒｓ）”として使用することができる。このコールド・フィンガ ーと他の構造物との間の高い熱的遮断は、組み込まれた真空空洞により達成され ることができる。

シリコン技術は、マイクロフルイブイスティクスによる同一のシリコン・ウェー ファー内に、マイクロポンプ膜、加熱要素、熱交換器、温度センサー、圧力セン サー、光学センサー、他の光学的要素及び電子部品を組み込むことを可能にする 。

先に述へたマイクロフルイブイスティクスの基本的特徴は以下のものであるニ ー液体取扱い空間が、微粒子が水圧機構によりいかなる時において動かされるこ とができ、そしてその系がその粒子寸法よりも大きなサイズのポケットを含まな いような幾何学的なデザインを有し、−内部まで滅菌することができる廃棄液体 の容量が分析物当たり１０−１００マイクロリッター未満であり、−液体かいず れかの別々に動く摩擦を受けやすい成分と接しておらず、 一液体の小分は系が完全に水力学的であり（液−気間相てはなく）、−その液体 が１ナノメーター〜１００マイクロリツターの容量範囲内に小分けされ、 一液体の取扱いの精度がマイクロリッター・レンジにおいて０．１％、そしてナ ノリッター・レンジにおいて１−５％であり、−その液体取扱い系の脱汚染能力 （交差汚染）が０．０００１％であり、−水力学的混合が小分けとインキュベー ションとの間に反応体のために提供され、そして混合されるべき液体が、動く摩 擦を受けやすい部分と接触していない。

本明細書中に記載した完全な自動化は、液体サンプル、例えば、血液血清が、細 いチューブを通して供給されるような装置を含んで成る。必要な反応体、例えば 、微粒子と必要なバッファー及び洗浄液体との懸濁液は、目的のあるそして（必 要な場合に）無菌の容器であってその装置に溶融して接続されたものの内に含ま れる。

サンプル及び反応体は、閉じた空間内及び微小容量内の系において取り扱われる 。この系の本質的な反応体は、以下のものである。

１、Ｒ粒子懸濁液は、異なるバイオアフィニティー反応体によりコートされた微 粒子であって、その粒子の直径が１−２００マイクロメーターであるものの混合 物である。商業的な微粒子の例は、Ｄｕｋｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ、 　（ＬＩＳＡ）の選択物である。磁気的微粒子も使用することができる。

２、　バッファーは、インキュベーションの間に化学的環境を最適化するために 使用される液体である。バッファーを、その系を洗浄するために使用することも てきる。

３、　測定液体は、ランタニド・キレートの蛍光の測定の間又は燐光又は発光の 測定の間の化学的環境を最適化するために使用される液体である。測定液体は、 ランタニド・キレートの蛍光の増強剤（例えば、補助蛍光剤）及び微粒子の凝集 を取り除くための試薬を取り込むことかできる。

この系の機能的プロノック・ダイアグラムを、以下の部分を含んで成る図２中に 示す。

１、　その中にサンプル、微粒子懸濁液及びバッファーが供給されるマルチプレ ース・インキュベ−ター（１０）。このマルチプレース・インキュベーターは、 マイクロチャンネル、氷バルブ及び温度調節装置を取り込み、そしてサンプルの でたらめインプット及び同時インキュベーションを可能にする。このインキュベ ーター内では、サンプルは、微粒子懸濁液と混合される。それぞれのサンプルの インキュベーション時間は、正確に制御され、そしてバイオアフィニティー反応 は、必ずしも平衡にもっていかれない。いずれかの所定時間においてインキュベ ーター内にある微粒子の数は、反応速度及び精度に対する有意な効果をもってい ないが、採られるべき微粒子の正確な計数を可能とする系は、正確さのために有 用であることか証明されるはずである。異なるサンプルが、様々な長さの時間に わたりインキュベートされることができる。

結合した反応体は、遊離の反応体から、例えば、よく知られたバイパス洗浄濾過 法により、分離される。他の方法は、磁場によりインキュベーター内で微粒子を 固定し、そしてその遊離の反応体を洗い流し、同時に遊離の反応体を測定液体に より置き換えることである。Ｆ１特許第７２６６０号中に記載された閉じた流れ 通過遠心分離（Ｃ１０ｓｅｄ　ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇ ｅ）又はＦ１特許第６７４９０号中に記載された濾過方法も、上記分離のために 使用されることができる。

２、　マイクロチャンネル内の液体の及び検出装置中への微粒子懸濁液の運搬の ためのポンプ（２０）。それぞれのカテゴリーに対応する望ましい数の微粒子が 測定されるまでポンプ供給を続ける。このマイクロポンプは、その懸濁液が正確 に制御された速度においてその検出装置中への懸濁液の運搬を確保し、そしてそ の微粒子が、測定が行われながら、動き又は静止することができる。この微粒子 懸濁液は、その流れキャピラリー内の平均粒子間距離がそれらか放射するシグナ ルの光学的解像度を許容するのに十分なものであるようにこの段階において希釈 される。このマイクロポンプは、そのチャンネルの中心軸に沿って、所定の速度 で、マイクロ光度計測定チャンネル内の微粒子懸濁液を、その微粒子を層流によ り中心に集めながら、動かし、そしてその粒子の局在化は、流れの方向において 、必要な場合には、マイクロメーターの精度で、光度検出検装置の焦点において 、測定されることができる。液体の流れは、同一の精度をもってその流れを横切 る方向においてその粒子を中心に寄せる。その粒子の比重がその測定液体のもの と異なる場合には、その粒子は、局在化された後に、すなわち、液体流れが停止 した後に、１秒の両分における水平測定チャンネルの壁に対して止まるか又は上 昇するかのいずれかとなる。この点において、粒子の光度計、蛍光計又は発光計 による測定が、特定の用途に必要な精度及び感度をもって、行われることができ る。

先に記載したマイクロポンプは、例えば、コンピューター制御ステッピング・モ ーター及び偏心駆動により制御されたベロー・ポンプ（ｂｅｌｌｏｗ　ｐｕｍｐ ）であることがてき、その液体の容量がそのステッピング・モーターの回転角度 に対し非線型関係をもつポンプにより小分けされ、それが、所定の速度において そして一定の精度をもって広く異なる液体の容量の運搬を可能にしている。

３、微粒子を同定するために使用される要素（３０）は、光源及び微粒子内に含 まれる染料の測定のだめの及びあるいはその微粒子の直径の測定のための光検出 装置を取り込んだ光度計の又は蛍光計の装置である。それぞれの微粒子のカテゴ リーは、その検出装置からのシグナルの強度に従ってその系により同定される。

その同定工程から及び測定から得られた情報は、その標識のための検出装置（４ ０）から得られたシグナル強度に基きサンプル中の分析物の濃度を計算するコン ピューター内で特定の分析物のための標準化プログラム中の計算のパラメーター として使用される。同定要素は、測定されないがそらされる、凝集した微粒子を も検出することができる。

４、　標識のための検出装置（４０）は、時間分解の蛍光計又は燐光計又は発光 計のいずれかである。この測定セルは、例えば、断面０．２５ｘ　Ｏ，２５ｍｍ を測定し及び２０ナノリツタ一未満の有効容量をもつ商業的なフロー・スルー・ セルであり、その容量において、たった１つの微粒子のシグナルが一度に測定さ れる。あるいは、その測定チャンバーは、他の機能的部分をもつ同一のシリコン 支持体内に取り込まれる。

本系は、さらに、液体取扱いのための機能的要素の制御のために、及び電気的機 構の制御のために、他の必要な機構、例えば、慣用のポンプ、バルブ、液体容器 及び温度調節装置並びに必要数の電気制御要素及び系制御のための及び結果の標 準化及び計算のためのコンピューターを、取り込む。

本分野における専門家は、本発明の異なる用途が以下のセクション中に表される 請求の範囲内で変動することができることを理解する。本発明の方法が様々な態 様の形態で取り込まれることができ、この中のほんの少しのみが本明細書中に開 示されていることが、理解されよう。他の態様が存在し、そして本発明の核心か ら外れないことが当業者に理解されよう。したがって、記載した態様は、例示的 なものであり、そして限定として解釈されてはならない。

日Ｇ、１ サンプル フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＬＶ、ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　 ＰＬ、　ＰＴ、　ＲＯ。

ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．異なるカテゴリー中に分散され、そして異なる分析物を表す前もって作られ た微粒子を使用する自動化された多変数バイオアフィニティー検定法であって、 −方法中、異なるカテゴリーに属する微粒子が異なる量の蛍光染料を含み、 −方法中、異なるカテゴリーの微粒子が、異なる分析物に結合するバイオ特異的 反応体によりコートされ、−方法中、異なるカテゴリーの微粒子が、懸濁液中で 混合され、その懸濁液中にサンプルが添加され、その懸濁液中に、発光を生成し 若しくは触媒する分子又は蛍光若しくは燐光の分子により標識されたバイオ特異 的第二反応体の混合物が添加され、−方法中、上記蛍光染料が活性化され、そし てその蛍光放射の強度が微粒子カテゴリーの同定のためのそれぞれの粒子につい て別々に測定され、 −そして方法中、上記バイオ特異的第二反応体の標識が活性化され、そしてバイ オ特異的結合反応が発光を生成若しくは触媒する分子からの又は蛍光若しくは燐 光分子からのシグナルにより測定され、微粒子カテゴリーの同定及びバイオ特異 的結合反応の測定のための並びにあるいはまた遊離画分の小分け、混合、インキ ュベーション又は分離のための、マイクロチャンネルの装置を使用することを特 徴とする検定法。
2. ２．電気鋳造により不活性金属から作られた細い壁をもつマイクロチャンネル内 の液体輸送又はリトグラフィー及びエッチングにより作られた支持体中に作られ たマイクロチャンネル内の液体輸送を特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ３．マイクロチャンネルにより形成された液体取扱い装置の閉じたデザインの使 用を特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. ４．マイクロチャンネルの装置の操作の制御及び／又は液体の小分けのための氷 バルブの使用を特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. ５．液−気界面が小分けの間にマイクロチャンネル内に本質的に全く存在しない ような液体の水力学的小分けの使用を特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. ６．コンピューターにより正確に制御されたマイクロポンプにより定められた可 変速度においてマイクロチャンネルの装置における微粒子の流れを制御すること を特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. ７．マイクロ光度計検出装置による微粒子の動きの同定及び測定並びに得られた データをポンプを制御しているコンピューター中にフィーディングすることを特 徴とする、請求項６に記載の方法。
8. ８．広いレンジの容量にわたり一定の精度をもつ非線型ベロー・ポンプであるマ イクロポンプの使用を特徴とする、請求項６に記載の方法。
9. ９．サンプルの同時インキュベーションのための、マイクロチャンネル及びバル ブにより形成されたサンプル・レジスターの使用を特徴とする、請求項１〜８の 中のいずれか１項に記載の方法。
10. １０．微粒子を含む液相の広い希釈による又はそれを交換することによる遊離標 識反応体と結合標識反応体との分離を特徴とする、請求項１〜９の中のいずれか １項に記載の方法。
11. １１．標識の最大検定感度を提供するために、交換又は希釈から得られた新たな 液相を最適化することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. １２．微粒子を保留するための平面又は装置を含むマイクロチャンネル内の希釈 又はバイパス流れろ過により微粒子から遊離の反応体を分離することを特徴とす る、請求項１０に記載の方法。
13. １３．閉じたフロー・スルー遠心分離である装置を使用することを特徴とする、 請求項１２に記載の方法。
14. １４．先に述べた液体に加えて、加圧パルスの弾性的受け取りのための気相を含 むマイクロチャンネル内の水圧パルスにより作られた乱流により、小分け及びイ ンキュベーションの間にサンプルと反応体とを混合することを特徴とする、請求 項１〜１３の中のいずれか１項に記載の方法。
15. １５．マイクロチャンネルの装置を通して液体と気体との混合物をポンピングす ることによりサンプルを先行させた後マイクロチャンンネルの装置を脱汚染する ことを特徴とする、請求項１〜１４の中のいずれか１項に記載の方法。