JP3424831B2 - 結合アッセイ - Google Patents
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Description
被分析物の濃度を測定することに関する。
度を、該液体と、被分析物に対し特異的な結合部位を有
する結合試薬とを接触させ、該試薬に結合している被分
析物を有する結合試薬を分離し、被分析物が占有してい
る結合試薬の結合部位の割合を表わす数値(「小部分占
有(fractional occupancy)」という)を測定すること
によって測定することは既知である。一般的には、次に
液体試料中の被分析物の濃度を、該小部分占有と既知の
濃度の被分析物を含有している一連の標準溶液から得ら
れた数値とを比較することによって決定することができ
る。
または非競合的方法のいずれかを用いて、標識現像試薬
を(developing reagent)用いた逆滴定によって行われ
た。
は、一般的には被分析物の標識化変形体である標識現像
試薬を用いて同時または連続的のいずれかで、逆滴定さ
れる。現像試薬は、濃度を測定される被分析物と、結合
試薬の結合部位を獲得するために競合するということが
できる。標識された被分析物により占有された小部分の
結合部位は、次いで蒸気のように被分析物の濃度に関連
づけることができる。
薬を結合された被分析物または結合試薬上の占有された
結合部位のいずれかと結合できる標識現像試薬を用いて
逆滴定する。結合部位の小部分占有を、次いで標識現像
試薬の存在を検出することによって測定し、競合アッセ
イと同様に、上記のように液体試料中で被分析物の濃度
と関連づけることができる。
試薬を検出できるように標識を用いて現像試薬を標識化
する。いろいろな標識、たとえば、放射性同位体、酵
素、化学発光標識および蛍光標識が過去に用いられた。
にBersonおよびYalowによって、たとえば「調査および
診断の内分泌学における方法(Methods in Investigati
ve and Deiagnostic Endocrinology)」の第111〜116ペ
ージに発表された設計則にしたがって実行する。競合免
疫アッセイを行う際には、結合試薬を検出されるべき被
分析物の約30から50%という低濃度と結合する量で用い
る場合に、最高の感度が達成される。非競合免疫アッセ
イにおいては、最高の感度は通常、液体試料中の被分析
物の100%近くまで結合するのに十分な結合試薬を用い
ることによって達成されると考えられている。しかしな
がら、両方の場合において、これらの広く受け入れられ
た教示にそって設計された免疫アッセイにおいては、試
料の容積を知る必要および用いられる結合試薬の量を正
確に知るか、結合試薬の量が一定であることを知る必要
がある。
中の被分析物の濃度を、被分析物に特異的な結合部位を
有する少量の結合試薬と液体試料とを接触させることに
よって測定できることを開示した。この方法において
は、結合試薬の量が液体試料中の被分析物の濃度に対
し、ほんの少ししか影響しないほど少量であるなら、被
分析物により結合試薬の結合部位の小部分占有は試料の
容積と実際上無関係であることが分った。
および容易さの開発を固体支持体の小さな区域(または
「ミクロスポット」)上に位置する0.1V/Kモル(Vは試
料の容積で、Kは被分析物についての結合試薬の平衡常
数である)よりも少ない量の結合試薬を用いることによ
って改良することを開示するEP304,202号をさらに改良
するものである。
結合試薬の小部分占有を上述したように、競合的技術ま
たは非競合的技術のいずれかを用いて測定する。
ってもまた、正確に被分析物の濃度を測定できる結合ア
ッセイを開発することに継続するニーズがある。
結合試薬と、結合部位の小部分が被分析物によって占有
されるように接触させ、 (b)第1および第2の現像試薬を用いて結合試薬を逆
滴定し、ここで、第1の現像試薬は占有されていない結
合部位に結合でき、第1の標識を有するものであり、第
2の現像試薬は結合された被分析物または占有された結
合部位に結合でき、第1の標識とは異なる第2の標識を
有しているものであり、 (c)第1および第2の標識によって生じたシグナルを
測定して、被分析物によって占有された結合部位の部分
を表す数値を供給し、 (d)該数値を既知の濃度の被分析物を含有する一連の
標準溶液から得られる対応する数値と比較して、液定試
料中の被分析物の濃度を得る: ことを含んでなる液体試料中の被分析物の濃度を測定す
る方法を提供する。
合的な方法を兼ね備えた被分析物の濃度を測定する方法
を提供する。この発明は、むしろアッセイが所望の精確
さの結果を提供できる実用範囲を広げるという利点を有
している。これについては下記でさらに説明する。
性同位元素、酵素、化学発光標識または蛍光標識であ
る。蛍光染料標識を用いることは、検出のために適切な
色の範囲(励起および発光波長)の蛍光を供給するため
に蛍光染料を選択することができるので、特に好まし
い。蛍光染料はクマリン、フルオレセイン、ローダミン
およびテキサスレッド(Teras Red)を含む。背景の蛍
光が減衰した後に蛍光性シグナルの強度を測定するのに
時間分解(time−resolved)蛍光を用いることを可能と
するので、長期の蛍光時間を有する蛍光染料分子を用い
ることができる。蛍光標識または他の標識を含有する
か、表面にそれらを坦持するラテックス ミクロスフェ
ア(microsphere)もこの発明の文脈に用い得る。標識
からのシグナルをレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて測
定することができる。
る抗体である。あるいは結合試薬は標的核酸分子に、た
とえば標的核酸分子に相補的配列を持つことにより、結
合することができるオリゴヌクレオチドであってもよ
い。
WO84/01031号の「周囲の被分析物(ambient analyt
e)」の技術に従って小量の結合試薬を用いる。上述し
たように、結合試薬の量は、液体試料中の被分析物の周
囲濃度を著しく乱さないように十分に小量であるべきで
ある。5%よりも少ない被分析物に結合する量の結合試
薬を用いることが好ましい。しかしながら、もっと少量
の、たとえば2%または1%の被分析物と結合する、結
合試薬を用いることは、さらに被分析物の周囲濃度への
妨害を減少させ、被分析物濃度の測定におけるエラーを
最小限度にするのに役立つ。
うに、Vは試験帯に適用する試料の容積であり、Kは結
合試薬に結合する被分析物の会合常数である)よりも大
きくない濃度の結合試薬を用いると、この条件が被分析
物の濃度にかかわらず満たされることを保証する。
異的な結合部位をそれぞれ有する多数の異なった結合試
薬を用いて、多数の異なった被分析物の濃度を同時に測
定することができる。この場合好ましくは結合試薬は支
持体上の別々の位置に、たとえばミクロスポットとして
固定化される。
上のそれらの位置によって別々に区別される異なった結
合試薬を含有する別々の位置を逆滴定するのに同じ第1
の現像試薬および第2の現像試薬を用いることができ
る。したがって、検出するのに単に二つの種類の標識が
必要であるという利点とともに共通の一対の現像試薬を
用いることが可能である。
結合試薬を、一連のその被分析物の濃度の繰り返しの測
定を一度にできるように、支持体上の多数の位置に固定
化することができる。
たは試料の容積が1mまたはそれよりも小さいオーダー
であるとき、位置は1mm2の面積を有するミクロスポット
である。さらに結合試薬は好ましくは感度を最大にする
ようにミクロスポット内で高表面密度で存在すべきであ
る。
濃度を測定するためのキットも含んでおり、該キット
は、 (a)被分析物に特異的な結合部位を有する結合試薬で
ある、結合試薬を付着させた固体基体、 (b)第1の現像試薬および第2の現像試薬を含んでな
る逆滴定試薬を含んでなり、ここで、第1の現像試薬は
占有されていない結合部位に結合でき第1の標識を有す
るものであり、第2の現像試薬は結合された被分析物ま
たは占有された結合部位に結合でき、第1の標識とは異
なる第2の標識を有するものである。
して記載する。
る、アッセイにおけるその実用範囲へのエラーに関する
グラフを示し、 図2は、従来技術の競合アッセイを示し、 図3は、従来技術の非競合アッセイを示し、 図4は、この発明によるアッセイの例を示し、 図5は、第1の現像試薬が結合部位の占有されていな
い結合試薬と反応することによって発するシグナルおよ
び第2の現像試薬を占有されていない結合部位と反応す
ることによって発するシグナルを観察することにより得
られた応答曲線を示し、並びに、 図6は、競合および非競合のデータの別々の分析によ
り得られた精度プロフィールと、データが割合Ry、すな
わち、両現像試薬により発せられたシグナルの割合に依
存して組み合わされたときに得られたプロフィールとの
比較を示す。
ように変わるかを図解している。この図はアッセイの精
度プロフィール、すなわち、被分析物の濃度に対しプロ
ットされた被分析物の濃度測定におけるエラー(CV)に
関する曲線を表す。アッセイの実用範囲は、その濃度範
囲内では、アッセイの結果が受容できる精度(一般的に
は10%より良い)である被分析物の濃度範囲(XとYの
間)を含む。アッセイの感度は、被分析物測定のCVが10
0%を越えるよりは低い被分析物の濃度として表わされ
る。
を定義するために用いられるCV値は個々の選択の問題で
あり、そして、図1に描かれた一般的なコンセプトが広
く容認されているにもかかわらず、この分野において
は、これらの値に関して一般的に受け入れられた慣習は
ない。
で、測定するために、すなわち、非常に低い検出限度を
もたらすために暗黙のうちに設計されている。アッセイ
の効果的な感度は、一般に検出限界と密接に関係してい
る値である、実用範囲の下限によっても表わされる。ア
ッセイの感度を増加することは、検出の下限および実用
範囲(X)の下限の両方を下げることを含む。しかしな
がら、アッセイの感度の増加は、また、実用範囲の上限
(Y)を下げるという同時に発生する所望しない効果を
もつことは、通常経験することである。言い換えると、
高感度のために設計されたアッセイは一般に、高被分析
物濃度の正確な測定には適さない。
た。結合試薬は被分析物6に特異的な結合部位を有して
いる。結合試薬2と被分析物6を含有する液体試料とを
接触させた後、被分析物6のいくらかは結合試薬2の結
合部位に結合する。
物6によって占有されていない結合試薬2の結合部位に
結合する。現像試薬8による結合試薬2の結合部位の小
部分占有を標識10を検出することによって測定する。こ
れは液体試料中の被分析物6の濃度を、既知の濃度の被
分析物6を含有する一連の標準溶液を用いて得られた結
果と、標識10からのシグナルとを比較することによって
確かめることを可能にする。
識14を坦持する現像試薬12を用いて逆滴定することによ
って検出する非競合アッセイを示す。結合試薬2は被分
析物6または結合試薬の占有された結合部位に結合し得
る。被分析物により結合部位の小部分占有は次いで標識
14を検出することによって測定する。図2に示されてい
る競合アッセイの場合のように、標識14からのシグナル
は、一連の既知の濃度の溶液を用いて得られた結果と照
合することによって、液体試料中の被分析物6の濃度と
関係づけることができる。
結合試薬2を被分析物6と接触させた後に、結合部位の
一部分は被分析物6によって占有される。次いで結合試
薬2を第1および第2の標識10,14を用いて標識され
た、第1および第2の現像試薬8,12を用いて逆滴定す
る。標識10,14はたとえば蛍光標識の場合には、異なっ
た頻度および/または異なった蛍光減衰時をもった発色
団を選択することによって区別できるシグナルを与える
ように選択される。
合的アッセイにまさるいくつかの重要な利点を有する。
結合アッセイを用いることができる実用範囲を広げるこ
とを見い出した。これは低い被分析物濃度では、標識14
を坦持する非競合的現像試薬12の量および標識14の検出
能が結合アッセイの実用範囲の下限のかぎとなる決定要
因であるからである。言い換えると、非常に低い被分析
物濃度は現像試薬12を用いて行われた標識14により生じ
たシグナルの測定によって卓越した精度で測定される
が、現像試薬8を用いて行われた標識10により生じたシ
グナルの重要性はより低い。
合的現像試薬の量および標識10の検出能は結合アッセイ
の実用範囲の上限を決定するのに非常に重要である。言
い換えると、高い被分析物濃度は現像試薬8を用いて行
われた標識10によって生じたシグナルの観察により、卓
越した精度で測定されるが、現像試薬12を用いて標識14
により生じたシグナルの重要性はより低い。
合した両方の標識によって生じた特異的なシグナルを測
定することにより、そして測定された特異的なシグナル
に反する背景のシグナル(たとえば、固体の支持体上に
非特異的に結合した現像試薬8および12によって生じ
た)を最小限にまで減らすことによって、実用範囲の下
限を最小限まで小さくし、そして上限を最高限まで高く
することができ、それによってアッセイ系の実用範囲、
すなわち、受容できる精度で測定できる被分析物の濃度
の範囲を拡張する。
に入れて適切に調整した時、二つの標識によって発せら
れたシグナルの合計が、系に存在する結合試薬の総量の
測定値を提供する時に生じる。従来技術においては、結
合試薬の総量を知っていることまたはそれが一定である
ことが、しばしばアッセイの実行における必要条件であ
る。以前には表面に均一の密度で、一定量の結合試薬
(たとえば抗体)を固定化するのにかなりの困難性が見
い出されたが、占有された部位と占有されない部位の測
定値をもたらすことによって、この方法はこの問題を克
服し、結合部位の総数を測定することを可能にする。
よりも少ない被分析物と結合する)を用いてこの発明に
したがって行われるアッセイにおいて、二つの標識から
のシグナルの比は被分析物濃度にのみ依存することが分
かった。この観察の根拠は、このような状況の下では結
合部位の小部分占有(F)は周囲の被分析物の濃度にの
み依存するという国際特許出願WO98/01031号に開示され
た発見である。
合部位の総数をXとすると、FyX部位が占有され、(1
−FY)X部位が占有されていないものとなる。占有され
た部位により生じたシグナルの測定効率をε1、占有さ
れていない部位により生じたシグナルのそれをε2とす
ると、占有された部位および占有されていない部位から
生じたシグナルの比(RY)は、ε1FY/ε2(1−FY)ま
たはCFY/1−FY(ここでC=ε1/ε2=一定)である。F
Yは周囲の被分析物濃度にのみ依存し、Cは不知の試料
および標準の両方に対し一定であるから、Ryの測定はX
の正確な値にかかわりなく、Yの測定値をもたらす。
とは義務となっていないし、ある状況下、たとえはミク
ロスポットに位置する結合試薬の量の変化が低い時に
は、該量が本質的に一定であることを条件に含むこと
は、本当に不利であるかもしれない。このような状況で
は、競合アッセイおよび非競合アッセイのデータを別々
に処理するのが好ましいだろう。この発明による競合ア
ッセイおよび非競合アッセイの両方を組み合わせること
の主要な利点はそれによってそこなわれない。
場合、たとえば液体試料中に存在する被分析物の総量の
5%より多くが結合する場合にもより広い適応性があ
る。この場合には二つの標識からのシグナルの比は、被
分析物濃度および結合試薬の量の両方に依存する。しか
しながら、結合試薬の量は二つの標識からのシグナルの
合計から測定できるので、二つのシグナルの比から試料
中の被分析物濃度を得るために簡単な補正をすることが
できる。
薬の量の変化は容易に補正できるので、一定量の結合試
薬が異なった支持体上に固定化されたことを知る必要性
をさけることもできる。
か一定であるかのいずれかでなければならない。
をつけた標識によって発せられたシグナルをSoで与え、 占有されていない結合試薬結合部位に向かう現像試薬
に印をつけた標識により発せられたシグナルをSuで与え
よう。
へのそれぞれのシグナルに関係する定数をそれぞれεo
およびεuと、 そして、K=被分析物と結合試薬の間の反応を支配す
る有効な平衡定数としよう。
Oおよびεu/Kを含んでいる。シグナルSoおよびSuを一
連の既知の被分析物濃度について測定することによっ
て、これらの常数を決定でき、そして、未知である被分
析物濃度をSoおよびSuの相当する測定から推定すること
ができる。
o/Suは周囲の被分析物濃度に比例する。
7μm(Ex642nm、Em653nm)、Boehringer Mannheimから
入手。
1μm(Ex490nm、Em515nm)、Molecular Probesから入
手。
−モルホリノ〕エタンスルホン酸)、無水オルトリン酸
水素ジナトリウム、オルトリン酸ジ水素ナトリウム、エ
チル−3(3−ジメチルアミノ)プロピルカルボジイミ
ド塩酸塩、RIA級ウシ血清アルブミン、トリツマ(Trizm
a)およびナトリウムアジド、Sigmaから入手。
inger Mannheimから入手。
ウスのモノクローナル抗体の複合 1. 2回蒸留した水0.5mの中の10mgの蛍光親水性ラテ
ックスシクロスフェアに0.5mの1%トウイーン20を添
加し、室温で15分間振とうし、TSE High SPin20遠心分
離機中で20,000rpmで8℃で10分間遠心分離した。
ノ〕エタンスルホン酸)緩衝液pH6.1中に分散させ、遠
心分離した。
ミクロスフェアに加え、室温で15分間振とうした。
チルアミノ)プロピルカルボジイミド塩酸塩を加え、室
温で2時間振とうした。
を加え、さらに30分間振とうし、遠心分離した。
時間振とうし、遠心分離した。
間振とうし、遠心分離した。
散させ、遠心分離した。
する1%BSA中に分散させ、4℃で貯蔵した。
液、pH7.4中の4mgのフッ化球体硫酸塩に加え、室温で1
晩振とうした。
℃で15分間、20,000rpmで遠心分離した。
うし、遠心分離した。
せ、30分間振とうさせ、遠心分離した。
分離した。
SA中に分散させ、4℃で貯蔵した。
ドイッチTSHアッセイ 1. 各黒のDynatech Micro Fluorミクロ滴定ウエル上に
0.1Mリン酸塩緩衝液pH7.4中、濃度200μg/mで抗体の
一滴が0.5μの滴を置くことによって、捕獲抗−TSH抗
体ミクロスポットを作った。滴を直ちに吸引した。
し、リン酸塩緩衝液で洗浄した。
0.0,0.3,1.0,3.0,10,30,75,150および300μU/mを加
え、これらを2時間振とうし、0.05%トウイーン20を含
有するリン酸塩緩衝液で洗浄した。
の抗−TSH現像抗体が複合した親水性ミクロスフェアの2
00μを全ウエルに加え、これらを1時間振とうし、リ
ン酸塩−トウイーン20緩衝液で洗浄した。
μg/mのTSH−複合ミクロスフェア硫酸塩の200μを
全ウエルに加え、これらを1時間振とうし、リン酸塩−
トウイーン20緩衝液で洗浄し、レーザー走査共焦点顕微
鏡で走査した。
「センサー」抗体結合部位とを反応させ、第1の現像試
薬(標準化TSH)を占有されてない結合部位と反応させ
ることによって発せられたシグナルを観察することによ
って得られた応答曲線を描く。第1および第2の標識か
らのシグナルは組み合わさって、被分析物濃度に対して
プロットされた、比RYを与える。したがって、図5は、
被分析物濃度に対するRYの変化は被分析物濃度の広い範
囲にたかって滑らか、すなわち、アッセイの実用範囲は
従来技術の競合的方法または非競合的方法よりも大きい
ことを示す。
の分析によって得られた精度プロフィールと上述したよ
うに、データが応答変数としての比RYを信頼して組み合
わされたときに得られたプロフィールの比較を示す。
からE)の両方の実用範囲は、Bから1000μU/mより
上まで広がる組み合わされたアッセイの実用範囲よりも
制限されていることに注意せよ。
利にする現象も説明している。しかしながら、これらの
状況においてデータを異なった方法で処理することが可
能である。この現象(該比を信頼して該範囲のある部分
にわたって得られた精度は、別々にデータを処理するこ
とにより得られたものと比較して低い)は、比における
統計上のエラーは、特に、ミクロスポットにおける結合
試薬の量が一定であれば、個々の測定の1つにおけるそ
れよりも大きいという事実から生じる。この状況下で
は、低被分析物濃度の試料は非競合的データを信頼し
て、高被分析部物濃度のものは競合的データを信頼して
測定することができる。
Claims (11)
- 【請求項1】液体試料中の被分析物の濃度を測定する方
法であって、 (a)液体試料を被分析物に特異的な結合部位を有する
結合試薬と、結合部位の小部分が被分析物によって占有
されるように接触させ、 (b)第1および第2の現像試薬を用いて結合試薬を逆
滴定し、ここで、第1の現像試薬は被分析物によって占
有されていない結合部位に結合でき、第1の標識を有す
るものであり、第2の現像試薬は結合された被分析物ま
たは占有された結合部位に結合でき、第1の標識とは異
なる第2の標識を有しているものであり、 (c)第1および第2の標識によって生じたシグナルを
測定して、被分析物によって占有された結合部位の部分
の表わす数値を供給し、 (d)該数値を既知の濃度の被分析物を含有する一連の
標準溶液から得られる対応する数値と比較して、液定試
料中の被分析物の濃度を得る: ことを含んで成る方法。 - 【請求項2】試料中の被分析物の周囲の濃度が著しく乱
されないように少量の結合試薬を用いる請求項1に記載
の方法。 - 【請求項3】少量の結合試薬が0.1V/Kモル未満であり、
Vは液体試薬の容積であって、Kは結合試薬に結合する
被分析物についての会合常数である請求項2に記載の方
法。 - 【請求項4】各結合試薬が与えられた被分析物に対して
特異的な結合部位を有している多数の結合試薬を用い
て、液体試料中の多数の異なった被分析物の濃度を測定
する請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項5】結合試薬が支持体上の別々の位置に固定化
されている請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項6】多数の結合試薬のためのアッセイにおい
て、多数の異なった結合試薬を、支持体上のそれらの位
置によって別々に区別された異なった結合試薬を含有す
る別々の位置を滴定するのに、同じ第1および第2の現
像試薬を用いる請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】特定の被分析物に特異的な結合部位を有す
る結合試薬が、その被分析物の一連の濃度測定値が得ら
れるように、支持体上の多数の別々の位置に固定化され
る請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項8】別々の位置がミクロスポットである請求項
5〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項9】ミクロスポットの面積が1mm2より小さい請
求項8に記載の方法。 - 【請求項10】結合試薬が抗原に対する結合部位を有す
る抗体であるか、核酸被分析物に結合し得るオリゴヌク
レオチドである請求項1〜9のいずれか1項に記載の方
法。 - 【請求項11】請求項1〜10のいずれか1項に記載の方
法による液体試料中の被分析物の濃度を測定するための
キットであって、 (a)被分析物に特異的な結合部位を有する結合試薬で
ある結合試薬を付着させた固体支持体、 (b)第1の現像試薬は被分析物によって占有されてい
ない結合部位に結合でき、 第1の標識を有するものであり、第2の現像試薬は結合
された被分析物または占有された結合部位に結合でき、
第1の標識とは異なる第2の標識を有しているものであ
る、第1および第2の現像試薬を含んでなる滴定試薬: を含んでなるキット。
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