JP3442327B2 - ハイブリダイゼーション検出方法及びバイオチップ - Google Patents
ハイブリダイゼーション検出方法及びバイオチップInfo
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- JP3442327B2 JP3442327B2 JP32835299A JP32835299A JP3442327B2 JP 3442327 B2 JP3442327 B2 JP 3442327B2 JP 32835299 A JP32835299 A JP 32835299A JP 32835299 A JP32835299 A JP 32835299A JP 3442327 B2 JP3442327 B2 JP 3442327B2
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サンプル生体高分
子とプローブ生体高分子とのハイブリダイゼーションを
利用してサンプル生体高分子に目的とする配列が存在す
るか否かを分析するハイブリダイゼーション検出法、及
びそれに用いられるバイオチップに関する。
子とプローブ生体高分子とのハイブリダイゼーションを
利用してサンプル生体高分子に目的とする配列が存在す
るか否かを分析するハイブリダイゼーション検出法、及
びそれに用いられるバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、生体内の分子を同定・分画す
るために、特に目的ＤＮＡの検出、あるいは遺伝子ＤＮ
Ａの有無検出などのために、既知の配列をもつ核酸や蛋
白質をプローブとしてハイブリダイズする方法が多く用
いられてきた。ハイブリダイゼーション検出の方法は、
固定したプローブＤＮＡに蛍光物質を標識したサンプル
ＤＮＡを入れてハイブリダイズさせる。サンプルＤＮＡ
がプローブＤＮＡに結合すると、プローブＤＮＡと一緒
に固定され、光源からの励起光で蛍光物質を励起し、発
光する蛍光を検出することでハイブリダイゼーションを
検出していた。
るために、特に目的ＤＮＡの検出、あるいは遺伝子ＤＮ
Ａの有無検出などのために、既知の配列をもつ核酸や蛋
白質をプローブとしてハイブリダイズする方法が多く用
いられてきた。ハイブリダイゼーション検出の方法は、
固定したプローブＤＮＡに蛍光物質を標識したサンプル
ＤＮＡを入れてハイブリダイズさせる。サンプルＤＮＡ
がプローブＤＮＡに結合すると、プローブＤＮＡと一緒
に固定され、光源からの励起光で蛍光物質を励起し、発
光する蛍光を検出することでハイブリダイゼーションを
検出していた。
【０００３】図７、図８、図９は、この従来のハイブリ
ダイゼーション検出方法の原理を説明する図である。図
７に示すように、一定量のプローブＤＮＡ１ａをガラス
プレート４にスポット３ａとして固定化する。別種のプ
ローブＤＮＡ１ｂ、プローブＤＮＡ１ｃも同様に、スポ
ット３ｂ、スポット３ｃとして固定化する。このとき、
各スポット１ａ，１ｂ，１ｃのプローブＤＮＡを全て同
量にして固定化することはできない。
ダイゼーション検出方法の原理を説明する図である。図
７に示すように、一定量のプローブＤＮＡ１ａをガラス
プレート４にスポット３ａとして固定化する。別種のプ
ローブＤＮＡ１ｂ、プローブＤＮＡ１ｃも同様に、スポ
ット３ｂ、スポット３ｃとして固定化する。このとき、
各スポット１ａ，１ｂ，１ｃのプローブＤＮＡを全て同
量にして固定化することはできない。
【０００４】図８（ａ）に示すように、全てのサンプル
ＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…を蛍光物質６で標識する。
図８（ｂ）に示すように、プローブＤＮＡとサンプルＤ
ＮＡをハイブリダイズさせるために、スポットされたガ
ラスプレート４と蛍光標識したサンプルＤＮＡ５ａ，５
ｂ，５ｃ，…をハイブリダイゼーション溶液７に入れ、
ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液７
は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（ＮａＣｌ，trisodium
citrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤ
ＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水な
どからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの
性質により異なる。
ＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…を蛍光物質６で標識する。
図８（ｂ）に示すように、プローブＤＮＡとサンプルＤ
ＮＡをハイブリダイズさせるために、スポットされたガ
ラスプレート４と蛍光標識したサンプルＤＮＡ５ａ，５
ｂ，５ｃ，…をハイブリダイゼーション溶液７に入れ、
ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液７
は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（ＮａＣｌ，trisodium
citrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤ
ＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水な
どからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの
性質により異なる。
【０００５】このとき図８（ｃ）に示すように、サンプ
ルＤＮＡとプローブＤＮＡが相補鎖であればプローブＤ
ＮＡ１ａ，１ｂとサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂのようにハ
イブリダイゼーションして二重らせん構造で結合する。
一方、両者が相補鎖ＤＮＡでなければ、プローブＤＮＡ
１ｃのようにサンプルＤＮＡが結合しないでそのままで
ある。ハイブリダイゼーションの検出は、図９に示すよ
うに、励起光源としてのランプ９からの励起光でガラス
プレート４を照射して蛍光物質６を励起し、発光波長域
以外の光を光学フィルター１０でカットして、各スポッ
トからの発光をＣＣＤカメラなどの二次元光センサー８
で検出する。
ルＤＮＡとプローブＤＮＡが相補鎖であればプローブＤ
ＮＡ１ａ，１ｂとサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂのようにハ
イブリダイゼーションして二重らせん構造で結合する。
一方、両者が相補鎖ＤＮＡでなければ、プローブＤＮＡ
１ｃのようにサンプルＤＮＡが結合しないでそのままで
ある。ハイブリダイゼーションの検出は、図９に示すよ
うに、励起光源としてのランプ９からの励起光でガラス
プレート４を照射して蛍光物質６を励起し、発光波長域
以外の光を光学フィルター１０でカットして、各スポッ
トからの発光をＣＣＤカメラなどの二次元光センサー８
で検出する。
【０００６】この時、ハイブリダイザーションが生じた
スポット３ａ，３ｂには蛍光物質６が存在するため、ラ
ンプ９からの励起光によって蛍光物質６が励起され、発
光が検出される。一方、ハイブリダイゼーションが生じ
ていないスポット３ｃには蛍光物質が存在しないため、
ランプ９からの励起光照射によっても発光は生じない。
このようにして、ハイブリダイゼーションが生じたか否
かによってスポット毎に明暗が観察される。二次元光セ
ンサー８からの画像データは、コントローラ１２によっ
てコンピュータ１３に転送され、ディスプレイに画像表
示される。
スポット３ａ，３ｂには蛍光物質６が存在するため、ラ
ンプ９からの励起光によって蛍光物質６が励起され、発
光が検出される。一方、ハイブリダイゼーションが生じ
ていないスポット３ｃには蛍光物質が存在しないため、
ランプ９からの励起光照射によっても発光は生じない。
このようにして、ハイブリダイゼーションが生じたか否
かによってスポット毎に明暗が観察される。二次元光セ
ンサー８からの画像データは、コントローラ１２によっ
てコンピュータ１３に転送され、ディスプレイに画像表
示される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】プローブＤＮＡをガラ
スプレートに固定化するとき、全てのプローブを同じ量
ずつ均等にスポットすることはできないため、プローブ
が多量に固定化されたスポットと少量に固定化されたス
ポットとではプローブＤＮＡの量が異なる。このため、
ハイブリダイゼーションの検出ではサンプルＤＮＡがハ
イブリダイズしたか否かは判断できるが、どの位のプロ
ーブＤＮＡにどの程度のサンプルＤＮＡがハイブリダイ
スしたか定量的な測定を行うことはできなかった。本発
明は、このような従来技術の問題点に鑑みなされたもの
で、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡがどの程度ハイブ
リダイズしたか、定量的な測定が可能な検出方法を提供
することを目的とする。
スプレートに固定化するとき、全てのプローブを同じ量
ずつ均等にスポットすることはできないため、プローブ
が多量に固定化されたスポットと少量に固定化されたス
ポットとではプローブＤＮＡの量が異なる。このため、
ハイブリダイゼーションの検出ではサンプルＤＮＡがハ
イブリダイズしたか否かは判断できるが、どの位のプロ
ーブＤＮＡにどの程度のサンプルＤＮＡがハイブリダイ
スしたか定量的な測定を行うことはできなかった。本発
明は、このような従来技術の問題点に鑑みなされたもの
で、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡがどの程度ハイブ
リダイズしたか、定量的な測定が可能な検出方法を提供
することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するた
め、本発明では、プローブ生体高分子とサンプル生体高
分子に各々異なる蛍光物質を標識し、蛍光物質の発光波
長が異なることを利用して各スポット毎に、そのスポッ
トに存在しているプローブ生体高分子とサンプル生体高
分子を別々に検出できるようにする。また、ハイブリダ
イゼーションの検出で、プローブ生体高分子を標識して
いる蛍光物質の発光波長とサンプル生体高分子を標識し
ている蛍光物質の発光波長を分離検出することにより、
各スポット毎にプローブ生体高分子の量及びそのプロー
ブ生体高分子にハイブリダイズしたサンプル生体高分子
の量を個別に検出して定量測定することを可能とする。
め、本発明では、プローブ生体高分子とサンプル生体高
分子に各々異なる蛍光物質を標識し、蛍光物質の発光波
長が異なることを利用して各スポット毎に、そのスポッ
トに存在しているプローブ生体高分子とサンプル生体高
分子を別々に検出できるようにする。また、ハイブリダ
イゼーションの検出で、プローブ生体高分子を標識して
いる蛍光物質の発光波長とサンプル生体高分子を標識し
ている蛍光物質の発光波長を分離検出することにより、
各スポット毎にプローブ生体高分子の量及びそのプロー
ブ生体高分子にハイブリダイズしたサンプル生体高分子
の量を個別に検出して定量測定することを可能とする。
【０００９】すなわち、プローブ生体高分子を標識した
蛍光物質を発光させてガラスプレートのスポットに固定
化されたプローブ生体高分子の量を求め、更にサンプル
生体高分子を標識した蛍光物質を発光させてプローブ生
体高分子にハイブリダイズしたサンプル生体高分子の量
を求める。そして、その差分を前記プローブの量で規格
化した値で、基板上にスポットされたプローブ量に対し
て、サンプルがどれくらいハイブリダイズしたかを測定
する。ここで生体高分子とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質
など、生体を構成する高分子をいう。
蛍光物質を発光させてガラスプレートのスポットに固定
化されたプローブ生体高分子の量を求め、更にサンプル
生体高分子を標識した蛍光物質を発光させてプローブ生
体高分子にハイブリダイズしたサンプル生体高分子の量
を求める。そして、その差分を前記プローブの量で規格
化した値で、基板上にスポットされたプローブ量に対し
て、サンプルがどれくらいハイブリダイズしたかを測定
する。ここで生体高分子とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質
など、生体を構成する高分子をいう。
【００１０】以上をまとめると、本発明によるハイブリ
ダイゼーション検出方法は、プローブとサンプルとのハ
イブリダイゼーションを検出するハイブリダイゼーショ
ン検出方法において、プローブの量と前記プローブに結
合したサンプルの量とを検出することを特徴とする。こ
こでいうプローブとは、基板に固定する生体高分子（例
えばＤＮＡ）を示し、サンプルとはハイブリダイズに用
いる生体高分子（例えばＤＮＡ）を示す。本発明による
ハイブリダイゼーション検出方法は、また、プローブと
サンプルとのハイブリダイゼーションを検出するハイブ
リダイゼーション検出方法において、プローブの量と前
記プローブに結合したサンプルの量との差分を前記プロ
ーブの量で規格化した値を検出することを特徴とする。
ダイゼーション検出方法は、プローブとサンプルとのハ
イブリダイゼーションを検出するハイブリダイゼーショ
ン検出方法において、プローブの量と前記プローブに結
合したサンプルの量とを検出することを特徴とする。こ
こでいうプローブとは、基板に固定する生体高分子（例
えばＤＮＡ）を示し、サンプルとはハイブリダイズに用
いる生体高分子（例えばＤＮＡ）を示す。本発明による
ハイブリダイゼーション検出方法は、また、プローブと
サンプルとのハイブリダイゼーションを検出するハイブ
リダイゼーション検出方法において、プローブの量と前
記プローブに結合したサンプルの量との差分を前記プロ
ーブの量で規格化した値を検出することを特徴とする。
【００１１】プローブの量とプローブに結合したサンプ
ルの量の検出は、ハイブリダイゼーションを行う前にプ
ローブの量を検出し、ハイブリダイゼーション終了後に
プローブに結合したサンプルの量を検出するようにして
もよいし、ハイブリダイゼーション終了後にプローブの
量とプローブに結合したサンプルの量を共に検出するよ
うにしてもよい。
ルの量の検出は、ハイブリダイゼーションを行う前にプ
ローブの量を検出し、ハイブリダイゼーション終了後に
プローブに結合したサンプルの量を検出するようにして
もよいし、ハイブリダイゼーション終了後にプローブの
量とプローブに結合したサンプルの量を共に検出するよ
うにしてもよい。
【００１２】プローブの量とプローブに結合したサンプ
ルの量の検出は、プローブとサンプルに各々異なる検出
用の標識を付けておき、その標識を検出することで行う
ことができる。検出されたプローブの量とプローブに結
合したサンプルの量との差分を前記プローブの量で規格
化した値はディスプレイに表示することができる。本発
明によるバイオチップは、蛍光物質で標識したプローブ
をスポットしたことを特徴とする。
ルの量の検出は、プローブとサンプルに各々異なる検出
用の標識を付けておき、その標識を検出することで行う
ことができる。検出されたプローブの量とプローブに結
合したサンプルの量との差分を前記プローブの量で規格
化した値はディスプレイに表示することができる。本発
明によるバイオチップは、蛍光物質で標識したプローブ
をスポットしたことを特徴とする。
【００１３】基板に固定されるプローブ量は、各プロー
ブごと、各基板ごとに異なる。同じプローブが固定され
ている２個のバイオチップ１，２を用いて、異なるサン
プルＡ、Ｂについて実験を行ったときを例に挙げて説明
する。用いたサンプル及びプローブはＤＮＡであるとす
る。バイオチップ上のあるプローブが、バイオチップ１
には１０ｎｇ固定され、バイオチップ２には８ｎｇ固定
されていて、ハイブリダイズ前の蛍光強度が例えば２５
６階調の１００と８０あったとする。サンプルＡ、Ｂを
それぞれこのバイオチップ１，２上のプローブとハイブ
リダイズしたとき、ハイブリダイズ後の蛍光強度がサン
プルＡは７０、サンプルＢは６０となったとすると、こ
のままではサンプルＡの方がサンプルＢよりもそのＤＮ
Ａ量が多いと判断される。しかし、バイオチップにもと
もと固定されていたプローブの量とそのプローブに結合
したサンプルの量との差分をプローブの量で規格化した
値を計算して、どのくらいの割合でハイブリダイズして
いるのかを考えると、サンプルＡ：（１００−７０）÷
１００＝０．３サンプルＢ：（８０−６０）÷８０＝
０．２５となり、プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ
の割合は実際にはサンプルＡの方がサンプルＢより少な
いといえる。このようにハイブリダイズ後の蛍光強度だ
けでサンプルのＤＮＡ量を考えるより、より精密な解析
ができる。
ブごと、各基板ごとに異なる。同じプローブが固定され
ている２個のバイオチップ１，２を用いて、異なるサン
プルＡ、Ｂについて実験を行ったときを例に挙げて説明
する。用いたサンプル及びプローブはＤＮＡであるとす
る。バイオチップ上のあるプローブが、バイオチップ１
には１０ｎｇ固定され、バイオチップ２には８ｎｇ固定
されていて、ハイブリダイズ前の蛍光強度が例えば２５
６階調の１００と８０あったとする。サンプルＡ、Ｂを
それぞれこのバイオチップ１，２上のプローブとハイブ
リダイズしたとき、ハイブリダイズ後の蛍光強度がサン
プルＡは７０、サンプルＢは６０となったとすると、こ
のままではサンプルＡの方がサンプルＢよりもそのＤＮ
Ａ量が多いと判断される。しかし、バイオチップにもと
もと固定されていたプローブの量とそのプローブに結合
したサンプルの量との差分をプローブの量で規格化した
値を計算して、どのくらいの割合でハイブリダイズして
いるのかを考えると、サンプルＡ：（１００−７０）÷
１００＝０．３サンプルＢ：（８０−６０）÷８０＝
０．２５となり、プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ
の割合は実際にはサンプルＡの方がサンプルＢより少な
いといえる。このようにハイブリダイズ後の蛍光強度だ
けでサンプルのＤＮＡ量を考えるより、より精密な解析
ができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、図面を参照して本発明の実
施の形態について説明する。ここでは、本発明の一例と
して、プローブ生体高分子及びサンプル生体高分子が共
にＤＮＡである場合について説明するが、ＤＮＡ以外の
ＲＮＡや蛋白質に対しても本発明が同様に適用可能であ
るのは勿論である。
施の形態について説明する。ここでは、本発明の一例と
して、プローブ生体高分子及びサンプル生体高分子が共
にＤＮＡである場合について説明するが、ＤＮＡ以外の
ＲＮＡや蛋白質に対しても本発明が同様に適用可能であ
るのは勿論である。
【００１５】図１〜図３は、本発明によるハイブリダイ
ゼーション検出方法の一例の原理を説明する図である。
図１に示すように、全てのプローブＤＮＡ１ａ，１ｂ，
１ｃ，…に同一の蛍光物質２を標識する。蛍光物質２と
しては、例えばイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩ
ＴＣ）を使用する。プローブＤＮＡ１ａをガラスプレー
ト４にスポット３ａとして固定化し、別種のプローブＤ
ＮＡ１ｂ、プローブＤＮＡ１ｃ、…も同様に、スポット
３ｂ、スポット３ｃ、…としてガラスプレート４に固定
化する。
ゼーション検出方法の一例の原理を説明する図である。
図１に示すように、全てのプローブＤＮＡ１ａ，１ｂ，
１ｃ，…に同一の蛍光物質２を標識する。蛍光物質２と
しては、例えばイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩ
ＴＣ）を使用する。プローブＤＮＡ１ａをガラスプレー
ト４にスポット３ａとして固定化し、別種のプローブＤ
ＮＡ１ｂ、プローブＤＮＡ１ｃ、…も同様に、スポット
３ｂ、スポット３ｃ、…としてガラスプレート４に固定
化する。
【００１６】また、図２（ａ）に示すように、サンプル
ＤＮＡは全てのサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…を
蛍光物質６で標識する。蛍光物質６としては、例えばＣ
ｙ５を使用する。ハイブリダイゼーションに当たって
は、図２（ｂ）に示すように、プローブＤＮＡとサンプ
ルＤＮＡをハイブリダイズさせるために、プローブＤＮ
Ａ１ａ，１ｂ，１ｃ，…がスポットされたガラスプレー
ト４（図１参照）と蛍光標識したサンプルＤＮＡ５ａ，
５ｂ，５ｃ，…とをハイブリダイゼーション溶液７に入
れ、ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶
液７は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（ＮａＣｌ，trisod
ium citrate）、ＳＤＳ（sodium dodecylsulfate）、Ｅ
ＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水
などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡ
の性質により異なる。
ＤＮＡは全てのサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…を
蛍光物質６で標識する。蛍光物質６としては、例えばＣ
ｙ５を使用する。ハイブリダイゼーションに当たって
は、図２（ｂ）に示すように、プローブＤＮＡとサンプ
ルＤＮＡをハイブリダイズさせるために、プローブＤＮ
Ａ１ａ，１ｂ，１ｃ，…がスポットされたガラスプレー
ト４（図１参照）と蛍光標識したサンプルＤＮＡ５ａ，
５ｂ，５ｃ，…とをハイブリダイゼーション溶液７に入
れ、ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶
液７は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（ＮａＣｌ，trisod
ium citrate）、ＳＤＳ（sodium dodecylsulfate）、Ｅ
ＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水
などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡ
の性質により異なる。
【００１７】このとき、サンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５
ｃ，…とプローブＤＮＡが相補鎖であれば、図２（ｃ）
に示すスポット３ａのプローブＤＮＡ１ａやスポット３
ｂのプローブＤＮＡ１ｂのように、サンプルＤＮＡ５
ａ，５ｂ，５ｃ，…とハイブリダイゼーションして二重
らせん構造で結合する。一方、両者が相補鎖ＤＮＡでな
ければ、図２（ｃ）に示すスポット３ｃのプローブＤＮ
Ａ１ｃのように、サンプルＤＮＡが結合しないでそのま
まである。つまり、ハイブリダイゼーションが生じたス
ポット３ａや３ｂには、プローブＤＮＡ１ａ，１ｂを標
識している蛍光物質２と、プローブＤＮＡ１ａ，１ｂに
結合したサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂを標識している蛍光
物質６が存在する。一方、ハイブリダイゼーションが生
じていないスポット３ｃには、プローブＤＮＡ１ｃを標
識している蛍光物質２のみが存在する。
ｃ，…とプローブＤＮＡが相補鎖であれば、図２（ｃ）
に示すスポット３ａのプローブＤＮＡ１ａやスポット３
ｂのプローブＤＮＡ１ｂのように、サンプルＤＮＡ５
ａ，５ｂ，５ｃ，…とハイブリダイゼーションして二重
らせん構造で結合する。一方、両者が相補鎖ＤＮＡでな
ければ、図２（ｃ）に示すスポット３ｃのプローブＤＮ
Ａ１ｃのように、サンプルＤＮＡが結合しないでそのま
まである。つまり、ハイブリダイゼーションが生じたス
ポット３ａや３ｂには、プローブＤＮＡ１ａ，１ｂを標
識している蛍光物質２と、プローブＤＮＡ１ａ，１ｂに
結合したサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂを標識している蛍光
物質６が存在する。一方、ハイブリダイゼーションが生
じていないスポット３ｃには、プローブＤＮＡ１ｃを標
識している蛍光物質２のみが存在する。
【００１８】ハイブリダイゼーションの検出は、図３に
示すように、励起光源としてのランプ９からの励起光で
サンプルを標識する蛍光物質６とプローブＤＮＡを蛍光
物質２を励起して発光させる。励起光源のランプとして
は例えば、発光波長域が約３００−約７００ｎｍである
キセノンランプを使用する。これは、ＦＩＴＣが励起波
長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍであり、Ｃｙ５が励
起波長６５０ｎｍ、発光波長６６７ｎｍであるため、両
方の蛍光物質を同時に発光させることができるからであ
る。発光の検出にあたっては、ＦＩＴＣの発光を読み取
るときは透過波長５２０ｎｍの光学フィルター１０を、
Ｃｙ５の発光を読み取るときは透過波長６６７ｎｍの光
学フィルター１１を用いて二次元光センサー８で読み取
る。二次元光センサー８からのデータは、コントローラ
ー１２によってコンピュータ１３へ転送される。二次元
光センサー８としては例えばＣＣＤカメラを使用し、２
枚の光学フィルター１０，１１はステージ１４の駆動に
よって矢印の方向に移動され、交換される。
示すように、励起光源としてのランプ９からの励起光で
サンプルを標識する蛍光物質６とプローブＤＮＡを蛍光
物質２を励起して発光させる。励起光源のランプとして
は例えば、発光波長域が約３００−約７００ｎｍである
キセノンランプを使用する。これは、ＦＩＴＣが励起波
長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍであり、Ｃｙ５が励
起波長６５０ｎｍ、発光波長６６７ｎｍであるため、両
方の蛍光物質を同時に発光させることができるからであ
る。発光の検出にあたっては、ＦＩＴＣの発光を読み取
るときは透過波長５２０ｎｍの光学フィルター１０を、
Ｃｙ５の発光を読み取るときは透過波長６６７ｎｍの光
学フィルター１１を用いて二次元光センサー８で読み取
る。二次元光センサー８からのデータは、コントローラ
ー１２によってコンピュータ１３へ転送される。二次元
光センサー８としては例えばＣＣＤカメラを使用し、２
枚の光学フィルター１０，１１はステージ１４の駆動に
よって矢印の方向に移動され、交換される。
【００１９】コンピュータ１３では、ＦＩＴＣの発光を
読み取ったデータ値から各スポットにおけるプローブＤ
ＮＡの量を求め、Ｃｙ５の発光を読み取ったデータ値か
ら各スポットにおいてプローブＤＮＡとハイブリダイズ
したサンプルＤＮＡの量を求める。ＦＩＴＣの発光量Ａ
ｉからＣｙ５の発光量Ｂｉを引いて得られた差分をＦＩ
ＴＣの発光量で割った評価値Ｃｉ〔Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂ
ｉ）／Ａｉ〕を計算すれば、プローブＤＮＡ量からの相
対値でハイブリダイズしたサンプルＤＮＡ量を求めるこ
とができ、高精度な定量測定ができる。
読み取ったデータ値から各スポットにおけるプローブＤ
ＮＡの量を求め、Ｃｙ５の発光を読み取ったデータ値か
ら各スポットにおいてプローブＤＮＡとハイブリダイズ
したサンプルＤＮＡの量を求める。ＦＩＴＣの発光量Ａ
ｉからＣｙ５の発光量Ｂｉを引いて得られた差分をＦＩ
ＴＣの発光量で割った評価値Ｃｉ〔Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂ
ｉ）／Ａｉ〕を計算すれば、プローブＤＮＡ量からの相
対値でハイブリダイズしたサンプルＤＮＡ量を求めるこ
とができ、高精度な定量測定ができる。
【００２０】上記評価値Ｃｉを計算することにより、評
価値Ｃｉ〔Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉ〕が大きいほど
プローブＤＮＡにハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの
量が少ないことを意味し、反対に評価値Ｃｉが小さいほ
どプローブＤＮＡにハイブリダイズしたサンプルＤＮＡ
の量が多い、即ちプローブＤＮＡと相補性があると判断
できる。ここで、評価値としてＣｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／
Ａｉを採用したのは、プローブＤＮＡ量からハイブリダ
イズしたサンプルＤＮＡ量を引いた方が比較を簡単に行
えるからである。つまり、どんな状態でも、基板上に固
定されたプローブＤＮＡの方が、そのＤＮＡにハイブリ
ダイズしたサンプルＤＮＡの量より少ないということは
ないからである。
価値Ｃｉ〔Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉ〕が大きいほど
プローブＤＮＡにハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの
量が少ないことを意味し、反対に評価値Ｃｉが小さいほ
どプローブＤＮＡにハイブリダイズしたサンプルＤＮＡ
の量が多い、即ちプローブＤＮＡと相補性があると判断
できる。ここで、評価値としてＣｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／
Ａｉを採用したのは、プローブＤＮＡ量からハイブリダ
イズしたサンプルＤＮＡ量を引いた方が比較を簡単に行
えるからである。つまり、どんな状態でも、基板上に固
定されたプローブＤＮＡの方が、そのＤＮＡにハイブリ
ダイズしたサンプルＤＮＡの量より少ないということは
ないからである。
【００２１】図４は、評価値の処理手順を示すフローチ
ャートである。ステップ１１において、評価値を計算す
るスポットの番号を初期設定する。ステップ１２では、
スポットｉのＦＩＴＣの発光量ＡｉとＣｙ５の発光量Ｂ
ｉを求める。ステップ１３では、発光量の差分を発光量
Ａｉで割った値Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉを計算す
る。得られた評価値Ｃｉはハイブリダイズしなかったプ
ローブＤＮＡ量に対応し、これからサンプルＤＮＡとプ
ローブＤＮＡとの相補性の程度を判断することができ
る。ステップ１４では、求めた相対値Ｃｉをコンピュー
タ１３の表示部に階調として表示する。このとき、評価
値の大きい値は明るく、小さい値は暗く表示する。ま
た、ポジフィルムのようにその反対で表示してもよい。
ステップ１５では、全てのスポットを処理したかチェッ
クし、全てのスポットの処理が終了してないときはステ
ップ１６で次のスポットの位置を求め、ステップ１２か
らの処理を繰り返す。全てのスポットの計算が終了した
ときは処理を終了する。
ャートである。ステップ１１において、評価値を計算す
るスポットの番号を初期設定する。ステップ１２では、
スポットｉのＦＩＴＣの発光量ＡｉとＣｙ５の発光量Ｂ
ｉを求める。ステップ１３では、発光量の差分を発光量
Ａｉで割った値Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉを計算す
る。得られた評価値Ｃｉはハイブリダイズしなかったプ
ローブＤＮＡ量に対応し、これからサンプルＤＮＡとプ
ローブＤＮＡとの相補性の程度を判断することができ
る。ステップ１４では、求めた相対値Ｃｉをコンピュー
タ１３の表示部に階調として表示する。このとき、評価
値の大きい値は明るく、小さい値は暗く表示する。ま
た、ポジフィルムのようにその反対で表示してもよい。
ステップ１５では、全てのスポットを処理したかチェッ
クし、全てのスポットの処理が終了してないときはステ
ップ１６で次のスポットの位置を求め、ステップ１２か
らの処理を繰り返す。全てのスポットの計算が終了した
ときは処理を終了する。
【００２２】図５及び図６は、本発明による検出方法の
他の例の原理を説明する図である。この検出方法は、ハ
イブリダイゼーションする前にプローブＤＮＡの量、す
なわちプローブＤＮＡに標識したＦＩＴＣ等の発光量を
読み取っておき、ハイブリダイゼーション後、サンプル
ＤＮＡの量、すなわちサンプルＤＮＡに標識したＣｙ５
等の発光量を読み取り、評価値を求める方法である。
他の例の原理を説明する図である。この検出方法は、ハ
イブリダイゼーションする前にプローブＤＮＡの量、す
なわちプローブＤＮＡに標識したＦＩＴＣ等の発光量を
読み取っておき、ハイブリダイゼーション後、サンプル
ＤＮＡの量、すなわちサンプルＤＮＡに標識したＣｙ５
等の発光量を読み取り、評価値を求める方法である。
【００２３】図５（ａ）に示すように、例えばＦＩＴＣ
のような蛍光物質で標識したプローブＤＮＡをスポット
３ａ，３ｂ，３ｃ，…としてガラスプレート４に固定化
する。これは、先に図１にて説明したのと同様の方法で
行う。次に、ハイブリダイゼーション前に各スポット３
ａ，３ｂ，３ｃ，…のプローブＤＮＡの量を読み取るた
め、図５（ｂ）に示すように、ランプ９からの励起光を
照射してプローブＤＮＡに標識したＦＩＴＣの発光量を
二次元光センサー８で読み取る。このとき、二次元光セ
ンサー８の光路中には透過波長５２０ｎｍの光学フィル
ター１０を配置する。これは、先に図３によって説明し
たＦＩＴＣの発光量読み取りと同様にして行われる。読
み取った各スポットの発光量データＡｉは、フロッピー
ディスク１４などの記憶媒体に格納しておく。
のような蛍光物質で標識したプローブＤＮＡをスポット
３ａ，３ｂ，３ｃ，…としてガラスプレート４に固定化
する。これは、先に図１にて説明したのと同様の方法で
行う。次に、ハイブリダイゼーション前に各スポット３
ａ，３ｂ，３ｃ，…のプローブＤＮＡの量を読み取るた
め、図５（ｂ）に示すように、ランプ９からの励起光を
照射してプローブＤＮＡに標識したＦＩＴＣの発光量を
二次元光センサー８で読み取る。このとき、二次元光セ
ンサー８の光路中には透過波長５２０ｎｍの光学フィル
ター１０を配置する。これは、先に図３によって説明し
たＦＩＴＣの発光量読み取りと同様にして行われる。読
み取った各スポットの発光量データＡｉは、フロッピー
ディスク１４などの記憶媒体に格納しておく。
【００２４】例えばＣｙ５からなる蛍光物質６で標識し
たサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…とプローブＤＮ
Ａとのハイブリダイゼーションは、図６（ａ）に示すよ
うに、図２（ｂ）で説明したのと同様にして行われる。
ハイブリダイゼーションの検出は、図６（ｂ）に示すよ
うに、ランプ９からの励起光でガラスプレート４を照射
し、Ｃｙ５からの発光量を二次元光センサー８で読み取
ることによって行われる。このとき、二次元光センサー
８の光路中には透過波長６６７ｎｍの光学フィルター１
１を配置する。これは、図３で説明したＣｙ５の発光読
取りと同様である。このあと、フロッピーディスク１４
に格納されているＦＩＴＣの発光量データＡｉを読み込
み、Ｃｙ５の発光量データＢｉとの差分をとる。各差分
はＦＩＴＣの発光量データＡｉで割る。差分の取り方
は、図３に示す処理と同様であり、この方法によっても
定量測定ができる。
たサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…とプローブＤＮ
Ａとのハイブリダイゼーションは、図６（ａ）に示すよ
うに、図２（ｂ）で説明したのと同様にして行われる。
ハイブリダイゼーションの検出は、図６（ｂ）に示すよ
うに、ランプ９からの励起光でガラスプレート４を照射
し、Ｃｙ５からの発光量を二次元光センサー８で読み取
ることによって行われる。このとき、二次元光センサー
８の光路中には透過波長６６７ｎｍの光学フィルター１
１を配置する。これは、図３で説明したＣｙ５の発光読
取りと同様である。このあと、フロッピーディスク１４
に格納されているＦＩＴＣの発光量データＡｉを読み込
み、Ｃｙ５の発光量データＢｉとの差分をとる。各差分
はＦＩＴＣの発光量データＡｉで割る。差分の取り方
は、図３に示す処理と同様であり、この方法によっても
定量測定ができる。
【００２５】この方法は、基板にどの程度プローブＤＮ
Ａが固定化されたか、ハイブリダイゼーションを行う前
に分かるため、サンプルＤＮＡの量をどの程度にしてハ
イブリダイゼーションすればよいか、また、プローブＤ
ＮＡが固定化できなかった無効なスポットの位置などを
ハイブリダイゼーション前に知ることができるため、事
前の対処ができ、効率の良い実験ができる。
Ａが固定化されたか、ハイブリダイゼーションを行う前
に分かるため、サンプルＤＮＡの量をどの程度にしてハ
イブリダイゼーションすればよいか、また、プローブＤ
ＮＡが固定化できなかった無効なスポットの位置などを
ハイブリダイゼーション前に知ることができるため、事
前の対処ができ、効率の良い実験ができる。
【００２６】
【発明の効果】本発明によると、スポットされたプロー
ブの量と、プローブにハイブリダイゼーションしたサン
プルの量を知ることができ、その差分を前記プローブの
量で規格化した値を求めることでより厳密なハイブリダ
イズ量（相補性の程度）を計算でき、プローブに結合し
たサンプルの量を高精度に測定することができる。
ブの量と、プローブにハイブリダイゼーションしたサン
プルの量を知ることができ、その差分を前記プローブの
量で規格化した値を求めることでより厳密なハイブリダ
イズ量（相補性の程度）を計算でき、プローブに結合し
たサンプルの量を高精度に測定することができる。
【図１】本発明によるハイブリダイゼーション検出方法
の一例の原理を説明する図。
の一例の原理を説明する図。
【図２】本発明によるハイブリダイゼーション検出方法
の一例の原理を説明する図。
の一例の原理を説明する図。
【図３】本発明によるハイブリダイゼーション検出方法
の一例の原理を説明する図。
の一例の原理を説明する図。
【図４】評価値の処理手順を示すフローチャート。
【図５】本発明による検出方法の他の例の原理を説明す
る図。
る図。
【図６】本発明による検出方法の他の例の原理を説明す
る図。
る図。
【図７】従来のハイブリダイゼーション検出方法の原理
を説明する図。
を説明する図。
【図８】従来のハイブリダイゼーション検出方法の原理
を説明する図。
を説明する図。
【図９】従来のハイブリダイゼーション検出方法の原理
を説明する図。
を説明する図。
１ａ，１ｂ，１ｃ…プローブＤＮＡ、２…蛍光物質、３
ａ，３ｂ，３ｃ…プローブＤＮＡのスポット、４…ガラ
スプレート、５ａ，５ｂ，５ｃ…サンプルＤＮＡ、６…
蛍光物質、７…ハイブリダイゼーション溶液、８…二次
元光センサー、９…励起光源、１０，１１…光学フィル
ター、１２…コンピュータ、１３…コントローラ、１４
…フロッピーディスク
ａ，３ｂ，３ｃ…プローブＤＮＡのスポット、４…ガラ
スプレート、５ａ，５ｂ，５ｃ…サンプルＤＮＡ、６…
蛍光物質、７…ハイブリダイゼーション溶液、８…二次
元光センサー、９…励起光源、１０，１１…光学フィル
ター、１２…コンピュータ、１３…コントローラ、１４
…フロッピーディスク
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(72)発明者 伊藤 敏明
神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地
日立ソフトウエアエンジニアリング株
式会社内
(72)発明者 渡辺 敏正
神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地
日立ソフトウエアエンジニアリング株
式会社内
(56)参考文献 特開 平６−341989（ＪＰ，Ａ)
特表 平９−512899（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/566
C12M 1/00
C12N 15/09
C12Q 1/68
G01N 33/50
G01N 33/53
Claims (6)
- 【請求項１】 プローブとサンプルとのハイブリダイゼ
ーションを検出するハイブリダイゼーション検出方法に
おいて、 プローブの量と前記プローブに結合したサンプルの量と
の差分を前記プローブの量で規格化した値を検出するこ
とを特徴とするハイブリダイゼーション検出方法。 - 【請求項２】 請求項１記載のハイブリダイゼーション
検出方法において、ハイブリダイゼーションを行う前に
プローブの量を検出し、ハイブリダイゼーション終了後
に前記プローブに結合したサンプルの量を検出すること
を特徴とするハイブリダイゼーション検出方法。 - 【請求項３】 請求項１記載のハイブリダイゼーション
検出方法において、ハイブリダイゼーション終了後にプ
ローブの量と前記プローブに結合したサンプルの量を検
出することを特徴とするハイブリダイゼーション検出方
法。 - 【請求項４】 請求項１記載のハイブリダイゼーション
検出方法において、プローブとサンプルに各々異なる検
出用の標識が付けられていることを特徴とするハイブリ
ダイゼーション検出方法。 - 【請求項５】 請求項１記載のハイブリダイゼーション
検出方法において、検出されたプローブの量と前記プロ
ーブに結合したサンプルの量との差分を前記プローブの
量で規格化した値をディスプレイに表示することを特徴
とするハイブリダイゼーション検出方法。 - 【請求項６】 プローブとサンプルとのハイブリダイゼ
ーションを検出するハイブリダイゼーション検出方法に
おいて、 第１の検出用標識が付けられた複数種類のプローブがそ
れぞれ異なる位置に固定化された基板を用い、前記第１
の検出用標識と異なる第２の検出用標識が付けられたサ
ンプルを前記基板上のプローブとハイブリダイズさせる
ステップと、 前記第１の検出用標識を検出して前記基板の各位置に固
定化された前記プローブの量を検出するステップと、 前記第２の検出用標識を検出して前記基板の各位置に固
定化された前記プローブにハイブリダイズしたサンプル
の量を検出するステップと、 前記基板の各位置に固定化された前記プローブの量と当
該プローブにハイブリダイズしたサンプルの量を前記プ
ローブの量で規格化することによって前記プローブと前
記サンプルの間のハイブリダイゼーションの程度を求め
るステップとを含むことを特徴とするハイブリダイゼー
ション検出方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32835299A JP3442327B2 (ja) | 1998-12-15 | 1999-11-18 | ハイブリダイゼーション検出方法及びバイオチップ |
| DE69930826T DE69930826T8 (de) | 1998-12-15 | 1999-12-10 | Hybridisierungsnachweisverfahren unter Verwendung von Biochips |
| EP99124644A EP1010764B1 (en) | 1998-12-15 | 1999-12-10 | Hydridization detection method using biochips |
| US09/459,712 US6775621B1 (en) | 1998-12-15 | 1999-12-13 | Degree of hybridization detection method |
| US10/780,862 US20040161801A1 (en) | 1998-12-15 | 2004-02-19 | Hybridization detection method and biochips |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35595698 | 1998-12-15 | ||
| JP10-355956 | 1998-12-15 | ||
| JP32835299A JP3442327B2 (ja) | 1998-12-15 | 1999-11-18 | ハイブリダイゼーション検出方法及びバイオチップ |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003130458A Division JP2004029009A (ja) | 1998-12-15 | 2003-05-08 | バイオチップ |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000235035A JP2000235035A (ja) | 2000-08-29 |
| JP3442327B2 true JP3442327B2 (ja) | 2003-09-02 |
Family
ID=26572838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32835299A Expired - Fee Related JP3442327B2 (ja) | 1998-12-15 | 1999-11-18 | ハイブリダイゼーション検出方法及びバイオチップ |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3442327B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| CA2457474A1 (en) * | 2001-08-21 | 2003-03-06 | Mcw Research Foundation, Inc. | Method and apparatus for three label microarrays |
| DE10145701A1 (de) * | 2001-09-17 | 2003-04-10 | Infineon Technologies Ag | Fluoreszenz-Biosensorchip und Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung |
| WO2004017068A1 (ja) * | 2002-08-12 | 2004-02-26 | Hitachi High-Technologies Corporation | Ｄｎａマイクロアレイを用いた核酸検出方法及び核酸検出装置 |
| JP5065913B2 (ja) * | 2005-02-16 | 2012-11-07 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | キャピラリ照明における屈折率整合 |
| EP1975247A1 (de) * | 2007-03-30 | 2008-10-01 | Micronas GmbH | Biochip und Verfahren zu dessen Herstellung |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP3479100B2 (ja) | 1993-06-02 | 2003-12-15 | 帝国臓器製薬株式会社 | 免疫化学的簡易半定量方法および装置 |
| GB9326451D0 (en) | 1993-12-24 | 1994-02-23 | Multilyte Ltd | Binding assay |
| US5861247A (en) * | 1996-01-26 | 1999-01-19 | University Of Chicago | Rapid method to detect duplex formation in sequencing by hybridization methods |
| US6023540A (en) * | 1997-03-14 | 2000-02-08 | Trustees Of Tufts College | Fiber optic sensor with encoded microspheres |
| US6197503B1 (en) | 1997-11-26 | 2001-03-06 | Ut-Battelle, Llc | Integrated circuit biochip microsystem containing lens |
| US6245518B1 (en) * | 1998-12-11 | 2001-06-12 | Hyseq, Inc. | Polynucleotide arrays and methods of making and using the same |
-
1999
- 1999-11-18 JP JP32835299A patent/JP3442327B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-12-10 EP EP99124644A patent/EP1010764B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-10 DE DE69930826T patent/DE69930826T8/de active Active
- 1999-12-13 US US09/459,712 patent/US6775621B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-02-19 US US10/780,862 patent/US20040161801A1/en not_active Abandoned
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