JP4414333B2 - 検体のマルチパラメーター解析を基礎とする溶液のためのシステム及び方法 - Google Patents

検体のマルチパラメーター解析を基礎とする溶液のためのシステム及び方法 Download PDF

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Description

本発明は溶液中における検体のマルチパラメーター解析のためのシステムに関し；更に本発明は溶液中における検体のかかるマルチパラメーター解析の実施の方法にも関する。
数百、又は数千のサンプルを同時に研究する必要がある多くの産業が存在する。連続した検査の伝統的なマニュアル技術を用いるかかる研究が、非常に時間がかかること、及び高価であることが証明された。マルチパラメータースクリーニングは、今や多くのサンプルの迅速な検定が求められる方法のための重要な手段となった。例えば、我々のヒトゲノムの理解における最近の進歩は、識別される多くの新規薬剤ターゲットの数を大きく増加させるに至った。同時に化学合成物の自動化された合成における躍進は、これらの新規ターゲットでの薬剤活性の可能性について、大量の合成物ライブラリーをスクリーニングする可能性を導いた。従って、かかる開発は、薬剤探索及び薬剤開発のためのより迅速、低廉、且つより人的負担が少ない解析方法のため、需要拡大を引き起こした。更なるマルチプル検査の適用が見出された産業の例は、診断、プロテオミクス、食品産業（例えば、餌中の獣医学上の薬剤残留物の検出、所望されない、及び危険な病原菌のモニタリング、及び防腐剤の識別のため）、及び化粧品産業（例えば、動物検査での代替を提供するため、活性成分及び新規分子のスクリニーングのため）である。
マルチプレキシング技術の開発では、ハイスルースクリーニング方法に改良がなされた。そこでは２つの主要の戦略、即ちマイクロアレイ上（例えば、ラベルされたチューブ又はウェル、高密度アレイ又はマイクロチップ）の特定の場所へそれぞれの分子を物理的に分離すること、又は個別にコード化された微小担体上（それぞれの担体はその表面と結合した特異的な分子を有する）で反応を実施すること、が採用される。
第一の戦略において、マイクロアレイ上の正確な位置（x,y-座標）が、その場所で解析される標的／化合物の識別を可能にする。この反応の追跡方法は、普通、位置的又は空間的コードと称される。多くの異なるマイクロアレイのフォーマットは、商業的に利用され得る（例えば、Affymetrix製GeneChip（登録商標））。かかるマイクロアレイ上で解析される分子の特徴はしばしば公知であるべきであり、及び予め単離されるべきであり、；かかる既存の知識は、短い先行時間で顧客の要求に合った特異的なマイクロアレイの製造を複雑且つ費用がかかる方法にする。スポットされたマイクロアレイの更なる不都合は、マイクロアレイ上でスポットされた分子の低品質である。これは検定から得られる検査結果の低い信頼性という結果となる。かかる低い信頼性は、今度はスポッティングの品質を確実にするために、マイクロアレイ及びスポットアレイの製造の間の厳しい品質管理の要件、又はマイクロアレイの中に組み込まれるそれぞれの分子の高い重複性でさえももたらしてしまう。それぞれのマイクロアレイでの検査の数の増加により、最先端の縮小化の使用が求められる。縮小化は試薬の量を減少させるためにも使用される。更に多くの企業及び研究施設がマイクロアレイを生産するために独自の方法を用いている。独自で実施し得る検査の数は、非常に限定され、上記の欠点も有す。これらの独自の解読は、データポイントリードの数に関しては時間と人的負担がかかる。
第二の戦略において、即ち微小担体に基づく検定の第二の方法は、それらの表面に結合した分子を識別することができる微小担体（支持体ともいう）のそれぞれのラベルの必要性を提起する。この方法は１の反応器中で特有な形でコードされた微小担体を混合し、同時にそれらを検定にかけることによって、より各ユーザーの事情に応じた設定にすることができる。結合された分子及び標的検体との間に都合の良い反応を見せるそれらの微小担体は、コードの解読に付され、それによって都合の良い反応を生じる分子の識別を導く。そのような技術の例は、Luminex CorporationのxMAP（商標）技術である。xMapシステムでは、１００の異なる光学的にコードされた微小担体に限定される。
別個の微小担体上の検査する分子の数が増えると、最先端の流体取扱い法が求められる。もしも異なる実験中で異なる分子のために微小担体の同一の識別コードが用いられる場合、結合した分子を持つ微小担体を調製する間に汚染のリスクがある。微小担体の数が実験中で増加した場合、スペクトルの重複の問題に偽陽性及びデータの低品質の問題が更に加わる。ｘＭａｐシステムと類似したマルチカラーのコード化を採用する微小担体技術の他の例は、例えばIllumina’s BeadArray(商標)システム、及びQuantum Dot Corporation’s Q-dot(商標)ナノクリスタルである。伝統的な検定の中で用いられるコード化した微小担体の識別のその他の方法は、高周波識別(RFID)技術（例えば米国特許No.US6361950に発表されたPharmaSeq社のmicro-transponders）もしくはバーコード識別技術（例えば、PCT国際公開No.WO0016893に発表されたSmartBead Technologies社のUltraplex(商標)システム）の使用である。これらのコード化された微小担体の新規のアプローチは、かかる微小担体検出のシグナル／ノイズ率を改善させた。
他のコード化された微小担体溶液は、IRORI社が発表したＰＣＴ国際公開No.WO96/36436の記載通りメモリーと共にプログラムに組めるマトリックスの使用を含む。この記録デバイスは、どの分子及び生物学的材料がプログラムに組めるそれぞれのマトリックスのマトリックス材料と結合するかの情報を蓄積する。これらのマトクックスは、１の容器中の溶液中に存在することができ、又はマイクロタイタープレートのウェルとそれぞれ結合することができる。いくつかのマトリックスは、マイクロアレイのフォームを採用するアレイ中で調整することもできる。Virtual Arrays Inc及びUniversity of Hertfordshire製の他の微粒子アレイ溶液が、ＰＣＴ国際公開No.WO00/63419及びWO02/37944にそれぞれ発表されている。粒子を基礎とするアレイは、位置を基礎とするマイクロアレイ溶液よりも、より各ユーザーの事情に応じたプローブ（分子）（このプローブはコード化された微粒子アレイに結合され、そして検査サンプルに対し検査される）を許容する。特有な方法で識別した粒子アレイ上のマルチプレキシドプローブの数が、数百又は数千という非常に大きな範囲になる場合、これらの粒子アレイ溶液は、さらなる自動化及びロボット化を要求する。全ての粒子を基礎とするアレイは、マルチプレキシングの数が増加した時、一定の検体／分子に対する交差反応性を伴う問題をも有する。粒子アレイラベル化分子及び標的検体の間との反応は、蛍光、発光、又は放射活性ラベル（多くの場合保存期間に制限がある）のような確立された検出方法を用いて検出される。生物学的サンプルの中での標的物質を検出するために用いられるその他のシステムは、光学バイオディスク上で解読されるビーズ検定システムを含むＰＣＴ国際公開No.WO 0242498が発表された。この技術は、磁気捕捉ビーズ及びレポータービーズを含む。プローブで覆われた両ビーズセットは、生物学的サンプル中で捜される標的分子に対し担補的なものである。もしも標的物質がサンプル中に存在している場合、当該リポータービーズ及び磁気捕捉ビーズはそれと結合する。当該ビーズ複合体はその後、磁場を用いて単離され、そして光学ディスク（そこへ固定された捕捉層を持つ）上へ装填される。２重のビーズ複合体の存在は、電子磁気的又は蛍光を基礎とするいずれか一方で検出を行うことができる。大きさの異なる磁気ビーズ、及び異なるタイプの蛍光レポータービーズの組み合わせは、異なる標的物質を同時に検出することを許容する。この２重のビーズシステムは、人的負担の方法論、スペクトルの重複等以前に発表された標的検体を解析するマイクロアレイ、及び微小担体に基づく検定方法について発表された多くの欠点を有する。当該欠点は、システムのコストを増加させる最先端の分類及び解読設備を要求する。
発明の概要
本発明の第一の目的は、マルチパラメーター検体の解析のための改良システムを提供することである。
本発明の第二の目的は、多くの数のマルチプルパラメーターを同時に検査するためのシステムを提供することである。
本発明の第三の目的は、一般に用いられる微小担体に基づく検定システムの並行検査処理量を改良することである。
本発明の第一の観点は、請求項１に定義されたようなシステムを提供する。
当該システムは、本発明の前記目的の少なくとも１つを達成することを可能にする利点がある。
当該システムはフレキシブルであり、且つ現存の支持基盤及び／又はマイクロアレイ技術の補助及び／又は改良にも用いることができるという利益がある。当該システムにおける反応は全て個々の識別し得る支持体の相互作用により追跡されているため、支持体により第一の検体を標識し、そして蛍光ラベルされた第二の検体（例えば標的検体）に対し検査する支持基盤技術を用いた以前に達成された処理量は効果的に改良される。多くの第二検体に対する多くの第一検体を検査し得る可能性は、実験数、用いる試薬の総量を徹底的に減少させ、そして同時に解析し得るマルチパラメーターの総量を増加させる。かかる改良は慣例的な解読手段にも使用され得るが、第一及び第二の支持体の識別手段の相互作用の検出が必要とされる。個々に識別され得る支持体の相互作用による本マルチパラメーター検査の可能性は、例えばタンパク質又は他の多くの数の分子と多数の化合物との相互作用の解析を実質的に改良する。識別し得る支持体の２組の異なるセットを使用することによる個々にラベル化された支持体のこれらの利益は、いっそう明白になる。これは以前達成することが困難であった第一及び第二の検体の結合特徴の解析を可能にする。当該システムは、それゆえに単に１つ又は非常に少ない蛍光ラベルされた第二の検体に対し多くの数の第一の検体を検査することができることに制限されない。以前はin silicaでのみ実施することができたシステムバイオロジー実験を、更に今は経験的に実施することができるようにする。
本発明の好適な態様は、第一の支持体がそれぞれ同時の検査方法のために使用される試薬の量を減少させる微小粒子のフォームである。
更に本発明の好適な態様は、サンプル中に存在する第二の検体の定量的計測の可能性を改良するために、第二の支持体が第一の支持体と同じ大きさか、又はより小さいことである。
他の本発明の好適な態様は、当該識別手段が１以上の識別される幾何学的な特徴（各々の支持体の識別を可能にする形態、サイズ、バーコード又はドットコードのような）を含む。これは、例えば良好なシグナル／ノイズ率、並びにスペクトルの重複及び擬陽性の危険性の減少を与えるバーコードのような十分に確立された識別標準品の使用を許容する。
本発明の他の好適な態様は、蛍光又は色彩コード化のような高周波識別ドランスポンダー（ＲＦＩＤ）又は光学的識別の使用を含む。当該ＲＦＩＤは非常に多くの数のコードを使用できる利点を与え、且つ計測手段及び識別し得る支持体との間の視覚伝達を要求しない。支持体上の光学的コード化の使用は、波長又は色彩のコンビネーションを許容し（標準の蛍光マーカー、例えばＦＩＴＣラベル化では可能ではない）、並びに低コストラベル化支持体の使用を許容する。
本発明の更なる態様は、流動性溶液に適合する固体基質を提供することである。これは検体間の３方向の相互作用解析のために、第一及び第二の支持体の相互作用を用いるマルチパラメーター解析の現存するマイクロアレイ技術との併用を許容する。
本発明の第二の観点によれば、請求項１５に記載の通りの方法を提供することである。
本方法は、本発明の前記目的の少なくとも一つを達成することが可能であるということであるということを利点とする。
本発明の特徴は本発明の範囲からそれずに任意のコンビネーションを組合せることができる、ということが理解されるであろう。
発明の詳細な説明
図１は、本発明によるシステムにおいて使用するための好適な態様の図解を示す。この支持体の好適な態様は、以下の詳細な説明において更に説明される検体のマルチパラメーター解析のためのシステムにおいて、第一の支持体１、及び／又は第二の支持体１’として使用されるためのものである。１つの支持体１、１’が示されており；そのような支持体は、以下の説明において微小担体、微小粒子、又は“ビーズ”としても言及されるであろう。当該第一の支持体１、１’は、実質的には不溶性又は固体材料（例えば１以上のポリマー、シリケート、ガラス、繊維、金属、又は金属合金）から組み立てることができる。本発明の好適な態様は、当該支持体１，１’は金、銀、銅、ニッケル、亜鉛、又は最適にはアルミニウムのような金属から組み立てられる。支持体１，１’を組み立てる時、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリアミド、又はポリカルボネートのような１以上のポリマーを用いることも好ましい。当該支持体１，１’が部分的に又は全体的に１以上の上記材料のいずれかで覆われていることが好ましい。
当該支持体１，１’は、下記における識別コード又はタグとしても言及される識別特徴２，２’を含む。識別特徴２，２’の例は、１以上の連続的な識別、支持体の様々な形状及び大きさ、支持体へ結合されたトランスポンダー（例えば高周波識別チップ、ＲＦＩＤｓ）、並びに支持体の蛍光コード化又は異なる色、に基づくことができる。好適な識別特徴２，２’は、溝、切込み、くぼみ、隆起、突出、及び最も好適には穴の、少なくとも１の（又はそれらの任意のコンビネーション）形状にすることができる連続的な識別である。支持体１，１’の一部である識別特徴２，２’は、製造後、各々の支持体１，１’をラベルする必要がないという利点がある。連続的な識別２，２’は、機械解読が可能であり、透過して読んでも、反射して読んでも、シグナル／ノイズ率を増強させる伝達光学的バーコードであることが適切である。一体化した連続的な識別コードは、それによって慣例的なバーコードシステム（例えば商業的な小売店でのラベル化された商品のために用いられるようなもの）で見出されたものと類似したコーディングスキームを使用した穴の連続として支持体１，１’中に記録される。そのようなコードは、支持体１，１’の識別特徴２，２’を見極めるために現存する解読技術の使用を許容し、それによって本発明による技術を採用する場合、最初の投資が減少する。
好適な態様における第一の支持体１、及び／又は第二の支持体１’は図１に図解されるように少なくとも主要な表面６を有す実質的に平面のフォームである。支持体１，１’は、約１：２から約１：２０の範囲で適切に幅４、長さ３の比率を有すが、約１：１５から約１：５の範囲の率は、特に好適である。更に、当該支持体１，１’は厚さ５μｍであり、好適には約３μｍ未満であり、そして更に好適には約１μｍ未満である。約１μｍ未満の厚さは、粗悪な実験状況において使用できる支持体１，１’を与えるために十分な機械的支持体強度を提供することを示した。支持体１，１’に関する発明の好適な態様は、約１００μｍの長さ３、約１０μｍの幅４、及び約１μｍの厚さ５を有し；そのような支持体は異なる識別配列バーコード２を100,000以上貯蔵することができる。検体評価実験のためのバイオ検定における使用のため、支持体１，１’の100,000までの異なる異形の実験的論証が実施された。現在用いられているバーコードシステムは、エラー及び指向性の検査を有し、並びに１００μｍの長さを有す支持体上で利用できる情報を３２ビットまでを有す。支持体１，１’は、４０μｍから１００μｍの範囲で様々な長さ３に組み立てられ、配列識別２におけるデータの０．２から０．５digits間で実施するようになっている；支持体１，１’のような例は、検体特徴の検出のために異なる実験における使用のため組み立てられた。
支持体１と類似する約２５０万の支持体、すなわち第一及び／又は第二の支持体１，１’は、１つの直径３インチの半導体タイプのウェハース（例えば現在確立された製造技術を用いたシリコーンウェハース）上に組み立てられるであろう。当該支持体１，１’の形状は、ウェハースごとに製造される支持体１，１’の数を最適化し、実質的に支持体１，１’上に可能な識別コード数も実質的に最適化する。慣例的なフォトリソグラフィー及びドライエッチング方法は、バーコード化識別２，２’と別個の固体支持体１，１’を産出するために材料層を製造及びパターン化するため用いられるような製造技術の例である。
支持体１，１’と類似する多数の支持体を製造するための組立て方法であって、以下のステップを含む：
（１）平面のウェハース上へ可溶性放出層を置き；
（２）ウェハースから離れた放出層上へ支持体材料の層を置き；
（３）フォトリソグラフィック方法及びエッチング方法を通して、支持体材料層における配列識別２を含む支持体特徴を規定し；
（４）平面のウェハースから放出された支持体を産生するため、適切な溶媒を用いて放出層を除去し；そして
（５）任意にその結合特性を改良するために支持体材料を処理する。
支持体材料の化学的処理又は物理的改変の多くの方法は、支持体１，１’への検体、例えばマルチパラメーター実験検体において用いられる検査サンプル、及び／又はプローブの結合を促進させるための任意のステップ（５）に用いられ得る。支持体１，１’の処理は、上記のようにウェハースから放出された後、或いはウェハースから放出される前、又は製造工程ステップの早期に実施できる。その他ステップ（５）における支持体材料層の処理は省略することができる。
図２は検体、すなわち第一又は第二の検体１２，１２’がどのようにして支持体１，１’のセクション１１へ結合するかの図解を提供する。上記の通り検体１２，１２’は、支持体１，１’を利用する実験をどのようにデザイン且つカスタマイズ化するかに依存して、検査サンプル中においてプローブ又は標的検体のいずれかであってよい。様々なタイプの検体１２，１２’を、フォトリソグラフィック操作を実行する、又は平面のウェハースから支持体１，１’を放出する前後のいずれかにおいて上記のステップ（１）から（５）により組立てられた支持体１，１’へ結合させることができる。支持体１，１’又は検体１２，１２’の表面６，６’を修飾することによって、検体１２，１２’と支持体１，１’の間の結合が改良される。支持体１，１’の結合表面６，６’を陽極処理することは、かかる改良された結合増強を提供する一つの方法である。アルミニウムは支持体１，１’のために好適な材料であり、それらの結合特性を改良させるため、アルミニウム陽極処理を通して多孔性表面を成長させる公知の方法がある。同様にかかる多孔性表面を閉じ込めるための方法も公知である。出願人は、正確に制御された多孔性及び深さを有す吸収表面を成長させるための比較的簡単な方法を開発するためにかかる知識を利用した。かかる多孔性表面６，６’は、好適な検体１２，１２’と機械的結合を達成することを可能にする。アビジン−ビオチンシステムの使用は支持体１，１’とそれらに関連した検体１２，１２’との間の化学的結合を改良するための他のアプローチである。支持体１，１’表面６，６’は、結合特性を更に増強させるためにシラン、及び／又はビオチンのような結合材料により処理することもできる。支持体１，１’は好適にはそれらの表面６，６’上に焼き付けられたシランを有す。検体１２，１２’への結合分子、例えばアビジン−ビオチンサンドウィッチシステムの結合は、それらの化学的分子結合特性を更に増強させる。
増強された結合は、好適には支持体１，１’の結合表面６，６’と検体１２，１２’との間に共有結合を有すことを通して達成される。共有結合は、検体１２，１２’を支持体１，１’から脱離しないようにし、解析の間のバックグランドノイズを乱す原因とならないようにする。結合していない検体１２，１２’が発生した反応の識別を妨げ得る潜在的な問題も存在する。解析の間、実験におけるノイズを本来なら増加させ得る全ての過剰な検体１２，１２’を除去するために結合後に、活性支持体１，１’（当該支持体１，１’はそこへ結合させた検体１２，１２’を有する）を洗浄することが重要であることが見出された。検査の識別はよりよいシグナル−ノイズ率を介して増強される。
上記の第一の支持体１、及び／又は第二の支持体１’は、必要に応じてデザイン及び識別コードを特注する可能性を伴って、安価な製造技術の利点を利用する。それらの利点は、長さ約５００μｍもしくはそれ未満、好適には約３００μｍもしくはそれ未満、より好適には約１５０μｍもしくはそれ未満、最適には約１００μｍもしくはそれ未満、約５０μｍもしくはそれ未満、又は約１０μｍもしくはそれ未満でさえ支持体１，１’の最大寸法３を許容する。異なる第一の検体１２，１２’を特異的な識別コード２，２’を有すそれぞれの支持体１，１’に結合させることにより、分子又は他の適切な化合物のような多数の検体１２，１２’は検査のための用意が整うことができる。上述の通り、支持体１，１’の形状及び大きさは、マイクロファブリケーション製造技術を用いて適切に変化させることができる。可能な形状の非限定的な例は、例えば円形、長円形、細長形、正方形、長方形、多角形、又は同一もしくは異なる材料の平行多層支持体である。 また、いくつかの応用において、好適には最大寸法約５００ｎｍ又はそれ未満であるナノ粒子サイズでの第一の支持体１、及び／又は第二の支持体１’を有すことであり；例えばかかるナノ粒子は、円柱状のナノバーを含む。しかしながら、大きさの低限は反応速度の十分な感受性が達成されることにより制御される。
図３は、マルチパラメーター解析検定反応１３を描写する。当該検定での反応１３は、本発明の最初の態様に従って流動性溶液中で起こる。当該溶液は検定反応の感受性を改善する液体であることが好ましい。検定１３は標的分子として第一の検体１２と共有結合的に結合したいくつかの浮遊した第一の支持体１を含む。検定１３において、検査分子のような第二の検体１２’と共有結合的に結合したいくつかの浮遊した第二の支持体１’もある。多くの異なる標的分子１２及び検査分子１２’は、特異的な識別２を有する第一の支持体１に結合された標的分子１２のそれぞれのタイプ、及び特異的な識別２’を有する第二の支持体１’に結合された検査分子１２’のそれぞれのタイプにより実施される関連した実験において反応分子として機能するために用いられる。１以上の標的分子１２と１以上の検査分子１２’とが仮に対合するならば、それらは新しい２重の支持体ユニット１６を作り出すために互いに結合（好適には水素結合を通して）するであろう。支持体１，１’両方の支持体上における特異的な識別２，２’は、その後標的分子１２及び検査分子１２’が相互作用することを示すことを測定することができる。本システム及び方法論は、同一の実験におけるマルチプルパラメーターの解析を許容する。過去の実験では、非常に少数（しばしば２から４）の蛍光ラベルされた標的分子に制限されていた。同時に行う検査の限界は、蛍光ラベルのスペクトルの重複の高いリスクのためのである。マルチプル支持体１，１’の利用は、マルチプル標的分子１２及び検査分子１２’を含むマルチプレキシングのより多くの数を許容する。
伝統的な反応タグの代わりの第二の支持体１’の利用による利点は、１の標的検体に対し検査された伝統的なマルチプル粒子を基礎とするアレイと比較して２倍の第二の検体（標的検体）をマルチプレックス、及びカスタマイズすることがきることできる。第二の支持体１’を通す第二の検体１２’の識別により、よりよい反応シグナルが達成され得る。また、マルチプレキシド検体の数が増加した場合、交差反応性による問題が増加する。慣例的な粒子アレイの実験を行う中で例えば１０００の第一の検体に対し１の第二の検体の間の交差反応性は、例えば識別可能な第一の支持体１上の１００の第一の検体１２に対し識別可能な第二の支持体１’上の１０の第二の検体１２’を用いた実験を行うことより問題がある。これはマルチプル次元の特徴を有する非常に複雑化された生物学的なシステムをin silicaモデリングだけでなく、実験を通して解析されることを可能にする。
本態様に従ったこれらの同時検査の実施の方法論の例は、ここに示されるであろう。当該方法論は、流体溶液中で浮遊した薬剤標的１２が適切なやり方で結合したいくつかの第一の支持体１を提供する最初のステップに関する。当該方法論の第二のステップは、検査化合物１２’が適切なやり方で結合したいくつかの第二の支持体１’の浮遊物を溶液に付加することであり；そのような付加は、多くの異なる標的分子１２に対して多くの異なる検査化合物１２’を同時に検査することを許容し、それによって現在の方法と比較して検査処理量を劇的に改善する。得られる支持体ユニット１６はその後計測器具により検出される。図３では第二の支持体１’が潜在的に第一の支持体１より小さいことをも示す。そのような大きさの相違は、第一の支持体１の識別２の解読を改良することを可能とする。なぜなら第二の支持体１’が、例えば伝達バーコード識別２に干渉しないからである。過去に可能であった数よりも、より多くの化合物が多くの分子に対して同時に検査されるため、試薬の使用も減少する。好適には個々の識別を有するそれぞれの支持体１，１’はそれらに結合した検体１２、１２’（例えば特定のタンパク質）の１タイプのみを有す。しかしながら、仮に支持体１，１’上で多重反応が解析される場合、個々の識別を有する各々の支持体１，１’に複数のタイプの検体１２，１２’が結合していることが可能である。検体１２，１２’は好適には溶液中で支持体１，１’に結合しているため、支持体１，１’全体が覆われており、良好な実験感度が供される。
検体実験のマルチパラメーター解析を実施する時、検体１２，１２’の多くの異なるタイプを用いることができる。ライフサイエンス産業のために、当該検体１２，１２’は、抗体、抗原、タンパク質、酵素基質、糖質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、細胞株、化学成分、オリゴヌクレオチド、血清成分、薬剤、又はそれらの任意の由来物もしくはフラグメントであってよい。マルチパラメーター解析システムは、相互作用の調査が必要とされるタンパク質の数が非常に多いため、タンパク質−タンパク質相互作用の領域において非常に有用である。他の産業のために、当該検体は例えば、染料、防腐剤、ラベルした化学製品（例えば偽造製品の動向を追跡するため）、放射性ラベルした化学製品、及び食品とすることができる。
図４ａ及び４ｂは、第一の検体１２と結合した第一の支持体１、及び第二の検体１２’と結合した第二の支持体１’の対の反応前後の相互作用を図式で示す。これらの第一及び第二の支持体１，１’は各々上記の通りバーコードされた識別２，２’を有す。本態様における検体１２，１２’を、製造の間中、それらの対応する平面上のウェハースからそれらを放出する前に支持体へ付加し、それによって、支持体１，１’の１の側上に唯一存在する検体１２，１２’を得た。支持体上に結合した検体１２，１２’を妨げる材料で支持体１，１’の１の表面を覆うことによって類似の効果を達成することもできる。この覆いは、互いに向かい合う特異的な主要な表面７，７’とのみ第一及び第二の支持体が相互作用することを更に保証し、それによって、それぞれの識別コード２，２’が十分なシグナル−ノイズ率により反射又は透過して適切に解読されることを可能にする。仮に反応していない支持体１，１’から支持体ユニット１６を分離することを所望し得る状況が発生した場合、大きさを基礎とする障壁の分類を用いることができ、又はセルソーティングの当業界において周知である分類設備が適切に使用される。
図５ａ及び５ｂは、異なる識別特徴２，２’を有する支持体１，１’を用いたマルチパラメーター解析システムの代替態様を図式で示す。本代替態様は、第一の支持体１が立方体の形状であり、高周波トランスポンダー識別(RFID)２を含む。第二の支持体１’は色彩でコードされた識別２’を有す。図５ｂは、第一の支持体１上の第一の検体１２がどのように第二の支持体１’上の第二の検体１２’へ直接的に結合するかを見ることができる。伝統的なサンドウィッチ検定のような色彩ラベルよりも色彩でコードされた支持体を使用する利点は、パターン又は色彩のバリエーションが、Luminex xMapシステムのようなコード化可能性を増加させるために用いることができることである。第一の支持体１が、第二の支持体１’よりもはるかに大きく作製される場合（例えば少なくとも５倍）、第二の支持体１’当りの第二の検体１２’の総量がわかっていることを条件に、サンプル中に存在している第二の検体１２’の総量を定量的に計測することがより容易となる。その他のアプローチは、異なる支持体１，１’の間の相互作用の有無のみを計測することである。異なる識別シグナルとの間の相互作用のリスクがより少ない時、マルチパラメーター解析における識別手段２，２’の２つの異なるタイプを使用することも好ましい。
２重の支持体ユニット１６を形成するため相互作用する支持体１，１’を解読するために用いられるリーダーは、図８の参照と共に後に述べる詳細な説明において記載されるリーダーの改変版である。仮に２重の支持体ユニットが第一の又は第二の支持体１，１’のための識別特徴２，２’の異なるタイプを有す場合、２つの異なる識別シグナルを検出することが可能な解読ユニット３０を使用すべきであり；当該解読ユニット３０は後に図８において記載される。同じタイプの識別手段２，２’、例えばバーコードを第一及び第二の支持体１，１’のために使用した場合、リーダーユニット３０は、両方の識別特徴を同時に解読するための適合を必要とする。図４ａ及び４ｂにおいて記載される態様の場合、支持体１，１’の調査は、反射又は透過して同時にバーコードを解読するためにリーダーユニット３０の中に相互に対角線上と対立して配置された２以上のサブリーダーを含ませることにより潜在的に達成され得る。仮に大量の２重支持体ユニット１６を解析する場合、フローサイトメトリーの熱力学的原理は１時間に数千までのユニット１６の非常に高い処理量の可能性を付加する。ここでもリーダーユニット３０が、支持体１，１’の識別特徴２，２’を検出するため配備されることが好適である。リーダーユニット３０のためのレーザーの使用は、支持体ユニットの非常に小さい特徴（例えば採用されるレーザー放射の波長と同等の側面サイズの特徴）の解読を可能にする。
図６において、マルチパラメーター解析システムの更なる態様に沿ったシステムを図式で示す。当該システムは、一般に１７で示され、支持体１，１’を含む流動性溶液１９の定量をしやすくする基盤（アレイ）１８を含んで成る。基盤１８は本明細書において後にアレイ又はマイクロアレイとしても言及され、実質的に平面の主要な表面２０を有し、及び所望される任意の形状とすることができるが、しかしより好適なのは、長方形（例えば実質的に正方形）である。基盤１８は、ガラス、金属、プラスチック材料、ウェハース、膜、又は現在マイクロアレイを組立てるために用いられる任意の他の材料のような様々な材料からも作成され得る。最適には当該基盤１８が光伝達性である、例えばガラス（マイクロスコープスライド）又はプラスチック材料（例えばアクリレート）のような材料から組立てられることである。そのような材料特徴は、透過性バーコード識別特徴２，２’を有す支持体１，１’が基盤１８上にありながら透過して解読されることを潜在的に可能にする。当該基盤１８の上部の主要な表面２０は、好適には平面であり、又は特徴を仕切ることによりセクション（例えばウェル、又は境界）へと分割され、セクション間の交差交雑を防いでいてよい。基盤１８の主要な表面２０は、好適には０．２５ｃｍ２から５０ｃｍ２の範囲の面積であり、より好適には約１ｃｍ２から２５ｃｍ２の範囲であり、及び最適には約２ｃｍ２から６ｃｍ２の範囲である。当該液体１９は、基盤１８上に置かれ、適切には流動性緩衝溶液であり、そして通常は水性溶液を正常にする。システム１７は基盤１８の上に置かれた装填支持体１，１’を有す流動性溶液１９を含む検定とすることを検討することができる。当該システム１７は、構築された解読技術、マルチプレキシング、並びに高い処理量、良好な感度、及び十分な反応速度を有す微小担体を用いたマルチパラメーター解析システムの利便性を有す２次元基盤１８の使用の利点を提供することができる点で極めて好都合である。
本発明の更なる態様は、特異的な検査分子１２’が個々の支持体１’に、好適には共有結合を通して結合される。マルチプル検査分子１２’は、結合した標的分子１２を調査する分子２１を有す基盤１８上に浮遊した支持体１，１’を有す流動性溶液１９を置くことにより個々の支持体１に結合したマルチプル標的分子１２の活性へのそれらの影響について検査することができる。本発明の更なる態様の例は、個々の支持体１に結合したマルチプル標的分子１２に対して個々の支持体１’に結合したマルチプル検査分子１２’の活性を同時に検査するため基質分子２１により事前にスポットされたマイクロアレイを使用する。結合反応は分子２１が検査分子１２’、及び／又は標的分子１２と結合した時に起こる。検査分子１２’、及び／又は標的分子１２の間の反応の結果は、それらの識別コード２，２’を一緒に有す支持体１，１’の最終的な位置に基づくであろう。
図７ａ及び７ｂは、一般に１４により示された検定反応が、本発明の前記態様による基盤１８上で起こることを描く。当該検定１４は、浮遊した支持体１，１’及び検体１２，１２’を有す流動性溶液から成る。当該検体１２，１２’は標的分子１２及び検査分子１２’から成り立っている。多くの異なる標的分子１２及び検査分子１２’が、実施すべき実験中において反応分子として機能するために用いられる特異的な識別２を有す第一の支持体１に結合した標的分子１２のそれぞれのタイプが結合しており、そして特異的な識別２’を有す第二の支持体１’に検査分子１２’のそれぞれのタイプが結合している。少なくとも１の標的分子１２又は検査分子１２’を好適に有する当該支持体１，１’を流動性溶液１９中に浮遊させ、その後当該支持体を基盤１８の主要な表面２０の上に置く。当該基盤１８は、更に第三の分子２１を有し、それは標的分子１２，１２’のために基質として作用し、例えば共有結合性結合を通じて主要な表面２０と結合する。これは、マルチパラメーター解析に更なる別の次元を付加するため、システム１７における基盤１８として事前にスポットされたマイクロアレイの使用を潜在的に許容する。基質に結合した分子２１は、フルオロフォア(fluorophore)２２、及びクエンチャー(quencher)分子２３で適切にラベルされる。
１以上の標的分子１２及び検査分子１２’の間が対合するならば、新たな２重支持体ユニット１６を作り出すためそれらは好適には水素結合を通して相互に結合するであろう。もしも検査分子１２’がその基質第三分子２１と標的分子１２との相互作用を阻害するならば、クエンチャー分子２３は基質分子２１から切断されず、従ってフルオロフォア２２は、図７ａに示されるようにクエンチされたままであろう。しかしながら、仮に検査分子１２’が標的分子１２と結合するが、その基質分子２１と標的分子との相互作用を阻害しないならば、クエンチャー分子は切断され、フルオロフォアは光学的調査の際に蛍光シグナルを放すであろう。
本態様の実施例は、流動性溶液中において浮遊した酵素標的を適切なやり方で結合させたいくつかの支持体１の使用である。検定を行う時、適切なやり方で結合された検査化合物を有するいくつかの支持体の浮遊物を溶液へ付加する。酵素のための基質であることが公知である分子は、所定の位置でアレイ基盤１８上に事前にスポットされるであろう。これは、検査化合物が標的酵素に結合するか否かだけではなく、標的酵素の活性への前記結合の効果も示すために、多くの異なる酵素標的分子に対し多くの異なる検査化合物を検査することを可能にする。
上記のような適切な支持体１，１’の識別は、特異的な検体１２，１２’のために特異的な識別を用いることの重要性を述べる（例えば標的分子１２又は検査分子１２’）。そのような配備は、一定の検体１２，１２’のための所定の識別コード２，２’の使用も許容するが、試験をデザインする時に所望される識別コード２，２’と検体１２，１２’の対合も可能とするだろう。
マルチプル検査分子１２’に対するマルチプル標的分子１２の検査を実施する時、本発明の記載の態様に示す通り、異なる時点で実験を解析することの利点もある。この過渡的な解析は経時的な変化を記録することが重要である薬剤プロファイリング中で潜在的に有益である。
流動性溶液１９において装填された支持体１，１’が浮遊する基盤１８を解読するために使用される解読システムを、図６、７ａ及び７ｂの参考文献としてここに記載するだろう。
例えばマイクロアレイ、又は微小担体に基づく検定の解析のために現在用いられるレーザー、紫外線（ＵＶ）、又は発光ダイオード（ＬＥＤ）リーダー設備も、検体１２，１２’のマルチプルパラメーターを解析するための前記システムと共に採用してよい。当該システムにおいて検体１２，１２’を反応させた検査結果物は、有無の二次元結果として計測されるか、又はシグナル放出ラベル２３から放出される蛍光の程度により計測される。
当該システムは一般に図８の２４によって示され、リーダーを含んで成る。当該リーダーは検体１２，１２’の結合された支持体１，１’の活性を計測するための２５により示された計測ユニットを含んで成る。計測ユニット２５は、クエンチされていない基質２２から蛍光反応シグナルを検出するための検出器ユニット２７、及び支持体１，１’の識別コード２，２’を解読するためのリーダーユニット３０を有す。当該検出器ユニット２７は、反応を示す蛍光シグナルを検出するための蛍光マイクロスコープを有す。リーダーユニット３０は支持体１，１’の透過バーコード２，２’を解読するためのバーコードリーダーを有す。それは好適には支持体１，１’の識別２，２’及び当該反応検出のためのシグナルの異なるタイプを有し、なぜならこれによりシグナルが混ざり合ったり、重複（スペクトルのオーバーラップ）するリスクが制限されるからである。これはマルチプレキシング（多数の同時反応）の可能性をより高くすることを許容する。
支持体１，１’の十分な数が解読されたなら、計測ユニット２５の処理ユニット２８が支持体１，１’に関連した検査結果を計算する。この十分な数とは好適には１０から１００の間の支持体１，１’の各々のタイプのコピーであり；この数は好適には検査結果に対し統計解析を実行することを可能にする。例えば平均値計算、及び標準偏差計算のような統計解析が、クエンチされていないフルオロフォア２２と関連する蛍光のために実行され得る。処理ユニット２８は、検出器及びリーダーユニット２７，３０を制御するためにも含まれ、ゆえに各々に個々の支持体１，１’がたった一度で解析される。
通常では、基盤１８上の全ての支持体１，１’は総合的な実験の質を確証するために解析される。時間の短縮、及び／又は処理能力に関心がある場合、処理ユニット２８のソフトウェアは、好適には相互作用してシグナルを放出し、検体１２，１２’の特徴の間の相互作用が発生したことを示す支持体のみを解析するための構成とすることができる。計測ユニット２５に用いる装填された基盤１８の解析は、非常に安価であり、実施しやすく、及び例えば各々の基盤１８上の１桁から数千の支持体１，１’の範囲における少数から中程度のサンプル数についての、解析能力を増やす適切な方法である。
基盤１８を体系的に調査するための好適な軌道５０は、図９ａ及び９ｂに示す。図９ａは、曲がりくねって続くタイプの調査管理体系の描写である一方、図９ｂは、らせんタイプの調査管理体系の描写である。もちろん当業界における当業者にとって明白である多くの他の可能な軌道５０がある（例えば軌道５０への反対の方向での基盤１８の動向、曲がりくねった対角線軌道での基質の動向、又はその表面を横切る１の実質的直線軌道での基質全体の覆い）。しかしながら、図９ａ，９ｂの管理体系は支持体１，１’解読速度の増強を達成するために十分である。基盤１８を支持し支える段階モーター（stepper-motor）作動式ベースプレート４０は、計測ユニット２５が静止した状態にある間、基盤１８を動かすために用いられ得る。分析の最適な方法は、基盤が静止した状態にある間、計測ユニット２５を動かすことであるだろう。支持体１，１’の位置は追跡されるため、それらは一回分析されるだけである。
計測ユニット２５のイメージ処理のためのリーダーユニット３０は、検体１２，１２’の結合した支持体１，１’を浮遊させる流動性溶液１９を有す基盤１８の各々の領域のデジタルイメージを捕捉するために使用される。それによって得られたデジタルイメージは、基盤１８を通り、ベースプレート４０を越え、そしてその後支持体１，１’を通った光に相当し、シルエットでの支持体１，１’を表現する（rendering）；そのような支持体１，１’のシルエットでのイメージは、処理ユニット２８とリーダーユニット３０の組合わせにより解析される。各々の支持体１，１’と関連した連続識別２，２’、例えばバーコードは、それゆえにリーダーユニット３０により透過される光プロファイルから識別される。シグナル放出ユニット２９は蛍光シグナルを発生させ、当該シグナルは基質分子２１上にフルオロフォア２２を蛍光発光させ、陽性反応を示唆する。
処理ユニット２８は、光源４５、シグナルユニット２９、リーダーユニット３０、及び検出器ユニット２７、並びにディスプレイ４６と連結している。更に処理ユニット２８は、光源４５及びシグナルユニット２９を制御するための制御システムを含んで成る。基質分子２１上のフルオロフォア２２からの光シルエット及び蛍光シグナルは、光アセンブリ４１（例えばアセンブリは１以上のレンズ、及び／又は１以上の鏡を含んで成る）を経由して検出器ユニット２７及びリーダーユニット３０へ送られる。鏡４２は光シグナルを２つの軌道に分裂させるために用いられ、光フィルター４３、４４はそれらの波長に基づき所望されない光シグナルをろ過するために用いられる。或いは、光源４５及びシグナルユニット２９は、間隔をおいて、例えば相互に交替で、つけたり消したりすることができる。リーダーユニット３０及び検出器ユニット２７から受け取ったシグナルは処理され、ディスプレイ４６上に示される統計解析結果と一致させる。支持体１，１’の各々のタイプの良く似た数は、実験の最適な統計解析を与えることを要求する。そのような統計解析は当業界において周知である。
意図されたシステム１７の使用は、検体の３次元マルチパラメーター解析を要求する実験で任意の手順とすることができる。いくつかのパラメーターでの応用は、例えば、リード標的識別及び薬物標的を含む特徴的な１以上の検体の生化学検出に関与する。他の産業で求められる検体のマルチパラメーター解析のために本システムは他の多くに応用されるであろう。
第一及び第二の検体１２，１２’の結合特徴の識別として、第一及び第二の支持体１，１’を使用する実験のフローベース解読は、前記平面リーダーの代替、又は補足、及び反応結果を解析する迅速で効果的な方法を提供する。第一及び第二の支持体１，１’を使用した実験の分類及び検出は、Union Biometrica, COPAS（商標）のフローサイトメーター上で約２０支持体／秒の率で実施した。前方散乱、並びに例えば長さ及び密度の計測は、第一及び第二の支持体１，１’上の検体１２，１２’の間の任意の相互作用の良い指標を与える。フローサイトメーター中のシース（Sheath）流体は、フローチャンネルの中心へ支持体１，１’を集中させ２つのレーザーを用いた検出を許容する。２つのレーザーはフローチャネルの断面を網羅し、お互いに約９０度で配置され、そしてチャンネルの中心に結合焦点を有する。質的及び量的結果は共に計測された。記載された第一及び第二の支持体１，１’の態様を用いたマルチパラメーター実験を解析するためによく働く他のフローリーダーは、DakoCytomation（MoFlo（商標））及びBecton Dickenson（FACScan（商標））である。
添付の請求項により定義されるような本発明の範囲から離れずに前記記載の発明の態様を作ることができる改変は理解されるであろう。例えばアレイ１８の表面２０に直接結合された基質分子２１により慣例的にスポットされたマイクロアレイ１８又はＥＬＩＳＡウェルプレートである時、適した第三の分子２１と２重の支持体ユニット１６が反応した時、蛍光シグナルを不活性にするように配置され得るシステム１４、フルオロフォア２２及びクエンチャー分子２３中の位置識別を有するアレイ（基盤）１８として使用される。
配列識別を含んで成る１の支持体（微小担体）の平面図及び側面図である。 結合した検体を有する１の支持体（微小担体）の側面模式図である。 検体のマルチパラメーター解析のためのシステムの模式図である。 マルチパラメーター解析システムの好適な態様に沿った第一及び第二の支持体の間の相互作用の模式図である。 マルチパラメーター解析システムの代替の態様に従った第一及び第二の支持体の間の相互作用の模式図である。 多数の支持体、及び結合されたアレイ又は基盤を含む検体のマルチパラメーター解析のためのシステムの模式図である。 支持体、及び固定されたアレイ又は基盤の間の実験反応を示す模式図である。 図３のシステムを調査するための平面基盤リーダーを図解した模式図である。 図８の平面基盤リーダーにより取り込まれた計測軌道の例を図解した平面基盤の上からの模式図である。

Claims (17)

  1. 検体のマルチパラメーター解析のためのシステムであって；
    （ａ）使用時において流動性溶液の中で浮遊した最大寸法５００μｍ又はそれ未満の第一の支持体、ここでそれぞれの第一の支持体がそれらの識別のための識別手段を含み、そして少なくとも１の第一の検体がそれぞれの第一の支持体に結合している；
    （ｂ）使用時において流動性溶液の中で浮遊した第二の検体；及び
    （ｃ）第一の検体及び第二の検体の間の相互作用をモニタリングするため流動性溶液と連絡して配備された計測手段：を含んで成り、ここで
    （ｄ）第一の支持体の最大寸法未満又は最大寸法と同じ第二の支持体が、使用時において流動性溶液の中で浮遊され、ここでそれぞれの第二の支持体がそれらの識別のため識別手段を含み、そして少なくとも１の第二の検体がそれぞれの第二の支持体に結合し；そして
    （ｅ）前記計測手段は、１以上の第一の検体及び１以上の第二の検体の間の反応後の任意の相互作用を、それらに結合した第一及び第二の支持体の識別手段を検出することにより検出するために配備されている、
    ことを特徴とするシステム。
  2. 前記第一の支持体の最大寸法が、３００μｍ未満である請求項１に記載のシステム。
  3. 前記第一の支持体の最大寸法が、１５０μｍ未満である請求項２に記載のシステム。
  4. 前記第一の支持体の最大寸法が、５０μｍ未満である請求項３に記載のシステム。
  5. 前記第二の支持体の最大寸法が、第一の支持体のそれよりも小さい請求項１から４のいずれか１項に記載のシステム。
  6. 前記第二の支持体の最大寸法が、１００μｍ未満である請求項５に記載のシステム。
  7. 前記第二の支持体の最大寸法が、５０μｍ未満である請求項６に記載のシステム。
  8. 前記第二の支持体の最大寸法が、１０μｍ未満である請求項７に記載のシステム。
  9. 前記識別手段の少なくとも１が、各々の支持体の識別を可能にする１以上の識別される幾何学的な特徴を含んで成る請求項１から８のいずれか１項に記載のシステム。
  10. 前記幾何学的な特徴が、形態、サイズ、バーコード及びドットコードからなる群から選ばれる、請求項９に記載のシステム。
  11. 前記識別手段の少なくとも１が、高周波識別トランスポンダー（ＲＦＩＤ）である請求項１から１０のいずれか１項に記載のシステム。
  12. 前記識別手段の少なくとも１が、光学的識別である請求項１から１０のいずれか１項に記載のシステム。
  13. 前記光学的識別が、蛍光又は色彩に基づくものである、請求項１２に記載のシステム。
  14. 前記第一又は第二の支持体が、部分的にのみそれぞれの第一又は第二の検体で覆われた請求項１から１３のいずれか１項に記載のシステム。
  15. 前記流動性溶液が液体である請求項１から１４のいずれか１項に記載のシステム。
  16. 前記液体浮遊物が固体基盤上へ適用され、当該固体基盤が実質的に２次元の平面に広がる主な表面を含み、位置的識別のために当該固体基盤上で固定的に配備された第三の検体を有す請求項１５に記載のシステム。
  17. 検体のマルチパラメーター解析の方法であって、以下のステップ；
    （ａ）最大寸法５００μｍ又はそれ未満であり、及びそれらの識別のための識別手段を有す少なくとも１の第一の支持体を提供し；
    （ｂ）それぞれの第一の支持体へ少なくとも１の第一の検体を結合させ；
    （ｃ）流動性溶液中で第一の検体及び第二の検体と共に第一の支持体を浮遊させ；そして
    （ｄ）第一の検体、及び第二の検体の間の相互作用をモニタリングするために流動性溶液と連絡した計測手段を提供することを含み、更に当該方法は以下の；
    （ｅ）第一の支持体の最大寸法未満又は最大寸法と同じであり、及びそれらの識別のための識別手段を有する第二の支持体を提供し；
    （ｆ）少なくとも１の第二の検体をそれぞれの第二の支持体へ結合させ、
    （ｇ）使用時において流動性溶液中で第二の支持体を浮遊させ、そして
    （ｈ）１以上の第一の検体及び１以上の第二の検体の間の反応後の任意の相互作用を、それらに結合した第一及び第二の支持体の識別手段を検出することにより検出する計測手段を配備する、
    ステップを含んで成ることを特徴とする方法。
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