JP5816291B2 - 生体分子分析方法及び生体分子分析装置 - Google Patents
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Description
標識したプローブ分子を、分析対象の生体分子と反応させる工程と、
前記微粒子を支持基体上に収集及び固定する工程と、
前記支持基体上の標識を測定する工程
を含むことを特徴とする、生体分子分析方法。
標識したプローブ分子と分析対象の生体分子とを反応させる手段と、
前記反応工程後に、前記磁気微粒子を支持基体上に収集及び固定する手段と、
標識を測定する手段と
を具備することを特徴とする生体分子分析装置。
標識されたプローブ分子を前記生体分子と反応させる手段と、
前記生体分子と結合したプローブ分子の標識を検出する手段と
を備え、検出された標識の数から目的生体分子の絶対濃度を評価することを特徴とする生体分子の分析装置。
分析対象の生体分子を濃度調整する手段と、
分析対象の生体分子を撹拌する手段と
を具備することを特徴とする、[33]に記載の装置。
分析対象の生体分子を磁気微粒子上に固定する手段と、
標識したプローブ分子と分析対象の生体分子とを反応させる手段と、
前記反応工程後に、前記磁気微粒子を支持基体上に収集及び固定する手段と、
標識を測定する手段。
本実施例の分析方法を、分析対象の生体分子が核酸である場合を例にとり、図1を用いて説明する。分析対象の核酸断片101に蛍光色素103が標識された捕捉用タグ102を結合させる。結合には、ライゲーション反応や、予め分析対象の核酸断片101と捕捉用タグ102にアミノ基やスクシンイミド基などの官能基を導入しておいて官能基同士のカップリング反応を用いることもできる。特に、分析対象の核酸断片101がマイクロRNAの場合には、捕捉用タグ102を10〜20塩基長程度のRNA分子とし、T4RNAリガーゼを用いて両者を結合する方法が有効である。分析対象の核酸断片101に蛍光色素103が標識された捕捉用タグ102を結合させた後、蛍光体105で標識された核酸分子(プローブ分子)104とハイブリダイゼーションを行う。核酸分子104は個々の核酸断片を識別するためのものであり、個々の遺伝子の配列を代表する塩基配列を有する必要がある。配列設計を行う場合には、核酸二本鎖の安定性の指標となる融解温度を個々の標識された核酸分子で一定の範囲に収める必要がある。その範囲は狭いほうが好ましいが、所定の温度±3℃程度に抑えることが好ましい。また、標識された核酸分子同士の塩基配列の相同性は低いことが好ましく、相同性を70%以下、より好ましくは60%以下に抑えることが好ましい。次に、実施例6に記載した方法を用いて、磁気微粒子108に捕捉用分子106を結合分子107を介して一分子だけ固定したものを予め作製しておき、これを加えてハイブリダイゼーションを行うことで、磁気微粒子108上に、分析対象の核酸断片101と蛍光体105で標識された核酸分子104のハイブリッドを一分子対形成したものを作製することができる。蛍光体105には、Cy3やCy5などの通常の蛍光色素分子や、Zn-Seなどからなる半導体微粒子、さらに、Genisphere社から製品として市販されているデンドリマーに蛍光色素を数百分子付けたものを用いることができる。
本実施例の分析方法を、分析対象の生体分子がタンパク質である場合を例にとり、図2を用いて説明する。
本実施例のデバイス構成及び分析方法を、図3を用いて説明する。
本実施例のデバイスの構成を、図4を用いて説明する。支持基体401の上に接着パッド402が規則正しく、例えば図4に示すように格子状に形成されている。接着パッド402と微粒子403は、線状分子405を介して化学結合又は化学的相互作用により結ばれている。線状分子405の末端の官能基406と、接着パッド402とは化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基406は、支持基体401との相互作用が弱く、接着パッド402との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、支持基体401としては、石英ガラス、サファイア、シリコン基板などを用いることができる。また、接着パッド402には、金、チタン、ニッケル、アルミから選ばれる材料で構成することができる。官能基406は、支持基体401と接着パッド402との組合せを考えて選択する必要があるが、例えば、スルホヒドリル基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基、アルデヒド基等を用いることができる。線状分子405は、微粒子403と接着パッド402を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、低分子の場合には炭素数にして3から20程度の直鎖状分子が好ましい。線状分子405の末端の官能基407は、微粒子403との接着性をもたらす。また、線状分子405として高分子を用いる場合には、複数の側鎖を有し、官能基406を有する側鎖と官能基407を有する側鎖を併せ持つものを用いることができる。微粒子403としては、金属微粒子や半導体微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径5nm〜100nmのものが市販されており、利用することができる。また、半導体微粒子としては、直径が10nm〜20nm程度のCdSe等の化合物半導体が市販されており、利用することができる。官能基407として用いることができる官能基は、微粒子の種類によって異なるが、例えば金微粒子を用いた場合にはスルホヒドリル基、アミノ基等が好ましい。半導体微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンで表面が修飾された微粒子が市販されており、官能基407としてビオチンを用いることができる。さらに、微粒子403として、ポリスチレンなどの高分子材料からなる微粒子を用いることもできる。高分子材料の場合には、微粒子の粒径を揃えることができ、粒径の大きさも数十nmから数μmまで幅広く選択することができる。また、高分子材料が有する官能基を足場に表面修飾を施すことで、微粒子表面に固定する捕捉分子404の固定反応のための官能基の導入量を均一にすることができるという点で好ましい。特に、捕捉分子404を一分子だけ微粒子表面に固定する場合、固定率の再現性が非常に高く、好ましい。
本実施例の分析用デバイスの製造方法を、図5を用いて説明する。平滑な支持基体501上に電子線用ポジ型レジスト502をスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体501としては、ガラス基板、サファイア基板、シリコンウエハ等が用いられる。デバイスとしたときに、微粒子506を配列した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。電子線用ポジ型レジスト502としては、例えば、ポリメチルメタクリレートやZEP-520A(日本ゼオン社製)を挙げることができる。支持基体501上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行ったうえ電子線直描露光を行って、レジストにスルーホールを形成する。例えば、直径15nmのスルーホールを形成する。並行処理で分析できる生体分子の分子数に依存するが、スルーホールは1μm程度のピッチで形成することが、製造上の簡便さ、歩留まりの高さ、及び並行処理で分析できる生体分子の分子数を勘案すると、適している。スルーホール形成領域も、並行処理で分析できる生体分子の分子数によるが、検出装置側の位置精度や位置分解能にも大きく依存する。例えば、1μmピッチで反応サイト(接着パッド)を構成した場合、スルーホール形成領域を1mm×1mmとすると、100万反応サイトを形成できる。スルーホールを形成後、接着パッド503を構成する材料、例えば金、チタン、ニッケル、アルミをスパッタリングで製膜する。平滑な支持基体501としてガラス基板、サファイア基板を用い、接着パッド503の材料として金、アルミ、ニッケルを用いる場合には、支持基体材料と接着パッド材料との間に接着を補強する意味でチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。次に、接着パッド503に線状分子504を反応させる。接着パッド503が金、チタン、アルミ、ニッケルの場合には、線状分子504末端の官能基505としては、各々、スルホヒドニル基、リン酸基、チアゾール基を用いることが好ましい。線状分子504の反対側の官能基506には、例えばビオチンを用いることができる。線状分子504を接着パッド503と反応させた後、レジストを剥離する。レジストを剥離後、接着パッド503を形成した以外の支持基体501表面に非特異吸着防止処理を施す。蛍光色素付きヌクレオチド(プローブ分子)に対する吸着防止を実現するには、負の電荷を帯びた官能基を有する非特異吸着防止用分子507でコートする。例えば、エポキシシランを表面にスピンコートで塗工し、加熱処理後、弱酸性溶液(pH5〜pH6程度)で処理することにより、エポキシ基を開環させOH基を表面に導入することで非特異吸着防止効果をもたらすことができる。
本実施例では、捕捉用分子(分析対象の生体分子が核酸の場合には核酸、タンパク質の場合には抗体が好ましい)を一分子だけ固定した微粒子の製造方法の一例を、特に、微粒子一個につき一分子の捕捉用分子を固定する方法を図6を用いて説明する。微粒子601の表面に捕捉用分子604を固定するための結合サイト602を結合させておく。例えば、結合サイトとしてストレプトアビジンを用いることができ、市販のストレプトアビジンコート微粒子(インビトロジェン社製)を微粒子として用いることができる。捕捉用分子604には予め、結合サイト603を修飾しておく。結合サイト603には微粒子601表面の結合サイト602と容易に結合するものを選択する。例えば、結合サイト602として前記のストレプトアビジンを用いた場合には結合サイト603としてビオチンを用いる。次に、微粒子601と捕捉用分子604を反応させることで、捕捉用分子604を微粒子601に結合させる。微粒子601一個につき一分子の捕捉用分子604を固定するには、単位体積中の捕捉用分子604の分子数を微粒子601の個数よりも少なくすることが好ましい。微粒子601よりも捕捉用分子604が過剰にあると微粒子601一個当たりの捕捉用分子数が一分子よりも多くなる可能性が高いからである。発明者らが検討した結果では、微粒子601の数を捕捉用分子604の数よりも10倍多くして反応させると、凡そ90%の微粒子601には捕捉用分子604は固定されず、約9%の微粒子601には捕捉用分子604が一分子固定されていた。この結果は、ポアソン分布を仮定した場合の予測結果と良く一致している。したがって、捕捉用分子604を捕捉した微粒子601のみを捕集すれば、捕集した微粒子601のうち90%以上は捕捉用分子604を一分子のみ固定した微粒子601となる。
本実施例のデバイスの構成及び分析方法を、図7を用いて説明する。分析対象の核酸断片701に蛍光色素703が標識された捕捉用タグ分子702を結合させる。結合には、ライゲーション反応や、予め分析対象の核酸断片701と捕捉用タグ分子702にアミノ基やスクシンイミド基などの官能基を導入しておいて官能基同士のカップリング反応を用いることもできる。特に、分析対象の核酸断片701がマイクロRNAの場合には、捕捉用タグ分子702を10〜20塩基長程度のRNA分子とし、T4RNAリガーゼを用いて両者を結合する方法が有効である。分析対象の核酸断片701に蛍光色素703が標識された捕捉用タグ分子702を結合させた後、蛍光体705で標識された核酸分子(プローブ分子)704とハイブリダイゼーションを行う。核酸分子(プローブ分子)704は個々の評価目的の核酸断片を識別するためのものであり、個々の遺伝子の配列を代表する塩基配列を有する必要がある。配列設計を行う場合には、核酸二本鎖の安定性の指標となる融解温度を個々の標識された核酸分子(プローブ分子)で一定の範囲に収める必要がある。その範囲は狭いほうが好ましいが、所定の温度±3℃程度に抑えることが好ましい。また、標識された核酸分子(プローブ分子)同士の塩基配列の相同性は低いことが好ましく、相同性を70%以下、より好ましくは60%以下に抑えることが好ましい。次に、実施例6に記載した方法を用いて、微粒子708に捕捉分子706を結合分子707を介して一分子だけ固定したものを予め作製しておき、これを加えてハイブリダイゼーションを行うことで、微粒子708上に、分析対象の核酸断片701と蛍光体705で標識された核酸分子(プローブ分子)704のハイブリッドを一分子対形成したものを作製することができる。蛍光体705には、実施例3で述べたように、蛍光体入り蛍光ビーズを用いることができる。
実施例8では捕捉分子を一分子だけ固定した微粒子803の固定率を著しく向上させる方法とデバイスの構成を、図8を用いて説明する。その方法の一つは捕捉分子を一分子だけ固定した微粒子803を含む溶液を接着パッド802を配置した支持基体801上に滴下して、乾燥しないように蓋をしてしばらく放置して反応させる方法である。このとき微粒子803はブラウン運動により、確率的に接着パッド802に接近する。例えば、接着パッド802表面に結合分子としてアルカン分子で覆い、ポリスチレンなどのポリマーで構成される微粒子803と分子間力が働くようにすることで、接着パッド802に対して微粒子803が接近することで速やかに結合が起こり一度接着すれば剥がれることはない。さらに能動的な衝突を促進するために、溶液を撹拌子で撹拌する、熱又はマイクロ波を加えて溶液を対流させる、などによって微粒子803が接着パッド802に衝突する頻度を高めることができる。さらに微粒子803の衝突頻度を積極的に高める効果的な方法として微粒子803を含む溶液を流路で撹拌する方法がある。この方法に関して図8を用いて説明する。まず、図8のAに示したように、支持基体801上に流路を配置し、流路の蓋には図8のBで示すような溝を切った凹凸板804を使用する。流路形成部材としてはシランカップリング剤などで非特異的吸着防止処理をした石英やPDMS(Polydimethylsiloxane)などが好ましい。通常、微小な流路に溶液を一定方向に流すと、溶液は層流となって流路を通過する。そのため、支持基体801に近い層にある微粒子803のみが、接着パッド802に固定され、支持基体801から離れた層にある微粒子803は支持基体801に接近することができない。例えば、静置又は層流中で微粒子803を接着パッド802に分子間力で吸着させる場合、ポテンシャルエネルギーは距離の6乗に反比例するため、支持基体801の近傍、せいぜい数十マイクロメートル付近に存在する微粒子803のみが衝突の機会を得られる。微粒子803の接着パッドに対する衝突頻度は微粒子803の濃度に比例するため、支持基体801の表層の微粒子803は一定時間後にほとんどが接着パッド802に固定される。そのため、液層間の微粒子803の移動は拡散のみとなり、表層近傍とそれ以外の液層に濃度差が生じ、接着パッド802に対する実質的な微粒子803の濃度は著しく低下する。
本実施例の分析方法を、図9を用いて説明する。分析対象の核酸断片901に蛍光色素903が標識された捕捉用タグ分子902を結合させる。結合には、ライゲーション反応や、予め分析対象の核酸断片901と捕捉用タグ分子902にアミノ基やスクシンイミド基などの官能基を導入しておいて官能基同士のカップリング反応を用いることもできる。特に、分析対象の核酸断片901がマイクロRNAの場合には、捕捉用タグ分子902を10〜20塩基長程度のRNA分子とし、T4RNAリガーゼを用いて両者を結合する方法が有効である。分析対象の核酸断片901に蛍光色素903が標識された捕捉用タグ分子902を結合させた後、蛍光体905で標識された核酸分子(プローブ分子)904とハイブリダイゼーションを行う。核酸分子(プローブ分子)904は個々の評価目的の核酸断片を識別するためのものであり、個々の遺伝子の配列を代表する塩基配列を有する必要がある。配列設計を行う場合には、核酸二本鎖の安定性の指標となる融解温度を個々の標識された核酸分子(プローブ分子)で一定の範囲に収める必要がある。その範囲は狭いほうが好ましいが、所定の温度±3℃程度に抑えることが好ましい。また、標識された核酸分子(プローブ分子)同士の塩基配列の相同性は低いことが好ましく、相同性を70%以下、より好ましくは60%以下に抑えることが好ましい。次に、実施例6に記載した方法を用いて、微粒子908に捕捉分子906を結合分子907を介して一分子だけ固定したものを予め作製しておき、これを加えてハイブリダイゼーションを行うことで、微粒子908上に、分析対象の核酸断片901と蛍光体905で標識された核酸分子904のハイブリッドを一分子対形成したものを作製することができる。蛍光体905には、実施例1で述べたように、蛍光体入り蛍光ビーズを用いることができる。
本実施例では、生体分子分析方法に用いる生体分子分析装置の好ましい構成の一例について、生体分子が核酸の場合を例にとり、図10を参照しながら説明する。
102 捕捉用タグ
103 蛍光色素
104 核酸分子(プローブ分子)
105 蛍光体
106 捕捉用分子
107 結合分子
108 磁気微粒子
109 磁石
110 支持基体
111 検出器
201 磁気微粒子
202 抗体
203 結合分子
204 分析対象のタンパク質
205 蛍光標識を施した抗体(プローブ分子)
206 支持基体
207 磁石
208 検出器
301 支持基体
302 接着パッド
303 微粒子
304 捕捉分子
305 結合分子
306 分析対象の核酸断片(生体分子)
307 捕捉用タグ分子
308 蛍光体標識付核酸分子(プローブ分子)
401 支持基体
402 接着パッド
403 微粒子
404 捕捉分子
405 線状分子
406 官能基
407 官能基
501 平滑な支持基体
502 電子線用ポジ型レジスト
503 接着パッド
504 線状分子
505, 506 線状分子末端の官能基
507 非特異吸着防止用分子
508 微粒子
509 アビジン
510 捕捉分子
601 微粒子
602 結合サイト
603 結合サイト
604 捕捉用分子
605 オリゴヌクレオチド
606 結合サイト
607 回収用微粒子
608 結合サイト
609 水溶液
610 磁石
701 分析対象の核酸断片
702 捕捉用タグ分子
703 蛍光色素
704 核酸分子(プローブ分子)
705 蛍光体
706 捕捉分子
707 結合分子
708 微粒子
709 接着パッド
710 支持基体
711 検出器
801 支持基体
802 接着パッド
803 微粒子
804 凹凸板
901 分析対象の核酸断片
902 捕捉用タグ分子
903 蛍光色素
904 核酸分子(プローブ分子)
905 蛍光体
906 捕捉分子
907 結合分子
908 微粒子
909 流路
910 検出器
1001 核酸分析用デバイス基板
1002 流路部材
1003 温調プレート
1004 流路
1005 送液ユニット
1006 対物レンズ
1007 YAGレーザ光源
1008 レンズ
1009 ダイクロイックミラー
1010 光学フィルタ
1011 結像レンズ
1012 2次元CCDカメラ
1013 He-Neレーザ光源
1014 注入口
1015 ダイクロイックミラー
1016 磁石ユニット
Claims (13)
- 分析対象の生体分子を磁気微粒子表面に固定する工程と、
蛍光標識したプローブ分子を、分析対象の生体分子と反応させる工程と、
前記微粒子を支持基体上に収集及び固定する工程と、
前記支持基体上の標識を測定する工程を含む生体分子分析方法であって、
前記磁気微粒子の直径は1μm以下であり、
前記支持基体は、前記微粒子を収集及び固定させる面が平滑であり、
分析対象の生体分子を磁気微粒子表面に固定する工程は、前記磁気微粒子1個につき前記分析対象の生体分子を一分子固定することにより行い、
前記支持基体上の標識を測定する工程は、生体分子一分子に付けた蛍光色素一分子の蛍光観察にて、輝点をカウントすることにより行うことを特徴とする、生体分子分析方法。 - 前記磁気微粒子表面には予め捕捉用分子を固定しておき、分析対象の生体分子を前記捕捉用分子を介して前記磁気微粒子表面に固定することを特徴とする、請求項1に記載の生体分子分析方法。
- 前記磁気微粒子に予め捕捉用分子を一分子固定しておき、分析対象の生体分子を前記捕捉用分子を介して前記磁気微粒子表面に固定することを特徴とする、請求項1又は2に記載の生体分子分析方法。
- 磁力を用いることで、前記磁気微粒子を支持基体上に収集及び固定することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
- 分析対象の生体分子を磁気微粒子表面に固定する工程を行った後、標識したプローブ分子を前記分析対象の生体分子と反応させる工程を行うことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
- 標識したプローブ分子を分析対象の生体分子と反応させる工程を行った後、前記分析対象の生体分子を磁気微粒子表面に固定する工程を行うことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
- 前記生体分子が核酸であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
- 前記プローブ分子が、測定しようとする生体分子とハイブリダイズすることができる核酸であることを特徴とする、請求項7に記載の生体分子分析方法。
- 前記生体分子がタンパク質であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
- 前記プローブ分子が、測定しようとする生体分子に対する抗体であることを特徴とする、請求項9に記載の生体分子分析方法。
- 標識の測定結果から、分析対象の生体分子の絶対濃度を評価する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の生体分子分析方法。
- 分析対象の生体分子を磁気微粒子上に固定する手段と、
蛍光標識したプローブ分子と分析対象の生体分子とを反応させる手段と、
前記反応工程後に、前記磁気微粒子を支持基体上に収集及び固定する手段と、
標識を測定する手段と
を具備することを特徴とする生体分子分析装置であって、
前記磁気微粒子の直径は1μm以下であり、
前記支持基体は、前記微粒子を収集及び固定させる面が平滑であり、
分析対象の生体分子を磁気微粒子表面に固定する手段は、前記磁気微粒子1個につき前記分析対象の生体分子を一分子固定するものであり、
標識を測定する手段は、生体分子一分子に付けた蛍光色素一分子の蛍光観察にて、輝点をカウントするものである、生体分子分析装置。 - 標識を測定する手段が、光照射手段及び発光検出手段を含むことを特徴とする、請求項12に記載の生体分子分析装置。
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