JP7141405B2 - 検体検出イムノアッセイ - Google Patents
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Description
本出願は、2017年2月9日出願の米国仮特許出願シリアル番号62/456,906の利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の方法及び物質と同様または同等のあらゆる方法及び物質を、本明細書に記載する実施形態の実施または試験に使用可能であるが、一部の好ましい方法、組成物、デバイス及び物質について本明細書において説明する。しかしながら、本物質及び方法を説明する前に、本発明は本明細書に記載の特定の分子、組成物、方法またはプロトコルに限定されず、それらは通常の実験及び最適化により様々であり得るということを理解すべきである。本明細書で使用する専門用語は特定の様式または実施形態を説明するためだけのものであり、本明細書に記載する実施形態の範囲を限定することを意図するものではないということも理解されたい。
本明細書の実施形態の開発中に実験を行い、本明細書に記載のイムノアッセイの実現性及び有用性を証明した。
2レポーターイムノアッセイ
1)2レポーターシステムを使用して抗EGFR治療抗体であるセツキシマブを検出するための組み合わせアッセイを設計し実施した(図4A)。IdeSプロテアーゼ酵素(Promega catalog# V7511)を使用して、標識競合物質用に、セツキシマブをF(ab)2フラグメントとFcフラグメントに分割した。磁気プロテインAビーズ(Promega)を使用して抗体のFc部分を除去し、セツキシマブのF(ab)2フラグメントを残した。それから、化学的コンジュゲートを用いてセツキシマブF(ab)2をNANOLUCで標識した(標識競合物質)。一定濃度のNANOLUC標識セツキシマブF(ab)2の存在下で、増加量のセツキシマブ含有試料を、表面固相EGFRを含有するプレートに加えた。図1Aは、セツキシマブの濃度が上昇するにつれてシグナルが低下することを示している。このアッセイにおける検出限界(LOD)は約0.01ug/mlであり、定量上限(ULOQ)は約1.0ug/mlであった。第1の検出工程の後、プレートを洗浄してから、標識検出剤である、HRPで標識した抗ヒトFc二次抗体を用いてインキュベートした(図1B)。本アッセイの第2の検出工程では、0.00001~0.01のダイナミックレンジが認められた。2段階のイムノアッセイの個々のグラフ(図1)を使用することにより、少なくとも5対数オーダーにわたるセツキシマブの検出が可能となる。第2の検出由来のシグナル(標識検出剤由来のシグナル)と第1の検出由来のシグナル(標識競合物質由来のシグナル)の比率を取ることにより、単一の無次元量を得る(図2)。これにより、濃度が上昇するにつれてシグナル比率が上昇し>5対数オーダーのダイナミックレンジを明確に示す、直観的かつ容易に解釈可能な結果がもたらされる(図3)。加えて、比率を使用することによって、大きく異なった絶対シグナルにより生じ得る潜在的な混乱が排除される。
単一レポーターイムノアッセイ
単一レポーターシステムを使用して抗EGFR治療抗体であるセツキシマブを検出するための組み合わせアッセイを設計し実施した(図4B)。NANOLUCで標識したIdeS開裂セツキシマブF(ab)2を標識競合物質として使用した。上記のとおり、一定濃度のNANOLUC標識セツキシマブF(ab)2の存在下で、増加量のセツキシマブを、表面固相EGFRを含有するプレートに加えることにより、第1の検出工程を実施した。次に、NANOLUC阻害剤であるJRW-0552を使用して、NANOLUC標識セツキシマブF(ab)2由来のシグナルを除去した。それからプレートを洗浄し、NANOLUCで標識した抗ヒトFc二次抗体(標識検出試薬)を用いてインキュベートした。図2に示した2レポーターシステムのシグナル比率と共に、本アッセイにおける2回の検出工程(標識競合物質の検出と標識検出試薬の検出)に由来するシグナルの比率をセツキシマブに対してプロットした(図3)。本明細書の実施形態の開発中に行った実験に由来するデータは、組み合わせイムノアッセイの高ダイナミックレンジを示している。
JRW-0552
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔1〕(a)標識競合物質の存在下で、固相捕捉剤を提示する表面を試料に曝露する工程であって、前記競合物質と標的検体の両方が前記捕捉剤に結合可能である、工程と、
(b)前記標識競合物質由来のシグナルを測定する工程であって、前記標識競合物質由来のシグナルが、(A)前記捕捉剤に結合した標識競合物質の量に比例し、(B)前記試料中の標的検体の量に反比例する、工程と、それに続いて、
(c)前記表面を標識検出剤に曝露する工程であって、前記標識検出剤が、前記標的検体に結合可能であるが前記標識競合物質には結合不能である、工程と、
(d)前記標識検出剤由来のシグナルを測定する工程であって、前記標識検出剤由来のシグナルが、(A)前記標的検体に結合した標識検出剤の量に比例し、(B)前記試料中の標的検体の量に比例する、工程と、
を含む、方法。
〔2〕イムノアッセイの工程(a)~(d)が、同一の試料において、同一の物理的位置で、同一の標的検体に対して実施される、前記〔1〕に記載の方法。
〔3〕イムノアッセイが、既知量の標識競合物質及び未知量の標的検体を使用して実施される、前記〔1〕に記載の方法。
〔4〕(e)前記標識競合物質由来のシグナル及び/又は前記標識検出剤由来のシグナルを、既知量の標的検体を用いて調整した基準値と比較して、前記試料中の標的検体の量を測定する工程、
を更に含む、前記〔3〕に記載の方法。
〔5〕(e)前記標識競合物質由来のシグナルと前記標識検出剤由来のシグナルの比率を測定して無次元量を生成する工程、
を更に含む、前記〔3〕に記載の方法。
〔6〕(f)前記無次元量を、既知量の標的検体を用いて調整した基準比率と比較して、前記試料中の標的検体の量を測定する工程、
を更に含む、前記〔5〕に記載の方法。
〔7〕前記標識競合物質及び前記標識検出剤が、検出可能に異なる標識を含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔8〕前記標識競合物質及び前記標識検出剤が同一の標識を含み、工程(a)由来の前記シグナルが工程(b)において実質的に検出されないように、工程(a)と工程(b)の間に前記標識の阻害剤を添加する工程を更に含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔9〕前記標識競合物質の標識が、検出可能な活性を有する酵素を含む、前記〔8〕に記載の方法。
〔10〕前記阻害剤が、前記酵素との基質結合を防止する、前記〔9〕に記載の方法。
〔11〕前記阻害剤が、前記酵素による基質代謝回転を防止する、前記〔9〕に記載の方法。
〔12〕前記標的検体が、標的抗体である、前記〔1〕に記載の方法。
〔13〕前記捕捉剤が、前記標的抗体用のエピトープを提示する、前記〔12〕に記載の方法。
〔14〕前記標識競合物質が、前記標的抗体用のエピトープに結合可能なF(ab) 2 フラグメントを含む、前記〔13〕に記載の方法。
〔15〕前記検出剤が、前記標的抗体のFc部分に結合可能であるが前記F(ab) 2 フラグメントには結合不能な抗Fc抗体を含む、前記〔14〕に記載の方法。
〔16〕標的検体を検出するためのイムノアッセイを実施するための試薬を含むシステムであって、
(a)前記標的検体が安定的に結合可能な捕捉剤を提示する表面と、
(b)第1の検出可能標識を含み、前記捕捉剤に結合可能な標識競合物質と、
(c)第2の検出可能標識を含み、前記標的検体に結合可能であるが前記競合物質には結合不能な検出剤と、
を含む、システム。
〔17〕前記表面が、スライドガラス、チューブの内側、プレート、又はマイクロウェルの内側である、前記〔16〕に記載のシステム。
〔18〕前記標的検体が、標的抗体である、前記〔16〕に記載のシステム。
〔19〕前記標的抗体が、治療抗体である、前記〔18〕に記載のシステム。
〔20〕前記捕捉剤が、前記標的抗体のエピトープを含む、前記〔18〕に記載のシステム。
〔21〕前記競合物質が、前記標的抗体用のエピトープに結合可能なF(ab) 2 フラグメントを含む、前記〔20〕に記載のシステム。
〔22〕前記第1の検出可能標識が、蛍光色素、検出可能な活性を有する酵素、及び蛍光タンパク質から選択される、前記〔21〕に記載のシステム。
〔23〕前記第1の検出可能標識が酵素であり、前記検出可能な活性が発光である、前記〔22〕に記載のシステム。
〔24〕検出剤が、前記標的抗体のFc部分に結合可能であるが前記F(ab) 2 フラグメントには結合不能な抗Fc抗体を含む、前記〔16〕に記載のシステム。
〔25〕前記第2の検出可能標識が、蛍光色素、検出可能な活性を有する酵素、及び蛍光タンパク質から選択される、前記〔24〕に記載のシステム。
〔26〕前記第1の検出可能標識が酵素であり、前記検出可能な活性が発光である、前記〔24〕に記載のシステム。
〔27〕前記第1の標識及び前記第2の標識が、検出可能に異なる標識である、前記〔16〕に記載のシステム。
〔28〕前記第1の標識及び前記第2の標識が同一の標識であり、前記システムが前記標識の阻害剤を更に含む、前記〔16〕に記載のシステム。
〔29〕前記第1の検出可能標識及び前記第2の検出可能標識が、酵素である、前記〔28〕に記載のシステム。
〔30〕前記阻害剤が、前記酵素との基質結合を防止する、前記〔29〕に記載の方法。
〔31〕前記阻害剤が、前記酵素による基質代謝回転を防止する、前記〔29〕に記載の方法。
〔32〕(a)標識競合物質の存在下で、固相捕捉剤を提示する表面を試料に曝露する工程であって、前記捕捉剤が、標的抗体用のエピトープを含み、前記競合物質が、F(ab) 2 フラグメント及び第1の検出可能標識を含み、前記標的抗体用のエピトープに結合可能である、工程と、
(b)前記第1の検出可能標識由来のシグナルを測定する工程であって、前記第1の検出可能標識由来のシグナルが、(A)前記捕捉剤に結合した標識競合物質の量に比例し、(B)前記試料中における標的検体の量に反比例する、工程と、
(c)前記標識競合物質と前記捕捉剤に結合した前記標的抗体を有する前記表面を標識検出剤に曝露する工程であって、前記標識検出剤が、抗Fc抗体及び第2の検出可能標識を含み、前記標的検体に結合可能であるが前記標識競合物質には結合不能であり、前記第2の検出可能標識のシグナルが、前記第1の検出可能標識のシグナルと識別可能である、工程と、
(d)前記第2の検出可能標識由来のシグナルを測定する工程であって、前記第2の検出可能標識由来のシグナルが、(A)前記標的検体に結合した標識検出剤の量に比例し、(B)前記試料中の標的検体の量に比例する、工程と、
を含む、方法。
〔33〕(a)標識競合物質の存在下で、固相捕捉剤を提示する表面を試料に曝露する工程であって、前記捕捉剤が、標的抗体用のエピトープを含み、前記競合物質が、F(ab) 2 フラグメント及び第1の検出可能標識を含み、前記標的抗体用のエピトープに結合可能である、工程と、
(b)前記第1の検出可能標識由来のシグナルを測定する工程であって、前記第1の検出可能標識由来のシグナルが、(A)前記捕捉剤に結合した標識競合物質の量に比例し、(B)前記試料中における標的検体の量に反比例する、工程と、
(c)前記第1の検出可能標識の阻害剤を添加する工程であって、前記阻害剤が、前記標識競合物質の前記第1の検出可能標識に結合して、前記標識競合物質の前記第1の検出可能標識に由来するその後のシグナル検出を防止する、工程と、
(d)前記阻害標識競合物質と前記捕捉剤に結合した前記標的抗体を有する前記表面を標識検出剤に曝露する工程であって、前記標識検出剤が、抗Fc抗体及び第2の検出可能標識を含み、前記標的検体に結合可能であるが前記標識競合物質には結合不能である、工程と、
(e)前記第2の検出可能標識由来の第2のシグナルを測定する工程であって、前記第2の検出可能標識由来の第2のシグナルが、(A)前記標的検体に結合した標識検出剤の量に比例し、(B)前記試料中における標的検体の量に比例する、工程と、
を含む、方法。
〔34〕工程(c)と工程(d)の間に、前記試料中の非結合阻害剤を洗浄除去する工程を更に含む、前記〔33〕に記載の方法。
〔35〕前記第1の検出可能標識及び前記第2の検出可能標識が、同一タイプの標識である、前記〔33〕に記載の方法。
Claims (17)
- (a)標識競合物質の存在下で、固相捕捉剤を提示する表面を試料に曝露する工程であって、前記競合物質と標的検体の両方が前記捕捉剤に結合可能である、工程と、
(b)前記標識競合物質由来のシグナルを測定する工程であって、前記標識競合物質由来のシグナルが、(A)前記捕捉剤に結合した標識競合物質の量に比例し、(B)前記試料中の標的検体の量に反比例する、工程と、
(c)前記表面を前記標識競合物質の標識の阻害剤に暴露する工程であって、前記阻害剤が前記標識競合物質に結合して前記標識競合物質由来のシグナルを低下させる、工程と、
(d)前記表面を標識検出剤に曝露する工程であって、前記標識検出剤が、前記標的検体に結合可能であるが前記標識競合物質には結合不能であり、前記標識検出剤が前記標識競合物質と同じ標識を含む、工程と、
(e)前記標識検出剤由来のシグナルを測定する工程であって、前記標識検出剤由来のシグナルが、(A)前記標的検体に結合した標識検出剤の量に比例し、(B)前記試料中の標的検体の量に比例する、工程と、
を含み、前記阻害剤が結合した標識競合物質は工程(d)及び(e)で除去されず、前記標識がルシフェラーゼである、方法。 - イムノアッセイの工程(a)~(e)が、同一の試料において、同一の物理的位置で、同一の標的検体に対して実施される、請求項1に記載の方法。
- イムノアッセイが、既知量の標識競合物質及び未知量の標的検体を使用して実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記標識競合物質由来のシグナル及び/又は前記標識検出剤由来のシグナルを、既知量の標的検体を用いて調整した基準値と比較して、前記試料中の標的検体の量を測定する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標識競合物質由来のシグナルと前記標識検出剤由来のシグナルの比率を測定して無次元量を生成する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記無次元量を、既知量の標的検体を用いて調整した基準比率と比較して、前記試料中の標的検体の量を測定する工程を更に含む、請求項5に記載の方法。
- 前記標的検体が、標的抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉剤が、前記標的抗体用のエピトープを提示する、請求項7に記載の方法。
- 前記標識競合物質が、前記標的抗体用のエピトープに結合可能なF(ab)2フラグメントを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記検出剤が、前記標的抗体のFc部分に結合可能であるが前記F(ab) 2 フラグメントには結合不能な抗Fc抗体を含む、請求項9に記載の方法。
- 標的検体を検出するためのイムノアッセイを実施するための試薬を含むシステムであって、
(a)前記標的検体が安定的に結合可能な捕捉剤を提示する表面と、
(b)ルシフェラーゼ標識を含み、前記捕捉剤に結合可能な標識競合物質と、
(c)ルシフェラーゼ標識を含み、前記標的検体に結合可能であるが前記競合物質には結合不能な検出剤と、
(d)前記ルシフェラーゼの阻害剤であって、前記標識競合物質のルシフェラーゼに結合してルシフェラーゼ由来のシグナルを低下させる、阻害剤と、
を含む、システム。 - 前記表面が、スライドガラス、チューブの内側、プレート、又はマイクロウェルの内側である、請求項11に記載のシステム。
- 前記標的検体が、標的抗体である、請求項11に記載のシステム。
- 前記標的抗体が、治療抗体である、請求項13に記載のシステム。
- 前記捕捉剤が、前記標的抗体用のエピトープを含む、請求項13に記載のシステム。
- 前記競合物質が、前記標的抗体用のエピトープに結合可能なF(ab) 2 フラグメントを含む、請求項15に記載のシステム。
- 前記検出剤が、前記標的抗体のFc部分に結合可能であるが前記F(ab)2フラグメントには結合不能な抗Fc抗体を含む、請求項16に記載のシステム。
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