JP2576910B2 - 免疫分析要素および免疫分析方法 - Google Patents
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Description
析要素及びそれを用いた免疫分析方法に関するものであ
る。
析は、病態の診断や治療経過の判定に非常に有用であ
り、臨床検査の分野で重要な役割を果たしている。この
ような微量成分(リガンド)の分析方法として、酵素免
疫分析方法(エンザイムイムノアッセイ)がある。酵素
免疫分析方法には、B/F分離が必要な非均一系とB/F分離
が不要な均一系がある。均一系反応は抗体と抗原(リガ
ンド)が結合すると標識酵素の酵素活性が何らかの干渉
を受けることに基づくもので、一般には抗原抗体結合に
よる阻害作用を利用する。大分子である抗体が酵素標識
抗原中の抗原に結合することにより、酵素の基質に対す
る結合が立体障害を受けたり、或いは酵素の立体構造が
変化するために、酵素活性が抑制されるものと考えられ
ている。
臨床検査では、簡便、迅速に分析でき自動操作化もでき
ることが望まれ、このような観点から、乾式分析要素が
提案されている(例えば特開昭45-53888、同59-77356、
同59-102388、米国特許4,459,358)。
ている(特開平1-321360)。これは (A)高分子化抗原(リガンドまたはその誘導体と高分
子化合物との結合物)、 (B)水不溶性の高分子基質、 (C)リガンドに対する抗体と、基質に対する酵素との
結合物、 の3つを多層分析要素の同一層或いは別々の層に含有さ
せたものである。分析要素に点着し供給された抗原は、
高分子化抗原と競争して、抗体−酵素結合物に結合す
る。この抗原−抗体−酵素複合体は、水不溶性高分子基
質に反応して、可溶性の低分子生成物を生成する。一
方、高分子化抗原と結合してできた高分子抗原−抗体−
酵素複合体は、高分子基質に対して酵素活性を示すこと
ができない。従って検体中の抗原量が増えるに従って、
酵素反応生成物は増えることになる。この生成物を検出
層に移行させて、その量をその有色化学基が与える吸収
の光学濃度を測定することにより、検体中の抗原量を分
析する。
予め色素を結合させた高分子基質を用いて、酵素(アミ
ラーゼ)による分解生成物であるアミロースについてい
る色素(ダイ)を測定するので、高分子基質と反応生成
物とは分離して測定しなければならない。そのため未反
応基質を含有する試薬層と、反応生成物を受容する検出
層の間には酸化チタン粒子等を含む光遮蔽層を設けてい
る。このような層構成の分析要素では、試薬層で生成さ
れた可溶性反応生成物が、光遮蔽層を経て検出層に十分
拡散するまでの時間を考慮しなければならず、乾式化学
分析の特徴である迅速な定量には好ましくない。
キシル基やスルホ基のような親水性基を導入しておい
て、反応生成物の拡散性を上げることも考えられる。し
かし、これらの置換基を導入し得る位置は限られてお
り、またその導入により、分析の感度を支配する色素部
位の分子吸光係数を低下させるという新たな不都合が生
じることになる。
り、簡便な操作で高感度にかつ迅速な分析が出来る、均
一系酵素免疫反応を適用した免疫分析要素を提供するこ
とを目的とする。
ことも目的とする。
高分子化合物との結合物と、酵素標識抗体との間の反応
により生じた酵素活性の変化を測定することによりリガ
ンド量を分析する免疫分析要素において、 前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を
含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成
物にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備えること
を特徴とする免疫分析要素により達成することができ
る。
化抗原)と酵素標識抗体は、基質層或いは基質層の上に
積層された別の層に予め含有させておくこともできる。
障害により、非拡散性基質に対する酵素活性が干渉され
る。検体中の抗原(リガンド)が結合した酵素標識抗体
の酵素は、非拡散性基質に対する酵素活性は影響されな
い。従って、検体中の抗原量に応じた拡散性の反応生成
物が生成される。基質層で生じた拡散性物質は、速やか
に試薬層に移行し、ここでさらに低分子物質に分解され
る。この低分子物質を試薬層内で又は次の検出層で検出
する。未反応の非拡散性基質は基質層に留まる。
上には試薬層12、基質層14が積層されている。
て結合された酵素の基質である非拡散性基質を含有す
る。この基質は測定対象であるリガンド(抗原)の量に
応じて生成される、抗原−抗体−酵素複合体の存在下で
拡散性物質を生成する。
・移行して来た拡散性物質をさらに低分子量の生成物に
する低分子化酵素を含有する。基質層12はまたこの低分
子生成物を検出するための試薬組成物を含有する。
るリガンドである。
漿、血清)リンパ液、尿などがある。血球などの浮遊物
がある場合には予め除去しておくのが好ましい。ただし
適当な濾過層を分析要素の最上層に設けた場合にはその
まま分析要素に点着・供給してもよい。
であれば、本発明の分析要素で分析できる。例えば、ジ
ゴキシン、テオフィリン、フェノバルビタール、フェニ
トイン、ペニシリン、アミカシン等の薬物の誘導体(例
えば薬物と蛋白等の生体物質との結合物)、プロスタグ
ランジン、テストステロン、プロゲステロン、チロキシ
ン等のホルモン等を挙げることができる。
抗原との酵素標識抗体への競争的結合反応を利用する。
従ってリガンドは酵素活性にあまり影響を与えない程度
の大きさ、すなわち低分子量のものが好ましい。例えば
分子量2万ダルトン以下のリガンドの分析に本発明の分
析要素は威力を発揮する。
物は、抗体と結合することにより、その抗体を標識する
酵素の活性を抑制するものである。
ので、かつ水溶性のものが好ましい。このような高分子
化合物として、ゼラチン、ヘモシアニンやフェリチン等
の蛋白質、ポリエチレングリコールなどを挙げることが
できる。これらはリガンドと結合した状態で前述の条件
を備えていれば十分であり、例えば牛血清アルブミンの
ような比較的低分子量のものであっても、それを多量体
に自家重合させるなどして高分子化したものでもよい。
を考慮して決定することができる。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミダゾー
ル基、フェニル基などを利用することができる。例えば
アミノ基相互間を結合する方法は、イソシアネート法、
グルタルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾ
キノン法等数多く知られている。アミノ基とカルボキシ
ル基とを結合する方法としては、カルボキシル基をサク
シニルイミドエステル化する方法の他カルボジイミド
法、ウッドワード試薬法等が知られており、アミノ基と
糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法(Nakane法)も適用で
きる。チオール基を利用する場合には、例えば一方の側
のカルボキシル基をサクシニルイミドエステル化してこ
れにシスティンを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋剤を用いて双方を結合することが
できる。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化
法、アルキル化法などがある。結合方法はこれらの例に
限られるものではなく、この他例えば「Mathod in Immu
nology and Immunochemistry」Vol.1(C.A.Williams,M.
W.Chase,Academic Press,1967年)あるいは石川、河
井、宮井編,「酵素免疫測定法」(医学書院、1978年発
行)等の成書に記載されている方法の中から適宜選択し
て利用することができる。リガンドと高分子化合物との
結合比は1:1に限らず、目的に応じて任意の比率とする
ことができるのはいうまでもない。結合反応後は、ゲル
濾過法、イオン交換クロマトグラフィー等により精製
し、必要により凍結乾燥法等により乾燥する。
もよい。その場合の重合方法は前述の結合方法に準じて
行なうことができ、例えばカルボジイミド、グルタルア
ルデヒド等の二価性架橋剤で高分子化すればよい。
対する抗体と交差反応性を有するリガンド誘導体を結合
させてもよい。ここでいうリガンド誘導体とは、単に化
学構造上の類縁体のみならず、免疫反応性において、リ
ガンドと類似の挙動を示すものを指す。例えば、リガン
ドであるテオフィリンに対する抗体がカフェインにも交
差反応する場合には、カフェインの誘導体も高分子化抗
原の材料として用いることができる。
結合させるための適当な官能基がない場合には、これら
にアミノ基、カルボキシル基或いはチオール基等が導入
してもよい。その際にはスペーサーを介して導入し、高
分子化合物と結合し易くしてもよい。例えばリガンドが
テオフィリンである場合には、カルボキシル基を導入し
た8−プロピルカルボキシルテオフィリンを高分子化合
物に結合することができる。
する特異抗体を用いる。高分子化抗原にリガンド誘導体
を用いる場合には、リガンドとリガンド誘導体に共通す
る抗原決定基に反応するものを用いる。常法により得ら
れる抗体でよいが、モノクローナル抗体を用いれば、よ
り感度が向上する。またこの抗体はF(ab′)2、Fa
b′、Fabなどのフラグメントでもよい。
非拡散性基質を分解して、低分子化酵素によりさらに低
分子の生成物を生じるような拡散性生成物を生成する。
自体は試薬層に拡散しない。
より、非拡散性基質より生成した拡散性生成物を、さら
に検出可能な低分子生成物にするものであり、本発明の
分析要素の試薬層に含有される。
拡散性物質を生成し、さらにこの拡散性生成物が、後記
低分子化酵素によりさらに低分子の生成物を生じて容易
に検出できるような組合わせから選ぶことができる。
から拡散性オリゴマーを生成するような分解酵素があ
り、例えば、糖質加水分解酵素を挙げることができる。
このような糖質加水分解酵素酵として、α−アミラー
ゼ、β−アミラーゼ、デキストラナーゼ等がある。その
他の加水分解酵素としては、セルラーゼ、コラゲナー
ゼ、マンナーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ等があ
る。
の結合方法と同様に行なう。
影響されないものが好ましく、また検体中には競合する
同種の酵素がないことが好ましい。ただし、標識酵素を
同種の酵素が検体中に含まれている場合には、この酵素
阻害剤を用いてもよい。この酵素阻害剤は、検体中の酵
素を阻害する程度が標識酵素の活性を阻害する程度より
大きいものであればよい。酵素阻害剤は検体中の酵素を
完全に失活させるが、標識酵素を全く阻害しないものが
最も好ましい。しかし実用上は単に測定時においてブラ
ンク値を上昇させなければよく、測定後には酵素阻害剤
が失活するなどして検体中の酵素活性が回復しても構わ
ない。なお酵素阻害剤は、酵素標識抗体の酵素を阻害し
ないものであればよく、遊離状態の酵素を阻害すること
は構わない。この酵素阻害剤は、公知の酵素阻害剤から
上記のような特異性を持つものを選んで用いればよい。
或いは検体中の問題となる酵素に対する抗体を作って、
これを酵素阻害剤として用いてもよい。
ナーゼ等に対する基質の例として、カルボキシメチル化
澱粉、澱粉、アミロース、アミロペクチン等がある。
酵素として後述するグルコアミラーゼ又はα−グルコシ
ダーゼを用いる場合には、非還元末端グルコースをカル
ボキシルメチル基で修飾したオリゴサッカライド誘導体
(特開昭59-31699)やアミロース誘導体(特開昭59-393
00,Clinica Chemica Acta,138,p21-29(1984))を用い
てもよい。これらの修飾基質はα−アミラーゼの基質と
はなるが、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼの
基質とはならない。
てもよい。この場合には標識酵素は分子内部から切断し
てオリゴマーを生成するエンド(endo)活性の酵素であ
り、低分子化酵素は分子の端から作用して単量体を生成
するエクソ(exo)活性を持つものとするのが好まし
い。例えば、非拡散性基質が重合体(例えば澱粉)であ
る場合に、標識酵素により生成される拡散性オリゴマー
(例えばマルトース)を単量体(例えばグルコース)に
まで分解できるものが用いられる。このような低分子化
酵素の例として糖加水分解酵素、より具体的には、α−
アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラナーゼ、グル
コアミラーゼ、α−グルコシダーゼ等があげられる。
セルロースとセルラーゼを用いた場合には、低分子化酵
素としてC1エンザイムを用いることができる。また同様
にガラクタンとガラクタナーゼを用いた場合にはβ−ガ
ラクトシダーゼ、RNAとリボヌクレアーゼを用いた場合
にはエクソリボヌクレアーゼをそれぞれ低分子化酵素と
して用いることができる。
合せは、公知文献(例えば、「酵素ハンドブック」(丸
尾文治、田宮信雄監修、朝倉書店1982年発行)、「生化
学ハンドブック」(井村伸正、他編、丸善1984年発行)
に記載された酵素、基質から選ぶことができる。
生成物は、公知の検出系試薬により光学的に検出するこ
とができる。
を検出する方法としては、例えば、グルコースをグルコ
ースオキシダーゼ存在下に酸化し生成した過酸化水素を
検出する方法(例えばAnn.Clin.Biochem.,6,24(196
4)、J.Clin.Pathol.,22,246(1969)に記載のTrinder
試薬、特開昭49-50991号(対応米国特許3,886,045)、
米国特許3,992,158号、特開昭55-164356号(対応米国特
許4,292,272)等に記載のTrinder試薬、特開昭53-26188
号(対応米国特許4,089,747)、特開昭58-45557号等に
記載のトリアリール置換イミダゾールロイコ色素を含む
試薬、特開昭59-193352号(対応欧州特許公開EP 012264
1A)、特開昭60-224677号(対応米国特許4,665,023)等
に記載のジアリール−モノアラルキル置換イミダゾール
ロイコ色素を含む試薬を用いる方法)、グルコースデヒ
ドロゲナーゼとNADの存在下に生成するNADHを検出する
方法、またヘキソキナーゼ存在下に生成するグルコース
−6−リン酸を検出する方法等、公知の方法を用いるこ
とができる。これらの検出方法の中で、グルコースオキ
シダーゼ存在下にグルコースを酸化し生成した過酸化水
素をペルオキシダーゼとロイコ色素を用いて検出する方
法が、感度の点で最も望ましい。
と一緒に含有させてもよいが、試薬層の下層に設けた別
の層(例えば第2試薬層又は検出層等)に含有させてこ
の層で検出するようにしてもよい。なお、ロイコ色素を
使用する場合には、水非混和性溶媒の溶液の親水性バイ
ンダー中への分散物とするのが生成した色素の安定性の
上で好ましい。
要素と同様の層構成とすることができる。要素は、基質
層、試薬層の他、支持体、展開層、検出層、光遮蔽層、
接着層、吸水層、下塗り層その他の層を含む多重層とし
てもよい。このような分析要素として、特開昭49-53888
号(対応米国特許3,992,158)、特開昭51-40191号(対
応米国特許4,042,353)、及び特開昭55-164356号(対応
米国特許4,292,272)の各明細書に開示されたものがあ
る。
の乾式免疫分析要素は、実用的に次のような構成を取り
得る。ただし本発明の内容はこれに限定はされない。
の。
するもの。
有するもの。
この順に有するもの。
この順に有するもの。
基質層をこの順に有するもの。
試薬層、基質層をこの順に有するもの。
の層から成ってもよい。また試薬層は後述するように免
疫反応し得る成分を含む免疫反応層としてもよい。
もよい。また各層の間には濾過層を設けてもよい。また
基質層の上には展開層を設けてもよく、又は基質層に展
開作用を持たせ展開層として機能させてもよい。
酵素の基質である非拡散性基質を含有する。
らなる多孔性層とするか、親水性ポリマーバインダーか
らなる層とするのが好ましい。
てもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、
織物布地(例えば平織布地)、編物布地、(例えばトリ
コット編物布地)、ガラス繊維濾紙等を用いることがで
きる。非繊維質材料としては、特開昭49-53888等に記載
の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルター、特
開昭49-53888、特開昭55-90859(対応米国特許4,258,01
1)、特開昭58-70163(対応米国特許4,486,537)等に記
載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有粒状
構造物層等のいずれでもよい。特開昭61-4959(対応欧
州公開EP 0166365A)、特開昭62-116258、特開昭62-138
756(対応欧州公開EP 0226465A)、特開昭62-138757
(対応欧州公開EP 0226465A)、特開昭62-138758(対応
欧州公開EP 0226465A)等に記載の部分接着された複数
の多孔性層の積層物も好適である。
液体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であ
ってもよい。展開層としては、これらのうち織物布地、
編物布地などが好ましい。織物布地などは特開昭57-663
59号に記載されたようなグロー放電処理をしてもよい。
展開層に展開面積、展開速度等を調節するため、特開昭
60-222770(対応:EP 0162301A)、特開昭63-219397(対
応西独特許公開DE 37 17 913A)、特開昭63-112999(対
応:DE 37 17 913A)、特開昭62-182652(対応:DE 37 17
913A)に記載したような親水性高分子あるいは界面活
性剤を含有させてもよい。
め含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他の水浸透性
層、例えば試薬層の上に、特開昭55-164356号のような
方法で接着させるのも有用な方法である。また別の方法
として多孔質層を他の水浸透性層(例えば試薬層)に前
記のような方法で接着させた後、基質を含む組成物を多
孔質層に塗布してもよい。多孔質層への含浸又は塗布に
は公知の方法を利用できる。塗布には例えばディップ塗
布、ドクター塗布、ホッパー塗布、カーテン塗布等を適
宜選択して用いる。
が、塗布層として設ける場合には、1μm〜50μm程
度、好ましくは2μm〜30μmの範囲が適当である。ラ
ミネートによる積層など、塗布以外の方法による場合、
厚さは数十μmから数百μmの範囲で大きく変化し得
る。
層を構成する場合、使用できる親水性ポリマーとして
は、例えば、以下のものがある。ゼラチン及びこれらの
誘導体(例えばフタル化ゼラチン)、セルロース誘導体
(例えばヒドロキエチルセルロース)、アガロース、ア
ルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合体、メタア
クリルアミド共重合体、アクリルアミド又はメタアクリ
ルアミドと各種ビニル性モニマーとの共重合体、ポリヒ
ドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウ
ム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体な
どである。
昭53-21677号(対応米国特許3,992,158)、特開昭55-16
4356号(対応米国特許4,292,272)、特開昭54-101398号
(対応米国特許4,132,528)、特開昭61-292063号(Chem
ical Abstracts106,210567y)等の明細書に記載の方法
に従って、基質その他の試薬組成物と親水性ポリマを含
む水溶液又は水分散液を支持体又は検出層等の他の層の
上に塗布し乾燥することにより設けることができる。親
水性ポリマーをバインダーとする基質層の乾燥時厚さは
約2μm〜約50μm、好ましくは約4μm〜約30μmの
範囲、被覆量では約2g/m2〜約50g/m2、好ましくは約4g/
m2〜約30g/m2の範囲である。
合物の拡散性、反応性、保存性等の諸性能の向上を目的
として、酵素の活性化剤、補酵素、界面活性剤、pH緩衝
剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるい
は無機物からなる各種添加剤を加えることができる。基
質層に含有させることができる緩衝剤の例としては、日
本化学会編「化学便覧 基礎編」(東京、丸善(株)、
1966年発行)1312-1320頁、R.M.C.Dawson et al編、「D
ata for Biochemical Research」第2版(Oxford at th
e Clarendon Press,1969年発行)476-508頁、「Biochem
istry」5,467-477頁(1966年)、「Analytical Bioche
mistry」104,300-310頁(1980年)に記載のpH緩衝剤系
がある。pH緩衝剤の具体例としてトリス(ヒドロキシメ
チル)アミノメタン(Tris)を含む緩衝剤;燐酸塩を含
む緩衝剤;ホウ酸塩を含む緩衝剤;クエン酸又はクエン
酸塩を含む緩衝剤;グリシンを含む緩衝剤;バイシン
(Bicine)を含む緩衝剤;HEPESを含む緩衝剤等がある。
子化酵素により生じた低分子生成物を検出するための検
出試薬組成物を含有する。
で述べた水浸透性層のうち、親水性ポリマーバインダー
からなる連続層とするのが好ましい。用いる親水性ポリ
マーバインダーは基質層で生成される拡散性生成物や、
試薬層内に含有する発色試薬などを考慮して決められ
る。
(半透明)、光透過性(透明)のいずれのものも用いる
ことができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支
持体が好ましい。
のはポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンであ
る。親水性層を強固に接着させるため通常、下塗り層を
設けるか、親水化処理を施す。
分子化抗原及び酵素標識抗体を併せて含有させ、この基
質層内で免疫反応を併せて行なわせる免疫反応層として
もよい。この場合には、要素に検体を点着するだけで、
要素内で均一系の酵素免疫反応が進行させることができ
る。
は基質層の上層に積層された水浸透性層に含有させても
よい。
体を別々に含有させてもよい。
抗体を含有する水浸透性層16を設け、さらにその上に高
分子化抗原を含有する水浸透性層18を設けて免疫分析要
素を構成してもよい。この場合には、検体中のリガンド
(抗原)は、層18の高分子化抗原と共に、層16に拡散・
浸透する。層16では、リガンドと高分子化抗原とはそれ
ぞれ酵素標識抗体の抗体と結合し、さらに基質層14に移
行する。
標識抗体を実質的な乾燥状態又は実質的に水の不存在状
態で一緒に含有させてもよい。
化抗原と酵素標識抗体を実質的な乾燥状態又は実質的に
水の不存在状態で含有する水浸透性層20を設けて免疫分
析要素を構成してもよい。この場合には、水が溶媒であ
る被検液が層20に点着供給された時に、層20の中で被検
液に由来する水の中で、検体中のリガンド(抗原)と高
分子化抗原とは、それぞれ酵素標識抗体の抗体と結合
し、基質層14に移行する。1つの層に高分子化抗原と酵
素標識抗体を実質的な乾燥状態又は実質的に水の不存在
状態で一緒に含有させるには、高分子化抗原と酵素標識
抗体の一方又は両者をアルコール(例、エタノール)等
の非水溶媒に溶解又は分散させて水浸透性層に含浸させ
ればよい。
載の公知の方法により調製することができる。
たはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭57-2
8331(対応米国特許4,169,751)、実開昭56-142454(対
応米国特許4,387,990)、特開昭57-63452,実開昭58-323
50,特表昭58-501144(対応国際公開;WO 83/00391)等に
記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用い
ることが、製造,包装,輸送,保存,測定操作等の観点
で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセ
ットまたはマガジンに収めて用いたり、または小片を開
口のあるカードに貼付または収めて用いることなどもで
きる。
作と同様の操作により液体試料中の被検物であるリガン
ドの定量分析ができる。
範囲の血漿、尿などの水性液体試料液を基質層14に点着
する。点着した分析要素を約20℃〜約45℃の範囲の一定
温度で、好ましくは約30℃〜約40℃の範囲内の一定温度
で1〜10分間インキュベーションする。要素内の発色又
は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成し
た検量線を用いて比色測定法の原理により検体中のリガ
ンド量を求めることができる。点着する液体試料の量、
インキュベーション時間及び温度を一定にすることによ
り定量分析を高精度に実施できる。
367、同58-161867(対応米国特許4,424,191)などに記
載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定
量分析を実施できる。
度合いを判定して、半定量的な測定を行なってもよい。
せていない場合には、要素に点着する前に、水性試料液
を高分子化抗原及び酵素標識抗体を含む溶液と混和し
て、結合反応を十分行なわせてから、基質層に点着すれ
ばよい。
リセロ燐酸1mlに溶かし、[4−(マレイミドメチル)
シクロヘキサン−1−カルボン酸]スクシンイミドエス
テル(CHMS)2mg/mlのDMF溶液100mLを加えて室温で、1
時間反応させた。この反応液をセファデックスG-25カラ
ムにアプライして、pH6.3の0.1Mグリセロ燐酸を流して
素通り分画を分取、4−(マレイミドメチル)シクロヘ
キサン−1−カルボン酸アミド化アミラーゼ(CHM化ア
ミラーゼ)を得た。
5.5))2mlにパパイン300μgを加え、37℃で18時間攪
拌した。0.1N NaOHを加えてpHを6.0に調節したこの反応
液を予め0.1M燐酸緩衝1mM EDTA溶液(pH6.3)で緩衝化
したAcA-44ゲルカラムに入れ、上記の燐酸緩衝液で溶出
した。分子量約10万付近に溶出されたピーク部分を集め
て1mlに濃縮し、目的の抗テオフィリンマウスIgGF(a
b′)2を得た。
物の作製 で調製した抗テオフィリンマウスIgGF(ab′)26m
gを含む0.1M燐酸緩衝液(1mM EDTA含有、pH6.0)1mlに1
0mg/mlの2−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液100
μlを加え、37℃で90分間攪拌した。この反応液を予め
0.1M燐酸緩衝液(pH6.3)で緩衝化したセファデックスG
-25カラムでゲル濾過して未反応の2−メルカプトエチ
ルアミンを除去し、HS-Fab′を得た。これにで調製し
たCHM化α−アミラーゼ2mgを加え、37℃で90分間反応さ
せた。次にこの反応液を0.1M酢酸緩衝5mM塩化カルシウ
ム溶液(pH7.0)で緩衝化したAcA-34カラムゲル濾過し
て分子量20万以上の分画を集め、これを濃縮して目的の
結合物を得た。
合物)の合成 8−プロピルカルボキシテオフィリン5mgを1mlジメチ
ルホルムアミド(DMF)に溶かし、これにN−ヒドロキ
シサクシンイミド3mg、水溶性カルボジイミド5mgを加え
室温にて2時間攪拌し活性化テオフィリンを調製した。
ウマフェリチン10mgを0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液1m
lに溶かし、上記活性化テオフィリン溶液を500μl加え
室温にて1時間放置し、予め燐酸緩衝化生理食塩水(PB
S;pH7.0)で平衡化したセファデックス−G25ゲルカラム
にて、未反応物を除去し目的の高分子化抗原(テオフィ
リン−ウマフェリチン結合物)を9mg得た。
ン結合物)の合成 8−プロピルカルボキシテオフィリン5mgを1mL DMFに
溶かし、これにN−ヒドロキシサクシンイミド3mg、水
溶性カルボジイミド5mgを加え室温でにて2時間攪拌し
活性化テオフィリンを調製した。ウシ血清アルブミン
(BSA)10mgを0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液1mlに溶か
し、上記活性化テオフィリン溶液を500μl加え室温に
て1時間放置し、予めPBSで平衡化したセファデックス
−G25ゲルカラムにて、未反応物を除去し目的の高分子
化抗原(テオフィリン−BSA結合物)を9mg得た。
透明ポリエチレンテレフタレート(PET)シート(支持
体)上に下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬溶液
を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。
塗布し、乾燥して設けた。
試薬含有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤させ、その
上に50デニール相当のPET紡績糸36ゲージ編みした厚さ
約250μmのトリコット編物布地をほぼ一様に軽く圧力
をかけてラミネートして多孔性展開層を設けた。
て基質層を設けてテオフィリン分析用多層分析要素を調
製した。
開昭57-63452に記載のスライドの枠に収めて、テオフィ
リン分析用多層乾式スライド1とした。
物及び合成例(2)のテオフィリン−ウマフェリチン結
合物をそれぞれ0.1mg/mlとなるように、既知量のテオフ
ィリンを含有する50mMグリセロ燐酸緩衝溶液(pH7)に
加え、37℃で20分間インキュベートした。この後、当溶
液10μlを前記スライド1に点着し、37℃に保って、中
心波長650nmの可視光でPET支持体側からスライド1の反
射光学濃度を測定した。点着から3分後および5分後の
反射光学濃度の差(ΔOD5-3)を第4図に示す。
質層兼展開層であるトリコット編物布地層に、さらに合
成例(1)で合成したアミラーゼ−抗テオフィリンIgG
結合物を3mg/m2の被覆量となるようにしてエタノール溶
液を塗布し含浸させ乾燥させてテオフィリン分析用多層
免疫スライド2を作成した。
l)を含み、既知量のテオフィリンを含有するpH7の50mM
グリセロ燐酸緩衝液10μlを、スライド2に点着した。
37℃に保って、中心波長650nmの可視光でPET支持体側か
らスライド2の反射光学濃度を測定した。点着から3分
後および5分後の反射光学濃度の差(ΔOD5-3)を第5
図に示す。第5図の検量線より、本発明のテオフィリン
分析用乾式免疫分析要素はテオフィリンの定量が精度良
く行えることが明らかである。
質層兼展開層であるトリコット編物布地層に、さらに合
成例(3)で合成したテオフィリン−BSA結合物を3mg/m
2の被覆量となるようにして水溶液を塗布し含浸させ、
次いで合成例(1)で合成したアミラーゼ−抗テオフィ
リンIgG結合物を3mg/m2の被覆量となるようにしてエタ
ノール溶液を塗布し含浸させ乾燥させて乾燥させてテオ
フィリン分析用多層免疫スライド3を作成した。
7の50mMグリセロ燐酸緩衝溶液10μlを点着し、37℃に
保って、支持体側から650nmの反射光学濃度を測定し、
点着から3分後および5分後の反射光学濃度の差(ΔOD
5-3)を求めて、検量線を作成した。実施例2と同様に
テオフィリンの定量が精度良く行えること判明した。
りである。
と、酵素標識抗体との間の反応により生じた酵素活性の
変化を測定することによりリガンド量を分析する免疫分
析要素において、 前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を
含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成
物にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備えること
を特徴とする免疫分析要素。
層の上に積層された層に含有されていることを特徴とす
る(1)記載の免疫分析要素。
基質層または前記基質層の上に積層された層に含有され
ていることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
物との結合物とが、前記基質層に含有されていることを
特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
解酵素であり、前記低分子化酵素がエキソ活性型の糖質
分解酵素であることを特徴とする(1)記載の免疫分析
要素。
の免疫分析要素。
素を生成する試薬組成物を、前記試薬層又は他の水浸透
性層に含有していることを特徴とする(1)記載の免疫
分析要素。
過酸化物を生成する(7)記載の免疫分析要素。
素を含む(8)記載の免疫分析要素。
らなる溶液の水性液中への分散物を含む(9)記載の免
疫分析要素。
ルオキシダーゼ、及びロイコ色素を含む(10)記載の免
疫分析要素。
と、酵素標識抗体との間の反応により生じた酵素活性の
変化を測定することにより、検体中のリガンド量を分析
する免疫分析方法において、 (a)前記検体を、前記酵素により拡散性物質を生成す
る非拡散性基質を含有する基質層に供給し、次いで、 (b)前記基質層で生成された拡散性物質を、さらに低
分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層に移行
させ、 (c)試薬層で生成された低分子生成物の量を測定す
る、 ことを特徴とする免疫分析方法。
実施態様例の構成図である。第4図は実施例1の免疫分
析要素の検量線を示す図、第5図は実施例2の免疫分析
要素の検量線を示す図である。 10……透光性支持体、12……試薬層、14……基質層、16
……酵素標識抗体を含有する水浸透性層、18……高分子
化抗原を含有する水浸透性層、16……酵素標識抗体と高
分子化抗原とを含有する水浸透性層。
Claims (6)
- 【請求項1】リガンドと、リガンドと高分子化合物との
結合物と、酵素標識抗体との間の反応により生じた酵素
活性の変化を測定することによりリガンド量を分析する
免疫分析要素において、 前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含
有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物
にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備えることを
特徴とする免疫分析要素。 - 【請求項2】前記酵素標識抗体が、前記基質層または前
記基質層の上に積層された層に含有されていることを特
徴とする請求項1記載の免疫分析要素。 - 【請求項3】前記リガンドと高分子化合物との結合物
が、前記基質層または前記基質層の上に積層された層に
設けられた層に含有されていることを特徴とする請求項
1又は2記載の免疫分析要素。 - 【請求項4】前記低分子化酵素が、糖分解酵素である請
求項1記載の免疫分析要素。 - 【請求項5】前記酵素標識抗体と、前記リガンドと高分
子化合物との結合物とが、前記基質層に含有されている
ことを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。 - 【請求項6】リガンドと、リガンドと高分子化合物との
結合物と、酵素標識抗体との間の反応により生じた酵素
活性の変化を測定することにより、検体中のリガンド量
を分析する免疫分析方法において、 (a)前記検体を、前記酵素により拡散性物質を生成す
る非拡散性基質を含有する基質層に供給し、次いで、 (b)前記基質層で生成された拡散性物質を、さらに低
分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層に移行
させ、 (c)試薬層で生成された低分子生成物の量を測定す
る、 ことを特徴とする免疫分析方法。
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