JP2576913B2 - 免疫分析要素および免疫分析方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は均一系酵素免疫測定法を適用した乾式免疫分
析要素及びそれを用いた免疫分析方法に関するものであ
る。

［発明の背景］ 血液や尿などの体液に含まれる生体成分、血漿蛋白等
の分析は、病態の診断や治療経過の判定に非常に有用で
あり、臨床検査の分野で重要な役割を果たしている。こ
のような微量成分（リガンド）の分析方法として、酵素
免疫分析方法（エンザイムイムノアッセイ）がある。酵
素免疫分析方法には、B/F分離が必要な非均一系とB/F分
離が不要な均一系がある。均一系反応は抗体と抗原（リ
ガンド）が結合すると標識酵素の酵素活性が何らかの干
渉を受けることに基づくもので、一般には抗原抗体結合
による阻害作用を利用する。大分子である抗体が酵素標
識抗原中の抗原に結合することにより、酵素の基質に対
する結合が立体障害を受けたり、或いは酵素の立体構造
が変化するために、酵素活性が抑制されるものと考えら
れている。

このような均一系酵素免疫反応を適用した分析方法と
して、特開昭61−80050に開示されているものが知られ
ている。この方法における試薬構成は、 （Ａ）水不溶性の色素標識高分子基質、 （Ｂ）リガンドに対する抗体と、基質に対する酵素との
結合物、 からなり、抗原（リガンド）を含む検体を一定量の酵素
標識抗体と所定時間反応させ抗原−酵素標識抗体複合体
を形成させ、この反応液に水不溶性の色素標識高分子基
質を添加して酵素反応を行わせるものである。

抗原と結合しなかった酵素標識抗体の酵素は、水不溶
性高分子基質に反応して、可溶性の色素標識低分子生成
物を生成する。一方、抗原（高分子性）と結合してでき
た抗原（高分子性）−抗体−酵素複合体は、水不溶性高
分子基質に対して酵素活性を示すことができない。従っ
て検体中の抗原量が増えるに従って、酵素反応生成物は
減少することになる。この生成物の有色化学基が与える
吸収の光学濃度を測定することにより、検体中の抗原量
を分析する。

しかし、この分析要素では、ダイ・スターチのような
予め色素を結合させた高分子基質を用いて、酵素（アミ
ラーゼ）による分解生成物であるアミロースについてい
る色素（ダイ）を測定するので、高分子基質と反応生成
物とは分離して測定しなければならない。そのため操作
が複雑で自動化しにくいという問題がある。

一方、多数の検体試料が取扱いルーティン化している
臨床検査では、簡便、迅速に分析でき自動操作化もでき
ることが望まれ、このような観点から、乾式分析要素が
提案されている（例えば特開昭49−53888、同59−7735
6、同59−102388、米国特許4,459,358）。

この方式を利用した分析要素でも、ダイ・スターチの
ような予め色素を結合させた高分子基質を用いて、酵素
（アミラーゼ）による分解生成物であるアミロースにつ
いている色素（ダイ）を測定するので、高分子基質と反
応生成物とは分離して測定しなければならない。そのた
め未反応基質を含有する試薬層と、反応生成物を受容す
る検出層の間には酸化チタン粒子等を含む光遮蔽層を設
けている。このような層構成の分析要素では、試薬層で
生成された可溶性反応生成物が、光遮蔽層を経て検出層
に十分拡散するまでの時間を考慮しなければならず、乾
式化学分析の特徴である迅速な定量には好ましくない。

反応生成物の拡散を早めるために、予め基質にカルボ
キシル基やスルホ基のような親水性基を導入しておい
て、反応生成物の拡散性を上げることも考えられる。し
かし、これらの置換基を導入し得る位置は限られてお
り、またその導入により、分析の感度を支配する色素部
位の分子吸光係数を低下させるという新たな不都合が生
じることになる。

［発明の目的］ 本発明は、以上のような事情に鑑みなされたものであ
り、簡便な操作で高感度にかつ迅速な分析が出来る、均
一系酵素免疫反応を適用した免疫分析要素を提供するこ
とを目的とする。

また本発明は、その分析要素を用いる方法を提供する
ことも目的とする。

［発明の構成］ このような本発明の目的は、高分子抗原と、酵素標識
抗体との間の反応により生じた酵素活性の変化を測定す
ることにより高分子抗原の量を分析する免疫分析要素に
おいて、前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性
基質を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分
子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備え
ることを特徴とする免疫分析要素により達成することが
できる。

酵素標識抗体は、基質層或いは基質層の上に積層され
た別の層に予め含有させておくこともできる。

［作用］ 検体中に含まれる高分子抗原と結合した酵素標識抗体
の酵素は、立体障害により、非拡散性基質に対する酵素
活性が干渉される。従って、検体中の抗原量に反比例し
て拡散性の反応生成物が生成される。基質層で生じた拡
散性物質は、速やかに試薬層に移行し、ここでさらに低
分子物質に分解される。この低分子物質を試薬層内で又
は次の検出層で検出する。未反応の非拡散性基質は基質
層に留まる。

［発明の構成の詳細な説明］ 免疫分析要素の層構成 第１図に本発明の免疫分析要素の一実施態様を示す。

この図において符号10は光透過性支持体であり、その
上には試薬層12、基質層14が積層されている。

基質層14は、水浸透性層で構成され、抗体に標識とし
て結合された酵素の基質である非拡散性基質を含有す
る。この基質は測定対象である高分子抗原の量に反比例
して残存する酵素標識抗体の酵素活性により拡散性物質
を生成する。

試薬層12は、水浸透性層で構成され、基質層から拡散
・移行して来た拡散性物質をさらに低分子量の生成物に
する低分子化酵素を含有する。基質層12はまたこの低分
子生成物を検出するための試薬組成物を含有する。

測定対象 本発明の測定対象は高分子量でかつ抗原決定基を有す
る高分子抗原である。

本発明の分析要素では、高分子抗原が酵素標識抗体に
結合して生じる酵素活性への干渉（抑制）作用を利用す
る。従って高分子抗原の分子量は、酵素活性に影響を与
える程度の高分子量のものが好ましい。例えば分子量２
万ダルトン以上、好ましくは約５万ダルトン以上の抗原
の定量分析に本発明の分析要素は威力を発揮する。

高分子抗原は、このような高分子量のものであって、
抗原性を有しその抗体を用意できるものであれば、本発
明の分析要素で分析できる。例えば、各種内分泌腺に由
来するホルモン類、免疫グロブリン、アルブミン、フェ
リチン、Ｃ−反応性蛋白（以下CRPと略す）等の血漿蛋
白質、HB抗原等のウイルス、バクテリア類、α−フェト
プロティン、癌胎児性抗原（CEA）等の各種臓器あるい
は血中、尿中に存在する抗原がある。

高分子抗原を含有する検体の種類は限定されないが、
例えば血液（全血、血漿、血清）リンパ液、尿などがあ
る。血球などの浮遊物がある場合には予め除去しておく
のが好ましい。ただし適当な濾過層を分析要素の最上層
に設けた場合にはそのまま分析要素に点着・供給しても
よい。

抗体 酵素で標識される抗体は、被検物である高分子抗原に
対する特異抗体を用いる。定法により得られる抗体でよ
いが、モノクローナル抗体を用いれば、より感度が向上
する。またこの抗体はＦ（ab′）_２、Fab′、Fabなどの
フラグメントでもよい。

酵素−非拡散性基質−低分子化酵素 抗体に標識として結合された酵素は、高分子性の非拡
散性基質を分解して、低分子化酵素によりさらに低分子
の生成物を生じるような拡散性生成物を生成する。

非拡散性基質は、水性検体液に対して非拡散性でそれ
自体は試薬層に拡散しない。

低分子化酵素は、抗体に標識として結合された酵素に
より、非拡散性基質より生成した拡散性生成物を、さら
に検出可能な低分子生成物にするものであり、本発明の
分析要素の試薬層に含有される。

これらの組合わせは、酵素が非拡散性基質に作用して
拡散性物質を生成し、さらにこの拡散性生成物が、後記
低分子化酵素によりさらに低分子の生成物を生じて容易
に検出できるような組合わせから選ぶことができる。

酵素 このような酵素としては重合体からなる非拡散性基質
から拡散性オリゴマーを生成するような分解酵素があ
り、例えば、糖質加水分解酵素を挙げることができる。
このような糖質加水分解酵素として、α−アミラーゼ、
β−アミラーゼ、デキストラナーゼ等がある。その他の
加水分解酵素としては、セルラーゼ、コラゲナーゼ、マ
ンナーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ等がある。

酵素と抗体との結合方法は双方の官能基を考慮して決
定することができる。官能基は、アミノ基、カルボキシ
ル基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル
基などを利用することができる。例えばアミノ基相互間
を結合する方法は、イソシアネート法、グルタルアルデ
ヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多
く知られている。アミノ基とカルボキシル基とを結合す
る方法としては、カルボキシル基をサクシニルイミドエ
ステル化する方法の他カルボジイミド法、ウッドワード
試薬法等が知られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過
ヨウ素酸酸化法（Nakane法）も適用できる。チオール基
を利用する場合には、例えば一方の側のカルボキシル基
をサクシニルイミドエステル化してこれにシステインを
反応させてチオール基を導入し、チオール基反応性二価
架橋剤を用いて双方を結合することができる。フェニル
基を利用する方法としてはジアゾ化法、アルキル化法な
どがある。結合方法はこれらの例に限られるものではな
く、このほか例えば「Method in Immunology and Immun
ochemistry」Vol.1（C.A.Williams,M.W.Chase,Academic
Press,1967年）あるいは石川、河井、宮井 編「酵素
免疫測定法」（医学書院、1978年発行）等の成書に記載
されている方法の中から適宜選択して利用することがで
きる。酵素と抗体との結合比は1:1に限らず、目的に応
じて任意の比率とすることができるのはいうまでもな
い。結合反応後は、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグ
ラフィー等により精製し、必要により凍結乾燥法等によ
り乾燥する。

これらの酵素はいずれの検体中に存在する妨害因子で
影響されないものが好ましく、また検体中には競合する
同種の酵素がないことが好ましい。ただし、標識酵素と
同種の酵素が検体中に含まれている場合には、この酵素
阻害剤を用いてもよい。この酵素阻害剤は、検体中の酵
素を阻害する程度が標識酵素の活性を阻害する程度より
大きいものであればよい。酵素阻害剤は検体中の酵素を
完全に失活させるが、標識酵素を全く阻害しないものが
最も好ましい。しかし実用上は単に測定時においてブラ
ンク値を上昇させなければよく、測定後には酵素阻害剤
が失活するなどして検体中の酵素活性が回復しても構わ
ない。なお酵素阻害剤は、酵素標識抗体の酵素を阻害し
ないものであればよく、遊離状態の酵素を阻害すること
は構わない。この酵素阻害剤は、公知の酵素阻害剤から
上記のような特異性を持つものを選んで用いればよい。
或いは検体中の問題となる酵素に対する抗体を作って、
これを酵素阻害剤として用いてもよい。

非拡散性基質 前述のα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラ
ナーゼ等に対する基質の例として、カルボキシメチル化
澱粉、澱粉、アミロース、アミロペクチン等がある。

低分子化酵素 この低分子化酵素は標識酵素と同じ種類の酵素であっ
てもよい。この場合には標識酵素は分子内部から切断し
てオリゴマーを生成するエンド（endo）活性の酵素であ
り、低分子化酵素は分子の端から作用して単量体を生成
するエクソ（exo）活性を持つものとするのが好まし
い。例えば、非拡散性基質が重合体（例えば澱粉）であ
る場合に、標識酵素により生成される拡散性オリゴマー
（例えばマルトース）を単量体（例えばグルコース）に
まで分解できるものが用いられる。このような低分子化
酵素の例として糖加水分解酵素、より具体的には、α−
アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラナーゼ、グル
コアミラーゼ、α−グルコシダーゼ等があげられる。

非拡散性基質と標識酵素として、カルボキシルメチル
セルロースとセルラーゼを用いた場合には、低分子化酵
素としてC1エンザイムを用いることができる。また同様
にガラクタンとガラクタナーゼを用いた場合にはβ−ガ
ラクトシダーゼ、RNAとリボヌクレアーゼを用いた場合
にはエクソリボヌクレアーゼをそれぞれ低分子化酵素と
して用いることができる。

これらの標識酵素、非拡散性基質、低分子化酵素の組
合せは、公知文献（例えば、「酵素ハンドブック」（丸
尾文治、田宮信雄監修、朝倉書店、1982年発行）、「生
化学ハンドブック」（井村伸正、他編、丸善1984年発
行）に記載された酵素、基質から選ぶことができる。

試薬層において低分子化酵素により生成された低分子
生成物は、公知の検出系試薬により光学的に検出するこ
とができる。

前記低分子化酵素により最終的に生成したグルコース
を検出する方法としては、例えば、グルコースをグルコ
ースオキシダーゼ存在下に酸化し生成した過酸化水素を
検出する方法（例えばAnn.Clin.Biochem.,６,24（196
4）、J.Clin.Pathol.,22,246（1969）に記載のTrinder
試薬、特開昭49−50991号（対応米国特許3,886,045）、
米国特許3,992,158号、特開昭55−164356号（対応米国
特許4,292,272）等に記載の改良Trinder試薬、特開昭53
−26188号（対応米国特許4,089,747）、特開昭58−4555
7号等に記載のトリアリール置換イミダゾールロイコ色
素を含む試薬、特開昭59−193352号（対応欧州特許公開
EP0122641A）、特開昭60−224677号（対応米国特許4,66
5,023）等に記載のジアリール−モノアラルキル置換イ
ミダゾールロイコ色素を含む試薬を用いる方法）、グル
コースデヒドロゲナーゼとNADの存在下に生成するNADH
を検出する方法、またヘキソキナーゼ存在下に生成する
グルコース−６−燐酸を検出する方法等、公知の方法を
用いることができる。これらの検出方法の中で、グルコ
ースオキシダーゼ存在下にグルコースを酸化し生成した
過酸化水素をペルオキシダーゼとロイコ色素を用いて検
出する方法が、感度の点で最も望ましい。

これらの検出試薬は分析要素の試薬層に低分子化酵素
と一緒に含有させてもよいが、試薬層の下層に設けた別
の層（例えば第２試薬層又は検出層等）に含有させてこ
の層で検出するようにしてもよい。なお、ロイコ色素を
使用する場合には、水非混和性溶媒の溶液の親水性バイ
ンダー中への分散物とするのが生成した色素の安定性の
上で好ましい。

分析要素の層構成 本発明の乾式免疫分析要素は、公知の多種の乾式分析
要素と同様の層構成とすることができる。要素は、基質
層、試薬層の他、支持体、展開層、検出層、光遮蔽層、
接着層、吸水層、下塗り層その他の層を含む多重層とし
てもよい。このような分析要素として、特開昭49−5388
8号（対応米国特許3,992,158）、特開昭51−40191号
（対応米国特許4,042,335）、及び特開昭55−164356号
（対応米国特許4,292,272）の各明細書に開示されたも
のがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合には、本発明
の乾式免疫分析要素は、実用的に次のような構成を取り
得る。ただし本発明の内容はこれに限定はされない。

（１）支持体上に試薬層、その上に基質層を有するも
の。

（２）支持体上に試薬層、接着層、基質層をこの順に有
するもの。

（３）支持体上に検出層、試薬層、基質層をこの順に有
するもの。

（４）支持体上に試薬層、光反射層、基質層をこの順に
有するもの。

（５）支持体上に検出層、試薬層、光反射層、基質層を
この順に有するもの。

（６）支持体上に検出層、光反射層、試薬層、基質層を
この順に有するもの。

（７）支持体上に第２試薬層、光反射層、第１試薬層、
基質層をこの順に有するもの。

（８）支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第１
試薬層、基質層をこの順に有するもの。

上記（１）ないし（６）において試薬層は異なる複数
の層から成ってもよい。また試薬層は後述するように免
疫反応し得る成分を含む免疫反応層としてもよい。

支持体と試薬層又は検出層との間には吸水層を設けて
もよい。また各層の間には濾過層を設けてもよい。また
基質層の上には展開層を設けてもよく、又は基質層に展
開作用を持たせ展開層として機能させてもよい。

基質層 基質層14は、水浸透性層で構成され、抗体を標識する
酵素の基質である非拡散性基質を含有する。

基質層の水浸透性を確保するためには、多孔性媒体か
らなる多孔性層とするか、親水性ポリマーバインダーか
らなる層とするのが好ましい。

多孔性層は繊維質であってもよいし、非繊維質であっ
てもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、
織物布地（例えば平織布地）、編物布地、（例えばトリ
コット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることがで
きる。非繊維質材料としては、特開昭49−53888等に記
載の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルター、
特開昭49−53888、特開昭55−90859（対応米国特許4,25
8,001）、特開昭58−70163（対応米国特許4,486,537）
等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含
有粒状構造物層等のいずれでもよい。特開昭61−4959
（対応欧州公開EP0166365A）、特開昭62−116258、特開
昭62−138756（対応欧州公開EP0226465A）、特開昭62−
138757（対応欧州公開EP0226465A）、特開昭62−138758
（対応欧州公開EP0226465A）等に記載の部分接着された
複数の多孔性層の積層物も好適である。

多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例した面積に
液体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であ
ってもよい。展開層としては、これらのうち織物布地、
編物布地などが好ましい。織物布地などは特開昭57−66
359号に記載されたようなグロー放電処理をしてもよ
い。展開層には、展開面積、展開速度等を調節するた
め、特開昭60−222770（対応:EP01623301A）、特開昭63
−219397（対応西独特許公開DE37 17 913A）、特開昭63
−112999（対応:DE37 17 913A）、特開昭62−182652
（対応:DE37 17 913A）に記載したような親水性高分子
あるいは界面活性剤を含有させてもよい。

例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等に基質を予
め含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他の水浸透性
層、例えば試薬層の上に、特開昭55−164356号のような
方法で接着させるのも有用な方法である。また別の方法
として多孔質層を他の水浸透性層（例えば試薬層）に前
記のような方法で接着させた後、基質を含む組成物を多
孔質層に塗布してもよい。多孔質層への含浸又は塗布に
は公知の方法を利用できる。塗布には例えばディップ塗
布、ドクター塗布、ホッパー塗布、カーテン塗布等を適
宜選択して用いる。

こうして作られる基質層の厚さは特に制限されない
が、塗布層として設ける場合には、１μｍ〜50μｍ程
度、好ましくは２μｍ〜30μｍの範囲が適当である。ラ
ミネートによる積層など、塗布以外の方法による場合、
厚さは数十μｍから数百μｍの範囲で大きく変化し得
る。

親水性ポリマーバインダーからなる水浸透性層で基質
層を構成する場合、使用できる親水性ポリマーとして
は、例えば、以下のものがある。ゼラチン及びこれらの
誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体
（例えばヒドロキエチルセルロース）、アガロース、ア
ルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合体、メタア
クリルアミド共重合体、アクリルアミド又はメタアクリ
ルアミドと各種ビニル性モニマーとの共重合体、ポリヒ
ドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウ
ム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体な
どである。

親水性ポリマーバインダーで構成される基質層は、特
公昭53−21677号（対応米国特許3,992,158）、特開昭55
−164356号（対応米国特許4,292,272）、特開昭54−101
398号（対応米国特許4,132,528）、特開昭61−292063号
（Chemical Abstracts 106,210567y）等の明細書に記載
の方法に従って、基質その他の試薬組成物と親水性ポリ
マを含む水溶液又は水分散液を支持体又は検出層等の他
の層の上に塗布し乾燥することにより設けることができ
る。親水性ポリマーをバインダーとする基質層の乾燥時
厚さは約２μｍ〜約50μｍ、好ましくは約４μｍ〜約30
μｍの範囲、被覆量では約2g/m²〜約50g/m²、好ましく
は約4g/m²〜約30g/m²の範囲である。

基質層には非拡散性基質の他に、塗布特性、拡散性化
合物の拡散性、反応性、保存性等の諸性能の向上を目的
として、酵素の活性化剤、補酵素、界面活性剤、pH緩衝
剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるい
は無機物からなる各種添加剤を加えることができる。基
質層に含有させることができる緩衝剤の例としては、日
本化学会編「化学便覧 基礎編」（東京、丸善（株）、
1966年発行）1312−1320頁、R.M.C.Dawson et al編、
「Data for Biochemical Research」第２版（Oxford at
the Clarendon Press,1969年発行）476−508頁、「Bio
chemistry」５,467−477頁（1966年）、「Analytical B
iochemistry」104,300−310頁（1980年）に記載のpH緩
衝剤系がある。pH緩衝剤の具体例としてトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（Tris）を含む緩衝剤；燐酸
塩を含む緩衝剤；硼酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はク
エン酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；ビシン
（Bicine）を含む緩衝剤;HEPESを含む緩衝剤等がある。

試薬層 試薬層12は、低分子化酵素、及び必要に応じて、低分
子化酵素により生じた低分子生成物を検出するための検
出試薬組成物を含有する。

試薬層は、水浸透性層で構成され、前記基質層の説明
で述べた水浸透性層のうち、親水性ポリマーバインダー
からなる連続層とするのが好ましい。用いる親水性ポリ
マーバインダーは基質層で生成される拡散性生成物や、
試薬層内に含有する発色試薬などを考慮して決められ
る。

支持体 支持体10としては光不透過性（不透明）、光半透過性
（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いる
ことができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支
持体が好ましい。

光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいもの
はポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。
親水性層を強固に接着させるため通常、下塗り層を設け
るか、親水化処理を施す。

免疫反応層 第１図の基質層14には、非拡散性基質のみならず、酵
素標識抗体を併せて含有させ、この基質層内で免疫反応
を併せて行なわせる免疫反応層としてもよい。この場合
には、要素に検体を点着するだけで、要素内で均一系の
酵素免疫反応が進行させることができる。

基質層とは別の層に酵素標識抗体を含有させてもよ
い。

例えば第２図に示すように、基質層14の上に酵素標識
抗体を含有する水浸透性層16を設け免疫分析要素を構成
してもよい。この場合には、検体中の高分子抗原は、層
16の酵素標識抗体の抗体と結合し、さらに基質層14に移
行する。

１つの層に酵素標識抗体を実質的な乾燥状態又は実質
的に水の非存在状態で含有させるには、酵素標識抗体を
アルコール（例、エタノール）等の非水溶媒に溶解又は
分散させて水浸透性層に含浸させればよい。

免疫分析要素の製造方法 本発明の乾式免疫分析要素は前述の諸特許明細書に記
載の公知の方法により調製することができる。

本発明の分析要素は一辺約15mmから約30mmの正方形ま
たはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭57−
28331（対応米国特許4,169,751）、実開昭56−142454
（対応米国特許4,387,990）、特開昭57−63452,実開昭5
8−32350,特表昭58−501144（対応国際公開:WO83/0039
1）等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドと
して用いることが、製造，包装，輸送，保存，測定操作
等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ
状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、または
小片を開口のあるカードに貼付または収めて用いること
などもできる。

免疫分析要素による分析方法 本発明の分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操
作と同様の操作により液体試料中の被検物である高分子
抗原の定量分析ができる。

例えば約５μＬ〜約30μＬ、好ましくは８〜15μＬの
範囲の血漿、血清、尿などの水性液体試料液を基質層14
に点着する。点着した分析要素を約20℃〜約45℃の範囲
の一定温度で、好ましくは約30℃〜約40℃の範囲内の一
定温度で１〜10分間インキュベーションする。要素内の
発色又は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め
作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中
の高分子抗原の量を求めることができる。点着する液体
試料の量、インキュベーション時間及び温度を一定にす
ることにより定量分析を高精度に実施できる。

測定操作は特開昭60−125543、同60−220862、同61−
294367、同58−161867（対応米国特許4,424,191）など
に記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度
の定量分析を実施できる。

なお、目的や必要精度によっては、目視により発色の
度合いを判定して、半定量的な測定を行なってもよい。

分析要素内に、酵素標識抗体を含有させていない場合
には、要素に点着する前に、水性試料液を酵素標識抗体
を含む溶液と混和して、結合反応を十分行なわせてか
ら、基質層に点着すればよい。

（合成例） （１）酵素標識抗体の合成 CHM化アミラーゼの作製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ5mgをpH6.3の0.1Mグ
リセロ燐酸1mLに溶かし、［４−（マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボン酸］スクシンイミドエス
テル（CHMS）2mg/mLのDMF溶液100μＬを加えて室温で、
１時間反応させた。この反応液をセファデックスＧ−25
カラムにアプライして、pH6.3の0.1Mグリセロ燐酸を流
して素通り分画を分取、４−（マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボン酸アミド化アミラーゼ（CHM
化アミラーゼ）を得た。

抗CRP・マウスIgGF（ab′）_２の作製 抗CRP・マウスIgG10mg（0.1M酢酸緩衝液（pH5.5））2
mLにパパイン300μｇを加え、37℃で18時間攪拌した。
0.1N NaOHを加えてpHを6.0に調節したこの反応液を予め
0.1M燐酸緩衝1mM EDTA溶液（pH6.3）で緩衝化したAcA−
44ゲルカラムにアプライし、上記の燐酸緩衝液で溶出し
た。分子量約10万付近に溶出されたピーク部分を集めて
1mLに濃縮し、目的の抗CRP・マウスIgGF（ab′）_２を得
た。

α−アミラーゼ−抗CRP・マウスIgGFab′結合物の作
製 で調製した抗CRP・マウスIgGF（ab′）₂6mgを含む
0.1M燐酸緩衝液（1mM EDTA含有、pH6.0）1mLに10mg/mL
の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液100μＬを
加え、37℃で90分間攪拌した。この反応液を予め0.1M燐
酸緩衝液（pH6.3）で緩衝化したセファデックスＧ−25
カラムでゲル濾過して未反応の２−メルカプトエチルア
ミンを除去し、HS−Fab′を得た。これにで調製したC
HM化α−アミラーゼ2mgを加え、37℃で90分間反応させ
た。次にこの反応液を0.1M酢酸緩衝5mM塩化カルシウム
溶液（pH7.0）で緩衝化したAcA−34カラムでゲル濾過し
て分子量20万以上の分画を集め、これを濃縮して目的の
結合物を得た。

（実施例１） ゼラチン下塗層が設けられている厚さ180μｍの無色
透明ポリエチレンテレフタレート（PET）シート（支持
体）上に下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬溶液
を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。

アルカリ処理ゼラチン 14.5 g/m² ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチ
レン単位平均９〜10含有） 0.2 g/m² グルコースオキシダーゼ 5000 u/m² ペルオキシダーゼ 15000 u/m² グルコアミラーゼ 5000 u/m² ２−（４−ヒドロキシ−３、５−ジメトキシフェニル）
−４−［４−ジメチルアミノ）フェニル］−５−フェネ
チルイミダゾール（ロイコ色素）酢酸塩 0.38g/m² ビス［（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］
メタン 0.1 g/m² この試薬層の上に下記の被覆量になるように接着層を
塗布し、乾燥して設けた。

アルカリ処理ゼラチン 14.5g/m² ビス［（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］
メタン 0.1g/m² ついで接着層の表面に下記の被覆量になるように下記
試薬含有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤させ、その
上に50デニール相当のPET紡績糸36ゲージ編みした厚さ
約250μｍのトリコット編物布地をほぼ一様に軽く圧力
をかけてラミネートして多孔性展開層を設けた。

ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチ
レン単位平均９〜10含有） 0.15g/m² ビス［（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］
メタン 0.4 g/m² 次に、下記の被覆量になるように基質を塗布、乾燥し
て基質層を設けてCRP分析用多層分析要素を調製した。

カルボキシメチル化澱粉 ４ g/m² ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチ
レン単位平均９〜10含有） 0.2g/m² 次いでこの分析要素を15mm四方のチップに裁断し、特
開昭57−63452に記載のスライドの枠に収めて、CRP分析
用多層乾式スライド１とした。

性能評価試験 合成例（１）のアミラーゼ−抗CRP・IgG結合物を0.1m
g/mLとなるように、既知量のCRPを含有する50mMグリセ
ロ燐酸緩衝溶液（pH7）に加え、37℃で20分間インキュ
ベートした。この後、当溶液10μＬを前記スライド１に
点着し、37℃に保って、中心波長650nmの可視光でPET支
持体側からスライド１の反射光学濃度を測定した。点着
から３分後および５分後の反射光学濃度の差（ΔO
D_5-3）を第３図に示す。

（実施例２） 実施例１と同様にして多層分析要素を作成し、その基
質層兼展開層であるトリコット編物布地層に、さらに合
成例（１）で合成したアミラーゼ−抗−CRP・IgG結合物
を3mg/m²の被覆量となるようにしてエタノール溶液を塗
布し含浸させ乾燥させてCRP分析用多層免疫スライド２
を作成した。

性能評価試験 既知量のCRPを含有するpH7の50mMグリセロ燐酸緩衝溶
液10μＬを、スライド２に点着した。37℃に保って、中
心波長650nmの可視光でPET支持体側からスライド２の反
射光学濃度を測定した。点着から３分後および５分後の
反射光学濃度の差（ΔOD_5-3）を第４図に示す。第４図
の検量線より、本発明のCRP分析用乾式免疫分析要素はC
RPの定量が精度良く行えることが明らかである。

最後に本発明の好ましい態様をまとめると、以下の通
りである。

（１）高分子抗原と酵素標識抗体との間の反応により生
じた酵素活性の変化を測定することにより高分子抗原の
量を分析する免疫分析要素において、 前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を
含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成
物にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備えること
を特徴とする免疫分析要素。

（２）前記酵素標識抗体が、前記基質層または前記基質
層の上に積層された層に含有されている（１）に記載の
免疫分析要素。

（３）前記非拡散性基質が高分子多糖類であり、前記酵
素標識抗体の酵素がエンド活性型の糖質分解酵素であ
り、前記低分子化酵素がエキソ活性型の糖質分解酵素で
ある（１）に記載の免疫分析要素。

（４）前記低分子生成物がグルコースである（３）に記
載の免疫分析要素。

（５）前記低分子生成物と反応して可視吸収を有する色
素を生成する試薬組成物を、前記試薬層又は他の水浸透
性層に含有している（１）に記載の免疫分析要素。

（６）前記試薬組成物が、前記低分子生成物と反応して
過酸化物を生成する（５）に記載の免疫分析要素。

（７）前記試薬組成物が、酸化により発色するロイコ色
素を含む（６）に記載の免疫分析要素。

（８）前記試薬組成物が、ロイコ色素の水不溶性溶媒か
らなる溶液の水性液中への分散物を含む（７）に記載の
免疫分析要素。

（９）前記試薬組成物が、グルコールオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、及びロイコ色素を含む（８）に記載の
免疫分析要素。

（10）前記高分子抗原の分子量が約２万ダルトン以上で
ある（１）に記載の免疫分析要素。

（11）前記高分子抗原の分子量が約５万ダルトン以上で
ある（10）に記載の免疫分析要素。

（12）前記高分子抗原が蛋白質である（10）に記載の免
疫分析要素。

（13）高分子抗原と酵素標識抗体との間の反応により生
じた酵素活性の変化を測定することにより、検体中の高
分子抗原の量を分析する免疫分析方法において、 （ａ）前記検体を、前記酵素により拡散性物質を生成す
る非拡散性基質を含有する基質層に供給し、次いで、 （ｂ）前記基質層で形成された拡散性物質を、さらに低
分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層に移行
させ、 （ｃ）試薬層で生成された低分子生成物の量を測定す
る、 ことを特徴とする免疫分析方法。

【図面の簡単な説明】

第１図から第２図はそれぞれ本発明に免疫分析要素の一
実施態様例の構成図である。第３図は実施例１の免疫分
析要素の検量線を示す図、第４図は実施例２の免疫分析
要素の検量線を示す図である。 10……透光性支持体、 12……試薬層、 14……基質層、 16……酵素標識抗体を含有する水浸透性層、

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 牧野 快彦 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士 写真フイルム株式会社内 (72)発明者 二宮 忠司 東京都新宿区下落合４丁目６番７号 富 士レビオ株式会社内 (72)発明者 篠木 浩 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士 写真フイルム株式会社内 (72)発明者 芦原 義弘 東京都新宿区下落合４丁目６番７号 富 士レビオ株式会社内 (72)発明者 洞 尚文 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士 写真フイルム株式会社内 (72)発明者 小川 雅司 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士 写真フイルム株式会社内

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】高分子抗原と、酵素標識抗体との間の反応
   により生じた酵素活性の変化を測定することにより高分
   子抗原の量を分析する免疫分析要素において、 前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含
   有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物
   にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備えることを
   特徴とする免疫分析要素。
2. 【請求項２】高分子抗原と酵素標識抗体との間の反応に
   より生じた酵素活性の変化を測定することにより、検体
   中の高分子抗原の量を分析する免疫分析方法において、 （ａ）前記検体を、前記酵素により拡散性物質を生成す
   る非拡散性基質を含有する基質層に供給し、次いで、 （ｂ）前記基質層で生成された拡散性物質を、さらに低
   分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層に移行
   させ、 （ｃ）試薬層で生成された低分子生成物の量を測定す
   る、 ことを特徴とする免疫分析方法。