JPH04128655A - 免疫分析要素および免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は均一系酵素免疫測定法を適用した乾式免疫分析
要素及びそれを用いた免疫分析方法に関するものである
。

［発明の背景］ 血液や尿などの体液に含まれる生体成分、血漿蛋白等の
分析は、病態の診断や治療経過の判定に非常に有用であ
り、臨床検査の分野で重要な役割を果たしている。この
ような微量成分（リガンド）の分析方法として、酵素免
疫分析方法（エンザイムイムノアッセイ）がある。酵素
免疫分析方法には、Ｂ／Ｆ分離が必要な非均−系とＢ／
Ｆ分離が不要な均一系がある。均一系反応は抗体と抗原
（リガンド）が結合すると標識酵素の酵素活性が何らか
の干渉を受けることに基づくもので、殻には抗原抗体結
合による阻害作用を利用する。

大分子である抗体が酵素標識抗原中の抗原に結合するこ
とにより、酵素の基質に対する結合が立体障害を受けた
り、或いは酵素の立体構造が変化するために、酵素活性
が抑制されるものと考えられている。

このような均一系酵素免疫反応を適用した分析方法とし
て、特開昭６１−８００５０に開示されているものが知
られている。この方法における試薬構成は、 （Ａ）水不溶性の色素標識高分子基質、（Ｂ）　　リガ
ンドに対する抗体と、基質に対する酵素との結合物、 からなり、抗原（リガンド）を含む検体を一定量の酵素
標識抗体と所定時間反応させ抗原−酵素標識抗体複合体
を形成させ、この反応液に水不溶性の色素標識高分子基
質を添加して酵素反応を行わせるものである。

抗原と結合しなかった酵素標識抗体の酵素は、水不溶性
高分子基質に反応して、可溶性の色素標識低分子生成物
を生成する。一方、抗原（高分子性）と結合してできた
抗原Ｃ高分子性）−抗体−酵素複合体は、水不溶性高分
子基質に対して酵素活性を示すことができない。従って
検体中の抗原量が増えるに従って、酵素反応生成物は減
少することになる。この生成物の有色化学基が与える吸
収の光学濃度を測定することにより、検体中の抗原量を
分析する。

しかし、この分析要素では、グイ・スターチのような予
め色素を結合させた高分子基質を用いて、酵素（アミラ
ーゼ）による分解生成物であるアミロースについている
色素（グイ）を測定するので、高分子基質と反応生成物
とは分離して測定しなければならない。そのため操作が
複雑で自動化しにくいという問題がある。

一方、多数の検体試料を取扱いルーティン化している臨
床検査では、簡便、迅速に分析でき自動操作化もできる
ことが望まれ、このような観点から、乾式分析要素が提
案されている（例えば特開昭４９−５３８８８、同５９
−７７３５６、同５９−１０２３８８、米国特許４．４
５９，３５８　　）　　。

この方式を利用した分析要素でも、グイ・スターチのよ
うな予め色素を結合させた高分子基質を用いて、酵素（
アミラーゼ）による分解生成物であるアミロースについ
ている色素（グイ）を測定するので、高分子基質と反応
生成物とは分離して測定しなければならない。そのため
未反応基質を含有する試薬層と、反応生成物を受容する
検出層の間には酸化チタン粒子等を含む光遮蔽層を設け
ている。このような層構成の分析要素では、試薬層で生
成された可溶性反応生成物が、光遮蔽層を経て検出層に
十分拡散するまでの時間を考慮しなければならず、乾式
化学分析の特徴である迅速な定量には好ましくない。

反応生成物の拡散を早めるために、予め基質にカルボキ
シル基やスルホ基のような親水性基を導入しておいて、
反応生成物の拡散性を上げることも考えられる。しかし
、これらの置換基を導入し得る位置は限られており、ま
たその導入により、分析の感度を支配する色素部位の分
子吸光係数を低下させるという新たな不都合が生じるこ
とになる。

［発明の目的コ 本発明は、以上のような事情に鑑みなされたものであり
、簡便な操作で高感度にかつ迅速な分析が出来る、均一
系酵素免疫反応を適用した免疫分析要素を提供すること
を目的とする。

また本発明は、その分析要素を用いる方法を提供するこ
とも目的とする。

［発明の構成］ このような本発明の目的は、高分子抗原と、酵素標識抗
体との間の反応により生じた酵素活性の変化を測定する
ことにより高分子抗原の量を分析する免疫分析要素にお
いて、前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基
質を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子
生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備える
ことを特徴とする免疫分析要素により達成することがで
きる。

酵素標識抗体は、基質層或いは基質層の上に積層された
別の層に予め含有させておくこともできる。

［作用コ 検体中に含まれる高分子抗原と結合した酵素標識抗体の
酵素は、立体障害により、非拡散性基質に対する酵素活
性が干渉される。従って、検体中の抗原量に反比例して
拡散性の反応生成物が生成される。基質層で生じた拡散
性物質は、速やかに試薬層に移行し、ここでさらに低分
子物質に分解される。この低分子物質を試薬層内で又は
次の検出層で検出する。未反応の非拡散性基質は基質層
に留まる。

［発明の構成の詳細な説明］ オ　−の声 第１図に本発明の免疫分析要素の一実施態様を示す。

この図において符号ｌＯは光透過性支持体であり、その
上には試薬層１２、基質層１４が積層されている。

基質層１４は、水浸透性層で構成され、抗体に標識とし
て結合された酵素の基質である非拡散性基質を含有する
。この基質は測定対象である高分子抗原の量に反比例し
て残存する酵素標識抗体の酵素活性により拡散性物質を
生成する。

試薬層１２は、水浸透性層で構成され、基質層から拡散
・移行して来た拡散性物質をさらに低分子量の生成物に
する低分子化酵素を含有する。基質層１２はまたこの低
分子生成物を検出するための試薬組成物を含有する。

直足Ｘ１ 本発明の測定対象は高分子量でかつ抗原決定基を有する
高分子抗原である。

本発明の分析要素では、高分子抗原が酵素標識抗体に結
合して生じる酵素活性への干渉（抑制）作用を利用する
。従って高分子抗原の分子量は、酵素活性に影響を与え
る程度の高分子量のものが好ましい。例えば分子量２万
ダルトン以上、好ましくは約５万ダルトン以上の抗原の
定量分析に本発明の分析要素は威力を発揮する。

高分子抗原は、このような高分子量のものであって、抗
原性を有しその抗体を用意できるものであれば、本発明
の分析要素で分析できる。例えば、各種内分泌腺に由来
するホルモン類、免疫グロブリン、アルブミン、フェリ
チン、Ｃ−反応性蛋白Ｃ以下ＣＲＰと略す）等の血漿蛋
白質、ＨＢ抗原等のウィルス、バクテリア類、α−フェ
トプロティン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等の各種臓器あ
るいは血中、尿中に存在する抗原がある。

高分子抗原を含有する検体の種類は限定されないが、例
えば血液（全血、血漿、血清）リンパ液、尿などがある
。血球などの浮遊物がある場合には予め除去しておくの
が好ましい。ただし適当な濾過層を分析要素の最上層に
設けた場合にはそのまま分析要素に点着・供給してもよ
い。

■ 酵素で標識される抗体は、被検物である高分子抗原に対
する特異抗体を用いる。常法により得られる抗体でよい
が、モノクローナル抗体を用いれば、より感度が向上す
る。またこの抗体はＦ（ａｂ’）ｚ、Ｆａｂ’　　Ｆａ
ｂなとのフラグメントでもよい。

拡 抗体に標識として結合された酵素は、高分子性の非拡散
性基質を分解して、低分子化酵素によりさらに低分子の
生成物を生じるような拡散性生成物を生成する。

非拡散性基質は、水性検体液に対して非拡散性でそれ自
体は試薬層に拡散しない。

低分子化酵素は、抗体に標識として結合された酵素によ
り、非拡散性基質より生成した拡散性生成物を、さらに
検出可能な低分子生成物にするものであり、本発明の分
析要素の試薬層に含有される。

これらの組合わせは、酵素が非拡散性基質に作用して拡
散性物質を生成し、さらにこの拡散性生成物が、後記低
分子化酵素によりさらに低分子の生成物を生じて容易に
検出できるような組合わせから選ぶことができる。

■ このような酵素としては重合体からなる非拡散性基質か
ら拡散性オリゴマーを生成するような分解酵素があり、
例えば、糖質加水分解酵素を挙げることができる。この
ような糖質加水分解酵素として、α−アミラーゼ、β−
アミラーゼ、デキストラナーゼ等がある。その他の加水
分解酵素としては、セルラーゼ、コラゲナーゼ、マンナ
ーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ等がある。

酵素と抗体との結合方法は双方の官能基を考慮して決定
することができる。官能基は、アミン基、カルボキシル
基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基
などを利用することができる。例えばアミン基相互間を
結合する方法は、イソシアネート法、グルタルアルデヒ
ド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く
知られている。アミン基とカルボキシル基とを結合する
方法としては、カルボキシル基をサクシニルイミドエス
テル化する方法の化カルボジイミド法、ウッドワード試
薬法等が知られており、アミン基と糖鎖を架橋する過ヨ
ウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）も適用できる。チオー
ル基を利用する場合には、例えば一方の側のカルボキシ
ル基をサクシニルイミドエステル化してこれにシスティ
ンを反応させてチオール基を導入し、チオール基反応性
二価架橋剤を用いて双方を結合することができる。フェ
ニル基を利用する方法としてはジアゾ化法、アルキル化
法などがある。結合方法はこれらの例に限られるもので
はなく、このほか例えばｒＭｅｔｈｏｄ　ｉｎＩｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙＪ　Ｖｏｌ、１　（Ｃ，ＡＷｉｌｌｉａｍｓ、　Ｍ、
　Ｗ、　Ｃｈａｓｅ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
、　１９６７年）あるいは石川、河井、宮井　編「酵素
免疫測定法」（医学書院、１９７８年発行）等の成書に
記載されている方法の中から適宜選択して利用すること
ができる。酵素と抗体との結合比は１：１に限らず、目
的に応じて任意の比率とすることができるのはいうまで
もない。結合反応後は、ゲル濾過法、イオン交換クロマ
トグラフィー等により精製し、必要により凍結乾燥法等
により乾燥する。

これらの酵素はいずれの検体中に存在する妨害因子で影
響されないものが好ましく、また検体中には競合する同
種の酵素がないことが好ましい。

ただし、標識酵素と同種の酵素が検体中に含まれている
場合には、この酵素阻害剤を用いてもよい。この酵素阻
害剤は、検体中の酵素を阻害する程度が標識酵素の活性
を阻害する程度より大きいものであればよい。酵素阻害
剤は検体中の酵素を完全に失活させるが、標識酵素を全
く阻害しないものが最も好ましい。しかし実用上は単に
測定時においてブランク値を上昇させなければよ（、測
定後には酵素阻害剤が失活するなどして検体中の酵素活
性が回復しても構わない。なお酵素阻害剤は、酵素標識
抗体の酵素を阻害しないものであればよく、遊離状態の
酵素を阻害することは構わない。この酵素阻害剤は、公
知の酵素阻害剤から上記のような特異性を持つものを選
んで用いればよい。或いは検体中の問題となる酵素に対
する抗体を作って、これを酵素阻害剤として用いてもよ
い。

１基１月１４！ 前述のα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラナ
ーゼ等に対する基質の例として、カルボキシメチル化澱
粉、澱粉、アミロース、アミロペクチン等がある。

敷立玉止皇１ この低分子化酵素は標識酵素と同じ種類の酵素であって
もよい。この場合には標識酵素は分子内部から切断して
オリゴマーを生成するエンド（ｅｎｄｏ）活性の酵素で
あり、低分子化酵素は分子の端から作用して単量体を生
成するエクソ（ｅｘｏｌ活性を持つものとするのが好ま
しい。例えば、非拡散性基質が重合体（例えば澱粉）で
ある場合に、標識酵素により生成される拡散性オリゴマ
ー（例えばマルトース）を単量体（例えばグルコース）
にまで分解できるものが用いられる。このような低分子
化酵素の例として糖加水分解酵素、より具体的には、α
−アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラナーゼ、グ
ルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ等があげられる。

非拡散性基質と標識酵素として、カルボキシルメチルセ
ルロースとセルラーゼを用いた場合には、低分子化酵素
としてＣ１エンザイムを用いることができる。また同様
にガラクタンとガラクタナーゼを用いた場合にはβ−ガ
ラクトシグーゼ、ＲＮＡとリボヌクレアーゼを用いた場
合にはエクソリボヌクレアーゼをそれぞれ低分子化酵素
として用いることができる。

これらの標識酵素、非拡散性基質、低分子化酵素の組合
せは、公知文献（例えば、「酵素ハンドブック」　（丸
尾文治、田宮信雄監修、朝食書店、１９８２年発行）、
［生化学ハンドブック」（井村伸正、他線、丸善１９８
４年発行）に記載された酵素、基質から選ぶことができ
る。

試薬層において低分子化酵素により生成された低分子生
成物は、公知の検出系試薬により光学的に検出すること
ができる。

前記低分子化酵素により最終的に生成したグルコースを
検出する方法としては、例えば、グルコースをグルコー
スオキシダーゼ存在下に酸化し生成した過酸化水素を検
出する方法（例えばＡｎｎ。

Ｃ１１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　６．２４（１９６４１
、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、　。

２２、２４６　（１９６９）に記載のＴｒｉｎｄｅｒ試
薬、特開昭４９−５０９９１号（対応米国特許３，８８
６，０４５）、米国特許３９９２．１５８号、特開昭５
５−１６４３５６号（対応米国特許４．２９２．２７２
）等に記載の改良Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬、特開昭５３−２
６１８８号（対応米国特許４．０８９．７４７１、特開
昭５８−４５５５７号等に記載のトリアリール置換イミ
ダゾールロイコ色素を含む試薬、特開昭５９−１９３３
５２号（対応欧州特許公開ＥＰ　０１２２６４１Ａｌ　
、特開昭６０−２２４６７７号（対応米国特許４．６６
５．０２３）等に記載のジアリール−モノアラルキル置
換イミダゾールロイコ色素を含む試薬を用いる方法）、
グルコースデヒドロゲナーゼとＮＡＤの存在下に生成す
るＮＡＤＨを検出する方法、またへキソキナーゼ存在下
に生成するグルコース−６−燐酸を検出する方法等、公
知の方法を用いることができる。これらの検出方法の中
で、グルコースオキシダーゼ存在下にグルコースを酸化
し生成した過酸化水素をペルオキシダーゼとロイコ色素
を用いて検出する方法が、感度の点で最も望ましい。

これらの検出試薬は分析要素の試薬層に低分子化酵素と
一緒に含有させてもよいが、試薬層の下層に設けた別の
層（例えば第２試薬層又は検出層等）に含有させてこの
層で検出するようにしてもよい。なお、ロイコ色素を使
用する場合には、水非混和性溶媒の溶液の親水性バイン
ダー中への分散物とするのが生成した色素の安定性の上
で好ましい。

（以下余白） 立所ｊ」Ｌ凶」檀滅 本発明の乾式免疫分析要素は、公知の多種の乾式分析要
素と同様の層構成とすることができる。

要素は、基質層、試薬層の他、支持体、展開層、検出層
、光遮蔽層、接着層、吸水層、下塗り層その他の層を含
む多重層としてもよい。このような分析要素として、特
開昭４９−５３８８８号（対応米国特許３，９９２，１
５８）　、特開昭５１−４０１９１号（対応米国特許４
，０４２，３３５）　、及び特開昭５５−１６４３５６
号（対応米国特許４．２９２．２７２）の各明細書に開
示されたものがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合には、本発明の
乾式免疫分析要素は、実用的に次のような構成を取り得
る。ただし本発明の内容はこれに限定はされない。

（１１支持体上に試薬層、その上に基質層を有するもの
。

（２）支持体上に試薬層、接着層、基質層をこの順に有
するもの。

（３）支持体上に検出層、試薬層、基質層をこの順に有
するもの。

（４）支持体上に試薬層、光反射層、基質層をこの順に
有するもの。

（５）支持体上に検出層、試薬層、光反射層、基質層を
この順に有するもの。

（６）支持体上に検出層、光反射層、試薬層、基質層を
この順に有するもの。

（７）支持体上に第２試薬層、光反射層、第１試薬層、
基質層をこの順に有するもの。

（８）支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第１
試薬層、基質層をこの順に有するもの。

上記（１）ないしく６）において試薬層は異なる複数の
層から成ってもよい。また試薬層は後述するように免疫
反応し得る成分を含む免疫反応層としてもよい。

支持体と試薬層又は検出層との間には吸水層を設けても
よい。また各層の間には濾通層を設けてもよい。また基
質層の上には展開層を設けてもよく、又は基質層に展開
作用を持たせ展開層として機能させてもよい。

五豆厘 基質層１４は、水浸透性層で構成され、抗体を標識する
酵素の基質である非拡散性基質を含有する。

基質層の水浸透性を確保するためには、多孔性媒体から
なる多孔性層とするか、親水性ポリマーバインダーから
なる層とするのが好ましい。

多孔性層は繊維質であってもよいし、非繊維質であって
もよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織
物布地（例えば平織布地）、編物布地、（例えばトリコ
ット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができ
る。非繊維質材料としては、特開昭４９−５３８８８等
に記載の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルタ
−１特開昭４９−５３８８８、特開昭５５−９０８５９
　（対応米国特許４．２５８．００１）、特開昭５８−
７０１６３　（対応米国特許４．４８６．５３７）等に
記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有粒
状構造物層等のいずれでもよい。特開昭６１−４９５９
　（対応欧州公開ＥＰ　０１６６３６５Ａ）　、特開昭
６２−１１６２５８　、特開昭６２−１３８７５６１対
応欧州公開ＥＰ０２２６４６５Ａ）　、特開昭６２−１
３８７５７　（対応欧州公開ＥＰ０２２６４６５Ａ）　
、特開昭６２−１３８７５８　ｆ対応欧州公開ＥＰ０２
２６４６５Ａ）等に記載の部分接着された複数の多孔性
層の積層物も好適である。

多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例した面積に液
体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であっ
てもよい。展開層としては、これらのうち織物布地、編
物布地などが好ましい。織物布地などは特開昭５７−６
６３５９号に記載されたようなグロー放電処理をしても
よい。展開層には、展開面積、展開速度等を調節するた
め、特開昭６０−２２２７７０　（対応：　ＥＰ　０１
６２３０１Ａ　１．特開昭６３−２１９３９７（対応西
独特許公開ＤＥ　３７１７９１３Ａ）　、特開昭６３−
１１２９９９　（対応：　ＤＥ　３７１７９１３Ａ　）
　、特開昭６２−１８２６５２　（対応：　ＤＥ　３７
１７９１３Ａ　）に記載したような親水性高分子あるい
は界面活性剤を含有させてもよい。

例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等に基質を予め
含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他の水浸透性層
、例えば試薬層の上に、特開昭５５−１６４３５６号の
ような方法で接着させるのも有用な方法である。また別
の方法として多孔質層を他の水浸透性層（例えば試薬層
）に前記のような方法で接着させた後、基質を含む組成
物を多孔質層に塗布してもよい。多孔質層への含浸又は
塗布には公知の方法を利用できる。塗布には例えばデイ
ツプ塗布、ドクター塗布、ホッパー塗布、カーテン塗布
等を適宜選択して用いる。

こうして作られる基質層の厚さは特に制限されないが、
塗布層として設ける場合には、１μｍ〜５０μｍ程度、
好ましくは２μｍ〜３０μｍの範囲が適当である。ラミ
ネートによる積層など、塗布以外の方法による場合、厚
さは数十μｍから数百μｍの範囲で太き（変化し得る。

親水性ポリマーバインダーからなる水浸透性層で基質層
を構成する場合、使用できる親水性ポリマーとしては、
例えば、以下のものがある。ゼラチン及びこれらの誘導
体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例
えばヒドロキエチルセルロース）、アガロース、アルギ
ン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合体、メタアクリ
ルアミド共重合体、アクリルアミド又はメタアクリルア
ミドと各種ビニル性モニマーとの共重合体、ポリヒドロ
キシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、アク
リル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体などである
。

親水性ポリマーバインダーで構成される基質層は、特公
昭５３−２１６７７号（対応米国特許３．９９２．１５
８）、特開昭５５−１６４３５６号（対応米国特許４．
２９２．２７２）、特開昭５４−１０１３９８号（対応
米国特許４，１３２，５２８）、特開昭６１−２９２０
６３号（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＡｂｓｔｒａｃｔｓｌｏＢ
、　２１０５６７ｙ）等の明細書に記載の方法に従って
、基質その他の試薬組成物と親水性ポリマを含む水溶液
又は水分散液を支持体又は検出層等の他の層の上に塗布
し乾燥することにより設けることができる。親水性ポリ
マーをバインダーとする基質層の乾燥時厚さは約２μｍ
〜約５０μｍ、好ましくは約４μｍ〜約３０μｍの範囲
、被覆量では約２ｇ／ｌＴ１２〜約５０ｇ／ｍ”、好ま
しくは約４ｇ／ｍ２〜約３０ｇ／ｍ”の範囲である。

基質層には非拡散性基質の他に、塗布特性、拡散性化合
物の拡散性、反応性、保存性等の諸性能の向上を目的と
して、酵素の活性化剤、補酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝
剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるい
は無機物からなる各種添加剤を加えることができる。基
質層に含有させることができる緩衝剤の例としては、日
本化学余線「化学便覧　基礎編」（東京、丸善■、１９
６６年発行）　１３１２−１３２０頁、Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄ
ａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａ１編、ｒ　Ｄａｔａ　ｆｏｒ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｊ第２版（
Ｏｘｆｏｒｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐ
ｒｅｓｓ、１９６９年発行）４７６−５０８頁、ｒＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　５，４６７−４７７頁　ｆ１
９６６年）　、　ｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙＪ　１０４，３００−３１０頁　（１９
８０年）に記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤の具
体例としてトリス（ヒドロキシメチル）アミツメクン（
Ｔｒｉｓ）を含む緩衝剤；燐酸塩を含む緩衝剤；硼酸塩
を含む緩衝剤；クエン酸又はクエン酸塩を含む緩衝剤；
グリシンを含む緩衝剤；ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を含む
緩衝剤、　）（ＥＰＥＳを含む緩衝剤等がある。

置薬１ 試薬層１２は、低分子化酵素、及び必要に応じて、低分
子化酵素により生じた低分子生成物を検出するための検
出試薬組成物を含有する。

試薬層は、水浸透性層で構成され、前記基質層の説明で
述べた水浸透性層のうち、親水性ポリマーバインダーか
らなる連続層とするのが好ましい。用いる親水性ポリマ
ーバインダーは基質層で生成される拡散性生成物や、試
薬層内に含有する発色試薬などを考慮して決められる。

叉丘盗 支持体１０としては光不透過性（不透明）、光半透過性
（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いる
ことができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支
持体が好ましい。

光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいのもの
はポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。

親水性層を強固に接着させるため通常、下塗り層を設け
るか、親水化処理を施す。

忠ｍζ厘 第１図の基質層１４には、非拡散性基質のみならず、酵
素標識抗体を併せて含有させ、この基質層内で免疫反応
を併せて行なわせる免疫反応層としてもよい。この場合
には、要素に検体を点着するだけで、要素内で均一系の
酵素免疫反応が進行させることができる。

基質層とは別の層に酵素標識抗体を含有させてもよい。

例えば第２図に示すように、基質層１４の上に酵素標識
抗体を含有する水浸透性層１６を設は免疫分析要素を構
成してもよい。この場合には、検体中の高分子抗原は、
層１６の酵素標識抗体の抗体と結合し、さらに基質層１
４に移行する。

１つの層に酵素標識抗体を実質的な乾燥状態又は実質的
に水の非存在状態で含有させるには、酵素標識抗体をア
ルコール（例、エタノール）等の非水溶媒に溶解又は分
散させて水浸透性層に含浸させればよい。

、の告　法 本発明の乾式免疫分析要素は前述の諸特許明細書に記載
の公知の方法により調製することができる。

本発明の分析要素は一辺約１５ｍｍから約３０ｍｍの正
方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公
昭５７−２８３３１　（対応米国特許４．１６９．７５
１＋、実開昭５６−１４２４５４　（対応米国特許４，
３８７，９９０）、特開昭５７−６３４５２．実開昭５
８−３２３５０．特表昭５８−５０１１４４（対応国際
公開：　Ｗｏ　８３１００３９１）等に記載のスライド
枠に収めて化学分析スライドとして用いることが、製造
、包装、輸送、保存、測定操作等の観点で好ましい。使
用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガ
ジンに収めて用いたり、または小片を開口のあるカード
に貼付または収めて用いることなどもできる。

−による　　　法 本発明の分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作
と同様の操作により液体試料中の被検物である高分子抗
原の定量分析ができる。

例えば約５μＬ〜約３０μＬ、好ましくは８〜１５μＬ
の範囲の血漿、血清、尿などの水性液体試料液を基質層
１４に点着する。点着した分析要素を約２０℃〜約４５
℃の範囲の一定温度で、好ましくは約り０℃〜約４０℃
の範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーション
する。要素内の発色又は変色を光透過性支持体側から反
射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原
理により検体中の高分子抗原の量を求めることができる
。点着する液体試料の量、インキュベーション時間及び
温度を一定にすることにより定量分析を高精度に実施で
きる。

測定操作は特開昭６０−１２５５４３、同６０−２２０
８６２、同６１−２９４３６７、同５８−１６１８６７
　（対応米国特許４，４２４．１９１）などに記載の化
学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析
を実施できる。

なお、目的や必要精度によっては、目視により発色の度
合いを判定して、半定量的な測定を行なってもよい。

分析要素内に、酵素標識抗体を含有させていない場合に
は、要素に点着する前に、水性試料液を酵素標識抗体を
含む溶液と混和して、結合反応を十分性なわせてから、
基質層に点着すればよい。

（合成例） （１）酵素標識抗体の合成 ■ＣＨＭ化アミラーゼの作製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ５ｍｇをｐｉｆ６．３
の０．１Ｍグリセロ燐酸１ｍＬに溶かし、（４畳マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸］スクシ
ンイミドエステル（ＣＨＭ　Ｓ　）　２ｍｇ／ｍＬのＤ
ＭＦ溶液１００μＬを加えて室温で、１時間反応させた
。この反応液をセファデックスＧ−２５カラムにアプラ
イして、ｐＨ６，３のＱ、１Ｍグリセロ燐酸を流して素
通り分画を分取、４−（マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボン酸アミド化アミラーゼ（ＣＨＭ化ア
ミラーゼ）を得た。

■抗ＣＲＰ−マウスＩｇＧ　Ｆ　（ａｂ’）　２の作製
抗ＣＲＰ−マウスＩｇＧ　１０ｍｇ　（０，１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ５，５１）　２ｍＬにパパイン３０口ｕｇを
加え、３７℃で１８時間撹拌した。０．Ｉ　Ｎ　ＮａＯ
Ｈを加えてｐｇを６．０に調節したこの反応液を予めＯ
，１Ｍ燐酸緩衝１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６，３）で緩
衝化したＡｃＡ−４４ゲルカラムにアプライし、上記の
燐酸緩衝液で溶出した。

分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を集めて１
ｍＬに濃縮し、目的の抗ＣＲＰ・マウスＩｇＧＦ（ａｂ
’１ｇを得た。

■α−アミラーゼー抗ＣＲＰ・マウスＩｇＧＦａｂ’結
合物の作製 ■で調製した抗ＣＲＰ−マウスＩｇＧ　Ｆ　（ａｂ’）
２６ｍｇを含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（１ｍＭ　ＥＤＴＡ
含有、　ｐＨ６，０１１ｍＬに１０ｍｇ／ｍＬの２−メ
ルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μＬを加え、
３７℃で９０分間攪拌した。この反応液を予め０．１Ｍ
燐酸緩衝液（ｐＨ６，３）で緩衝化したセファデックス
Ｇ−２５カラムでゲル濾過して未反応の２−メルカプト
エチルアミンを除去し、ＨＳ−Ｆａｂ’を得た。これに
■で調製したＣＨＭ化α−アミラーゼ２ｍｇを加え、３
７℃で９０分間反応させた。次にこの反応液を０．１Ｍ
酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐ！（７，（１）
で緩衝化したＡｃＡ−３４カラムでゲル濾過して分子量
２０万以上の分画な集め、これを濃縮して目的の結合物
を得た。

（実施例１） ゼラチン下塗層が設けられている厚さ１８０μｍの無色
透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ　）シート（
支持体）上に下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬
溶液を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　　１４．５　ｇ／ｍ２
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチ
レン単位平均９〜ｌＯ含有）０．２　ｇ／ｍ２ グルコースオキシダーゼ　　　　５０００　ｕ／ｍ２ペ
ルオキシダーゼ　　　　　　　１５０００　ｕ／ｍ”グ
ルコアミラーゼ　　　　　　　　５０００　ｕ／ｍ２２
−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−
４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］＝５−フェネ
チルイミダゾール （ロイコ色素）　酢酸塩　　　　０．３８　ｇ／ｍ２ビ
ス［（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノコメタン　　０．１　　ｇ／ｍ２こ
の試薬層の上に下記の被覆量になるように接着層を塗布
し、乾燥して設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　１４．５　ｇ／ｍ２ビ
ス［（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノコメタン　　０．１　ｇ／ｍ２つい
で接着層の表面に下記の被覆量になるように下記試薬含
有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤させ、その上に５
０デニール相当のＰＥＴ紡績糸３６ゲージ編みした厚さ
約２５０μｍのトリコット編物布地をほぼ一様に軽く圧
力をかけてラミネートして多孔性展開層を設けた。

ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチ
レン単位平均９〜１０含有）０．１５　ｇ／ｍ２ ビス［（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノコメタン　　　０．４　　ｇ／ｍ２
次に、下記の被覆量になるように基質を塗布、乾燥して
基質層を設けてＣＲＰ分析用多層分析要素を調製した。

カルボキシメチル化澱粉　　　　　４　ｇ／ｍ２ノニル
フエノキシボリエトキシエタノール（オキシエチレン単
位平均９〜１０含有）０．２　ｇ／ｍ” 次いでこの分析要素を１５ｍｍ四方のチップに裁断し、
特開昭５７−６３４５２に記載のスライドの枠に収めて
、ＣＲＰ分析用多層乾式スライド１とした。

１籠五員旦１ 合成例（１）のアミラーゼ−抗ＣＲＰ・ＩｇＧ結合物を
Ｏ，１ｍｇ／ｍＬとなるように、既知量のＣＲＰを含有
する５０　ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液（ｐＨ７１に加え
、３７℃で２０分間インキュベートした。この後、自溶
液ｌＯμＬを前記スライド１に点着し、３７℃に保って
、中心波長６５０ｎｍの可視光でＰＥＴ支持体側からス
ライド１の反射光学濃度を測定した。点着から３分後お
よび５分後の反射光学濃度の差（△ＯＤ、、）を第３図
に示す。

（実施例２） 実施例１と同様にして多層分析要素を作成し、その基質
層兼展開層であるトリコット編物布地層に、さらに合成
例（１）で合成したアミラーゼ−抗ＣＲＰ　−ＩｇＧ結
合物を３ｍｇ／ｍ２の被覆量となるようにしてエタノー
ル溶液を塗布し含浸させ乾燥させてＣＲＰ分析用多層免
疫スライド２を作成した。

１龍五頂１１ 既知量のＣＲＰを含有するｐＨ７の５０　ｍＭグリセロ
燐酸緩衝溶液ｌＯμＬを、スライド２に点着した。３７
℃に保って、中心波長６５０ｎｍの可視光でＰＥＴ支持
体側からスライド２の反射光学濃度を測定した。点着か
ら３分後および５分後の反射光学濃度の差（Δ０Ｄｓ−
ｉ）を第４図に示す。第４図の検量線より、本発明のＣ
ＲＰ分析用乾式免疫分析要素はＣＲＰの定量が精度良く
行えることが明らかである。

最後に本発明の好ましい態様をまとめると、以下の通り
である。

（１）高分子抗原と酵素標識抗体との間の反応により生
じた酵素活性の変化を測定することにより高分子抗原の
量を分析する免疫分析要素において、前記酵素により拡
散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、
前記拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵
素を含有する試薬層とを備えることを特徴とする免疫分
析要素。

（２）前記酵素標識抗体が、前記基質層または前記基質
層の上に積層された層に含有されている（１）に記載の
免疫分析要素。

（３）前記非拡散性基質が高分子多糖類であり、前記酵
素標識抗体の酵素がエンド活性型の糖質分解酵素であり
、前記低分子化酵素がエキソ活性型の糖質分解酵素であ
る（１）に記載の免疫分析要素。

（４）前記低分子生成物がグルコースである（３）に記
載の免疫分析要素。

（５）前記低分子生成物と反応して可視吸収を有する色
素を生成する試薬組成物を、前記試薬層又は他の水浸透
性層に含有している（１１　に記載の免疫分析要素。

（６）前記試薬組成物が、前記低分子生成物と反応して
過酸化物を生成する（５）に記載の免疫分析要素。

（７）前記試薬組成物が、酸化により発色するロイコ色
素を含む（６）に記載の免疫分析要素。

（８）前記試薬組成物が、ロイコ色素の水不溶性溶媒か
らなる溶液の水性液中への分散物を含む（７）に記載の
免疫分析要素。

（９）前記試薬組成物が、グルコースオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、及びロイコ色素を含む（８）に記載の
免疫分析要素。

（１０）前記高分子抗原の分子量が約２万ダルトン以上
である（１）に記載の免疫分析要素。

（１１）前記高分子抗原の分子量が約５万ダルトン以上
である（１０）に記載の免疫分析要素。

（１２）前記高分子抗原が蛋白質である（ｌＯ）に記載
の免疫分析要素。

（１３）高分子抗原と酵素標識抗体との間の反応により
生じた酵素活性の変化を測定することにより、検体中の
高分子抗原の量を分析する免疫分析方法において、 （ａ）前記検体を、前記酵素により拡散性物質を生成す
る非拡散性基質を含有する基質層に供給し、次いで、 （ｂｌ前記基質層で生成された拡散性物質を、さらに低
分子生成物にする低分子化酵素を含有する４゜ 試薬層に移行させ、 （ｃ）試薬層で生成された低分子生成物の量を測定する
、 ことを特徴とする免疫分析方法。

【図面の簡単な説明】

第１図から第２図はそれぞれ本発明に免疫分析要素の一
実施態様例の構成図である。第３図は実施例１の免疫分
析要素の検量線を示す図、第４図は実施例２の免疫分析
要素の検量線を示す図である。 １０・・・透光性支持体、 １２・・・試薬層、 １４・・・基質層、 １６・・・酵素標識抗体を含有する水浸透性層、特許出
願人　富士写真フィルム株式会社冨士レビオ株式会社 代　理　人　弁理士　山　１）文　雄 弁埋土　山　１）洋　資 ＣＲＰ　　（ｍｇ／ｄ１） 第４ 図 ＣＲＰ　（ｍｇ７　ｄｌ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）高分子抗原と、酵素標識抗体との間の反応により
   生じた酵素活性の変化を測定することにより高分子抗原
   の量を分析する免疫分析要素において、前記酵素により
   拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と
   、前記拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化
   酵素を含有する試薬層とを備えることを特徴とする免疫
   分析要素。
2. （２）高分子抗原と酵素標識抗体との間の反応により生
   じた酵素活性の変化を測定することにより、検体中の高
   分子抗原の量を分析する免疫分析方法において、 （ａ）前記検体を、前記酵素により拡散性物質を生成す
   る非拡散性基質を含有する基質層に供給し、次いで、 （ｂ）前記基質層で生成された拡散性物質を、さらに低
   分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層に移行
   させ、 （ｃ）試薬層で生成された低分子生成物の量を測定する
   、 ことを特徴とする免疫分析方法。