JPH0814580B2 - 乾式免疫分析要素 - Google Patents
乾式免疫分析要素Info
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- JPH0814580B2 JPH0814580B2 JP62268228A JP26822887A JPH0814580B2 JP H0814580 B2 JPH0814580 B2 JP H0814580B2 JP 62268228 A JP62268228 A JP 62268228A JP 26822887 A JP26822887 A JP 26822887A JP H0814580 B2 JPH0814580 B2 JP H0814580B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原−抗体反応を利用する酵素免疫分析法に
よる免疫学的に有用な乾式免疫分析要素に関する。
よる免疫学的に有用な乾式免疫分析要素に関する。
体液などに含有されている生化学物質を定量する方法
として種々の方法が知られているが、比較的感度よく測
れる方法として酵素免疫測定法が知られている。一方、
簡便さ、迅速性の観点から乾式分析要素を用いる方法が
開発されている（例えば、特開昭49−53888、特開昭55
−164356、特開昭59−102388）。両技術を結合すること
により乾式分析要素及び酵素免疫測定法の欠点を互いに
克服した乾式免疫分析要素の開発が望まれていた。そこ
で、本発明者らは特開昭61−80049、特開昭61−80050に
記載の酵素抗体結合物の基質として、水に不溶性の高分
子物質を使用する酵素免疫測定法を乾式分析要素に組込
むことを試みた。しかしながら、水に不溶性の高分子物
質を乾式分析要素に組込むのに、しばしば困難が生じ
た。そのため、その結果は満足できるものではなかっ
た。
として種々の方法が知られているが、比較的感度よく測
れる方法として酵素免疫測定法が知られている。一方、
簡便さ、迅速性の観点から乾式分析要素を用いる方法が
開発されている（例えば、特開昭49−53888、特開昭55
−164356、特開昭59−102388）。両技術を結合すること
により乾式分析要素及び酵素免疫測定法の欠点を互いに
克服した乾式免疫分析要素の開発が望まれていた。そこ
で、本発明者らは特開昭61−80049、特開昭61−80050に
記載の酵素抗体結合物の基質として、水に不溶性の高分
子物質を使用する酵素免疫測定法を乾式分析要素に組込
むことを試みた。しかしながら、水に不溶性の高分子物
質を乾式分析要素に組込むのに、しばしば困難が生じ
た。そのため、その結果は満足できるものではなかっ
た。
そこで本発明者らは鋭意努力した結果、酵素抗体結合
物の基質として、水可溶性の高分子物質を使用すること
により、前記の諸問題点が著しく改善されることを見出
し、本発明に到達した。
物の基質として、水可溶性の高分子物質を使用すること
により、前記の諸問題点が著しく改善されることを見出
し、本発明に到達した。
本発明の目的は簡便な操作で高感度の酵素免疫分析法
を実施することができる乾式免疫分析要素を提供するこ
とである。
を実施することができる乾式免疫分析要素を提供するこ
とである。
本発明の前記目的は、少なくとも２つの水浸透性層を
有し、少なくともその１層は多孔性層である、検体中の
リガンドの測定のための酵素免疫分析法による乾式免疫
分析要素であって、前記多孔性層中に、 （Ａ）水溶性高分子物質、及び、 （Ｂ）検体中のリガンドと反応する抗体と前記水溶性高
分子物質に作用しうる酵素との結合物であるところの酵
素抗体結合物、 を含有することを特徴とする乾式免疫分析要素により達
成することができた。
有し、少なくともその１層は多孔性層である、検体中の
リガンドの測定のための酵素免疫分析法による乾式免疫
分析要素であって、前記多孔性層中に、 （Ａ）水溶性高分子物質、及び、 （Ｂ）検体中のリガンドと反応する抗体と前記水溶性高
分子物質に作用しうる酵素との結合物であるところの酵
素抗体結合物、 を含有することを特徴とする乾式免疫分析要素により達
成することができた。
本発明の乾式免疫分析要素の測定対象は検体に含まれ
る抗原決定基を有するリガンドである。検体の種類は限
定されないが、例えば血液（全血、血漿、血清）、リン
パ液、尿などである。血漿、血清、尿などの場合には、
通常特別な前処理を必要とせず、検体そのままについて
測定を行うことができる。
る抗原決定基を有するリガンドである。検体の種類は限
定されないが、例えば血液（全血、血漿、血清）、リン
パ液、尿などである。血漿、血清、尿などの場合には、
通常特別な前処理を必要とせず、検体そのままについて
測定を行うことができる。
リガンドは抗原決定基を１又は２以上有しているもの
であり、例としては各種内分泌腺に由来するホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フェリチン等の血漿
蛋白質、HB抗原等のウイルス、バクテリア類、α−フェ
トプロテイン、癌関連性抗原等の各種臓器あるいは血
中、尿中に存在する抗原などである。本発明の乾式免疫
分析要素は特に高分子量のリガンド、例えば分子量約２
万以上のものの測定に威力を発揮する。
であり、例としては各種内分泌腺に由来するホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フェリチン等の血漿
蛋白質、HB抗原等のウイルス、バクテリア類、α−フェ
トプロテイン、癌関連性抗原等の各種臓器あるいは血
中、尿中に存在する抗原などである。本発明の乾式免疫
分析要素は特に高分子量のリガンド、例えば分子量約２
万以上のものの測定に威力を発揮する。
また、本発明に用いる抗体と前記水溶性高分子物質に
作用しうる酵素との結合物のその抗体はリガンドの抗原
決定基と反応するものである。この抗体にはＦ（ab′）
２、Fab′、Fabなどのフラグメントも含まれる。
作用しうる酵素との結合物のその抗体はリガンドの抗原
決定基と反応するものである。この抗体にはＦ（ab′）
２、Fab′、Fabなどのフラグメントも含まれる。
抗体の製造方法としてはリガンドと蛋白との結合物を
兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなどの温血動物に
体重1kgあたり0.3〜2mgを１〜数回背中皮下、フットパ
ッド、大腿筋等にアジュバントとともに注射して当該動
物の体内に形成させる。この抗体は血清をそのまま用い
てもよく、血清から抗体すなわち免疫グロブリンを採取
する公知の方法によって精製してから用いてもよい。
兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなどの温血動物に
体重1kgあたり0.3〜2mgを１〜数回背中皮下、フットパ
ッド、大腿筋等にアジュバントとともに注射して当該動
物の体内に形成させる。この抗体は血清をそのまま用い
てもよく、血清から抗体すなわち免疫グロブリンを採取
する公知の方法によって精製してから用いてもよい。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得する
こともできる。その場合にはマウスに前記のいずれかの
抗原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し脾臓細
胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマウ
スミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞
のなかから当該抗体を産生するものをクローニングによ
ってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中で
増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロー
ナル抗体を大量に製造することができる。
こともできる。その場合にはマウスに前記のいずれかの
抗原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し脾臓細
胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマウ
スミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞
のなかから当該抗体を産生するものをクローニングによ
ってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中で
増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロー
ナル抗体を大量に製造することができる。
一方、この結合物を構成している酵素は水溶性高分子
物質に作用しうるものである。使用するにあたっては活
性の測定方法が容易なものがよく、例えばこのような酵
素としてはアミラーゼ、デキストラナーゼ、セルラー
ゼ、コラーゲナーゼ、マンナーゼ、プロテアーゼ、エラ
スターゼ、リパーゼ、グルコアミラーゼなどである。
物質に作用しうるものである。使用するにあたっては活
性の測定方法が容易なものがよく、例えばこのような酵
素としてはアミラーゼ、デキストラナーゼ、セルラー
ゼ、コラーゲナーゼ、マンナーゼ、プロテアーゼ、エラ
スターゼ、リパーゼ、グルコアミラーゼなどである。
これらの酵素を作用する水溶性高分子物質としては例
えば澱粉、アミロース、アミロペクチン、ペプチド等を
あげることができ、詳しくは丸尾、田宮、監修「酵素ハ
ンドブック」（朝倉書店、1982年）、日本生化学会編
「生化学ハンドブック」（丸善、1980年）に記載されて
いる。
えば澱粉、アミロース、アミロペクチン、ペプチド等を
あげることができ、詳しくは丸尾、田宮、監修「酵素ハ
ンドブック」（朝倉書店、1982年）、日本生化学会編
「生化学ハンドブック」（丸善、1980年）に記載されて
いる。
また、上記高分子物質には直接または間接に検出でき
る官能基又は化合物がついていてもよい。
る官能基又は化合物がついていてもよい。
酵素と抗体との結合方法は双方の官能基を考慮して決
定すればよい。官能基は、アミノ基、カルボキシル基、
水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基など
を利用することができる。例えばアミノ基相互間を結合
させる場合には、ジイソシアネート法、グルタルアルデ
ヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多
く知られている。また、アミノ基とカルボキシル基との
間を結合させる方法としては、カルボキシル基をサクシ
ンイミドエステル化する方法のほかカルボジイミド法、
ウッドワード試薬法等が知られており、アミノ基と糖鎖
を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Nakane法）もある。チオ
ール基を利用する場合には、例えばもう一方の側のカル
ボキシル基をサクシンイミドエステル化してこれにシス
ティンを反応させてチオール基を導入し、チオール基反
応性二価架橋試薬を用いて双方を結合することができ
る。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化法、ア
ルキル化法などがある。結合方法はこれらの例示に限ら
れるものではなく、このほか例えば「Method in Immuno
logy and Immunochemistry」あるいは石川、河合、宮井
編「酵素免疫測定法」（医学書院、1978年発行）等の成
書に記載されている方法のなかから適宜選択して利用す
ることができる。反応後はゲル濾過法、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どを適宜組み合せて精製を行い、必要により凍結乾燥法
等で乾燥する。
定すればよい。官能基は、アミノ基、カルボキシル基、
水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基など
を利用することができる。例えばアミノ基相互間を結合
させる場合には、ジイソシアネート法、グルタルアルデ
ヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多
く知られている。また、アミノ基とカルボキシル基との
間を結合させる方法としては、カルボキシル基をサクシ
ンイミドエステル化する方法のほかカルボジイミド法、
ウッドワード試薬法等が知られており、アミノ基と糖鎖
を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Nakane法）もある。チオ
ール基を利用する場合には、例えばもう一方の側のカル
ボキシル基をサクシンイミドエステル化してこれにシス
ティンを反応させてチオール基を導入し、チオール基反
応性二価架橋試薬を用いて双方を結合することができ
る。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化法、ア
ルキル化法などがある。結合方法はこれらの例示に限ら
れるものではなく、このほか例えば「Method in Immuno
logy and Immunochemistry」あるいは石川、河合、宮井
編「酵素免疫測定法」（医学書院、1978年発行）等の成
書に記載されている方法のなかから適宜選択して利用す
ることができる。反応後はゲル濾過法、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どを適宜組み合せて精製を行い、必要により凍結乾燥法
等で乾燥する。
一方、結合物の酵素と同種の酵素が検体に含まれてい
る場合には、この検体中の酵素を阻害する程度が前記の
結合物に結合されている酵素の活性を阻害する程度より
大きい酵素阻害物質を接触させるのがよい。
る場合には、この検体中の酵素を阻害する程度が前記の
結合物に結合されている酵素の活性を阻害する程度より
大きい酵素阻害物質を接触させるのがよい。
この酵素阻害物質は検体に含まれている酵素を完全に
失活させかつ結合物に結合されている酵素を全く阻害し
ないものが最も望ましいことはいうまでもないが、実用
上は単に測定時においてブランク値を上昇させなければ
よく、測定後に酵素阻害物質が失活するなどしてこの酵
素活性が回復してもよい。この酵素阻害物質の作用が問
題になるもう一方の、酵素は抗体に結合されている状態
のものであり、遊離状態では酵素阻害物によって失活す
るものであってもよい。この酵素阻害物質にはこのよう
な特異生を有する公知の酵素阻害物質を利用すればよい
が、そのほか、検体に含まれている酵素を温血動物に投
与してその抗体を取得し、これを酵素阻害物質として用
いることもできる。抗体の取得方法は前述のリガンドに
対する抗体の取得方法と同様でよい。
失活させかつ結合物に結合されている酵素を全く阻害し
ないものが最も望ましいことはいうまでもないが、実用
上は単に測定時においてブランク値を上昇させなければ
よく、測定後に酵素阻害物質が失活するなどしてこの酵
素活性が回復してもよい。この酵素阻害物質の作用が問
題になるもう一方の、酵素は抗体に結合されている状態
のものであり、遊離状態では酵素阻害物によって失活す
るものであってもよい。この酵素阻害物質にはこのよう
な特異生を有する公知の酵素阻害物質を利用すればよい
が、そのほか、検体に含まれている酵素を温血動物に投
与してその抗体を取得し、これを酵素阻害物質として用
いることもできる。抗体の取得方法は前述のリガンドに
対する抗体の取得方法と同様でよい。
本発明は更にリガンドによる酵素活性の低下が不充分
な場合には、リガンドの他の決定基を認識し得る第２抗
体の使用が好ましい。第２抗体としては例えば、抗原を
マウス免疫して、モノクローナル抗体を取得し、その中
でお互いに異なる２種以上の抗原決定基に反応する抗体
を得、この異なる一方の抗体を第２抗体として用いるこ
ともできる。
な場合には、リガンドの他の決定基を認識し得る第２抗
体の使用が好ましい。第２抗体としては例えば、抗原を
マウス免疫して、モノクローナル抗体を取得し、その中
でお互いに異なる２種以上の抗原決定基に反応する抗体
を得、この異なる一方の抗体を第２抗体として用いるこ
ともできる。
本発明は公知の多種の乾式分析要素と同様の層構成と
することができる。要素は多孔性層、後述する試薬層の
ほか、支持体、展開層、検出層、光遮蔽層、接着層、濾
過層、吸水層、下塗り層その他の層を含む多重層の構成
を有してもよい。かような分析要素として、米国特許第
3,992,158号、同4,042,353号および特開昭55−164356号
各明細書に開示されたものがある。
することができる。要素は多孔性層、後述する試薬層の
ほか、支持体、展開層、検出層、光遮蔽層、接着層、濾
過層、吸水層、下塗り層その他の層を含む多重層の構成
を有してもよい。かような分析要素として、米国特許第
3,992,158号、同4,042,353号および特開昭55−164356号
各明細書に開示されたものがある。
光透過性水不透過性支持体を用いる場合、本発明の乾
式免疫分析要素は、実用的に次のような構成を採りう
る。もちろん本発明はこれに限定されるわけではない。
式免疫分析要素は、実用的に次のような構成を採りう
る。もちろん本発明はこれに限定されるわけではない。
（１）支持体上に試薬層、その上に展開層を有するも
の。
の。
（２）支持体上に検出層、試薬層、展開層をこの順に有
するもの。
するもの。
（３）支持体上に試薬層、光反射層、展開層をこの順に
有するもの。
有するもの。
（４）支持体上に検出層、試薬層、光反射層、展開層を
この順に有するもの。
この順に有するもの。
（５）支持体上に検出層、光反射層、試薬層、展開層を
この順に有するもの。
この順に有するもの。
（６）支持体上に第二試薬層、光反射層、第一試薬層、
展開層をこの順に有するもの。
展開層をこの順に有するもの。
（７）支持体上に検出層、第二試薬層、光反射層、第一
試薬層、展開層をこの順に有するもの。
試薬層、展開層をこの順に有するもの。
上記（１）ないし（５）において試薬層は異なる複数
の層から成ってもよい。また、試薬層は免疫反応しうる
成分を含む免疫試験層であってもよい。支持体と試薬層
または検出層との間には吸水層を設けてもよい。上記
（１）ないし（３）と（６）において試薬層と検出層ま
たは展開層の間に濾過層を設けてもよい。
の層から成ってもよい。また、試薬層は免疫反応しうる
成分を含む免疫試験層であってもよい。支持体と試薬層
または検出層との間には吸水層を設けてもよい。上記
（１）ないし（３）と（６）において試薬層と検出層ま
たは展開層の間に濾過層を設けてもよい。
上記（３）ないし（７）において光反射層と検出層、
試薬層または展開層との間、試薬層と検出層との間また
は試薬層と展開層との間に、さらに濾過層を設けてもよ
い。試薬層が複数層から成る場合に、試薬層と試薬層の
間にさらに濾過層を設けてもよい。
試薬層または展開層との間、試薬層と検出層との間また
は試薬層と展開層との間に、さらに濾過層を設けてもよ
い。試薬層が複数層から成る場合に、試薬層と試薬層の
間にさらに濾過層を設けてもよい。
光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいもの
はポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。
親水性層を強固に接着させるため通常、下塗り層を設け
るか、親水化処理を施す。
はポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。
親水性層を強固に接着させるため通常、下塗り層を設け
るか、親水化処理を施す。
支持体としては光反射性又は光不透過性（不透明）で
水不透過性の支持体も用いることができる。光反射性又
は不透明支持体の例として、二酸化チタン微粒子又は硫
酸バリウム微粒子を分散含有させた白色又は乳白色不透
明ポリエチレンテレフタレートがある。
水不透過性の支持体も用いることができる。光反射性又
は不透明支持体の例として、二酸化チタン微粒子又は硫
酸バリウム微粒子を分散含有させた白色又は乳白色不透
明ポリエチレンテレフタレートがある。
本発明の乾式分析要素の水浸透性層としては、親水性
ポリマーを結合剤とする実質的に均一の層のほか、例え
ば特開昭58−701635号、特開昭61−4959号、特願昭60−
256408号、同60−279859号、同60−279860号、同60−27
9861号等に記載されたような多孔性層も好適である。親
水性ポリマーとして例えば、ゼラチンおよびこれらの誘
導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体
（例えばヒドロキシメチルセルロース）、アガロース、
アクリルアミド共重体、メタアクリルアミド共重体、ア
クリルアミドまたはメタアクリルアミドと各種ビニル性
モノマーとの共重合体等が利用できる。
ポリマーを結合剤とする実質的に均一の層のほか、例え
ば特開昭58−701635号、特開昭61−4959号、特願昭60−
256408号、同60−279859号、同60−279860号、同60−27
9861号等に記載されたような多孔性層も好適である。親
水性ポリマーとして例えば、ゼラチンおよびこれらの誘
導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体
（例えばヒドロキシメチルセルロース）、アガロース、
アクリルアミド共重体、メタアクリルアミド共重体、ア
クリルアミドまたはメタアクリルアミドと各種ビニル性
モノマーとの共重合体等が利用できる。
多孔性層を構成する材料としては、例えば濾紙、不織
布、織物生地（例えば平織生地）、編物生地（例えば、
トリコット編）、ガラス繊維濾紙等を用いることができ
る。展開層としては、これらのうち織物、編物等が好ま
しい。織物等は特開昭57−66359号に記載されたような
グロー放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、
展開速度等を調節するため、特開昭60−222770号、特願
昭61−122875号、61−122876号、61−143754号に記載し
たような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有しても
よい。
布、織物生地（例えば平織生地）、編物生地（例えば、
トリコット編）、ガラス繊維濾紙等を用いることができ
る。展開層としては、これらのうち織物、編物等が好ま
しい。織物等は特開昭57−66359号に記載されたような
グロー放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、
展開速度等を調節するため、特開昭60−222770号、特願
昭61−122875号、61−122876号、61−143754号に記載し
たような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有しても
よい。
免疫反応試薬層は、本発明の分析要素の主要な免疫反
応試薬組成物の成分である （Ａ）水溶性高分子物質、及び、 （Ｂ）検体中のリガンドと反応する抗体と前記水溶性高
分子物質に作用しうる酵素との結合物であるところの酵
素抗体結合物、所望により更には第２抗体の一部又は全
部を含有する多孔性層である。尚、このように水溶性高
分子物質と酵素抗体結合物を同一の層に含有させても分
析要素は乾燥状態で保存されるので水性試料を点着する
まで発色反応はほとんど進行しない。
応試薬組成物の成分である （Ａ）水溶性高分子物質、及び、 （Ｂ）検体中のリガンドと反応する抗体と前記水溶性高
分子物質に作用しうる酵素との結合物であるところの酵
素抗体結合物、所望により更には第２抗体の一部又は全
部を含有する多孔性層である。尚、このように水溶性高
分子物質と酵素抗体結合物を同一の層に含有させても分
析要素は乾燥状態で保存されるので水性試料を点着する
まで発色反応はほとんど進行しない。
試薬層の支持体と反対側に展開層を設けてもよいし、
試薬層が展開層をかねていてもよい。また上記〜に
おいて、L,S以外の試薬（例，呈色試薬）を含有する試
薬層をさらに設けてもよい。
試薬層が展開層をかねていてもよい。また上記〜に
おいて、L,S以外の試薬（例，呈色試薬）を含有する試
薬層をさらに設けてもよい。
本発明の分析要素の試薬層に含有させることができる
緩衡剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩や「Bi
ochemistry」，５（２）,467−477（1966）に記載され
ているGoodの緩衡剤などを挙げることができる。これら
の緩衡剤は「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾武一ほ
か著、南江堂、1981年）、前記「Biochemistry」等の文
献を参考にして選択することができる。
緩衡剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩や「Bi
ochemistry」，５（２）,467−477（1966）に記載され
ているGoodの緩衡剤などを挙げることができる。これら
の緩衡剤は「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾武一ほ
か著、南江堂、1981年）、前記「Biochemistry」等の文
献を参考にして選択することができる。
多孔性層を展開層として利用する場合、液体計量作用
（メータリング作用）を有する層であることが好まし
い。液体計量作用とは、その表面に点着供給された液体
試料を、その中に含有している成分を実質的に偏在させ
ることなく面の方向上に単位面積当たりほぼ一定量の割
合で広げる作用である。
（メータリング作用）を有する層であることが好まし
い。液体計量作用とは、その表面に点着供給された液体
試料を、その中に含有している成分を実質的に偏在させ
ることなく面の方向上に単位面積当たりほぼ一定量の割
合で広げる作用である。
多孔性層を接着し積層するための接着層を試薬層、光
反射層、濾過層、吸水層、検出層等の層の上に設けても
よい。接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着する
ことができるような親水性ポリマー、例えばゼラチン、
ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からなる
ことが好ましい。
反射層、濾過層、吸水層、検出層等の層の上に設けても
よい。接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着する
ことができるような親水性ポリマー、例えばゼラチン、
ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からなる
ことが好ましい。
光反射層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能な変
化（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から
反射測定する際に、展開層に点着供給された被検液の
色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等
を遮蔽するとともに背景層としても機能する。光反射層
は、親水性ポリマーをバインダーとして、二酸化チタ
ン、硫酸バリウム等の光反射性微粒子が分散された水浸
透性の層であることが好ましい。バインダーとしてはゼ
ラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等
からなることが好ましい。
化（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から
反射測定する際に、展開層に点着供給された被検液の
色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等
を遮蔽するとともに背景層としても機能する。光反射層
は、親水性ポリマーをバインダーとして、二酸化チタ
ン、硫酸バリウム等の光反射性微粒子が分散された水浸
透性の層であることが好ましい。バインダーとしてはゼ
ラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等
からなることが好ましい。
分析要素には、光反射層を設ける代わりに、またはそ
れと同時に、展開層、試薬層、検出層等に二酸化チタン
等の光反射粒子を含有させてもよい。
れと同時に、展開層、試薬層、検出層等に二酸化チタン
等の光反射粒子を含有させてもよい。
本発明に乾式免疫分析要素は前述の諸特許明細書に記
載の公知の方法により調製することができる。
載の公知の方法により調製することができる。
本発明の分析要素は一辺約15mmから約30mmの正方形ま
たはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭57−
28331、実開昭56−142454、特開昭57−63452、実開昭58
−32350、特表昭58−501144等に記載のスライド枠に収
めて免疫スライドとして用いることが、製造、包装、輸
送、保存、測定操作等諸種の観点で好ましい。使用目的
によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに
収めて用いること、または小片を開口のあるカードに添
付または収めて用いることなどもできる。
たはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭57−
28331、実開昭56−142454、特開昭57−63452、実開昭58
−32350、特表昭58−501144等に記載のスライド枠に収
めて免疫スライドとして用いることが、製造、包装、輸
送、保存、測定操作等諸種の観点で好ましい。使用目的
によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに
収めて用いること、または小片を開口のあるカードに添
付または収めて用いることなどもできる。
本発明の分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操
作により液体試料中のアナライトであるリガンドの分析
を実施できる。例えば、約５μから約30μ、好まし
くは約８μから約15μの範囲の全血、血漿、血清、
リンパ液、尿等の水性液体試料滴を展開層に点着し１分
から10分の範囲で、約20℃から約40℃の範囲の実質的に
一定の温度で、好ましくは37℃近傍の実質的に一定の温
度でインクベーションし、要素内の発色又は変色を可視
光又は紫外光の吸収極大波長またはその近傍の波長の光
を用いて光透過性支持体から反射測光し、予め作成した
検量線を用いて比色測定法の原理により液体試料中のリ
ガンドの含有量を求めることができる。あるいは、要素
内の蛍光の強度を測定し、予め作成した検量線を用いて
液体試料中のリガンド含有量を求めることができる。点
着する液体試料の量、インクベーション時間及び温度を
一定にすることによりリガンドの定量分析を高精度で実
施できる。光反射性又は不透明支持体を用いる態様にお
いては、分析要素内の発色又は変色を支持体と反対側の
最外層側から反射測定する。
作により液体試料中のアナライトであるリガンドの分析
を実施できる。例えば、約５μから約30μ、好まし
くは約８μから約15μの範囲の全血、血漿、血清、
リンパ液、尿等の水性液体試料滴を展開層に点着し１分
から10分の範囲で、約20℃から約40℃の範囲の実質的に
一定の温度で、好ましくは37℃近傍の実質的に一定の温
度でインクベーションし、要素内の発色又は変色を可視
光又は紫外光の吸収極大波長またはその近傍の波長の光
を用いて光透過性支持体から反射測光し、予め作成した
検量線を用いて比色測定法の原理により液体試料中のリ
ガンドの含有量を求めることができる。あるいは、要素
内の蛍光の強度を測定し、予め作成した検量線を用いて
液体試料中のリガンド含有量を求めることができる。点
着する液体試料の量、インクベーション時間及び温度を
一定にすることによりリガンドの定量分析を高精度で実
施できる。光反射性又は不透明支持体を用いる態様にお
いては、分析要素内の発色又は変色を支持体と反対側の
最外層側から反射測定する。
測定操作は特開昭60−125543、特開昭60−220862、特
開昭61−294367、特開昭58−161867等に記載の化学分析
装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施
できる。
開昭61−294367、特開昭58−161867等に記載の化学分析
装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施
できる。
（合成例） （１）酵素抗体結合物の合成 CHM化アミラーゼの作製 パチルス・サブチリスアミラーゼ5mgをpH6.3の0.1Mグ
リセロ燐酸1mlに溶かし、CHMS2mg/mlのDMF溶液100μ
を加えて室温で１時間放置して反応させた。この反応液
をセファデックスＧ−25のカラムに入れ、pH6.3の0.1M
グリセロ燐酸を流してゲル濾過を行ない、素通り分画を
分取した。
リセロ燐酸1mlに溶かし、CHMS2mg/mlのDMF溶液100μ
を加えて室温で１時間放置して反応させた。この反応液
をセファデックスＧ−25のカラムに入れ、pH6.3の0.1M
グリセロ燐酸を流してゲル濾過を行ない、素通り分画を
分取した。
抗ヒトフェリチンヤギIgGF（ab′）２の作製 抗ヒトフェリチンヤギIgG10mg（0.1M酢酸緩衝液（pH
4.2）2mlにペプシン0.5mgを加え、37℃一夜攪拌し、0.1
N−NaOHを加えてpHを7.0に調節した。この反応液を予め
0.1M燐酸緩衝1mM EDTA溶液（pH7.0）で平衡化したAcA−
44分子量約10万付近に溶出されたピークの部分を集めて
1mlに濃縮し、目的の抗ヒトフェリチンヤギIgGF（a
b′）２を得た。
4.2）2mlにペプシン0.5mgを加え、37℃一夜攪拌し、0.1
N−NaOHを加えてpHを7.0に調節した。この反応液を予め
0.1M燐酸緩衝1mM EDTA溶液（pH7.0）で平衡化したAcA−
44分子量約10万付近に溶出されたピークの部分を集めて
1mlに濃縮し、目的の抗ヒトフェリチンヤギIgGF（a
b′）２を得た。
α−アミラーゼ−抗ヒトフェリチンヤギFab′結合物
の作製 抗ヒトフェリチンヤギＦ（ab′）26mgを含む1mM EDTA
含有0.1M燐酸緩衝液（pH7.0）mlに0.1M 2−メルカプト
エチルアミン塩酸塩水溶液100μ加え、37℃で２時間
インキュベーションした。この反応液を予め0.1Mグリセ
ロ燐酸水溶液（pH7.0）で平衡化したセファデックスＧ
−25のカラムで分離しFab′−SH5mgを分取した。このFa
b′−SH溶液に上記CHMアミラーゼ0.62mg加え、４℃、一
夜放置した。PEG−2000で1mlに濃縮後、予め0.1M酢酸緩
衝液（5mM塩化カルシウム含有pH7.0）平衡化したセファ
クリルＳ−300カラムでゲル濾過し、分子量20−30万ダ
ルトン前後のタンパン分画を分取し、目的の結合物を得
た。
の作製 抗ヒトフェリチンヤギＦ（ab′）26mgを含む1mM EDTA
含有0.1M燐酸緩衝液（pH7.0）mlに0.1M 2−メルカプト
エチルアミン塩酸塩水溶液100μ加え、37℃で２時間
インキュベーションした。この反応液を予め0.1Mグリセ
ロ燐酸水溶液（pH7.0）で平衡化したセファデックスＧ
−25のカラムで分離しFab′−SH5mgを分取した。このFa
b′−SH溶液に上記CHMアミラーゼ0.62mg加え、４℃、一
夜放置した。PEG−2000で1mlに濃縮後、予め0.1M酢酸緩
衝液（5mM塩化カルシウム含有pH7.0）平衡化したセファ
クリルＳ−300カラムでゲル濾過し、分子量20−30万ダ
ルトン前後のタンパン分画を分取し、目的の結合物を得
た。
実施例１ ゼラチン下塗層が設けられている厚さ180μｍの無色
透明ポリエチレンテレフタレート（PET）シート（支持
体）の上に下記の被覆量になるように架橋剤含有吸水層
を水溶液を用いて塗布し、乾燥して設けた。
透明ポリエチレンテレフタレート（PET）シート（支持
体）の上に下記の被覆量になるように架橋剤含有吸水層
を水溶液を用いて塗布し、乾燥して設けた。
アルカリ処理ゼラチン 6.6mg/m2 ノニルフェノキシポリグリシドール（平均10グリシドー
ル単位含有） 330 mg/m2 ビス〔（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ〕
メタン 380 mg/m2 架橋剤含有吸水層の上に下記の被覆量になるようにし
て検出層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して設けた。
ル単位含有） 330 mg/m2 ビス〔（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ〕
メタン 380 mg/m2 架橋剤含有吸水層の上に下記の被覆量になるようにし
て検出層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して設けた。
酸処理ゼラチン 10g/m2 重合体水性ラテックス（１）（固形分含有量10％）3g/m
2 ノニルフェノキシポリグリシドール（平均10グリシドー
ル単位含有） 2g/m2 検出層の上に下記の被覆量で乾燥層厚７μｍになるよ
うにして光遮蔽層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して
設けた。
2 ノニルフェノキシポリグリシドール（平均10グリシドー
ル単位含有） 2g/m2 検出層の上に下記の被覆量で乾燥層厚７μｍになるよ
うにして光遮蔽層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して
設けた。
アルカリ処理ゼラチン 2.9g/m2 ルチル型二酸化チタン微粒子 13 g/m2 ノニルフェノキシポリグリシドール（平均10グリシドー
ル単位含有） 400 mg/m2 光遮蔽層の上に下記の被覆量で乾燥層厚５μｍになる
ようにして接着層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して
設けた。
ル単位含有） 400 mg/m2 光遮蔽層の上に下記の被覆量で乾燥層厚５μｍになる
ようにして接着層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して
設けた。
アルカリ処理ゼラチン 6.7g/m2 ノニルフェノキシポリグリシドール（平均10グリシドー
ル単位含有） 600 mg/m2 ついで接着層の表面に水を30g/m2の割合でほぼ一様に
供給して湿潤させ、その上に50デニール相当のPET紡績
糸36ゲージ編した厚さ約250μｍのトリコット編物布地
をほぼ一様に軽く圧力かけてラミネート接着して多孔性
展開層を設けた。
ル単位含有） 600 mg/m2 ついで接着層の表面に水を30g/m2の割合でほぼ一様に
供給して湿潤させ、その上に50デニール相当のPET紡績
糸36ゲージ編した厚さ約250μｍのトリコット編物布地
をほぼ一様に軽く圧力かけてラミネート接着して多孔性
展開層を設けた。
次に、下記の被覆量になるように基質及び免疫反応試
薬組成物を塗布、乾燥した。
薬組成物を塗布、乾燥した。
ダイアミル−Ｌ（商品名） 3.5g/m2 α−アミラーゼ抗ヒトフェリチンヤギFab′結合物（合
成例） 1 mg/m2 ノニルフェノキシポリエトキシエタール（平均40オキシ
エチレール単位含有） 500 mg/m2 これを一辺15mmの正方形チップに裁断し、特開昭58−
32350に記載のスライドの枠に収めて、フェリチン分析
用多層免疫スライド（１）を完成した。
成例） 1 mg/m2 ノニルフェノキシポリエトキシエタール（平均40オキシ
エチレール単位含有） 500 mg/m2 これを一辺15mmの正方形チップに裁断し、特開昭58−
32350に記載のスライドの枠に収めて、フェリチン分析
用多層免疫スライド（１）を完成した。
性能評価試験 前記のフェリチン分析用多層免疫スライド（１）の展
開層に、既知量のフェリチンを含有するpH7の50mMグリ
セロ燐酸緩衡溶液10μ滴下した。37℃で30分間反応
後、支持体側より540nmの反射光学濃度を測定した。結
果は第１図に示す。
開層に、既知量のフェリチンを含有するpH7の50mMグリ
セロ燐酸緩衡溶液10μ滴下した。37℃で30分間反応
後、支持体側より540nmの反射光学濃度を測定した。結
果は第１図に示す。
第１図の検量線より、本発明のフェリチン分析用乾式
免疫分析要素はフェリチンの定量が精度よく実施できる
ことがわかる。
免疫分析要素はフェリチンの定量が精度よく実施できる
ことがわかる。
実施例２ ゼラチン下塗層が設けられている厚さ180μｍの無色
透明ポリエチレンテレフタレート（PET）シート（支持
体）の上に下記の被覆量になるように架橋剤含有吸水層
を水溶液を用いて塗布し、乾燥して設けた。
透明ポリエチレンテレフタレート（PET）シート（支持
体）の上に下記の被覆量になるように架橋剤含有吸水層
を水溶液を用いて塗布し、乾燥して設けた。
アルカリ処理ゼラチン 6.6mg/m2 ノニルフェノキシポリグリシドール（平均10グリシドー
ル単位含有） 330 mg/m2 ビス〔（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ〕
メタン 380 mg/m2 架橋剤含有吸水層の上に下記の被覆量になるようにし
て検出層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して設けた。
ル単位含有） 330 mg/m2 ビス〔（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ〕
メタン 380 mg/m2 架橋剤含有吸水層の上に下記の被覆量になるようにし
て検出層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して設けた。
酸処理ゼラチン 10 g/m2 重合体ラテッスク（１） 3 g/m2 ノニルフェノキシポリグリシドール（平均10グリシドー
ル単位含有） 2mg/m2 検出層の上に下記の被覆量で乾燥層厚７μｍになるよ
うにして光遮蔽層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して
設けた。
ル単位含有） 2mg/m2 検出層の上に下記の被覆量で乾燥層厚７μｍになるよ
うにして光遮蔽層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して
設けた。
アルカリ処理ゼラチン 2.9mg/m2 ルチル型二酸化チタン微粒子13 g/m2 ノニルフェノキシポリグリシドール（平均10グリシドー
ル単位含有） 400 mg/m2 光遮蔽層の上に下記の被覆量で乾燥層厚５μｍになる
ようにして接着層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して
設けた。
ル単位含有） 400 mg/m2 光遮蔽層の上に下記の被覆量で乾燥層厚５μｍになる
ようにして接着層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して
設けた。
アルカリ処理ゼラチン 6.7g/m2 ノニルフェノキシポリグリシドール（平均10グリシドー
ル単位含有） 600 mg/m2 ついで、接着層の表面に水を30g/m2の割合でほぼ一様
に供給して湿潤させ、その上に公称孔径3.0μｍ、厚さ
約140μｍのセルロースアセテートメンブランフィルタ
ーをラミネート接着し、多孔性試薬層とした。
ル単位含有） 600 mg/m2 ついで、接着層の表面に水を30g/m2の割合でほぼ一様
に供給して湿潤させ、その上に公称孔径3.0μｍ、厚さ
約140μｍのセルロースアセテートメンブランフィルタ
ーをラミネート接着し、多孔性試薬層とした。
次に、下記塗布量となるように試薬を塗布乾燥した。
ダイアミル−Ｌ（商品名） 3.5g/m2 ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（平均10オキ
シエチレン単位含有）100 mg/m2 ついで多孔性試薬層の上に、下記組成の免疫反応用試
薬組成物を含有させた、50デニール相当のPET紡績糸36
ゲージ編した厚さ約250μｍのトリコット編物布地をラ
ミネート接着して多孔性展開層を設けた。
シエチレン単位含有）100 mg/m2 ついで多孔性試薬層の上に、下記組成の免疫反応用試
薬組成物を含有させた、50デニール相当のPET紡績糸36
ゲージ編した厚さ約250μｍのトリコット編物布地をラ
ミネート接着して多孔性展開層を設けた。
α−アミラーゼ−抗ヒトフェリチンヤギFab′結合物
（合成例） 2mg/m2 ノニルフェノキシポリエトキシエタノール 500mg/m2 これを一辺15mmの正方形チップに裁断し、特開昭58−
32350記載のスライドの枠に収めてフェリチン分析用多
層分析スライド（２）とした。
（合成例） 2mg/m2 ノニルフェノキシポリエトキシエタノール 500mg/m2 これを一辺15mmの正方形チップに裁断し、特開昭58−
32350記載のスライドの枠に収めてフェリチン分析用多
層分析スライド（２）とした。
性能評価実験 実施例２のフェリチン分析用多層分析スライド（２）
を用いて、実施例１の性能評価実験と同様の手法により
フェリチンを測定すると、第２図のようになった。
を用いて、実施例１の性能評価実験と同様の手法により
フェリチンを測定すると、第２図のようになった。
第２図の検量線から、本発明のフェリチン分析用乾式
免疫分析要素はフェリチンの定量が精度よく実施できる
ことが明らかになった。
免疫分析要素はフェリチンの定量が精度よく実施できる
ことが明らかになった。
第１図は実施例１のフェリチン分析用乾式免疫分析要素
の検量線を示す図である。 第２図は実施例２のフェリチン分析用乾式免疫分析要素
の検量線を示す図である。
の検量線を示す図である。 第２図は実施例２のフェリチン分析用乾式免疫分析要素
の検量線を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 西薗 功 東京都新宿区下落合４丁目６番７号 富士 レビオ株式会社内 (72)発明者 平岡 俊景 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社内 (72)発明者 谷本 徹二 東京都新宿区下落合４丁目６番７号 富士 レビオ株式会社内 (72)発明者 景山 茂樹 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社内 (56)参考文献 特開 昭61−80050（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】少なくとも２つの水浸透性層を有し、少な
くともその１層は多孔性層である、検体中のリガンドの
測定のための酵素免疫分析法による乾式免疫分析要素で
あって、前記多孔性層中に、 （Ａ） 水溶性高分子物質、及び、 （Ｂ） 検体中のリガンドと反応する抗体と前記水溶性
高分子物質に作用しうる酵素との結合物であるところの
酵素抗体結合物、 を含有することを特徴とする乾式免疫分析要素。 - 【請求項２】リガンドが２以上の抗原決定基を有し、該
抗原決定基のうち酵素抗体結合物の抗体部分と反応しな
かった抗原決定基と反応する第２抗体を用いることから
なる、特許請求の範囲第１項に記載の免疫分析要素。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62268228A JPH0814580B2 (ja) | 1987-10-26 | 1987-10-26 | 乾式免疫分析要素 |
| DE3852166T DE3852166T2 (de) | 1987-09-30 | 1988-09-29 | Analytische Vorrichtung für enzymimmunologische Tests. |
| EP88116060A EP0310940B1 (en) | 1987-09-30 | 1988-09-29 | Analytical element for enzyme immunoassays |
| US07/993,964 US5603898A (en) | 1987-09-30 | 1992-12-17 | Dry-type analytical element for immunoassay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62268228A JPH0814580B2 (ja) | 1987-10-26 | 1987-10-26 | 乾式免疫分析要素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01112159A JPH01112159A (ja) | 1989-04-28 |
| JPH0814580B2 true JPH0814580B2 (ja) | 1996-02-14 |
Family
ID=17455692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62268228A Expired - Fee Related JPH0814580B2 (ja) | 1987-09-30 | 1987-10-26 | 乾式免疫分析要素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0814580B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102004050163A1 (de) | 2004-10-14 | 2006-04-27 | Volkswagen Ag | Wischblatt |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6151264A (ja) * | 1984-08-18 | 1986-03-13 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 文書処理装置 |
| JPS6180050A (ja) * | 1984-09-28 | 1986-04-23 | Fujirebio Inc | 酵素を利用した抗原決定基具有物質測定方法 |
-
1987
- 1987-10-26 JP JP62268228A patent/JPH0814580B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01112159A (ja) | 1989-04-28 |
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