DK164943B - Multizoneproeveanordning til en specifik bindingsbestemmelse af en analyt i en flydende proeve - Google Patents

Description

i

DK 164943 B

Den foreliggende opfindelse angår en multizoneprøve-anordning til en specifik bindingsbestemmelse af en analyt i en flydende prøve, især en flerlagsimmunanalyse-prøvean-ordning, der indebærer anvendelse af mærkede reagenser om-5 fattende en kemisk gruppe, der er påviselig på basis af kemisk reaktivitet med et andet stof, så at der tilvejebringes et påviseligt signal, såsom fluorescens eller farve.

Multizoneanalyseelementer eller -prøveanordninger har tidligere været foreslået og har været benyttet til 10 bindingsanalyse, f.eks. immunanalyser, som afhænger af et antistofs eller et antigens evne til at bindes til en specifik analyt til bestemmelse af analytten i en flydende prøve. Sådanne analyser omfatter de immunanalyser, hvor et mærket reagens, såsom en mærket form for analytten eller et 15 antistof herimod, deltager i en antigen/antistof-reaktion til dannelse af en fri form og en bundet form deraf, så at mængden af det mærkede reagens i den ene af sådanne former kan korreleres med mængden af analyt i den flydende prøve. Principielt omtales sådanne analyser som heterogene immunana-20 lyser, fordi den fri og den bundne form skal adskilles til fuldførelse af analysen.

Der kendes nu multizone-, især flerlags-, analyseelementer, som automatisk udfører det nødvendige adskillelsestrin, så at der ikke kræves yderligere operationer efter 25 påføring af den flydende prøve. I reglen omfatter sådanne anordninger flere lag, hvori de reagenser er inkorporeret, der er nødvendige for at udføre en immunanalyse og for at foretage det nødvendige adskillelsestrin. Nogle af disse anordninger omfatter endvidere et påvisningslag, hvorfra 30 det signal, der frembringes af et mærket reagens i enten den bundne eller den frie form, påvises og måles. Påviselige signaler, der tilvejebringes af sådanne anordninger, er i reglen optiske af natur, såsom farveændringer eller fluorescens. Alternativt kan påvisning ske ved elektrokemiske 35 målinger ved hjælp af f.eks. potentiometriske eller ampome-triske metoder.

DK 164943 B

2 I EP offentliggørelsesskrift nr. 97.952 og i DE offentliggørelsesskrift nr. 3.329.728 er der således beskrevet flerlagsimmunanalyseelementer, hvori der er inkorporeret en immobiliseret form af en bindingspartner, såsom et immobi-5 liseret antistof mod et antigen, og et antigen mærket med et påviseligt stof. Efter påføring af en flydende prøve på en sådan anordning konkurrerer antigen fra prøven med mærket antigen, der er inkorporeret i anordningen, om binding til det immobiliserede antistof. Adskillelse af den bundne form 10 fra den frie form sker efter migrering af den frie form af det mærkede antigen bort fra den immobiliserede zone.

På lignende måde omhandler EP offentliggørelsesskrifterne nr. 51.183 og 66.648 sådanne anordninger, hvor bestemmelsen af antigen eller antistof i en flydende prøve er 15 afhængig af antigenets (eller antistoffets) konkurrerende binding med en mærket form for antigenet (eller antistoffet) om en immobiliseret form for en bindingspartner hertil, såsom immobiliseret antistof (eller antigen).

Andre flerlagsimmunprøveanordninger er blevet fore-20 slået, f.eks. som beskrevet i US patentskrift nr. 4.258.001, hvor en anordning omfatter et eller flere lag omfattende findelte tredimensionale gitre dannet af en flerhed af or-ganopolymere partikler. Partiklerne danner indbyrdes forbundne tomme mellemrum, som hævdes at sørge for transport 25 derigennem af analytter med høj molekylvægt. Selv om det ikke er nødvendigt, foreslås det, at indbyrdes aktive sammensætninger, såsom antigener eller antistoffer, kan være immobiliseret på partiklerne, hvorved der tilvejebringes aktive forbindelses- eller bindesteder på partiklerne, hvor-30 til sådanne indbyrdes aktive sammensætninger kan bindes covalent.

En anden af denne type anordninger er beskrevet i US patentskrift nr. 4.446.232, der er baseret på et princip om konkurrence mellem bundet og en fri form for analyt om et 35 fast antal genkendelsessteder på et med enzym mærket antistof. Bestemmelsen af analyt i en analyseprøve afhænger af

DK 164943B

3 analyttens binding til enzym-mærkede antistoffer i den ene af anordningens zoner, og som derpå passerer ind i en anden zone i anordningen, hvor enzymaktiviteten hos de enzymbundne antistoffer, der er bundet til analyt, påvises. En af zonerne 5 omfatter endvidere bundet og immobiliseret analyt, som konkurrerer med analytten fra analyseprøven om binding til de enzymmærkede antistoffer, og som binder og immobiliserer et hvilket som helst af de enzymmærkede antistoffer, der ikke bliver bundet til analytten fra analyseprøven.

10 En særlig ulempe ved sådanne anordninger er det dog, at omvendt væskemigrering resulterer i reaktionsprodukter, der er migreret ned i det nedre eller påvisningslaget, for at migrere tilbage op i de øverste lag, hvilket resulterer i kemiske interferenser og formindsket analyserespons. For 15 at undgå denne ulempe har der været foreslået analyseanordninger, i hvilke man forsøger at lokalisere eller på anden måde hindre en sådan omvendt væskemigrering af reaktionsprodukterne .

Således foreslås der i EP offentliggørelsesskrifterne 20 nr. 51.183 og 66.648 anvendelse af lag til opsamling af det påviselige reaktionsprodukt omfattende hydrofile stoffer med høj molekylvægt. I EP offentliggørelsesskrift nr. 66.648 foreslås endvidere inkorporering i påvisningslaget af bejdseeller ætsemidler, som har kraftig reaktivitet med det påvi-25 selige reaktionsprodukt, for at opsamle det påviselige reaktionsprodukt deri. Sådanne midler omfatter kationiske polymere, anioniske polymere og kvaternære salte.

På lignende måde omhandler US patentskrifterne nr. 4.144.306 og 4.042.335 flerlagsanalyseelementer, som omfatter 30 et registreringslag, der er inkorporeret sammen med et bejdsemiddel til en påviselig form for at opsamle den påviselig form deri og derved forhindre diffusion eller migrering af den påviselige form ud af registreringslaget.

En variation af en sådan anordning er omhandlet i US 35 patentskrift nr. 4.459.358, som beskriver et flerlagselement omfattende et spredningslag, et reaktionslag, hvori der er

DK 164943 B

4 inkorporeret et diffunderbart mærket antistof, og et registreringslag, hvori der er inkorporeret materialer indrettet til på ikke-specifik måde at binde, immobilisere eller "bejdse" antistoffer, såsom latexpartikler. Efter påføring af en 5 flydende prøve på anordningen associeres analyt fra prøven med det mærkede antistof i reaktionslaget og immunfældes deri. Alt det mærkede antistof, som ikke bliver bundet til analytten, diffunderer ind i registreringslaget, hvor det immobiliseres af det deri inkorporerede bejdsestof.

10 Imidlertid kan anvendelsen af bejdsemidler gribe ind i de nødvendige reaktioner, der er påkrævet til dannelse eller frigørelse af det påviselige reaktionsprodukt som følge af bejdsemidlets ikke-specifikke binding. En sådan indgriben kan gøre både påvis-15 ning og måling upålidelig samt nedsætte prøveanordningens følsomhed.

I forsøg*-på åt undgå ulempen ved bejdsemidler i et regi'streringslag har der været foreslået andre analyseelementer, hvor der anvendes bejdsemidler 20 i et andet lag end registreringslaget for at hindre migrering af et dannet,påviseligt reaktionsprodukt ind i et lag, der ikke er et registrerings- eller påvisningslag, og som ellers ville gøre det påviselige reaktionsprodukt upåviseligt. En sådan anordning 25 er genstand for US patentskrift nr. 4.166.093, der omfatter en art migrerings-inhiberende lag indskudt mellem·et strålingsblokerende lag og et reagenslag i et flerlagsanalyseelement. Den påviselige form for mi-greringsinhiberende lag er permeabel,. for analyt og fikse-rer eller hindrer på anden måde en afgørende del af en hvilken som helst påviselig form, såsom et farvestof dannet i reagenslaget, i at migrere op i det strålingsblokerende lag. Sådanne påviselige former af migre- ringsinhiberende lag omfatter et bejdsemiddel for den 35 særlige påviselige form, der dannes i reagenslaget. Et sådant inhiberende lag frembyder dog stadig en ulem-

DK 164943 B

5 pe på grund af et bejdsemiddel, der kan gribe ind i reaktioner, der er igangsat ved tilstedeværelsen af ana-lyt, og hindrer eller inhiberer i væsentlig grad dannelsen eller frigørelsen af den påviselige form.

5 Endnu et forsøg på at overvinde problemet med omvendt væskemigrering i flerlags-analyseelementer er omtalt i international offentliggjort patentansøgning nr. WO 84/02193, der omhandler en chromogen understøtningsimmunanalyse, der omfatter en opsamling af et immun-10 kompleks .omfattende analyt bundet til et enzym-mærket anti-analyt-antistof på et porøst eller mikroporøst understøtningsmateriale. Understøtningen virker således, at den koncentrerer det farvesignal, der dannes af mærkestof komponenten, ved reaktion med sigrtaldannende rea-15 genser i understøtningsmaterialet. Koncentration af farvesignalet fremkommer ved covalent binding af reaktionsproduktet til understøtningen, og problemet med omvendt væskemigrering imødegås ved tilvejebringelse af et enkelt lag. Immunanalysen kræver imidlertid 20 en række inkubations- og vasketrin for at lokalisere og koncentrere signalet på understøtningen. Selv om immunanalysen hindrer omvendt væskemigrering ved tilvejebringelse af en enkeltlagsunderstøtning, i hvilken de nødvendige reaktioner til frembringelse af farvesig-25 nalet foregår, frembyder den stadig ulemperne ved omfattende inkubations- og vasketrin, som ikke er nødvendige med et flerlagsanalyseelement.

Det er således et formål med den foreliggende opfindelse at undgå de ovennævnte ulemper ved at tilvejebringe 30 en specifik bindingsprøve i en multizoneprøveanordning, der koncenterer det påviselige reaktionsprodukt af den indbyrdes reaktion mellem en kemisk mærkestofgruppe og et indbyrdes reaktivt påvisningsreagens derfor uden indgriben i de specifikke bindingsreaktioner, der indgår i prøven.

35 Med den her omhandlede prøveanordning tilvejebringes en specifik bindingsprøve med det slutresultat, at der opnås

DK 164943 B

6 en analyse, hvor yderligere migrering af de påviselige former ikke forekommer, og der opnås en følsom og specifik bindingsprøve til meget nøjagtig bestemmelse af analyt fra en flydende prøve og med hovedsageligt ringe eller intet bag-5 grundssignal, hvorhos man med prøveanodrningen ifølge opfindelsen opnår at forstærke det signal, der dannes af det påviselige reaktionsprodukt fra den indbyrdes reaktion mellem den kemiske gruppe og det indbyrdes aktive påvisningsreagens derfor til tilvejebringelse af følsomme påvisningsgrænser.

10 Den her omhandlede multizoneprøveanordning til en specifik bindingsbestemmelse af en analyt i en flydende prøve, der indebærer enten: a. konkurrende binding mellem en analyt (A) og en mærket analyt/analytanalog (A')# hvor A og A' bindes til en 15 immobiliseret bindingspartner (Bim), hvorefter kon centrationen af fri (A1) bestemmes ved hjælp af et påvisningsreagens, så der produceres et påviseligt signal, eller: b. konkurrerende binding mellem en analyt (A) og en 20 immobiliseret analyt/analytanalog (Aim), hvor A og

Aim bindes til en fri, mærket bindingspartner (B'), hvorefter koncentrationen af frit B* bestemmes ved hjælp af et påvisningsreagens, så der produceres et påviseligt signal, 25 er ifølge opfindelsen til opnåelsen af det ovennævnte formål og de beskrevne fordele ejendommelig ved, at prøveanordningen omfatter: 1. en reaktionszone indeholdende en fast porøs matrice, hvori der er inkorporeret den immobiliserede bin- 30 dingspartner (Bim) eller den immobiliserede analyt/- analytanalog (Aim) og 2. en påvisningszone indeholdende en fast porøs matrice, hvori der er inkorporeret en immobiliseret form af mindst den ene komponent af påvisningsreagenset.

De vigtigste fordele ved den foreliggende opfindelse 35

DK 164943 B

7 beror på anvendelsen af et mærket reagens, der tilvejebringer et påviseligt signal i form af et påviseligt reaktionsprodukt som følge af den indbyrdes reaktion mellem det mærkede reagens og et indbyrdes aktivt påvisingsreagens, hvilket reak-5 tionsprodukt kan immobiliseres i påvisningszonen. Der dannes intet påviseligt produkt, der kan migrere separat, som det er tilfældet med de kendte anordninger, og immobilisering og koncentration af det påviselige reaktionsprodukt er resultatet af stærkt specifikke kemiske indbyrdes reaktioner.

10 Det immobiliserede stof i reaktionszonen og det mær kede stof vælges således, at de omfatter specifikke bindingspartnere, der vil bindes til hinanden afhængigt af den mængde analyt, der er til stede. Når det mærkede stof er en mærket form af analytten eller en analog hermed, vil det 15 immobiliserede stof være en immobiliseret form af en bindingspartner for analytten, og analytten og mærket reagens vil konkurrere om binding med det immobiliserede stof. Når det mærkede stof er en mærket form af en bindingspartner med analytten, vil det immobiliserede stof være en immobi-20 liseret form af analytten eller en analog hermed, og dele af den mærkede bindingspartner, der ikke bliver bundet til analytten, vil blive immobiliseret ved binding med den immobiliserede analyt. Hvadenten det drejer sig om mærket analyt eller mærket bindingspartner, vil en del af det mær-25 kede reagens forblive ubundet, afhængigt af den mængde analyt, der er til stede.

Det herved opnåede mærkede stof, som forbliver eller bliver frit til at migrere inde i og ud af reaktionszonen, passerer derpå ind i påvisningszonen, 30 hvor det reagerer med det immobiliserede, indbyrdes reaktive påvisningsreagens i påvisningszonen, så at der derved dannes et påviseligt reaktionsprodukt. Fortrinsvis immobiliseres det herved opnåede reaktionsprodukt og forhindres derved i at migrere fra påvisningszonen op i re-35 aktionszonen. Reaktionsproduktet kan være naturligt immobiliseret, fordi det indeholder en rest af det immobiliserede, m

DK 164943 B

8 o indbyrdes reaktive påvisningsreagens eller ved at være et frigjort, men uopløseligt produkt, eller kan være im-mobiliseret af et immobiliseret middel med Bindingsaffinitet for reaktionsproduktet, når reaktionsproduktet dannes i en opløselig form. Reaktionsproduktet tilvejebrin-5 ger i påvisningszonen et påviseligt signal, som måles og korreleres med mængden af analyt i prøvemediet.

Opfindelsen vil i det følgende blive forklaret : i forbindelse med tegningen, på hvilken fig. 1 er et snit i en flerlagsprøveanordning 10 med et reaktionslag og et påvisningslag opbygget ifølge opfindelsen, fig. 2 er et snit i en flerlagsprøveanordning med to reaktionslag og et påvisningslag opbygget ifølge den foreliggende opfindelse, og 15 fig. 3 er et snit i en flerlagsprøveanordning med to reaktionslag, et påvisningslag og en understøtning opbygget ifølge den foreliggende opfindelse.

En multizoneprøveanordning ifølge opfindelsen tilvejebringer en specifik bindingsanalyse i en zoneind- 20 delt eller lagdelt prøvestrimmel eller -anordning. Analysen afhænger af opdelingen af et mærket reagens, som enten påføres på anordningen eller inkorporeres i anordningen, mellem at blive tilbageholdt i reaktionszonen ved at blive bundet eller immobiliseret på det immobi-25 liserede reagens og at være frit til at migrere ind i påvisningszonen. Det mærkede reagens, der migrerer ind i påvisningszonen, er frit til at reagere med det immobili-serede, indbyrdes reaktive påvisningsreagens, hvilket re-3Q suiterer i dannelsen af det påviselige reaktionsprodukt deri. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer et fordelagtigt middel til at koncentrere det påviselige reaktionsprodukt, som dannes i påvisningszonen, og forstærker derved det således producerede signal.

For at forenkle den følgende forklaring vil 35 prøveanordningen ifølge opfindelsen hovedsagelig bli-

DK 164943B

9 ve beskrevet som omfattende en lagdelt struktur. Det skal bemærkes, at andre zonetyper kan give det samme resultat. Ligeledes vil det mærkede reagens blive valgt som en mærket form af en bindingspartner for ana-5 lytten, og det immobiliserede reagens vil blive valgt som en immobiliseret form af analytten (idet immobili-seret analyt kan erstattes med en immobiliseret form af en analog med analytten, som det er kendt på området) .

10 Prøveanordningen ifølge opfindelsen omfatter især i det mindste ét reaktionslag og et påvisningslag og kan, som det vil blive detaljeret forklaret nedenfor, yderligere omfatte et reaktionslag nr. 2. Reaktionslaget inkorporerer det immobiliserede reagens, der omfatter en immobiliseret 15 form af analytten, som ikke kan opløseliggøres eller på anden måde fjernes fra reaktionslaget ved kontakt med prøven. Påvisningslaget inkorporerer en immobiliseret form af et bindingsstof for det mærkede reagens, hvilket bindingsstof på lignende måde ikke kan opløseliggøres eller på anden 20 måde fjernes fra påvisningslaget. Når der anvendes et reaktionslag nr. 2, inkorporerer det første reaktionslag det mærkede reagens, som opløseliggøres af prøven, når denne påføres derpå, og reaktionslag nr. 2 inkorporerer den immobiliserede form af analytten.

25 Det skal bemærkes, at ifølge den foreliggende opfin delse kan de lag, som udgør prøveanordningen, være i væskekontakt med hinanden, hvorved lagene i prøveanordningen, som er associeret med hinanden, tillader diffusion af en væske ind i og mellem disse lag. En sådan væskekontakt til-30 lader passage af i det mindste nogle komponenter i en væskeprøve, f.eks. antigener, haptener og/eller antistoffer, mellem anordningens lag og er fortrinsvis ensartet langs med kontaktgrænsefladen mellem væskekontaktlagene. Efter påføring af den flydende prøve og mærket reagens på reak-35 tionslaget lader man således den flydende prøve og mærket reagens diffundere og permeere ind i og gennem reaktionslaget

DK 164943 B

10 og ind i påvisningslaget. Når der findes et første og et andet reaktionslag, lader man på lignende måde-den flydende prøve diffundere og permeere ind i og gennem det første reaktionslag, hvorved det deri inkorporerede mærkede reagens 5 opløseliggøres, og den flydende prøve og det mærkede reagens dif funderer og permeerer videre ind i og inde i reaktionslag nr. 2 og ind i og inde i påvisningslaget.

Når først den flydende prøve og det mærkede reagens er blevet påført på og permeeret ind i reaktionslaget som 10 tidligere beskrevet, og hvis den analyt, der skal påvises, forekommer i den flydende prøve, bringes så godt som al tilstedeværende analyt i direkte væskekontakt med og bindes specifikt til det mærkede reagens. Som følge af fluiditeten mellem reaktionslaget og påvisningslaget kan det derved 15 opståede analyt/mærket-reagens-kompleks frit migrere inde i og ud af reaktionslaget og ind i påvisningslaget. Som det vil blive beskrevet mere detaljeret nedenfor, tilvejebringer det mærkede reagens fortrinsvis kun ét tilgængeligt bindingssted for binding af analytten med det mærkede reagens.

20 Når først et sådant tilgængeligt bindingssted er blevet besat af analyt, kan analyt/mærket-reagens-komplekset følgelig frit migrere inde i og ud af reaktionslaget uden af blive immobiliseret af den deri inkorporerede immobiliserede analyt. Når der findes et første og et andet reaktionslag, 25 bliver på lignende måde efter påføring af den flydende prøve på det første reaktionslag det mærkede reagens opløselig-gjort, og næsten al tilstedeværende analyt bringes i direkte væskekontakt med og bindes specifikt til det mærkede reagens.

Det herved som følge deraf dannede analyt/mærket reagens-kom-30 pleks kan migrere inde i og ud af det førte reaktionslag, gennem det andet reaktionslag og ind i påvisningslaget.

Eventuelt mærket reagens, som ikke bliver bundet til analytten fra prøven, bindes til og immobiliseres af den immobiliserede analyt i reaktionslaget eller, når der findes et 35 første og et andet reaktionslag, immobiliseres i det andet reaktionslag.

DK 164943 B

11 0 Når først komplekset af analyt/mærket reagens migrerer ind i påvisningslaget, reagerer kompleksets mærkede reagens med det immobiliserede, indbyrdes reaktive påvisningsreagens deri, så at der dannes et reaktionsprodukt som følge af disses indbyrdes reaktion. Som det vil 5 blive beskrevet mere detaljeret nedenfor, kan reaktionsproduktet i sig selv tilvejebringe et påviseligt signal eller kan kræve yderligere indbyrdes reaktion med et andet stof til dannelse af et påviseligt signal, afhængigt af arten af det mærkede reagens. Det skal bemærkes, at 10 ifølge en foretrukken udførelsesform for den foreliggende opfindelse immobiliseres det herved opnåede reaktionsprodukt i påvisningslaget for at hindre dettes omvendte migrering ud af påvisningslaget. Følgelig tillader lokalisering og fortrinsvis immobilisering af reaktions-15 produktet i påvisningslaget nøjagtig og følsom påvisning og måling af det påviselige reaktionsprodukt, hvilket nøjagtigt kan korreleres med mængden af analyt i prøvemediet.

Mærket reagens og påvisningssysterner

Det mærkede reagens ifølge opfindelsen indeholder- en bindingspartner for analytten, der skal bestemmes, eller analytten eller en bindingsanalog dermed mærket med en kemisk gruppe med en påviselig kemisk eller indbyrdes reaktiv egenskab. Det skal bemærkes, at den kemiske gruppe ikke danner et påviseligt produkt eller på anden måde tilvejebringer et påviseligt signal før den indbyrdes reaktion med et passende, dermed reaktivt påvisningsreagens. Følgelig afhænger arten af den kemiske gruppe i det mærkede reagens og det deraf afhængige påvisningsre-30 agens nødvendigvis af deres indbyrdes reaktive egenskaber, der danner et reaktionsprodukt, der vil give et påviseligt signal, som kan korreleres med mængden af analyt i en flydende prøve.

Ifølge den foreliggende opfindelse er der i på-35 visningslaget inkorporeret en immobiliseret form af det 0

DK 164943 B

12 indbyrdes reaktive pavisningsreagens for det mærkede reagens, som ikke kan opløses eller på anden måde fjernes fra påvisningslaget ved kontakt med den flydende prøve eller andre flydende reagenser. Immobilisering af det indbyrdes reaktive påvisningsreagens i påvisningsla-get forhindrer migrering af det indbyrdes reaktive påvisningsreagens ind i reaktionslaget, hvilket ville resultere i dettes reaktion med det uomsatte mærkede reagens, der er immobiliseret deri. En sådan reaktion ville ellers danne et generende og ikke-specifikt signal. Når først de rigtige bindingsreaktioner er påbegyndt, som tidligere beskrevet,· bringes komplekset af analyt og mærket reagens, der migrerer ind i påvisningslaget, i direkte væskekontakt med det indbyrdes reaktive påvisningsreagens, der er immobiliseret deri. Følgelig tillades kun fuldstændig reaktion mellem den kemiske gruppe i det mærkede reagens og det indbyrdes reaktive påvisningsreagens inden for påvisningszonen. I så henseende resulterer reaktionen mellem den kemiske gruppe og det indbyrdes reaktive påvisningsreagens i dannelsen af et reaktionsprodukt, som enten i sig selv tilvejebringer et påviseligt signal eller kræver yderligere reaktion med et andet stof eller andre stoffer for at kunne tilvejebringe et påviseligt signal, afhængigt af arten af det mærkede reagens og det dermed 25 reaktive påvisningsreagens. Det skal bemærkes, at reaktionsproduktet også kan være naturligt immobiliseret som følge af immobiliseringen af det mærkede reagens og det dermed reaktive påvisningsreagens eller kan dannes i en opløselig form, der kan immobiliseres af et immobilise-30 ret bindingsmiddel i påvisningslaget med bindingsaffinitet for reaktionsproduktet. Et sådant immobiliseret bindingsmiddel kan også være et immobiliseret stof, der er nødvendigt for dannelsen af et påviseligt signal ved indbyrdes reaktion med reaktionsproduktet, når reaktionspro-35 duktet ikke i sig selv tilvejebringer et påviseligt signal som beskrevet ovenfor.

DK 164943 B

13 I reglen er kemiske grupper med påviselige kemiske egenskaber sådanne grupper, der påvises på basis af deres egen reaktivitet eller indbyrdes reaktion med et andet stof til frembringelse af et påviseligt signal 5 som beskrevet ovenfor. Sådanne kemiske grupper er vel udviklede inden for immunanalyseområdet, og de fleste sådanne grupper, der anvendes til immunanalyser, kan påføres på det mærkede reagens ifølge opfindelsen.

Således omfatter repræsentative kemiske grupper en-10 zymatisk aktive grupper, såsom enzymer [jfr. Clin. Chem.

22. 1232 (1976), USA Reissue-patentskrift nr. 31.006 og GB patentskrift nr. 2.019.308], enzymsubstrater (jfr. GB patentskrift nr. 1.548.741), prosthetiske enzymgrupper, coenzymer (jfr. US patentskrifterne nr. 4.120.797 og 4.238.565) og 15 enzym-cofaktorer, enzyminhibitorer og -aktivatorer, kemilu-minescerende typer, kemiske katalysatorer, metalkatalysatorer, parter i enzymkanaliserende, fluorphorafbrydende eller energioverførende par (jfr. US patentskrifterne nr.

3.996.345, 4.174.384, 4.199.559 og 4.233.402) og ligander, 20 der bindes specifikt, såsom biotin, chelatorer eller et hapten. Eksempelvis kan en cofaktor-mærket art påvises ved tilsætning af det enzym, for hvilket mærkningen er en cofak-tor, og et substrat eller substrater for enzymet.

Også et hapten eller andre mærkede typer med ligander, 25 der bindes specifikt (f.eks. biotin), kan påvises ved at sætte et antistof til haptenet eller et protein (f.eks. avidin), som binder liganden markeret eller mærket med et påviseligt molekyle. Et sådant påviseligt molekyle kan være et hvilket som helst molekyle med en 30 målelig fysisk egenskab (f.eks. fluorescens eller ab-sorbans).

Det skal bemærkes, at sådanne repræsentative kemiske grupper besidder indbyrdes reaktive egenskaber, der også gør det muligt at anvende dem som indbyrdes 35 reaktivt påvisningsreagens ifølge den foreliggende opfindelse. Når således mærkestoffet i det mærkede rea-

DK 164943 B

14 0 gens er et enzymsubstrat, såsom umbelliferon-galactose, er det immobiliserede påvisningsreagens et enzym, der kan hydrolysere substratet, såsom β-galactosidase. Når mærkestoffet på lignende måde er en enzym-cofaktor, såsom nicotinamid-adenin-dinucleotid, er det immobilise-5 rede påvisningsreagens et enzym, såsom lactat-dehydro-genase. Andre repræsentative grupper omfatter prosthe-tiske enzymgrupper, såsom flavin-adenin-dinucleotid, og et apoenzym, såsom apoglucose-oxidase, samt enzyminhibitorer, såsom methotrexat, og et enzym, som inhiberes af 10 enzyminhibitoren, såsom dihydrofolat-reductase. Ligeledes kan et hapten eller andre typer mærket med ligand, der bindes specifikt (f.eks. biotin), påvises med et antistof mod hapten eller et protein (f.eks. avidin), som binder liganden, der er markeret eller mærket med et påviseligt 15 molekyle. Et sadant påviseligt molekyle kan være et hvillet som helst molekyle med en målelig fysisk egenskab (f.eks. fluorescens eller absorbans).

Endvidere kan den påviselige kemiske gruppe i det mærkede reagens være en polymerrest, hvortil der er 20 bundet internt blokerede sammensatte fluoresceringsmid- ler. Det immobiliserede indbyrdes reaktive påvisningsreagens i påvisningslaget kan være et enzym, der reagerer indbyrdes med fluoresceringsmiddel/polymer-resten, så at ublokerede fluoresceringsmolekyler fraspaltes og fri-

cO

gøres.

Som beskrevet ovenfor kan reaktionsproduktet, der dannes ved indbyrdes reaktion mellem det mærkede reagens og det indbyrdes reaktive påvisningsreagens, (1) i 3Q sig selv tilvejebringe et påviseligt signal eller (2) kræve indbyrdes reaktion med et yderligere stof for at kunne tilvejebringe et påviseligt signal. Således vil indbyrdes reaktion mellem et med FAD mærket antistof og et immobiliseret apoenzym-påvisningsreagens frembringe 35 et aktivt enzym, der vil reagere med glucose, så at der frembringes hydrogenperoxid. Dette sidstnævnte produkt

DK 164943B

15 0 kan måles ved en koblet enzymreaktion med peroxidase og et chromogen, såsom tetramethylbenzidin.

Ligeledes kan det reaktionsprodukt, der dannes, foreligge i en uopløselig form eller en opløselig form, afhængigt af det mærkede reagens' og det dermed reaktive 5 påvisningsreagens' natur. I begge tilfælde kan det påviselige signal forekomme naturligt eller kan kræve en indbyrdes reaktion med et yderligere stof som tidligere beskrevet. Når reaktionsproduktet dannes i en opløselig form, foretrækkes det dog at inkorporere et immobilise-ret bindingsmiddel med bindingsaffinitet for reaktionsproduktet i påvisningslaget for at hindre reaktionsproduktets migrering tilbage ud af påvisningslaget og ind i reaktionslaget. Når der således som enzymprodukt dannes en anionisk chromophor, kan produktet immo-15 biliseres ved, at der i matricen inkorporeres en anion-bytterharpiks. Alternativt kan substratet indeholde en derivatiseret sukkerforbindelse, som er bundet til chro-mophoren og underkastes reaktion med enzymmærkestoffet. Inkorporering i matricen af det tilsvarende immobilise- 20 rede lectin eller i et deroptil liggende bindingslag vil resultere i produktets binding og immobilisering der.

I nogle tilfælde foretrækkes det dog, at reaktionen mellem det mærkede reagens og det dermed reaktive 25 påvisningsreagens resulterer i dannelsen af et uopløseligt reaktionsprodukt. Således findes der til rådighed en række enzymsubstrater, der danner uopløselige produkter, såsom naphthol-AS-Bl-phosphat til enzymet alkalisk phosphatase eller naphthol-AS-Bl-fJ-D-galactopyranosid 30 til enzymet β-galactosidase.

Det påviselige signal måles fortrinsvis ved at lede prøveanordningen gennem en zone, der er udstyret med et passende apparat til påvisning af det endelige optiske signal, såsom ved refleksions-, transmissions-35 eller fluorescensfotometri. Et sådant apparat rétter

DK 164943 B

16 f.eks. en energikilde, såsom lys, på og/eller ind i prøveanordningen. Derpå reflekteres lyset fra eljementet tilbage til et påvisningsmiddel, hvor der anvendes en reflekterende understøtning, eller passerer gennem ele-5 mentet til en detektor, når det drejer sig om transmissionspåvisning, hvor der anvendes en strålingstransmitterende eller transparent understøtning. Om ønsket kan . der også anvendes gængse metoder som fluorescensspektro-; fotometri eller luminescensmålinger. Ved metoder, hvor 10 der anvendes en elektroaktiv type som mærkestof, kan påvisning ske med ampometriske eller potentiometriské påvisningsanordninger .

Analytiske flerlagselementer

Under henvisning til tegningens fig. 1 bely-15 ses nu en udførelsesform for flerlagsprøveanordningen ifølcre opfindelsen, som i det mindste omfatter ét reak-. tionslag og et påvisningslag, som er i vsskekontakt med hinanden. Reaktionslaget inkorporerer den immobiliserede form af analytten (gengivet som " (-An") , og i påvisnings-20 laget er inkorporeret en immobiliseret form af et dermed reaktivt påvisningsreagens for det kemiske gruppe-mærke-stof i det mærkede reagens (gengivet som " j-reagens"), som tidligere beskrevet.

Efter påføring af både den flydende prøve indeholdende 25 analyt og det mærkede reagens på reaktionslaget diffunderer prøven og mærket reagens ind i reaktionslaget og bringes derved i væskekontakt med den immobiliserede analyt i reaktionslaget. Ved denne udførelsesform kan det mærkede reagens og prøven påføres hver for sig eller sammen som en blanding, 30 idet sidstnævnte foretrækkes, fordi der derved tilvejebringes ensartet konkurrence mellem det mærkede reagens og analytten fra prøven om binding med den immobiliserede analyt. Følgelig bliver al den analyt, der forekommer i den flydende prøve, bundet med bindingspartneren for analytten i det mærkede 35 reagens, og det derved dannede kompleks kan frit migrere inde i og ud af reaktionslaget og ind i påvisningslaget. Alt

DK 164943 B

17 det overskydende mærkede reagens, som ikke bliver bundet med analyt fra prøven, bliver bundet med den immobiliserede analyt i reaktionslaget via analyttens bindingspartner i det mærkede reagens og hindres i at migrere ind i påvis-5 ningslaget.

Frem for at tilsætte det mærkede reagens som en separat komponent, hvadenten det sker ved tilsætning med den flydende prøve eller ved at være inkorporeret i et separat reaktionslag som beskrevet mere detaljeret nedenfor, kan 10 det mærkede reagens alternativt, som det er kendt på området, forud være bundet med det immobiliserede reagens i reaktionslaget. Eftersom bindingen vil være reversibel, vil tilstedeværelsen af analyt reversere noget af en sådan binding, så at der frigøres en påviselig mængde af det mærkede 15 reagens.

Det skal bemærkes, at ifølge den foreliggende opfindelse har bindingspartneren for analytten fortrins- vis kun ét specifikt bindingssted for analytten. Fortrinsvis er en sådan bindingspartner et monovalent frag- 20 ment af et antistof fremstillet mod analytten, og som er renset eller afledt fra et monoklont antistof.

Sådanne monovalente antistoffragmenter kan let fremstilles ved fordøjelse af normalt helt IgG-anti-„ stof med et proteolytisk enzym, såsom papain, så at der fremstilles antistoffragmenter, der almindeligvis inden for området omtales som Fab-fragmenter. Alternativt kan sådanne monovalente antistoffragmenter også fremstilles ved fordøjelse af normalt helt IgG-antistof med et pro-30 teolytisk enzym, såsom pepsin, efterfulgt af kemisk reduktion til fremstilling af antistoffragmenter, der normalt inden for faget omtales som Fab'-fragmenter.

Imidlertid kan der også anvendes andre bindingspartnere, der naturligvis fortrinsvis kun har ét speci-3g fiktjtilgængeligt bindings- eller genkendelsessted for den analyt, der skal bestemmes. Sådanne andre bindings-

DK 164943 B

18 partnere omfatter hele antistofhybrider, receptormolekyler og lignende. Således kan der anvendes et helt antistofhybrid, som kan fås ved hjælp af en række metoder.

Sådanne hybrider kan fremstilles in vivo ud fra en mono-5 klon·', cellelinie fremstillet ved hybridisering mellem en udskillende myelomcelle og en miltcelle, der udskiller det pågældende antistof. Den opnåede cellelinie kan spontant producere hybridmolekyler. der består af én . bindingsunderenhed med den pågældende specificitet og 10 en anden underenhed med en specificitet, der defineres af myelomcelleklonen. Et sådant antistof kan isoleres fra homogene dimere af det originale myelom-antistof eller miltceller ved hjælp af gængse proteinrensningsmetoder, der er kendt inden for faget. Hybrider kan også 15 dannes kemisk ved at co-blande anti-analyt-antistof med et andet antistof under passende denatureringsbetingelser, såsom ved tilsætning af urinstof (8 molær) og reduktionsmidler, såsom dithiothreitol, efterfulgt af fjernelse af denatureringsmidlet, så at antistof hybriderne kan rekon-20 stitueres. Følgelig vil en del af den rekonstituerede prøve indeholde hybrider med et bindingssted for det andet bærerantistof, som yderligere kan renses ved gængse proteinrensningsmetoder, der er kendt inden for fagområdet.

Når derfor analytten fra prøven er blevet bundet med 25 sin monovalente bindingspartner i det mærkede reagens, f.eks. det monovalente fragment af antistoffet mod analytten, hindres ikke-specifik immobilisering af det opnåede kompleks af den immobiliserede analyt i reaktionslaget som følge af, at der ikke er et bindingssted til rådighed på det mærkede 30 reagens for den immobiliserede analyt. Efter at komplekset af analyt/mærket reagens er migreret ind i påvisningslaget, reagerer det mærkede reagens med det immobiliserede dermed reaktive påvisningsreagens. Reaktionen mellem komplekset af analyt og mærket reagens og det immobiliserede reagens kon-35 centrerer eller lokaliserer reaktionsproduktet i påvisningslaget til påvisning og måling af det derved tilvejebragte

DK 164943B

19 signal, enten visuelt eller ved hjælp af et passende instrument.

Som det vil blive beskrevet mere detaljeret nedenfor, undtagen for reflekterende lag og strålingsblokerende midler, 5 er de forskellige zoner eller lag og understøtninger i anordningen ifølge opfindelsen i de fleste tilfælde strålingstransmitterende. Sådanne zoner eller lag og understøtninger tillader effektiv passage af synligt lys, fluorescerende eller luminescerende emission, radioaktiv stråling og lig-10 nende. Valget af det særlige strålingstransmitterende materiale vil afhænge af den særlige stråling, der vælges til anvendelse sammen med et element, hvori materialet skal inkorporeres. Følgelig tillader dannelsen af det påviselige signal i påvisningslaget i den anordning, der er vist i 15 fig. 1, påvisning af signalet med det passende instrument rettet enten på påvisningslaget eller på reaktionslaget.

Det skal bemærkes, at eftersom det mærkede reagens i reaktionslaget ikke udviser et påviseligt signal på grund af den manglende indbyrdes reaktion med det dermed reaktive 20 påvisningsreagens i påvisningslaget, er der intet generende signal fra reaktionslaget under påvisning af det påviselige signal, der er dannet i påvisningslaget.

Påvisning af det signal, der dannes af reaktionsproduktet fra enten reaktionslaget eller påvisningslaget, kan 25 ske ved hjælp af et passende instrument, såsom et spektrofo-tometer, reflektometer, fluorometer eller luminometer. Når således påvisning er baseret på absorbens eller fluorescens, rettes energikilden fra et sådant instrument enten mod eller gennem reaktionslaget eller mod eller gennem påvisningslaget.

30 Når påvisningen på den anden side er baseret på luminescens, benyttes et passende instrument, som påviser en sådan luminescens, uden at der kræves nogen energikilde.

Under henvisning til tegningens fig. 2 omtales nu en prøveanordning, som ligner anordningen i fig. 1. Ved denne 35 udførelsesform omfatter prøveanordningen yderligere et reaktionslag nr. 2 anbragt mellem det første reaktionslag og

DK 164943 B

20 påvisningslaget. Det yderligere reaktionslag tillader inkorporering af en i prøven opløselig form af det mærkede reagens i prøveanordningen, og herved overflødiggøres anvendelse af blanding i forvejen af den flydende prøve og det mærkede 5 reagens, før påføringen på prøveanordningen eller en uafhængig påføring, såsom ved prøveanordningen i fig. 1. I reaktionslag nr. 1 er inkorporeret det i prøven opløselige mærkede reagens (vist som "mærket reagens"), der bliver opløst efter væske-kontakt med den flydende prøve, som diffunderer 10 ind i laget. I reaktionslag nr. 2 er inkorporeret den im-mobiliserede form for analytten (vist som " (-An"), og i påvisningslaget er inkorporeret den immobiliserede form af det indbyrdes reaktive påvisningsreagens (gengivet som " (-reagens"), som tidligere beskrevet.

15 Efter at den flydende prøve er påført det første reaktionslag, diffunderer den flydende prøve ind i dette lag, hvilket bringer eventuel analyt fra prøven i direkte væskekontakt med det mærkede reagens deri, medens samtidig det mærkede reagens opløses. Følgelig bliver eventuel analyt 20 fra prøven bundet med sin bindingspartner i det mærkede reagens, og det analyt/mærket-reagens-kompleks, som derved dannes, migrerer inde i og ud af det første lag og ind i det andet lag. Det skal bemærkes, at eventuelt ubundet mærket reagens i det første lag, dvs. overskydende mærket reagens, 25 også vil migrere inde i og ud af det første lag og ind i det andet lag. Eftersom bindingsstedet for analyttens monovalente bindingspartner i det mærkede reagens er blevet optaget af binding med analytten fra prøven, når denne først er i det andet lag, kan analyt/mærket-reagens-komplekset 30 migrere inde i og ud af det andet lag uden at blive immobi-liseret og ind i påvisningslaget. Når det mærkede reagens er i påvisningslaget, samvirker det med det imxnobiliserede samvirkende påvisningsreagens, der er inkorporeret deri, så at der produceres det tidligere beskrevne reaktionsprodukt.

35 Eftersom dog det ubundne mærkede reagens i det andet lag har et tilgængeligt bindingssted for den immobiliserede

DK 164943 B

21 analyt i det andet lag, bliver det mærkede reagens bundet dermed og immobiliseres derved og hindres i yderligere at migrere ind i påvisningslaget. Det herved fremkomne signal, der dannes af reaktionsproduktet, påvises derpå, måles og 5 korreleres med analytmængden fra prøven som tidligere beskrevet .

Selv om de forskellige lag i flerlagsanordningen ifølge opfindelsen kan være selvbærende, foretrækkes det, at sådanne lag er overtrukket eller på anden måde anbragt 10 på en understøtning. Understøtningen kan være uigennemsigtig, reflekterende eller transparent for lys eller anden energi og er forligelig med den tilsigtede signalpåvisning. Når således prøveanordningens kemiske sammensætning bevirker dannelse af et gasformigt produkt, der skal påvises med en 15 gasfølerelektrode, er understøtningen et væskepermeabelt lag i flydende kontakt med en sådan elektrode. Foretrukne understøtninger omfatter transparente understøtningsmaterialer, der kan transmittere elektromagnetisk stråling med en bølgelængde i området mellem ca. 200 nm og ca. 900 nm. Under-20 støtningen behøver naturligvis ikke transmittere over hele 200-900 nm-området, selv om det er ønskeligt for fluorome-trisk påvisning af analyseresultater gennem understøtningen at transmittere over et bredere bånd,eller alternativt at transmittere ved ekscitations- og emissionsspektrene 25 for de fluorescerende materialer, der anvendes til påvisning. Det kan også være ønskeligt, at understøtnin-: gen transmitterer over en smallere bølgelængdebåndbredde, der har reduceret transmission for tilstødende bølgelængder. Dette kan f.eks. ske ved at imprægnere eller dæk-3° ke understøtningen med et eller flere farvestoffer med passende absorptionskarakteristika.

Efter dannelse af det påviselige signal måles signalet i reglen med et passende instrument til refleksions-, transmissions-, fluorescens- eller luminescens-35 spektrofotometri. Udvælgelse af en passende understøtning vil derfor afhænge af påvisningsmetoden, dvs. om den er

DK 164943 B

22 transmitterende eller reflekterende.

En strålingstransmitterende eller -transparent understøtning tillader en energistråle/ såsom lys, at passere derigennem. Derpå reflekteres strålen, såsom fra 5 et strålingsblokerende lag, tilbage til instrumentets føler. Reflekterende pigmenter, såsom titandioxid, bariumsulfat eller zinkoxid, kan anvendes hertil. Polymere, der bliver røde, kan også anvendes, enten for sig eller med et reflekterende pigment inkorporeret for at forøge 10 reflektivitet eller andre egenskaber. Sådanne strålingsblokerende lag og midler er kendt og omfatter dem, der er beskrevet i US patentskrifterne nr. 4.042.335 og 4.255.384. Når der benyttes en uigennemsigtig eller reflekterende understøtning, rettes en energistråle gen-15 nem anordningens forskellige lag og reflekteres af det reflekterende lag tilbage til anordningens føler.

Således vises der i fig. 3 en flerlagsanordning med et første og et andet reaktionslag og et påvisningslag monteret eller på anden måde anbragt på en under-20 støtning. I det første lag er inkorporeret det mærkede reagens, der indeholder et i prøven opløseligt monovalent antistoffragment af et monoklonalt antistof, som tidligere beskrevet, med bindingsaffinitet for den analyt, der skal bestemmes, og som i forvejen er blevet mærket med et enzym 25 (gengivet som "Fab-enzym"), dvs. med en påviselig kemisk egenskab. I det andet lag er inkorporeret en immobiliseret form af analytten (gengivet som " f-An"), som vil binde og derved immobilisere eventuelt mærket reagens, som ikke bindes til analyt fra prøven, som tidligere beskrevet. I påvis-30 ningslaget er inkorporeret en immobiliseret form af et substrat for enzymet (gengivet som " |-substrat") , hvori komplekset af analyt og mærket reagens reagerer med det im-mobiliserede substrat, så at der derved dannes et reaktionsprodukt. Som tidligere beskrevet kan reaktiorisproduktet 35 dannes som en påviselig type, eller det kan dannes i en form, der kræver yderligere reaktion med endnu et stof.

DK 164943 B

23 såsom en indikator, for at give et påviseligt signal. I sidstnævnte tilfælde foretrækkes det at inkorporere en im-mobiliseret form af en sådan indikator for at lokalisere det derved frembragte signal i påvisningslaget.

5 Det skal bemærkes, at den understøtning , der benyttes sammen med flerlagsanordningen ifølge opfindelsen, kan være enten reflekterende, dvs. strålingsuigennemtrængelig, eller transparent, dvs. strålingstransmitterende. For således at måle den ønskede enzym/substrat-10 reaktion, når der benyttes en reflekterende understøtning, rettes en energistråle gennem det første og det andet reaktionslag og påvisningslaget, hvor strålen derpå reflekteres tilbage til instrumentets føler af den reflekterende understøtning. Arten af den stråle, der 15 passerer gennem de forskellige lag og reflekteres af understøtningen, påvirkes af mængden af det påviselige reaktionsprodukt i påvisningslaget, hvori en påviselig ændring i strålen korreleres med mængden af analyt i prøven.

20 I

Omvendt kræver en strålingstransmitterende eller: -gennemtrængelig understøtning, der tillader en energikilde at passere igennem, at strålen reflekteres, såsom fra et strålingsblokerende lag eller middel, tilbage til instrumentets føler. Når der følgelig anvendes en 25 sådan transparent understøtning i flerlagsanordningen ' ^ifølge opfindelsen, er det især nødvendigt at inkorporere et sådant strålingsblokerende lag i anordningen, fortrinsvis mellem det andet reaktionslag og påvisningslaget eller et blokerende middel i det andet reaktionslag.

30 Når man med en sådan anordning skal måle den ønskede en-zym/substrat-reaktion, rettes en energikilde gennem den transparente understøtning og ind i påvisningslaget, hvorved energikilden reflekteres tilbage gennem påvis-ningslaget og understøtningen af det strålingsblokerende lag eller middel og tilbage til instrumentets føler. Anvendelsen af en sådan anordning med en transparent un-

DK 164943 B

24 derstøtning og et strålingsblokerende lag eller middel er særlig ønskelig, når den flydende prøve omfatter et farvet stof, såsom røde blodlegemer, når den flydende prøve er helblod, i hvilket tilfælde det strålingsblokerende stof 5 eller lag hindrer interferens af farvningen af røde blodlegemer, som vil blive filtreret ud af og forblive i et lag over påvisningslaget.

De forskellige lag i flerlagsprøveanordningen ifølge opfindelsen er ikke begrænset til de lag og udformninger, 10 der er beskrevet ovenfor. Yderligere lag til brug ved flerlagsprøveanordningen er tidligere beskrevet og er kendt inden for fagområdet, hvilke lag forøger og/eller modulerer sådanne prøveanordningers funktion. Således kan der medtages en spredningszone eller -lag, der anbringes umiddelbart 15 over og op til det første reaktionslag. Spredningszonen måler og fordeler jævnt en påført flydende analyseprøve på det nedenunder liggende første reaktionslag. Sådanne spredningszoner eller lag er kendt inden for området og omfatter dem, der er beskrevet i US patentskrifterne nr. 3.992.158 20 og 4.427.632.

Anordningen kan også mellem de forskellige lag omfatte en mellemzone eller -lag, der fungerer som et kls&estof /eller sublag, der skal lette adhæsion mellem lagene og yderligere lette adhæsion af lage-25 ne til en fast understøtning. Der kan også anvendes mellemzoner eller -lag, som f.eks. indeholder reagenser, der skal fjerne forstyrrende stoffer, som kan hindre påvisning af noget af analytten, eller kan være en strålingsblokende zone eller lag, der maskerer zoner eller 30 lag i anordningen, for at hindre interferens ved påvisning af produktet. Der kan også anvendes sådanne strålingsblokerende lag, der maskerer tilstedeværelsen af forskellige forstyrrende stoffer, der findes i analyseprøver, såsom røde blodlegemer i helblod.

35 Undertiden foretrækkes det også at anbringe en reguleringszone eller -lag, der regulerer diffusionsha-

DK 164943 B

25 stigheden for de forskellige reagenser, der er inkorporeret i flerlagsprøveanordningen, gennem dennes forskellige lag. Sådanne reguleringszoner eller -lag er inkorporeret i prøveanordningen for at tilvejebringe regule-5 rede inkubationstider og reaktionsserier eller for at lette anordningens fremstilling ved at hindre for tidlig indbyrdes reaktion mellem anordningens reagenser.

Anordningen ifølge opfindelsen kan også være en fler-zoneanordning med reaktionszoner og påvisningszoner og lig-10 nende samlet i en udformning, der er særlig egnet til chro-matografisk analyse. En sådan anordning omfatter en absorberende region, der kan nedsænkes i den flydende prøve, idet prøven vil diffundere i opadgående retning ind i de forskellige zoner.

15 Zonerne i en sådan flerzoneanordning kan foreligge i form af reagenspuder, der er monteret på en plastunderstøtning, der kan nedsænkes eller dyppes i en flydende prøve.

De zonedannende reagenspuder er anbragt på understøtningen ende mod ende, hvor deres ender er i flydende strømningskon-20 takt med hinanden. Især omfatter sådanne reagenspuder en nederste pude eller zone, der kan absorbere flydende prøve, første og anden reagenspude eller -zoner og en påvisningspude eller -zone anbragt over den anden reaktionszone.

Det skal bemærkes, at reaktions- og påvisningszoneme 25 i sig har inkorporeret de forskellige reagenser, der tidligere er beskrevet for flerlagsanordningen, og udfører de samme funktioner. Ved denne udførelsesform nedsænkes imidlertid den nederste absorberende pude i flerzoneanordningen i den flydende prøve i stedet for, at en flydende analyse-30 prøve påføres anordningen. På denne måde fungerer den absorberende pude som væge for henholdsvis prøvens absorption og dens opadgående diffusion ind i den første zone, den anden zone og påvisningszonen. Anordninger udformet som beskrevet i US patentskrifterne nr. 4.301.139 og 4.361.537, ved hvilke 35 der benyttes en fremkaldende væske, kan også tilpasses til den foreliggende opfindelse. Som tidligere beskrevet bindes

DK 164943 B

26 analyt fra prøven, der diffunderer ind i den første reaktionszone, med det deri inkorporerede, mærkede- reagens, og det derved dannede kompleks fortsætter med at migrere gennem den anden reaktionszone og ind i påvisningszonen, hvor ana-5 lyt/mærket-reagens-komplekset reagerer med det samvirkende påvisningsreagens, der er immobiliseret deri, så at der derved dannes et reaktionsprodukt til yderligere påvisning og måling deraf. På lignende måde migrerer eventuelt mærket reagens i den første zone, der ikke er bundet af analyt fra 10 prøven, ind i den anden reaktionszone, hvor det immobiliseres af den deri inkorporerede immobiliserede form af analytten.

Ifølge den foreliggende opfindelse omfatter de her beskrevne forskellige lag en porøs matrice, der er permeabel for i det mindste nogle komponenter i en væskeprøve, f.eks.

15 antigener, haptener og/eller antistoffer, idet en sådan permeabilitet i reglen stammer fra porøsitet, evne til at kvælde eller andre karakteristika. Matricematerialet kan omfatte forskellige porøse fibrøse materialer, såsom cellulose, papirsorter, uldfibre, filt, vævede stoffer og lig-20 nende, hvadenten de består af naturlige eller syntetiske materialer. Sådanne materialer er f.eks. beskrevet i US patentskrifterne nr. 3.802.842, 3.809.605, 3.897.214 og 3.987.214. Andre porøse, men ikke-fibrøse materialer omfatter mikroporøse polymere som dem, der er omtalt i US patentskrift 25 nr. 3.552.929.

Fortrinsvis er de matricedannende materialer i de forskellige lag i flerlagsprøveanordningen ifølge opfindelsen permeable materialer, såsom gelatine, agarose og lignende. Sådanne materialer tillader passage af 30 væsker ved diffusion frem for ved kapillær strømning som med fibrøse, porøse materialer, såsom papirsorter eller vævede materialer. Selv om de porøse, fibrøse materialer, der er beskrevet ovenfor, kan anvendes, fortrækkes især gelatine, agarose og lignende på grund af deres ens-35 artede permeabilitet over for væsker samt deres evne til at lade lys eller anden elektromagnetisk stråling passe-

DK 164943 B

27 0 re. Når man kender den flydende prøve, der analyseres, vil valg af passende materiale være indlysende for en fagmand.

Der kendes inden for fagområdet forskellige fremgangsmåder til immobilisering af analyt i prøvean-5 ordningen ifølge opfindelsen, eller der kan fremstilles et derivat eller passende analog af analytten for at lette dennes immobilisering i prøveanordningen. Selv om immobilisering ved hjælp af covalent binding af analytten eller dennes analog foretrækkes, kan også andre 10 midler, ved hvilke der benyttes ikke-covalent associering, såsom ionbytning eller adsorption, anvendes... Ana-lytimmobilisering kan f.eks. ske ved direkte inkorpore1· ring i anordningens bærermatrice, såsom cellulose i pa-pir eller i gelatine eller agarose i film. Alternativt kan analytanalogen bindes til en polymer bærer, som derpå inkorporeres i anordningens matrice, idet polymeren har en tilstrækkelig størrelse til at hindre væsentlig diffusion mellem bindings- og påvisningslag. I gelatine 2o vil f.eks. polymere med en molekylvægt på over 10.000 udvise ubetydelig diffusion gennem gelatinematricen. Ligeledes vil i agarose polymere med en molekylvægt på mere end 2.000.000 være afskåret fra at diffundere gennem matricen. Analytten kan også bindes direkte eller ved hjælp af en polymergrundkæde til meget små partikler, såsom 25 polystyren-mikroperler, som derefter kan inkorporeres i anordningens matricer. Sådanne partikler er let tilgængelige inden for et interval af størrelser og omfatter po-lystyren, mikrokrystallinsk cellulose, tværbundne dekstra-ner og. tværbundne agaroser, ionbytterharpikser og lignen-

wU

de. En lang række forskellige kemiske metoder står til rådighed, når midlerne skal kobles på bæreren. Således kan vandopløselige carbodiimider anvendes til at aktivere frie carboxylgrupper til efterfølgende reaktion med 3g nucleofiler, herupder forskellige aminforbindelser. Amidrester eller perler kan ved reaktion med hydrazin omdannes til hydrazider, som videre kan omsættes med bifunk-

DK 164943 B

28 o tionelle reagenser, såsom glutaraldehyd, 1,5-difluorni-trobenzen, 4 ,'4 '-difluor-3,3 1-dinitrophenylsulfon, 2,4-di-chlor-6-carboxymethyl-amino-5-trazin, dimethylaa pimidat eller dimethylsuberimidat, efterfulgt af omsætning med aminer eller andre nuclecfiler bundet til den pågældende analyt 5 eller analog; hydrazider kan omdannes til azidgrupper ved omsætning med salpetersyrling via en diazoterings-reaktion; hydrazider kan omsættes med ravsyreanhydrid til inkorporering af carboxylatgrupper med en afstandsarm; aliphatiske aminer eller partikler kan også omsæt-10 tes med bifunktionelle reagenser, der er analoge med hy-drazidkemien, herunder anvendelse af heterobifunktionel-le tværbindingsmidler, der tillader, at der til aminerne bindes funktionelle grupper med varierende specificiteter, såsom en maleimidgruppe, der udviser forøget spe-15 cificitet for sulfhydryIderivater; hydroxylgrupper kan aktiveres ved hjælp af cyanogenbromid, tosylchlorid, carbonyldiimidazol eller p-nitrophenylchlorformiat; partikler, såsom polystyren, kan nitreres, nitrogrupperne reduceres til aromatiske aminer, og de aromatiske aminer 20 kan diazolyseres før omsætning med en nucleofil-analyt/a-nalog, der er af interesse. Nitrocellulose, diazobenzo-xymethyl-(DMB)-papir, derivatiseret nylonnet eller papir, der er aktiveret med cyanogenbromid, o-nitrophenylchlor-formiat eller carboxyldiimidazol kan også anvendes til 25 at binde nucleofile reagenser eller reagenser bundet til reaktive polymere.

Som et alternativ til direkte binding af et :passende bindingsreagens med et materiale, der er immo- i :biliseret i reaktionslaget, kan man også drage fordel af 30 specifikke bindingspartnere til at opnå den nødvendige immobilisering in situ under udførelse af analysen. Materialet, der skal immobiliseres, dvs. analytten eller en analog eller bindingspartner, kan omfatte eller modificeres til at omfatte et bindingssted for et distinkt 35 bindingsstof, som igen kan imobiliseres i reaktionslaget.

Det immobiliserbare materiale kan således anbringes på et hvilket som helst passende sted i anordningen, og

O

DK 164943B

29 det vil efter udførelse af analysen resultere i en passende immobilisering. Indbyrdes bindingsreaktioner, som. tidligere beskrevet til immobilisering af det mærkede reagens i påvisningslaget, kan benyttes. På lig-5 nende måde kan de metoder, der er beskrevet ovenfor til immobilisering af analyt,også i reglen anvendes til immobilisering af de forskellige påvisningsreagenser eller derivater deraf.

Ved prøveanordningen ifølge opfindelsen kan der 10 anvendes flere reaktionslag, som er samlet, så at de tillader væskekontakt mellem op til hinanden liggende lag, som tidligere beskrevet. De forskellige lag kan fremstilles ved hjælp af filmdannere, så at der fremstilles efter hinanden følgende^ på hinanden liggende overtræk, 15 eller fremstilles ved hjælp af overlejrede lag af fibrøs reagensmatrice, såsom filtrerpapir, glasfiber eller vævet polyester. Alternativt kan op til hinanden liggende zoner udformes til et chromatografiformat, hvor hver zone er fastgjort på understøtningen, idet kanterne på 20 hver reaktionszone er i direkte væskekontakt som tidligere beskrevet.

Flere papirlag kan f.eks. sammenstilles med en omsluttende plastramme eller alternativt med et for væske gennemtrængeligt trådnet eller ved inkorporering 25 af et vandopløseligt klæbestof mellem lagene. Støbningen af flerlagsfilm kan ske ved hjælp af en række metoder inden for filmstøbning, herunder anvendelse af rakel, ekstrusionsovertrækker, "Meyer-rod", puddelovertrækker eller gravureovertrækker. Alternativt kan flere på hin-30 anden følgende lag støbes med en kaskadeovertrækker.

Filmlag, der er dannet ved de ovennævnte metoder, kan dækkes med et stof- eller netmateriale indeholdende re- % agenser, der inkuberes i et forud bestemt tidsrum.

Analyt 35 Den foreliggende analyse kan anvendes til på visning af en hvilken som helst analyt, hvortil der fin-

DK 164943 B

30 o des en bindingsmodpart. Analytten er i regien er peptid, polypeptid, protein, carbonhydrat, glycoprotein, steroid, nucleinsyre eller andet organisk molekyle, hvortil der findes en bindingsmodpart, eller som kan produ-5 ceres i biologiske systemer eller kan syntetiseres. A-nalytten vælges funktionelt udtrykt i reglen i gruppen, der omfatter antigener og antistoffer derimod, haptener og antistoffer derimod, komplementære polynucleotidse-kvenser, samt hormoner, vitaminer, metaboliter og far-10 makologiske midler og disses bindingsmodparter. I reglen er analytten et immunologisk aktivt polypeptid eller protein, i reglen med en molekylvægt mellem ca.

1000 og ca. 10.000.000, såsom et antistof eller antigent polypeptid eller protein, eller et hapten med en 15 molekylvægt på mindst ca. 100 og i reglen mindre end 1500.

Repræsentative polypeptidanalytter er angiotensin I og II, C-peptid, oxytocin, vasopressin, neuro-physin, gastrin, secretin, bradykinin og glucagon.

20 Repræsentative proteinanalytter omfatter klas serne af protaminer, mucoproteiner, glycoproteiner, glo-buliner, albuminer, scleroproteiner, phosphoproteiner, histoner, lipoproteiner, chromoproteiner og nucleopro-teiner. Eksempler på specifikke proteiner er præalbumin, 25 α^-lipoproteiner, humant serumalbumin, α^-surt glyccprotein,. a^-antitrypsin, α^-glycoprotein, transcortin, thyroxiitoindingsglo^-bulin,'haptoglobin,. haaroglobin, nyoglcbulin, ceruloplasmin, a2-makro-globulin, β-lipoprotein, erythropoietin, transferrin, hæmopexin, fibrinogen, immunglobulinerne, såsom IgG,

30 IgM, IgA, IgD og IgE og disses fragmenter, f.eks. F

w og F^, komplementfaktorer, prolactin, blodkoagulations faktorer, såsom fibrinogen, thrombin osv., insulin, , \ melanotropin, somatotropin, thyrotropin, follikel-stimulerende hormon, leutiniserende hormon, gonadotropin, thyu 35 roid-stimulerende hormon, placenta-lactogen, intrinsic faktor, transcobalamin, serumenzymer, såsom alkalisk

O

DK 164943 B

31 phosphatase, mælkesyredehydrogenase, amylase, lipase, phosphataser, cholinstearase, glutaminsyreoxaloeddike-syretransaminase, glutaminsyre-pyrodruesyretransaminase og uropepsin, endorphiner, enkephaliner, protamin, vævs-s antigener, bakterielle antigener og virale antigener, såsom med hepatitis associerede antigener (f.eks, HB Ag,

S

HB Ag og HB Ag).

C c

Repræsentative haptenanalytter omfatter de almene klasser af medikamenter, metabolitter, hormoner, vitaminer, toxiner og lignende organiske forbindelser. Hapteniske hormoner omfatter thyroxin og triiodthyronin. Vitaminer omfatter vitaminerne A, B, f.eks. 8^2' C, D, E og K, folinsyre og thiamin. Medikamenter omfatter antibiotics, såsom aminoglycosider, f.eks. gentamicin, to- _ bramycin, amikacin, sisomicin, kanamycin og netilmicin, 15 penicillin, tetracyclin, terramy.cin, chlormycetin og ac-tinomy.cin, nucleosider og nucleotider, såsom adenosin-diphosphat (ADP), adenosintriphosphat (ATP), flavinmono-nucleotid (FMN) , nicotinamidadenindinucleotid (NAD) og 2Q dets phosphatderivat (NADP) , thymidin, guanos in og ade-nosin; prostaglandiner; steroider, såsom østrogenerne, f.eks. østriol og østradiol, sterogener, adrogener, di-goxin, digitoxin og adrenocorticale steroider; og andre, såsom phenobarbital, phenytoin, primidon, ethosuximid, carbamazepin, valproat, thaophyllin, caffein, propranolol, procainamid, quinidin, amitryptilin, cortisol, desipramin, disopyramid, doxepin, doxorubicin, nortryptilin, metho-trexat, imipramin, lidocain, procainamid, N-acetylpro-cainamid, amphetaminer, catecholaminer og antihistaminer.

30 Toxiner omfatter acetyl-T-2-toxin, alfatoxiner, chole-ratoxin, citrinin, cytochalasiner, staphylococ-entero-toxin B, HT-2-toxin og lignende.

Væskeprøve Væskeprøven, der indeholder den analyt, der 3g skal bestemmes, kan være en naturligt forekommende eller kunstigt frembragt væske, der mistænkes for at in-

DK 164943 B

O

32 deholde analyt, og er i reglen en biologisk væske eller en fortynding deraf. Biologiske væsker, hvorfra en analyt kan bestemmes, omfatter serum, helblod, plasma, urin, spyt og amniotiske og cerebrospinale væsker.

5 Opfindelsen vil i det følgende blive belyst ved hjælp af eksempler.

Eksempel 1 10 Fremstilling af énzymmærket antistof_

Ascitesvæske indeholdende et ånti-digoxin-an-tistof (ca. 6 mg/ml) fortyndes 5 gange i 0,1 molær citratpuffer, pH 3,5, og inkuberes med en 1:50 (væ/væ) pepsin/antistofopløsning i 48 timer ved 37°C. Efter 15 koncentration til ca. 5 ml ved ultrafiltrering over en "Amicon" PM30-membran (Amicon’ Corp., Danvers, MA, USA), gelfiltreres prøven på en "Sephacryl1® S-300-(Pharmacia,

Inc., Piscataway, N.J., USA)-kolonne (2,4 x 90 cm) og bringes i ligevægt med 10 mmolær natriumphosphat og 0,15 20 molær natriumchlorid (pH 7,2) for at isolere F(ab')2“ ‘ — *» -fragmentet i antistoffet. Antistoffet reduceres med 10 mmolær dithiothreitol, og proteinspidsen slås sammen efter afsaltning på en "P-6DG"-polyacrylåmidgelharpiks (Bio-Rad Co. Richmond, CA 94804) umiddelbart før reaktion med 25 aktiveret β-galactosidase. β-Galactosidasen (type IX,

Sigma Chemical Co., St, Louis, MO, USA) dialyseres mod 50 mmolær natriumphosphat, pH 7,4. En opløsning ved 10 mg/ml omsættes med et heterobifunktionelt tværbindingsmiddel , succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-30 -carboxylat, i to timer ved stuetemperatur, og dette materiale ledes over en 1 x 60 cm "P-6DG"-kolonne. Den aktiverede β-galactosidase blandes med antistoffet i forholdet 1:3 og omsættes i 20 timer ved 4°C. Dette materiale koncentreres ca. 10 fold ved ultrafiltering over en "Ami-35 con PM30"-membran. Koncentratet ledes over en 1,5 x 110 cm "ACA 22"-harpiks (LKB Instruments, Inc., Gaithersburg,

O

DK 164943B

33 MD, USA) for at adskille Fab-S-galactosidase fra frit antistoffragment (Fab) og fra højere substituerede oli-gomere af Fab og β-galactosidase. De vigtigste enzym/-antistoffraktioner slås sammen og ledes over en affini-5 tetskolonne, der indeholder immobiliseret ouabain. Når den immobiliserede ouabainkolonne skal fremstilles, bindes ouabain til okseserumalbumin på lignende måde som beskrevet af Smith m.fl., Biochem. 9, 331-337 (1970). Ouabain-BSA bindes til "Sephadex1® G-25 (Pharmacia, Inc., to Piscataway, NJ, USA) efter periodatoxidation ved hjælp af kendte metoder [N. Wilson og P. Nakane, J. of Immunol. Methods 12, 171-181, 1976)]. Prøven, der indeholder Fab--β-galactosidase, ledes over en 1 x 10 cm kolonne af affinitetsharpiks. Fri β-galactosidase elueres fra kolonis nen og efterfølges af en eluerende opløsning indeholdende 20 mmolær ouabain for at frigøre antistof/enzym-kon-jugatet fra kolonnen. Fem kolonnevoluminer vaskes igennem og slås sammen, og dette koncentreres til 2 ml og dialyseres i 20 timer mod 10 skift phosphat-saltvandsop-20 løsningspuffer (50 mmolær natriumphosphat, 0,1 molær na-triumchlorid, pH 7,4).

Eksempel 2

Fremstilling af dét immobiliserede analytlag 25 "Whatman" 31-ET-(Whatman, Inc., Clifton, N.J., USA)-papir aktiveres for efterfølgende derivatisering med para-nitrophenylchlorformiat -(NPCF). Papirark nedsænkes i 15 minutter i destilleret vand, vandet dekanteres derpå, og papiret skylles med 6 på hinanden 30 følgende voluminer acetone, for at fjerne frit vand.

Derpå nedsænkes papiret i en 10%'s opløsning af NPCF i acetone, inkuberes i seks timer, og derpå fjernes uomsat NPCF ved flere på hinanden følgende skylninger med acetone. Skylleopløsningen afprøves for tilstedeværelse 35 af formiat ved at tilsætte lOO^uliter IN NaOH til 300 ^uliter skylleopløsning. Skylningen fortsættes med tre n

O

DK 164943 B

34 voxuminer acetone, indtil der ikke er nogen påvisexxg gul farve, efterfulgt af vask med 1 liter destilleret vandlog vaskes derefter med 5 x 100 ml voluminer acetone, og opløsningsmidlet fjernes ved lufttørring.

5

Eksempel 3

Fremstilling af immobiliseret substratlaq 3,7 g "Whatman" 31-ET-papir inkuberes med 2 g 1,11-carbonyldiimidazol i 100 ml acetone i én time ved 10 stuetemperatur med lejlighedsvis omrøring. Papiret vaskes med 3 x 200 ml voluminer acetone og tørres ved 50°C i ca. 10 minutter (eller indtil der ikke er nogen påviselig acetonelugt) og opbevares med silicageltørre-middel ved 4°C indtil senere anvendelse. Derpå omsæt-15 tes papiret med β-galactosidase-substrat, der indeholder en aktiv amin, β-galactosyl-umbelliferoni-aminohexyl (jfr. US patentskrift nr. 4.259.233). 50 mg substrat reagens opløses i 20 ml DMSO og tilsættes til 1 g aktiveret papir. Efter 15 minutter tilsættes 20 ml isopro-20 panol, og reaktionen fortsætter i seks timer ved stuetemperatur med lejlighedsvis omrøring. Opløsningsmidlet dekanteres, og papiret vaskes med 3 x 100 ml voluminer isopropanol. Der tilsættes en alikvot mængde isopro-panol på 200 ml indeholdende 2 ml ethanolamin og omsæt-25 tes i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af tre gange vask med 200 ml isopropanol. Papiret efterlades natten over ved stuetemperatur i 200 ml isopropanol.

Næste dag dekanteres opløsningsmidlet, og tiloversblevet opløsningsmiddel fjernes ved tørring ved 50°C i 15 30 minutter.

Eksempel 4

Enzym/antistof-konjugatlag "Whatman" 54-papir dyppes gennem en opløsning 35 indeholdende 10 mg/ml anti-digoxin-Fab^-galactosidase i en 0,6 molær natriumphosphatpuffer, pH 7,4, og tørres ved 40°C i 20 minutter.

35

DK 164943 B

O

Eksempel 5

Samling af flerlagsanordningen

En sammensat strimmelanordning samles af de tre reagenselementer, der er beskrevet ovenfor. Konju-gatlaget lamineres på en dobbeltsidig klæbestrimmel (3M Company, St. Paul, MN, USA) og skæres i 1 cm brede og 12,7 cm lange bånd. Dette materiale lamineres derpå på og langs med længden af en kant på den ene overflade af en 8,3 cm bred og 12,7 cm lang klar polystyrenunderstøtning ("Trycite1®, Dow Chemical Co., Midland, MI, USA). En 1-2 mm strimmel dobbeltsidig klæbestrimmel monteres langs med bagkanten af substratlaget, og et 1 cm bredt bånd af reagenspapir indeholdende den immobiliserede analyt-analog monteres derpå ved hjælp af strimlen af dobbeltsidig klæbestrimmel. Ovenstående fremgangsmåde genta-15 ges for at montere båndet af reagenspapir indeholdende enzym-antistof-konjugatet. Den opnåede flerlagsanordning opskæres i 5 mm brede og 8,3 cm lange reagensstrimler, hvor de forskellige lag er monteret på 2Q enderne af strimlerne.

Eksempel 6

Anordningens funktion

En prøve af normalt humanserum fortyndes til 25 5 nmolær med digoxin. Der fremstilles en række koncen trationer fra 0,2 til 5,0 nmolær digoxin ved fortynding af stamreageriset med normal humanserum. En 80yUliter alikvot mængde prøve påføres på prøveanordningen for at indlede prøven. Prøveanordningen monteres i et refleks-30 fotometer, der belyser bunden af reagenspuden med et hvidt lys fra et optisk fiberbundt monteret i en vinkel på 45° fra pudens vinkelrette. Reflekteret lys påvises af et optisk fiberbundt monteret vinkelret på puden, der bærer lyset til et 405 nm-interferensfilter (3 hul-35 rum, Ditric Optics, Inc., Hudson, MA, USA) med associeret påvisningselektronik. Ændringen i refleksions-

O

36

DK 164943 B

koefficienten følges med tiden og relateres til koncentrationen af påført digoxin.

5 10 15 20 25 30 35

Claims (10)

1. Multizoneprøveanordning til en specifik bindings-bestemmelse af en analyt i en flydende prøve, der indebærer enten: 5 a. konkurrende binding mellem en analyt (A) og en mærket analyt/analytanalog (A1), hvor A og A1 bindes til en immobiliseret bindingspartner (Bim), hvorefter koncentrationen af fri (A') bestemmes ved hjælp af et påvisningsreagens, så der produceres et påviseligt 10 signal, eller: b. konkurrerende binding mellem en analyt (A) og en immobil iseret analyt/analytanalog (Aim), hvor A og Aim bindes til en fri, mærket bindingspartner (B'), hvorefter koncentrationen af frit B' bestemmes ved 15 hjælp af et påvisningsreagens, så der produceres et påviseligt signal, kendetegnet ved, at prøveanordningen omfatter: 1. en reaktionszone indeholdende en fast porøs matrice, hvori der er inkorporeret den immobiliserede bin- 20 dingspartner (Bim) eller den immobiliserede analyt/- analytanalog (Aim) og 2. en påvisningszone indeholdende en fast porøs matrice, hvori der er inkorporeret en immobil iseret form af mindst den ene komponent af påvisningsreagenset. 25

2. Prøveanordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at påvisningsreagenset, der er immobiliseret i påvisningszonen, deltager i en kemisk reaktion med det mærkede reagens til fremstilling af et produkt, der tilveje- 30 bringer det påviselige signal, og hvor den påviselige kemiske gruppe i det mærkede reagens er en enzymatisk aktiv gruppe, fortrinsvis (i) et enzym eller (ii) et substrat eller en cofaktor for et sådant enzym, hvor den immobiliserede påvisningskomponent udgør den anden del. 35

3. Prøveanordning ifølge krav 1 eller 2, kende- DK 164943 B 38 tegnet vedf at den påviselige kemiske gruppe i det mærkede reagens er et enzym, og at den immobiliserede påvisningskomponent er et chromogent, fluorogent eller kemilumi-niscerende substrat derfor. 5

4. Prøveanordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den påviselige kemiske gruppe i det mærkede reagens er en polymerrest, hvortil der er knyttet internt-blokerede sammensatte fluore- 10 sceringsmidler, og at den immobiliserede påvisningskomponent er et enzym, der virker således på fluoresceringsmiddel-po-lymerresten, at det fraspalter og frigør ublokerede fluorescer ingsmiddelmolekyler .

5. Prøveanordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at den immobiliserede påvisningskomponent gennemgår en kemisk reaktion med det mærkede reagens til dannelse af et immobiliseret produkt, der tilvejebringer det påviselige signal. 20

6. Prøveanordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det påviselige produkt er uopløseligt, eller det påviselige produkt er opløseligt, og at påvisningszonen yderligere indeholder et 25 immobiliserende middel for et sådant opløseligt produkt.

7. Prøveanordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at den påviselige kemiske gruppe i det mærkede reagens omfatter et fluore- 30 sceringsmiddel, fortrinsvis en polymerrest, der bærer sammensatte fluoresceringsmidler, og at påvisningskomponenten, der er immobiliseret i påvisningszonen, er et blokeringsmiddel for det mærkede reagens' fluorescens.

8. Prøveanordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at påvisningskom- DK 164943 B 39 ponenten er immobiliseret i påvisningszonen ved at være covalent koblet til den deri værende matrice eller ved at være bundet til et polymert stof med høj molekylvægt dis-pergeret i matricen. 5

9. Prøveanordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at analyttens bindingspartner er et antistof eller et fragment deraf.

10. Prøveanordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, kendetegnet ved, at reaktions- og påvisningszonen foreligger i form af lag i flydende strømningskontakt, og at prøveanordningen yderligere omfatter et reagenslag omfattende en fast, porøs matrice, hvori der er 15 inkorporeret en i prøven opløselig form af det mærkede reagens, og at en understøtning er anbragt på den side af påvisningslaget, der vender bort fra reagenslaget.