DK165932B - Anordning og fremgangsmaade til hurtig kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af tilstedevaerelsen af en reaktiv ligand i et fluidum - Google Patents

Description

i

DK 165932B

Den foreliggende opfindelse angår en anordning og en fremgangsmåde til hurtig kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af en reaktiv ligand, som er til stede i et fluidum. Opfindelsen anvendes mere specielt, men ikke udelukkende, til bestemmelse af tilstedeværelsen af antistoffer el-5 ler antigener i et biologisk fluidum, til påvisning af toksiske substanser, virus eller bakterier i et hvilket som helst fluidum (vand, flydende produkter fra landbrug/levnedsmiddelindustrien, industrielt spildevand, biologiske fluider, etc.....), til kemisk analyse af substanser (såsom hormoner, vitaminer, enzymer, lægemidler, etc. ...), som er til 10 stede i et fluidum (især biologisk).

Fremgangsmåder til bestemmelse af tilstedeværelsen eller koncentrationen af antigeniske substanser i biologiske fluider ad immunologisk vej er idag velkendte. De er baseret på dannelsen af et kompleks af den antigeniske substans, der skal bestemmes, og ét eller flere antistoffer, 15 idet en af kompleksets bestanddele kan være mærket med et radioaktivt 125 stof (såsom for eksempel I) til muliggørelse af dens påvisning og/el-ler kvantitativ analyse deraf efter adskillelse af det kompleksbundne antigen eller mærkede antistof fra antigenet eller det mærkede antistof, som ikke indgår i komplekset.

20 Ved fremgangsmåder til immunologisk bestemmelse ved kompetitiv re aktion indgår den antigeniske substans, som er indeholdt i fluidumprøven, som skal analyseres, i konkurrence med en kendt mængde mærket antigen om et begrænset antal fikseringssteder for antistoffet: mængden af mærket antigen bundet til antistof er omvendt proportional med mængden 25 af antigen indeholdt i prøven.

Immunometriske tests anvender et mærket antistof: mængden af mærket antistof, som indgår i komplekset er proportional med mængden af antige-nisk substans indeholdt i prøven.

Immunometriske tests, som i særdeleshed er egnede til påvisning af 30 polyvalente antigener, dvs. antigeniske substanser, som er i stand til at danne kompleks med mindst to antistoffer på én gang, består i anvendelsen af en mængde ikke-mærket antistof bundet til en fast bærer, som er uopløselig i væsken, der skal analyseres, og en mængde opløseligt antistof, som bærer en indikator, såsom en radioaktiv isotop, som muliggør 35 påvisning eller kvantitativ bestemmelse af det ternære kompleks dannet af antistoffet i fast fase, antigenet og det mærkede antistof. Ved disse fremgangsmåder bringes anstistoffet, som er bundet til den faste fase, først i kontakt med prøven, som skal analyseres, for at ekstrahere anti-

DK 165932 B

2 genet fra prøven ved dannelse af et binært kompleks mellem antistoffet i fast fase og antigenet. Efter en inkubationstid vaskes den faste bærer for at fjerne remanensen af fluidumprøven, indbefattende eventuelt antigen, som ikke har reageret, og bringes derefter i kontakt med en opløs-5 ning indeholdende en kendt mængde mærket antistof. Efter en anden inkubationsperiode til muliggørelse af, at det mærkede antistof kan danne kompleks med antigenet, som er bundet til den faste bærer, ved hjælp af det ikke-mærkede antistof, vaskes den faste bærer endnu en gang til fjernelse af mærket antistof, som ikke har reageret, hvorefter tilstede-10 værelsen af mærket antistof på den vaskede faste bærer påvises (for eksempel ved måling af emitteret stråling, hvis indikatoren er et radioaktivt stof) og underkastes eventuelt en proces til kvantitativ bestemmelse.

Disse metoder er kendte under navnet "sandwich" eller "bi-site" 15 metoder på grund af, at antigenet har to antistoffer bundet til sin overflade på to forskellige steder. Disse metoder er beskrevet af WIDE i "Radioimmuno Assay Methods" (Kirkham og Hunter, E. og S. Livingstone,

Ed., Edinburgh, 1970, p. 199-206). Specifikke anvendelser (test til påvisning af antigen knyttet til hepatitis) er beskrevet i US patentskrift 20 nr. 3.867.517. Varianter af disse metoder ("simultane" eller "inverse") er beskrevet af Jeong et al. i "Comparison of RIA with a singleincubation two-site immunoradiometric assay (IRMA) as applied to the determination of human thyroid stimulating hormone (HTSH)", Bio-Rad Laboratories, 1979; i US patentskrift nr. 4.174.384 (mærkning af to an-25 ti stoffer med en fluorescerende kromofor (fluorescein) og med en kromo-for, som absorberer det lys, som emitteres af fluoresceinen), samt i US patentskrift nr. 4.098.876. Disse metoder anvendte i begyndelsen poly-klonale antistoffer, hvis følsomhed er utilstrækkelig på grund af eksistensen af en krydsreaktivitet med andre antigener. Fransk patentskrift 30 HYBRITECH nr. 81 15030, offentliggjort under nr. 2.487.983, foreslår, at man i disse immunometriske tests erstatter de polyklonale antistoffer med monoklonale antistoffer for på væsentlig måde at forøge disse metoders følsomhed.

Fransk patentskrift LIOTTA nr. 82 16973, offentliggjort under nr.

35 2.514.511, beskriver en anordning og en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af antigener i biologiske fluider ved ELISA metoden, idet man helt eliminerer de fortyndings- og vaskeoperationer, som den nødvendiggør, og reducerer varigheden af inkubationsperioden. Den fore- 3

DK 165932B

slåede anordning omfatter en matrix dannet af en papirstrimmel af nitrocellulose eller diazobenzyloxymethyl (DBM), en porøs gel såsom poly-acrylamid, agarose eller kollagen, i hvis porer antigenet kan være opfanget, eller det kan være tværbundet med gelen ved hjælp af ligandens 5 amingrupper og matrixens carboxylgrupper, eller også af en strimmel af cellulose eller af fibre af plastmateriale, inden i hvilke der er opfanget partikler eller kugler indeholdende liganden. Ifølge dette LIOTTA patentskrift omfatter anordningen: en første zone, som indeholder antigener og antistoffer bundet til et enzym, idet disse antistoffer er pi a -10 ceret således i nævnte første zone, at de vil blive fjernet fra denne første zone, når de har reageret med antigener (ikke bundne), som er indeholdt i analyseprøven, som passerer igennem denne første zone, men således, at de ikke vil blive elimineret ved fravær af sådanne antigener -og en anden zone, som indeholder en substans, som er i stand til at rea-15 gere med de nævnte antistoffer, som er bundet til et enzym, til frembringelse af en farvereaktion, som viser tilstedeværelsen af de nævnte antistoffer. På særlig vis omfatter den immunologiske analyseanordning, som beskrives i LIOTTA patentskriftet, en lagdelt matrix med tre porøse lag, af hvilke det første er imprægneret med et specifikt antistof bund-20 et til et enzym, det andet porøse lag indeholder et immobil iseret referenceantigen (bundet), og det tredie lag indeholder et substrat, som frembringer en farve, som reagerer med enzymet, som er bundet til antistoffet. Når det i analyseprøven tilstedeværende frie antigen, som skal måles, er bragt i kontakt med det første lag, diffunderer det ind i det 25 andet og derefter ind i det tredie lag. Det i prøven tilstedeværende frie antigen konkurrerer med det bundne referenceantigen, som er immobi-1 i seret i det andet lag, om at forene sig med det til et enzym bundne antistof. Hvis antistoffet, som er bundet til et enzym, forener sig med det frie antigen, diffunderer det frit ind i det tredie lag og frem-30 bringer en farvereaktion. Hvis analyseprøven derimod ikke indeholder antigen, har alle antistoffer, som er bundet til et enzym, frie bindingspositioner og forener sig med det i det andet lag tilstedeværende immobil iserede antigen; det til et enzym bundne antistof, som forener sig med det i det andet lag immobil i serede antigen, diffunderer ikke ind i 35 tredie lag, og der frembringes ikke nogen farvereaktion. Det franske patentskrift LIOTTA nr. 87 08007, offentliggjort under nr. 2.599.845, beskriver en variant af denne anordning, som kun omfatter to lag, af hvilke det øvre lag bærer antigenet med de to reaktive antistoffer, og det 4

DK 165932B

nedre lag indeholder et kromogent substrat, idet de to zoner, indfangningszonen og substratzonen, også kan være sideordnede. De porøse lag, gennem hvilke antigenet fra prøven diffunderer forenet med det til et enzym bundne antistof, optræder altså som et selektivt filter, som kun 5 lader antigen passere, som er forenet med antistof, der er mærket med et enzym, men det virker ikke, hvis antistoffet ikke er forenet med antigen, dvs. i fravær af antigen.

US patentskriftet HYBRITECH nr. 4.632.901 (og den tilsvarende internationale PCT-ansøgning nr. 85/05451) beskriver en fremgangsmåde og 10 en anordning til udførelse af immunoanalyser, som ikke nødvendiggør inkubationsetaper af lang varighed med tilhørende adskillige ganges vask, og som på grund af deres enkelhed muliggør, at de kan udføres af lægen i konsultationen, eller endog af patienten hjemme. Den pågældende anordning omfatter et første element, som er porøst, og som består af en mem-15 bran eller et filter, hvortil der er bundet et antistof, monoklonalt eller polyklonalt, som genkender det antigen, man søger at identificere, og et andet element, som er absorberende og har kapil 1 arpassager vinkelret på sin øverste og underste flade. -Dette andet element står i kapil-1 arforbindelse med den porøse membran eller lignende, som udgør anord-20 ningens første element, og porerne deri har en sådan dimension, at væskegennemstrømning gennem det første element fremkaldes uden anvendelse af eksterne midler. Den porøse filtermembran kan være af nylon indeholdende NH^-grupper, hvortil antistofferne bindes kovalent, ved kobling ved hjælp af glutaraldehyd, og det absorberende element kan være udformet af 25 filtrerende, fibrøst materiale, såsom fibre af celluloseacetat, polyester, polyolefin, osv. Disse to elementer kan være adskilt fra hinanden af et andet porøst element (f. eks. af polyethylen), som ikke fikserer antistoffer på ikke-specifik måde og forhindrer, at mærkede antistoffer fikseres på ikke-specifik måde på det absorberende elements øvre flade.

30 EP patentskrift ABBOTT LABORATORIES nr. 186100 beskriver ligeledes en anordning, som går ud på at bestemme tilstedeværelsen eller mængden af en substans i en analyseprøve, og som omfatter en fibrøs, porøs, ik-ke-absorberende matrix, såsom af glas,- imprægneret med en hydrofob polymer, som danner en overfladebeklædning på i det mindste en del af matri -35 een, og til hvilken der er fikseret et reagens, f. eks. et antistof eller et antigen, som er i stand til at reagere med den i prøven eftersøgte substans, idet denne anordning kan være forbundet med et underliggende lag af absorberende materi ale-og/eller med et lag af fibrøst materia- 5

DK 165932B

le, såsom glasfibre eller filterpapir af cellulose, som dækker den fibrøse, matrix og kan spille rollen som "forfilter".

EP patentskrift MUREX CORPORATION nr. 206561 viser ligeledes en diagnoseanordning, som omfatter et filterelement, som har mindst én re-5 aktionszone, som er forbundet til mindst én randzone, et absorberende element, som kun er forbundet med det første elements randzone samt et element til at holde filteret i den rigtige stilling. "Reaktionen", som frembringes i reaktionszonen, kan 1 igesåvel være en separation ved filtrering som en immunologisk kobling, og det er i den samme zone reaktio-10 nens signaler kan aflæses. Væskeprøven, som skal analyseres, løber ud på filteret gennem en tragt, hvis udløbsåbning er beregnet på en sådan måde, at dens diameter i kombination med væskens tryk i tragten er tilstrækkelig til, at væsken løber ud på filterets overflade, men ikke gen-nemtrænger dette, idet det hydrostatiske tryk følgelig er justeret såle-15 des, at væsken trænger ind i filteret ved tyngdekraften og diffunderer på tværs deraf ved kapillarvirkning uden at gennemtrænge det helt i lodret retning.

Alle disse anordninger har til fælles, at de har et filtrerende, porøst element, som væskeprøven, der skal analyseres, passerer igennem, 20 idet der er tilvejebragt midler til i givet fald at reducere hastigheden af udstrømningen af væske. Et sådant filterelement tillader imidlertid ikke en tilstrækkelig lang kontakttid mellem reagenset, som er bundet til filterelementet, og den i væskeprøven eftersøgte substans, og muliggør derfor ikke, at der opnås en reaktion med en sådan følsomhed, at den 25 er i stand til at påvise meget svage koncentrationer af nævnte substans i prøven; desuden vil udløb af prøven, som i givet fald indeholder et ligand-receptor kompleks, såsom i særdeleshed et antigen-antistof kompleks, igennem et filterlement kunne give anledning til aflæsningsfejl.

Den foreliggende opfindelse sigter således på at tilvejebringe en 30 anordning og en fremgangsmåde til hurtig kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af en reaktiv ligand i et fluidum, som er i bedre overensstemmelse med de praktiske krav end de i den kendte teknik foreslåede anordninger og fremgangsmåder, som har det samme sigte, idet anordningen ifølge den foreliggende opfindelse i særdeleshed har en 35 følsomhed, som er langt højere end dem, der er angivet i den kendte teknik, idet den er i stand til at påvise meget svage koncentrationer af ligand, i særdeleshed af antigen, i et fluidum, især biologisk, idet disse koncentrationer kan være så lave som 5 picogram, medens fremgangs- 6

DK 165932B

måderne ifølge den kendte teknik ikke muliggør påvisning af så svage koncentrationer og først er følsomme fra nogle μ$, idet anordningen ifølge opfindelsen tillader gennemførelse af to reaktioner mellem et reagens og en substans, der skal påvises, på to helt adskilte steder, 5 hvilket giver meget specifikke reaktioner og således på sikker måde undgår krydsreaktioner og falske positive eller negative resultater, uden at skulle gøre brug af kompetitive metoder, idet den er i stand til at benytte flere typer af monoklonale antistoffer på samme tid og finder anvendelse på alle metoder til resultataflæsning, såsom kolorimetri, 10 fluorescens, kemoluminescens, radioaktivitet, etc., og idet den muliggør kvantitative bestemmelser.

Den foreliggende opfindelse angår en anordning til hurtig kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af en reaktiv ligand i et fluidum og af den art, som omfatter en reaktionszone indeholdende 15 et mærket reagens, i særdeleshed et mærket antistof eller et antigen, for reaktion med liganden, der skal identificeres, samt en fremkaldelseszone, hvilken anordning omfatter: - en første reaktionszone omfattende en membran, som midlertidigt er impermeabel, hvilken zone er beregnet til at modtage en prøve af 20 testfluidum, og hvilken membran er beregnet til at blive forbundet med mindst ét passende mærket reagens, som er i stand til at genkende den eller de ligander, som skal identificeres, og som måtte være til stede i prøven, samt med en substans til opløsning eller et middel til lysering af membranen, 25 - en anden reaktionszone, adskilt fra den første og midlertidigt isoleret derfra ved hjælp af nævnte membran, og omfattende en fast fase indeholdende et ikke-mærket referencereagens, som er i stand til at genkende den eller de ligander, som skal identificeres, hvilken reaktionszone på den side, der ligger modsat den første membran, midlertidigt er 30 lukket med en anden membran, som midlertidigt er impermeabel, og - en tredie reaktionszone, som midlertidigt er isoleret fra ovennævnte anden reaktionszone ved hjælp af nævnte anden membran, og som indeholder midler til fremkaldelse af den reaktion, som eventuelt har fundet sted i den første eller anden reaktionszone, idet anordningen 35 yderligere er karakteriseret ved, at de nævnte to membraner er fremstillet af et materiale, som er impermeabelt i et første tidsrum, som er tilstrækkelig langt til, at den reaktion, som skal ske i den pågældende reaktionszone, kan finde sted, idet nævnte materiale er et sådant, som

DK 165932 B

7 opløses eller lyseres ved hjælp af den opløsende substans eller lyseringsmidlet efter dette første tidsrum, således at eventuelle produkter af reaktionen kan passere igennem og ind i den næste reaktionszone, idet nævnte opløsning eller lysering begynder samtidig med den reaktion, som 5 skal finde sted i den pågældende reaktionszone.

Ifølge en udførelsesform af anordningen ifølge den foreliggende opfindelsen er den opløsende substans eller lyseringsmidlet for membranerne ikke inkorporeret i den pågældende membran.

Ifølge en anden hensigtsmæssig udførelsesform af anordningen ifølge 10 den foreliggende opfindelse, er den opløsende substans eller lyseringsmidlet for membranerne inkorporeret i den pågældende membran.

Ifølge en fordelagtig foranstaltning ved opfindelsen er de midlertidigt impermeable materialer, som anvendes til fremstilling af ovennævnte membran(er) udvalgt fra gruppen, som i særdeleshed omfatter car-15 bonhydrater, proteiner, især gelatine, 1 i pi der og plastmaterialer.

Ifølge en yderligere fordelagtig udførelsesform af anordningen ifølge den foreliggende opfindelse er den første reaktionszone egnet til at optage en fast fase, hensigtsmæssigt understøttet af den første membran, som omfatter mindst ét passende mærket reagens, eventuelt i for-20 bindel se med et middel til lysering af membranen.

Ifølge opfindelsen er det mærkede reagens mærket på passende måde navnlig med et enzym, en radioisotop, et kemisk produkt, som er kromo-fort, fluorescerende eller kemoluminescerende, og det kan med fordel være et antistof eller et antigen.

25 Ligeledes ifølge opfindelsen er det materiale, som i det mindste den første membran er fremstillet af, et sådant, at membranen efter et passende tidsrum opløses af den vandige flydende fase af analyseprøven.

Ifølge den foreliggende opfindelse består midlet til permeabilise-ring af den pågældende membran af et lyseringsmiddel, såsom et passende 30 enzym, som eventuelt kan være inkorporeret i membranen, eller det kan være forbundet til nævnte membran ved at være indført i anordningen ifølge opfindelsen, eller det· kan være optaget i den faste fase, som indeholder ovennævnte reagens.

Ifølge en yderligere hensigtsmæssig udførelsesform af anordningen 35 ifølge den foreliggende opfindelse består den faste fase indeholdende et ikke-mærket referencereagens, som befinder sig i den anden reaktionszone, af en uopløselig bærer, som nævnte ikke-mærkede reagens (i særdeleshed antistof eller antigen) er bundet til, svarende til den ligand, man

DK 165932 B

8 søger at påvise, hvilken uopløselige bærer er udvalgt fra gruppen, som især omfatter mi krokugler, mi kropi ader eller lignende.

Ifølge en hensigtsmæssig udførelsesform af anordningen ifølge den foreliggende opfindelse indeholder den tredie reaktionszone et kromogent 5 substrat, når det er bestemt, at aflæsningen af reaktionen skal foregå ved kolorimetri.

Ifølge en yderligere hensigtsmæssig udførelsesform af anordningen ifølge opfindelsen omfatter anordningen imellem den første og den anden reaktionszone en mellemliggende zone, som indeholder et mærket reagens, 10 i hvilket tilfælde den første reaktionszone indeholder et ikke-mærket reagens.

Ifølge et hensigtsmæssigt arrangement af denne udførelsesform omfatter den mellemliggende zone mindst ét lag af vesi kul øse fieriags-strukturer, i hvilke der er inkorporeret mindst ét reagens egnet til at 15 blive frigjort efter et passende tidsrum af et passende lyseringsmiddel, såsom især et enzym.

Ifølge et yderligere hensigtsmæssigt arrangement af denne udførelsesform udgøres den mellemliggende zone af en mellemliggende membran, som er skudt ind imellem ovennævnte første membran og den anden reak-20 ti onszone, hvilken mellemliggende membran hensigtsmæssigt er forbundet med et mærket reagens, i hvilket tilfælde den første membran er forbundet med et reagens af samme type som ovennævnte mellemliggende membran.

Den udførelsesform af anordningen ifølge opfindelsen, som omfatter tre reaktionszoner, muliggør udførelse af kvalitative bestemmelser af 25 tilstedeværelsen eller fraværet af reaktive ligander i et fluidum, i særdeleshed af antigener eller antistoffer i et biologisk fluidum.

Den udførelsesform af anordningen ifølge opfindelsen, som omfatter en supplerende zone, muliggør udførelse af semikvantitative bestemmelser af sådanne ligander.

30 Ifølge den foreliggende opfindelse er det ligeledes muligt at fore tage kvantitative bestemmelser ved at forbinde anordningens tredie zone til et i sig selv kendt apparatur til kvantitativ bestemmelse, såsom RIA, spektrofotometer, etc.

Ifølge en hensigtsmæssig udførelsesform af anordningen ifølge den 35 foreliggende opfindelse er ovennævnte reaktionszoner overlejrede til dannelse af et øvre trin indeholdende den første reaktionszone, et mellemtrin indeholdende den anden reaktionszone og et nedre trin. indeholdende den tredie reaktionszone, samt eventuelt et mellemliggende trin

DK 165932 B

9 imellem det øvre trin og mellemtrinnet, indeholdende den mellemliggende reaktionszone.

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes en fremgangsmåde til hurtig kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af en 5 reaktiv ligand i et fluidum, ved hvilken en prøve af fluidet, som skal analyseres, i et første trin bringes i kontakt med et mærket reagens, såsom i særdeleshed et mærket antistof eller antigen, i en zone, som midlertidigt er isoleret fra de zoner, hvori de efterfølgende fremgangsmådetrin finder sted, i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at ligand-10 reagens reaktionen kan finde sted, hvorefter isoleringen af den zone, hvori nævnte reaktion har fundet sted, brydes ved hjælp af en substans til opløsning eller af et passende lyseringsmiddel, som er til stede i nævnte zone, overført samtidig med nævnte fluidum til en midlertidigt impermeabel membran, som opløses ved kontakt med nævnte substans eller 15 middel, - hvilken gradvise og programmerede opløsning eller lysering af den isolerende membran sker samtidig med nævnte reaktioner -, således at eventuelt reaktionsprodukt i et andet.trin kan komme i kontakt med et andet, ikke-mærket reagens svarende til liganden, som skal identificeres i ovennævnte fluidumprøve, i en anden zone, som er midlertidigt isoleret 20 fra den efterfølgende zone, hvorefter isoleringen af den anden zone brydes på gradvis, programmeret og samtidig vis ved hjælp af nævnte opløsende substans eller lyseringsmiddel, således at produktet fra den første eller den anden reaktion, under tredie fremgangsmådetrin, kan komme i kontakt med midler til påvisning af tilstedeværelsen - eller fraværet 25 - af liganden, som skal påvises.

Ifølge en udførelsesform af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse bringes fluidumprøven under fremgangsmådens første trin i kontakt med et ikke-mærket reagens, og forud for fremgangsmådens andet trin udføres et mellemliggende trin, hvorunder det under det første trin 30 dannede ikke-mærket reagens-ligand kompleks bringes i kontakt med et mærket reagens af samme type som det, der anvendtes under første trin, i en zone, som midlertidigt er isoleret, fra det efterfølgende trin.

Ifølge en hensigtsmæssig udformning af denne udførelsesform indføres det ikke-mærkede reagens, som under første fremgangsmådetrin blev 35 bragt i kontakt med fluidumprøven, som skal analyseres, i en bestemt mængde, som svarer til en kendt mængde af den ligand, man søger at påvise, idet overskydende ligand, dvs. den mængde, som ikke blev bundet til 10

DK 165932B

reagens under første fremgangsmådetrin, under det mellemliggende fremgangsmådetrin bliver opfanget af det mærkede reagens, som nævnte overskydende ligand fikseres til, med det resultat, at reaktionen til afsløring af den eventuelle tilstedeværelse af ligand i analysefluidet kun er 5 positiv, såfremt mængden af ligand i nævnte fluidum er større end ovennævnte mængde, hvilket muliggør en semi:kvantitativ bestemmelse af tilstedeværende ligand i nævnte fluidum.

Ifølge en foretrukket udførelsesform af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er det første fremgangsmådetrin en absorptions-10 fase, det andet fremgangsmådetrin er en desorptionsfase, og det tredie fremgangsmådetrin er en absorptionsfase.

Når fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter et mellemliggende trin, som er skudt ind imellem første og andet fremgangsmådetrin, er dette mellemliggende trin, ligesom første trin, en absorptionsfase.

15 Foruden de ovenfor beskrevne foranstaltninger omfatter opfindelsen yderligere foranstaltninger, som vil fremgå af den efterfølgende beskrivelse.

Opfindelsen vil lettere kunne forstås ved hjælp af den efterfølgende detaljerede beskrivelse, under henvisning til tegningn, hvor: 20 Fig. 1 er en skematisk afbildning i lodret snit af en udførelsesform af anordningen ifølge den foreliggende opfindelse;

Fig. 2 viser et skema over fremgangsmådetrinnene til kvalitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af antigener;

Fig. 3 viser et skema over fremgangsmådetrinnene til kvalitativ be-25 stemmel se af tilstedeværelsen af antistoffer, og

Fig. 4 viser den kvantitative analysekurve for ACE, som er til stede i humanserum.

Det skal imidlertid forstås, at tegningen og de tilsvarende dele af beskrivelsen udelukkende tjener til at belyse opfindelsens genstand og 30 ikke på nogen måde udgør en begrænsning af denne.

Den i fig. 1 viste anordning ifølge den foreliggende opfindelse omfatter, nedefra og opefter, en bærer 7, som bærer en tablet af kromo-gent substrat 6, oven på hvilken der er anbragt en membran 3', som vil blive beskrevet mere detaljeret i det efterfølgende. Oven på denne mem-35 bran 3' er anbragt et lag af mi krokugler 5, som vil blive beskrevet mere detaljeret i den efterfølgende beskrivelse. Mikrokuglerne er hensigtsmæssigt, men ikke nødvendigvis, på begge sider beskyttet af beskyttende lag, som kan være af et hvilket som helst passende materiale, i særde-

DK 165932B

η leshed af tekstil. En anden membran 3, er anbragt over laget 5 af mikro-kugler; strukturen 2 danner sammen med bæreren 7 samt en mellemramme 8 anordningens stativ. I den skålformede udskæring 9 i strukturen 2 er indlagt en fortrinsvis lyofiliseret tablet 1, af et reagens, som gen-5 kender liganden, hvis påvisning bliver udført ved hjælp af anordningen ifølge den foreliggende opfindelse.

De ligander, man søger at påvise ved hjælp af denne anordning, er antigener og antistoffer, men også alle typer af kemiske eller biologiske substanser. Der er talrige anvendelsesmuligheder for fremgangsmåden 10 og anordningen ifølge den foreliggende opfindelse, iblandt hvilke følgende kan nævnes: diagnosticering af virus og mikroorganismeangreb, enzymatiske analyser, påvisning af auto-immunsygdomme samt af Alzheimers sygdom, tidlig påvisning af cancer, udførelse af hurtige blodtypebestemmelser, bestemmelse af cirkulerende medikamenter, påvisning af allerge-15 ner og diagnosticering af allergier, bestemmelse af membranreceptorer, bestemmelse af hormoner, bestemmelse af kemiske stoffer og i særdeleshed af ionogramanioner og -kationer. Som det vil forstås, er denne opremsning hverken udtømmende eller begrænsende.

De reagenser, som genkender den ligand, som skal påvises, er i det 20 væsentlige antistoffer eller antigener, som fortrinsvis anvendes i lyofiliseret tilstand i form af tabletter 1.

Antistofferne eller antigenerne, som indeholdes i tabletten 1, er antistoffer eller antigener, som er mærkede med en passende markør såsom en radioisotop, et enzym, en fluorescerende substans, et kemisk produkt, 25 som vil være i stand til med et passende substrat at give en farvereaktion, etc.

Membranen 3, som danner det øvre trin af anordningen er udført af et materiale, som er midlertidigt impermeabelt, af en varighed, der er tilstrækkelig til, at en dråbe af fluidumprøven, som skal undersøges, og 30 som er bragt i kontakt med tabletten 1, vil kunne reagere til dannelse af et kompleks af mærket antistof eller antigen og ligand, såfremt fluidet virkelig indeholder den ligand, som skal påvises, idet membranen 3 mister sin impermeabi1 itet efter dette tidsrum for at tillade passage af hele mængden af fluidum, som eventuelt indeholder ovennævnte kompleks, 35 ned i mellemtrinnet.

Det er fordelagtigt at udføre membranen 3 i et materiale, som er impermeabelt under normale betingelser, men i løbet af 20 sekunder til 10 minutter opløses'af et passende enzym. I tilfælde af, at membranen 3

DK 165932 B

12 er af gelatine, vil det anvendte lyseringsenzym fordelagtigt være kollagenase. Det er fordelagtigt at inkorporere enzymet til lysering af gelatinen i antistof- eller antigentabletten 1, idet den nødvendige tid til at liganden og reagenset (antistof eller antigen) indeholdt i tabletten 5 1 kan reagere indbyrdes, er af samme størrelsesorden som den tid, der er nødvendig til, at lyseringsenzymet kan opløse membranen 3. Det kan være fordelagtigt at forstærke gelatinemembranen 3 ved indlægning af en glasfiberstruktur, som så udgør, membranens 3 skelet efter opløsning af gelatinen. Senere heri vil der blive nævnt yderligere eksempler på membra-10 ner, som vil kunne tænkes anvendt inden for den foreliggende opfindelses rammer.

Det mellemste trin af anordningen ifølge den foreliggende opfindelse omfatter et lag 5 af mi krokugler udført i ethvert egnet materiale, såsom metaller og deres legeringer, polyacrylamid, etc., med diametre 15 varierende mellem 10 og 250 βία og bærende et reagens (antigen eller antistof), som er identisk med eller ligner den ligand, man søger at påvise, og som er beregnet til at tilbageholde de mærkede reagenser, som er forblevet frie i det overliggende trin.

Hvis man under disse betingelser søger et antigen i en dråbe af 20 biologisk fluidum, vil det i nævnte fluidum tilstedeværende antigen i tilfælde af positiv reaktion bindes til antistoffet, som er indeholdt i tabletten 1, over membranen 3, som opløses af et passende enzym, efter at ovennævnte reaktion har fundet sted; det fluidum, som indeholder det førnævnte antigen-antistof kompleks, passerer igennem laget af mikrokug-25 ler 5 uden at blive tilbageholdt af disse, når frem til membranen 3', som det opløser ved hjælp af det førnævnte enzym, som er indeholdt i nævnte fluidum, til muliggørelse af at fluidet når frem til fremkaldelseszonen, som indeholder et substrat 8, som farves ved kontakt med det undersøgte fluidum.

30 I tilfælde af negativ reaktion, dvs. hvis det undersøgte fluidum ikke indeholder antigen, vil det mærkede antistof fra det overliggende trin blive tilbageholdt af det ikke-mærkede antigen, som er fikseret på mi krokuglerne, og farver således ikke substratet.

Forløbet vil være det samme, mutatis mutandis, hvis det er et anti-35 stof, man eftersøger i fluidet.

Hvis man ønsker at opnå en semi-kvantitativ bestemmelse, er reagenset i det øvre trin ikke mærket, eftersom et mellemliggende trin følger efter det øvre trin og omfatter vesi kul øse flerlagsstrukturer eller mi- 13

DK 165932B

krokapsler, i hvilke der er inkorporeret mærkede reagenser. Det med membranen 3 forbundne reagens, såsom f. eks. antistof, indføres i et mængdeforhold, som svarer til en fastsat mængde antigen, i tilfælde af x ng/ml antigen, f.eks. 10 ng/ml antigen. Hvis det testede fluidum inde-5 holder en større mængde antigen, fikseres den overskydende mængde til de mærkede antistoffer, som er inkorporeret i de vesikuløse strukturer i det mellemliggende trin, efter åbning af disse under indvirkning af lyseringsenzymet, således at man opnår resultater i forhold til en tærskelværdi, dvs. semikvantitative resultater.

10 Figur 2 viser kvalitativ bestemmelse af antigener under opnåelse af en positiv reaktion: man ser det dannede antistof-antigen kompleks, betegnet med 10, gennemtrænge mellemtrinnet uden at blive tilbageholdt på mi krokuglerne, til dannelse af en positiv reaktion. Faktisk er alle mærkede antistoffer i tabletten 1 efter ca. 30 sekunders forløb mættet med 15 de i serummet tilstedeværende antigener, således at når det mættede kompleks efter lysering af den overliggende membran 3 efter disse 30 sekunders forløb når frem til mikrokuglerne i laget 5, hvortil der er fik-seret antigener af den samme type, som dem, man eftersøger i serummet, kan mikrokuglerne ikke fiksere disse mættede komplekser, som når frem 20 til fremkaldelseszonen gennem den lyserede membran 3'.

Mere specifikt anvendes den i Figur 2 illustrerede bestemmelse til kvalitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af syfilis-antigener.

De mærkede antistoffer, som udgør reagenset i det øvre trin 13, er humane IgG'er (500 picogram) stammende fra positive kontrolsera (Pasteur 25 kode 76751) mærket med peroxidase (Merck) via concanavalin A (GUESD0N og AVRAMEAS metoden, 1980). Tabletten, som indeholder reagenset, indeholder ligeledes enzymet til lysering af membranen, idet dette lyseringsenzym, såfremt membranen er af gelatine, er kollagenase, i hvilket tilfælde nævnte tablet fortrinsvis indeholder 5 enheder kollagenase (kollagenase 30 Clostridium fra Calbiochem). Membranen 3 kan ligeledes være en DMF poly-carbonat-membran af 10 Mm tykkelse med 3 μπι porer, som i varm tilstand er udfyldt med en ethanolisk 3% gelatine-opløsning, idet gelatinen, som lukker porerne, efter 30 sekunders forløb lyseres af kollagenasen. Membranen 3 bæres af en glasfiberstruktur. De mærkede polyklonale antistof-35 fer 14, der anvendes som reagenser, danner, efter de er bragt i kontakt med serum-antigenerne 15 indeholdt i serumdråben, som er bragt i kontakt med tabletten indeholdende reagenset 14, et mærket antistof-antigen kompleks 10. Da blod, som er positivt mht VDRL-antigener, indeholder ca.

14

DK 165932B

200 picogram deraf pr. dråbe å 50 mikroliter, er de 500 picogram mærkede antistoffer, som er indført i det øvre trin 13 tilstrækkelige til at opfange serum-antigenerne 15. Dette overskud af antistoffer har iøvrigt indflydelse på hastighedsaccelerationen af Ag-Ac reaktionen. Af de 500 5 picogram mærkede antistoffer 14 fra det øvre trin vil 200 picogram knytte sig til serumantigenerne 15 til dannelse af komplekset Ag-Ac 10, som ikke vil fikseres til den faste fase, som udgøres af mi krokuglerne 5 i mellemtrinnet 11. Disse mikrokugler (5 μΐ) af "Magnogel" (IBF) er forsynet med en VDRL-LATEX antigenbelægning (1 ng/5 /xl) via protein A + glu-10 taraldehyd (reagens IBF) og VDRL (Diag Pasteur kode 52675). Efter lysering af gelatinen i membranen 3 vil 300 picogram mærkede antistoffer, som er forblevet frie, fikseres til VDRL-LATEX antigenerne på mikrokug-lerne 5 i mellemtrinnet 11, medens de 200 picogram mærkede antistoffer, som er mættet med serumantigenerne 10,' vil trænge igennem den nederste 15 membran 3' (identisk med membranen 3) så snart gelatinen, som lukker dens porer, er opløst i overensstemmelse med det beskrevne eksempel, for derefter at trænge ned i det nedre trin 16, som er fremkaldelseszonen, der indeholder substratet (S), som hensigtsmæssigt består af stabiliseret 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (ICN-LAB. MILES) på en passende bærer 20 såsom f. eks. Whatman-papir nr. 1. I kombination med substratet (S) giver komplekset 10 en farvereaktion (12); farvningen kan fremkomme med blot 20 picogram, hvis substratet foruden 3,3',5,5'-TMB indeholder komplekset glukose-oxydase/B-D-glukose, som i kontakt med serum frembringer oxygeneret vand, hvilket således muliggør en forstærkning af farvningen.

25 Figur 3 illustrerer kvalitativ bestemmelse af antistof under opnå else af en positiv reaktion: efter ca. 30 sekunders forløb er alle mærkede antigener mættet med serumantistoffer, hvorefter den øvre membran 3 lyseres og tillader passage af alle mærkede antistof-antigen komplekser ned imod mi krokuglerne i mellemtrinnet’, til hvilke ikke-mærkede anti-30 stoffer af samme type som de eftersøgte antistoffer fikseres. Da epito-perne (antigeniske positioner) er mættet af serumantistofferne, genkendes de ikke af de på mi krokuglerne fikserede antistoffer og når frem til fremkaldelseszonen, i hvilken de reagerer med substratet og giver en farvereaktion.

35 Det i Figur 3 illustrerede eksempel anvendes mere specielt til på visning af toxoplasmose-antistoffer.

Toxoplasmose-antigener (kode 52721 Diag. Pasteur), som hensigtsmæssigt er lyofiliserede (250 picogram) og peroxydase-mærkede (MERCK), an- 15

DK 165932B

bringes i det øvre trin 13 i form af et reagens af mærkede antigener.

Den lyofiliserede.tablet indeholdende Ag 17, indeholder et lyseringsenzym, som i det tilfælde, hvor membranen er som beskrevet ovenfor i forbindelse med Figur 2, specifikt er kollagenase (5 enheder) (Collagénase 5 Clostridium fra Calbiochem). De mærkede antigener 17, der anvendes som reagens, danner ved kontakt med serumantistofferne (polyklonale) 18 indeholdt i serumdråben, som bringes i kontakt med tabletten indeholdende reagenset 17, et kompleks af mærket antigen-serumantistof 19. Da blod, som er positivt med hensyn til anti-toxoplasmose-antistoffer, indeholder 10 100-150 picogram deraf, vil de 250 picogram mærkede antigener 17 mætte disse serumantistoffer 18 og forhindre dem i at blive fikseret på mikro-kuglerne (5 μΐ) 20 - såsom mikrokugler af "Magnogel" (I BF), som er forsynet med en belægning af anti-toxoplasmose antistoffer (1 ng/5 μΐ) via protein A + glutaraldehyd (reagenser fra IBF, antistoffer fra Institut 15 Pasteur) - som befinder sig i mellemtrinnet 11. Efter permeabilisering af membranen 3 ved lysering af gelatinen, som lukker polycarbonatmembra-nens porer, som beskrevet ovenfor på ikke-begrænsende vis, vil de mærkede antigener 17, som ikke er mættede med serumantistofferne 18, fiksere sig på antistofferne, som bæres af mikrokuglerne 20, medens komplekserne 20 af mærket antigen-antistof 21, passerer igennem den nedre membran 3', når denne på sin side bliver permeabiliseret, for derefter at forene sig med substratet (S), som kan være det samme som beskrevet ovenfor i forbindelse med Figur 2, til frembringelse af en farvning, som eventuelt kan forstærkes som ligeledes beskrevet i forbindelse med Figur 2.

25 Ovenstående beskrivelser af anordningen ifølge den foreliggende op findelse har henvist til udførelsesformer afbildet i Figurerne 1-3 og har som eksempler nævnt membraner til programmeret lysering, hovedsagelig membraner bestående af eller omfattende gelatine. Det vil imidlertid forstås, at membraner til programmeret lysering i overensstemmelse med 30 den foreliggende opfindelse kan udføres i andre materialer. De efterfølgende ikke-begrænsende eksempler har til formål dels at beskrive andre membraner til programmeret lysering,- som kan anvendes inden for rammerne af den foreliggende opfindelse, dels at beskrive anvendelsen af anordningen og analysefremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til 35 bestemmelse af tilstedeværende antigener i serum eller urin.

DK 165932 B

16

Eksempel 1 - Fremstilling af 1ipidmembraner.

Lipidmembraner kan fremstilles ud fra talrige arter af amfi file li-pider eller ud fra 1ipidblåndinger.

De lipider, som er bedst egnede til fremstilling af impermeable 5 membraner, er phospholipider, som kan være knyttet til cholesterol eller ikke, hvilke er basisbestanddelene i cellemembraner.

De naturlige (ikke-syntetiske) phospholipider har et radikal R til fælles, men adskiller sig ved deres terminalgruppe: R - H phosphatidinsyre 10 R - CH2 - CH£ - N - (CH^)3 , phosphatidylcholin R - CH2 - CHg - NHg phosphatidylethanolamin R - CH2 - CH - NHg phosphatidyl serin

COO

R - CH2 - CHOH - CH2 - OH phosphatidylglycerol 15 R - CH2 - CHOH - CH2 - 0 - R' cardiolipin R - Rj kompleks sphyngomyelin

Der findes syntetiske phospholipider, som giver bedre egenskaber med hensyn til resistens, holdbarhed, etc. Det drejer sig om: 20 DMPC dimyristoyl-phosphatidylchol in DPPC dipalmi toyl-phosphatidylchol in DSPC distearoyl-phosphatidylchol in 1. Fremstilling af 1ipidopløsningen: 25 - phospholipid 10 μπιοί - benzen 1 ml

Der omrøres på Vortex-blander i 1 minut.

2. Der opvarmes i mariebad på 40°C i nogle minutter.

30 3. 12 μΐ anbringes på en af følgende bærere med en diameter på 13 mm: nylon, nitrocellulose, cellulosepapir, polyester, med en porøsitet på mindst 0,45 μπι og en tykkelse på 100 μπι.

4. Benzenen afdampes i stærkt vakuum ( - 60 mm Hg), hvorefter der straks opbevares under vakuum eller i argon.

35 5. Lyseringen af denne membrantype'udføres ved hjælp af en passende detergent og/eller peroxidase.

Lyseringstest: 10 μΐ vand anbringes på en tablet: prøven forbliver ubevægelig 17

DK 165932B

i mindst 1 time.

10 μΐ indeholdende Tween 20 eller Triton X-100 til 0,02% og/eller peroxidase til 1 ng/μΐ anbringes på en tablet:

Dråben på 10 μ] forbliver ubevægelig i 45 sekunder, før den pludse-5 lig bevæger sig gennem bærermembranen.

6. Justering af membraner: lyseringsforsinkelsen kan ændres ved at variere koncentrationen af phospholipid eller koncentrationen af detergent-peroxidase ved at gå frem efter en af de nedenfor beskrevne udfø-relsesformer: 10 6.1 For en membran fremstillet ud fra en opløsning af 15 μπιοί phospholipid i 1 ml benzen: dråben med 0,02% Triton X-100 passerer først efter 90 sekunder.

6.2 Hvis der til samme koncentration phospholipid anvendes 0,01%

Triton X-100, vil lyseringen indtræffe efter 5 minutter.

15 6.3 I tilfælde af en membran fremstillet ud fra en opløsning af 5 μιηοΐ phospholipid i 1 ml benzen: 0,02% Triton X-100 passerer gennem membranen på 15 sekunder, mens forsinkelsen ved 0,01% er på 50 sekunder.

Vigtig bemærkning: De non-ioniske detergenter kombinerer sig, alt imens de sikrer en god beskyttelse af visse opløsninger (f. eks. anti-20 stoffer mærket med peroxidase) med den selvsamme peroxidase til lysering af membranen.

Eksempel 2 - Fremstilling af membraner af acrylatcopolymerer 1. Følgende monomer-opløsning fremstilles: 25 - 30% 2-propanol (isopropanol) - 40% acrylat/acryli sk copolymer - 20% 0H-propyl-methylcellulose - 5% acetyl-tri ethyl citrat - 5% aluminiumchlorhydrat.

30

Der opvarmes til 40°C i 10 minutter på mariebad.

Efter blanding i 1 minut på Vortex-blander opbevares der hermetisk tillukket.

2. Før anbringelse på en af de i det foregående eksempel beskrevne 35 bærere fortyndes denne monomer-opløsning i ethanol i forholdet 1 volumen acrylisk monomer-opløsning og 5 volumener ren ethanol.

3. 10 μ] anbringes på bæreren med en diameter på 13 mm.

4. Der tørres under vakuum og opbevares under vakuum i nærvær af et

DK 165932 B

18 tørremiddel.

5. Denne type membran lyseres af PBS ved pH 7,2.

Lyseringstest: 5 En 10 μΐ dråbe af PBS-puffer, pH 7, anbringes: gennemtrængningen af membranen sker langsomt (ca. 1 minut).

10 μΐ PBS, pH 7, anbringes: gennemtrængningen af bæreren sker efter nogle sekunder.

6. Det er muligt at forkorte eller forlænge acrylfilmens lyserings- 10 forsinkelse ved variation af: - monomeropløsningens sammensætning (f. eks. mere eller mindre 2-propanol), - ethanol andelen: f. eks. er filmen meget hurtigt permeabel ved 9 volumener ethanol ud af 10. Ved 4 volumener ud af 5 sker passagen lang- 15 sommere.

7. Det er muligt at variere lyseringens pH ved variering af koncentrationen af acetyl-triethylcitrat.

Eksempel 3 - Fremstilling af proteinmembraner 20 Gelatinemembranerne, hvortil der henvistes i forbindelse med be skrivelsen af den i Fig. 1-3 viste anordning, fremstilles med fordel som følger:

En monomer-opløsning af følgende sammensætning fremstilles: - 5 mg vegetabilsk gelatine 25 - 95 ml demineraliseret vand

Under omrøring med magnetomrører opvarmes til 50°C.

10 μΐ anbringes på en bærer såsom de i Eksempel 1 beskrevne. Der tørres under kraftigt vakuum. Opbevaring sker i vakuum i nærvær af et tørremiddel. Den vegetabilske gelatine lyseres med kollagenase.

30 Lyseringstest: 10 μΐ vand anbringes på den således fremstillede tablet. Vand forbliver ubevægeligt i mere end 1 time. , 10 μΐ af en 1 Ul/μΐ opløsning af kollagenase anbringes: dråben passerer gennem bæreren på 45 sekunder.

35 Det er muligt at retardere fluiders passage gennem denne protein membran ved i den passerende opløsning at inkludere kollagenase eller et hvilket som helst andet proteolytisk enzym. Kollagenasen vælges her, fordi den er kompatibel med de biologiske reaktioner, som ønskes over

DK 165932 B

19 eller under membranen, mens andre proteolytiske enzymer er toksiske, navnlig for mærkningsantistofferne eller -proteinerne.

Det er ligeledes muligt at variere forsinkelsen af gennemtrængningen af denne membran ved at variere gelatinekoncentrationerne eller kol-5 lagenasekoncentrationerne. Forsinkelsen reduceres således med mindre gelatine eller mere kollagenase og forlænges med mere gelatine eller mindre kollagenase.

Eksempel 4 - Fremstilling af carbonhydratmembraner 10 Følgende monomeropløsning fremstilles: 10 gram D-glucose 5 ml demineraliseret vand opvarmes til 70°C under omrøring med Vor-tex-blander, 10 g D-glucose tilsættes i små portioner under omrøring mellem de enkelte tilsætninger af D-glucose. Der opnås en tyktflydende 15 opløsning med sirupkonsistens.

Et volumen af denne sirup fortyndes med et volumen ren ethanol 99°, hvorefter 10 μΐ af denne opløsning anbringes på en af de i Eksempel 1 beskrevne bærere. Der tørres under vakuum ved 37°C og opbevares i nærvær af et tørremiddel. Denne membrantype lyseres i nærvær af vand.

20 Lyseringstest: 10 /il vand anbringes på: 1. - Samme bærer uden D-glucose: øjeblikkelig gennemtrængning.

2. - Bæreren fremstillet med D-glucose: gennemtrængning retarderet 35 sekunder.

25 D-glucosen er specielt egnet i tør form, da den gør det muligt at opnå peroxidet ved kontakt med glucoseoxidasen, således at signalet for stærkes ved bestemmelser under anvendelse af peroxidasen som markør.

Eksempel 5 - Påvisning af ACE i serum 30 Fig. 4 viser en analysekurve over ACE indeholdt i prøver af humant serum.

De testede prøver har et volumen på 50 /ti. 10 prøver af humant serum, som skal testes, og af samme volumen samt en prøve af humant testserum, som ikke indeholder ACE, behandles som følger: en prøve hældes på 35 en lyofiliseret tablet 1, som bæres af membranen 3, og som indeholder 1250 picogram murin IgGl anti-epitop 328.C af ACE mærket med peroxidase.

Efter 30 sekunder er hele mængden af mærket antistof mættet med serumantigenerne. Lyseringen af membranen 3, som f. eks. er af gelatine 20

DK 165932B

(forstærket med et net af glasfibre) ved hjælp af kollagenase sker først efter disse 30 sekunder, hvilket fremkalder en strøm af serum indeholdende mærkede antistoffer mættet med serumantigener til den anden reaktionszone, hvori de bringes i kontakt med mikrokuglerne i laget 5, som 5 er belagt med de samme antigener. De tilbageholdes ikke af de antigener, hvormed mikrokuglerne 5 er belagt, da de mærkede antistoffers Fab-steder er mættet med serumantigenerne. Det i fluidet, som passerer gennem den anden reaktionszone, tilstedeværende enzym lyserer så den anden membran 3', hvilket fremkalder en strøm af fluidum til den anden reaktionszone.

10 I denne zone når hele mængden af mærkede antistoffer, som er bundet til serumantigenerne, i kontakt med substrattabletten, som f. eks. er af 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin, og de fremkalder en næsten øjeblikkelig farvning i nærvær af peroxidase. En strimmel anbragt under anordningen ifølge opfindelsen opsamler filtreringsproduktet og fremkalder således 15 det reaktionssignal, som viser graden af mærket materiale, som passerer gennem mikrokuglerne.

De forskellige koncentrationer af ACE i analyseprøven, som er 0,5 - 1-1,5-2-2,5-5-10-15-20 nanogram ACE/ml serum eller 25-50-75-100-125-250-500-750-1000 picogram ACE i de 50 /il af prøven, som skal .

20 analyseres, er vist i Fig. 4.

I kraft af de meget lave påvisningsgrænser, som anordningen og fremgangsmåden ifølge opfindelsen muliggør, er det muligt at udføre bestemmelser ifølge opfindelsen med en enkelt bloddråbe på 50 /il.

Det er ligeledes muligt at udføre flere diagnoser samtidig under 25 anvendelse af mikrokugler med forskellige diagnostiske markører.

Målefølsomheden er af størrelsesordenen 5 til 125 picogram, alt efter følsomheden af det anvendte monoklonale antistof. Det er derfor, at det anbefales at anvende ultraspecifikke monoklonale antistoffer.

Som omtalt ovenfor udgør de successive trin i anordningen ifølge 30 opfindelsen faser, som frembyder forskellig affinitet over for vand. Det øvre trin udgør således en absorptionsfase, mens mellemtrinnet udgør en desorptionsfase og det nedre trin en absorptionsfase. Denne vekslen opnås i det beskrevne eksempel i kraft af etableringen af en osmotisk glu-cosegradient. Herved opnås, at alle væskerne suges mod substratet i det 35 nedre trin, mens i tilfælde af negativ reaktion kun det mærkede materiale tilbageholdes på mikrokuglerne.

21

DK 165932B

Eksempel 6 - Kvalitativ test til påvisning af anti-HIV-antistoffer i fuldblod 6.1 Anordning til påvisning af anti-HIV-antistoffer i fuldblod 5 Materiale indeholdte stoffer Mængde

Behandlet bærer HIV-antigener mærket med af papir D.122 glucoseoxidase 50 ng 10 (GP 40 og GP 120) 1. membran, som skal underkastes program- lipider (jfr. Eksempel 1) meret lysering (MLP) 15

Fast fase af præpare- antistoffer, som er identiske overskud ret nylon med de søgte efterfulgt af vask og blokering 20 2. MLP lipider nylon TMB 3 μΐ via 1M citratpuffer 10 μΐ, pH 3,5 og D-glucose 10 μg 25 6.2 Funktion af anordningen 0122-papiret behandles ved hjælp af følgende opløsning: - 10 vægt/vol% skummetmælk - 1% gelatine 30 - rest sterilt destilleret vand.

Den på tabletarrangementet anbragte fuldblodsprøve forbliver ubevægelig i 30 sekunder, takket være det første MLP.

Dette lyseres efter 30 sekunders forløb med den i opløsningen til anbringelse af mærkede antigener indeholdte detergent (0,1% Tween 20), 35 hvilken i øvrigt har tre andre meget vigtige funktioner: - at beskytte antigen-peroxidasen - at accelerere hæmolysen - at tjene som blokeringsmiddel: undgå, at de mærkede antigener 22

DK 165932B

fikseres på D122 i tilfælde af langvarig opbevaring.

De eventuelle serum-antistoffer bindes til de mærkede antistoffer, som er indeholdt i den på D122-papiret aflejrede opløsning: 5 - 0,1% Tween 20 - 1% gelatine - glucoseoxidase-mærkede antigener 10 ng/μΐ

- rest PBS

10 5 μΐ af denne opløsning aflejres.

Ved en negativ prøve har de mærkede antigener 30 sekunder (tid til lysering af den 2. MLP) til at blive fikseret til antistofferne i den faste fase.

Ved en positiv prøve fikseres komplekset af serum-antistof-mærkede 15 antigener ikke til den faste fase, og'glucoseoxidasen, hvormed antigenerne er mærket, frembringer oxygeneret vand i kontakt med D-glucosen i fremkaldelsestabletten og tilvejebringer således substratet (H^O^) for hæmoglobinperoxidasen til farvning af TMB.

Efter 30 sekunder er den 2. MLP lyseret, og komplekset af de søgte 20 antistoffer og de med glucoseoxidasen mærkede antigener når til fremkaldelsestabletten.

Eksempel 7 - Semikvalitativ test til bestemmelse af ACE i fuldblod

Som angivet ovenfor i forbindelse med Fig. 1 omfatter anordningen i 25 de semikvalitative tests ifølge opfindelsen en første fast fase, som opfanger en forudbestemt mængde antigener svarende til en normalværdi, mens de antigener, som er til stede i blodet ud over denne værdi, kaldet normal, opfanges af en anden fast fase.

Den til denne test anvendte anordning er som følger: 30

Beskrivelse af anordningen:

Fast fase fikserede antiACE-antistoffer

Behandlet nylon opfangende 5 nanogram ACE/ml blod 35 1. MLP med 1 ipider behandlet D122-papir 50 ng antiACE antistoffer mærket

med giucoseoxidase bindes til overskydende ACE

23

DK 165932B

2. MLP med l ipider

Fast fase nr. 2 fikserede antigener, der opfanger de

mærkede antistoffer, som ikke er mættet med ACE

5 3. MLP med Iipider

Bærer nylon 3 μΊ TMB

10 μΐ 1M citratpuffer 10 μg D-glucose 10 Eksempel 8 - Kvalitativ test til påvisning af HCG i urin (kvalitativ test til påvisning af graviditet)

Anordningen ifølge opfindelsen har følgende struktur: 15 Anvendt materiale Indeholdt substans Mængde 1 - Durieux 122 papir 1M phosphatpuffer 10 μΐ 2 - Behandlet papir mærkede antistoffer 50 ng 3 - Membran til programme- acrylatcopolymer 20 ret lysering 4 - Mi krokugler af gel på søgt antigen overskud efter- nylon fulgt af vask og blokering 5 - Membran til programme- acrylatcopolymer 25 ret lysering 6 - D 122 papir tør D-glucose 50 μg 7 - D 122 papir glucoseoxidase 2 I.E.

8 - 0,65 μπι nylonporer behandlet med 3,3',5,5'-TMB 2,5 μg

30 citratpuffer, pH 3,5 10 μΐ 1M

De netop beskrevne 8 lag anbringes oven på hinanden og trykkes sammen med en passende plexiglaslamel, som er perforeret med en åbning på 2-8 mm i diameter.

Ved hjælp af en Gi 1son-pipette udtages 90 μΐ prøver af frisk afgi-35 vet urin og anbringes forsigtigt i åbningen.

En lille del af urinprøverne absorberes straks, og den anbragte dråbe forbliver ubevægelig i 20 sekunder, hvorefter den pludselig synker delvis sammen. De øvre tabletter forbliver fugtige. Efter 20 sekunder 24

DK 165932B

sker der en ny sammensynkning af urinprøverne, og set ovenfra ser anordningen fuldstændig tør ud.

Disse trin illustrerer godt den programmerede lysering af de to membraner, hvoraf den ene befinder sig under de mærkede antistoffer og 5 den anden under den faste fase.

Ved negativt resultat giver det frembragte oxygenerede vand i fravær af peroxidase-antistoffer en laksefarvet farvning i løbet af 1-2 minutter (resultat af lyset og på TMB).

Ved positiv reaktion viser der sig straks en intens azurblå plet.

10 For at bevare farverne er det nødvendigt at opbevare dem tørt, og især i mørke. I praksis behøver man blot at anbringe prøven i emballagen igen og lukke emballagen godt, hvis man vil vise resultatet på et senere tidspunkt. Under disse betingelser holder farvningen i flere dage.

15 Eksempel 9 - Semikvantitativ test til påvisning af LH-top i urin LH i urin forefindes i et basisniveau under hele cyklen. Der ses en betydelig top kort før og under ovulationen. Testens formål er følgelig ikke at fremkalde farvning ved LH-basisniveauet og at give et farvesig- 20 nal ved LH-top.

Til dette formål tilføjes et trin ved den øvre del over de mærkede antistoffer. Dette trin omfatter: - en fast fase præpareret med LH-antistoffer på en sådan måde, at kun den LH-mængde, som svarer til basisniveauet, opfanges på dette ni- 25 veau, - en membran til programmeret lysering, som giver anti-LH antistofferne i denne fase tid til at opfange'basisniveauet af LH.

Resten af anordningen er identisk med den kvalitative.

30 Anordning:

Durieux 122 papir 1M phosphatpuffer 10 μ^

Fast fase nr. 1: gel anti-LH-antistoffer basisniveau af mi krokugler

Membran nr. 1 til programme- 35 ret lysering (forkortet: MLP) acrylatcopolymer

Præpareret D122-papir - anti-LH-antistoffer 50 ng mærket med peroxidase 25

DK 165932B

MLP nr. 2

Fast fase nr. 2: gel af LH (antigen) overskud mikrokugler efterfulgt af vask og 5 blokering MLP nr. 3 0.122 D-glucose og glucoseoxidase

Nylon TMB plet på 2-3

Ml 10 + 1M citratpuffer 10 μΐ

Som alternativ kan de mærkede anti-LH-antistoffer opfanges i lipo-somer på niveau med fast fase nr. 1 for at give anti-LH-antistofferne fra fast fase nr. 1 en fortrinsret til at opfange basisniveauet af LH.

15 Som det vil fremgå af det foregående, er opfindelsen på ingen måde begrænset til de udførelsesformer og anvendelser, som er beskrevet på mere explicit måde. Den omfatter tværtimod alle de variationer, som fagmanden inden for området vil kunne udtænke uden at afvige fra opfindelsens ånd og rammer.

20

Claims (16)

1. Anordning til hurtig kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af en reaktiv ligand i et fluidum og af den art, som 5 omfatter en reaktionszone indeholdende et mærket reagens, i særdeleshed et mærket antistof eller et antigen, for reaktion med liganden, der skal identificeres, samt en fremkaldelseszone, hvilken anordning omfatter: - en første reaktionszone (13) omfattende en membran (3), som midlertidigt er impermeabel, hvilken zone er beregnet til at modtage en 10 prøve af testfluidum, og hvilken membran er beregnet til at blive forbundet med mindst ét passende mærket reagens, som er i stand til at genkende den eller de ligander, som skal identificeres, og som måtte være til stede i prøven, samt med en substans til opløsning eller et middel til lysering af membranen, 15. en anden reaktionszone (11), adskilt fra den første og midlerti digt isoleret derfra ved hjælp af nævnte membran (3), og omfattende en fast fase indeholdende et ikke-mærket referencereagens (5 eller 20), som er i stand til at genkende den eller de ligander, som skal identificeres, hvilken reaktionszone på den side, der ligger modsat den første 20 membran, midlertidigt er lukket med en anden membran (3'), som midlertidigt er impermeabel, og - en tredie reaktionszone (16), som midlertidigt er isoleret fra ovennævnte anden reaktionszone ved hjælp af nævnte anden membran (3'), indeholdende midler til fremkaldelse af den reaktion, som eventuelt har 25 fundet sted i den første eller anden reaktionszone, idet anordningen yderligere er karakteriseret ved, at de nævnte to membraner (3, 3') er fremstillet af et materiale, som er impermeabelt i et første tidsrum, som er tilstrækkelig langt til, at den reaktion, som skal ske i den pågældende reaktionszone, kan finde sted, idet nævnte materiale er et så- 30 dant, som opløses eller lyseres ved hjælp af den opløsende substans eller lyseringsmidlet efter dette første tidsrum, således at eventuelle produkter af reaktionen kan passere igennem og ind i den næste reaktionszone, idet nævnte opløsning eller lysering begynder samtidig med den reaktion, som skal finde sted i den pågældende reaktionszone. 35

2. Anordning ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT den opløsende substans eller lyseringsmidlet for membranerne er inkorporeret i den pågældende membran. DK 165932B

3. Anordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-2, KENDETEGNET ved, AT den opløsende substans eller lyseringsmidlet for membranerne ikke er inkorporeret i den pågældende membran. 5

4. Anordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, KENDETEGNET ved, AT den første reaktionszone (13) er egnet til at optage en fast fase (1), som hensigtsmæssigt er understøttet af den første membran (3), som omfatter mindst ét passende mærket reagens, eventuelt i for- 10 bi ndel se med et middel til lysering af membranen.

5. Anordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, KENDETEGNET ved, AT den faste fase, som indeholder et ikke-mærket referencereagens, som er til stede i den anden reaktionszone (11), består af en 15 uopløselig bærer (5 eller 20), til hvilken det ikke-mærkede reagens (specielt antistof eller antigen) er bundet, hvilket svarer til liganden, som skal påvises.

6. Anordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, KENDE-

20 TEGNET ved, AT den tredie reaktionszone (16) indeholder et kromogent substrat beregnet til aflæsning af reaktionen ved kolorimetri.

7. Anordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, KENDETEGNET ved, AT anordningen mellem den første og den anden reaktionszone 25 har en mellemliggende zone indeholdende et mærket reagens, i hvilket tilfælde den første reaktionszone indeholder et ikke-mærket reagens.

8. Anordning ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, AT den mellemliggende zone omfatter mindst ét lag af vesi'kuløse flerlagsstrukturer inde- 30 holdende mindst ét reagens, som er i stand til at blive frigjort efter et passende tidsrum ved hjælp af et passende lyseringsmiddel, såsom i særdeleshed et enzym.

9. Anordning ifølge krav 8, KENDETEGNET ved, AT den mellemliggen- 35 de zone er dannet af en mellemliggende membran, som er skudt ind imellem ovennævnte første membran og den anden reaktionszone, idet nævnte mellemliggende membran hensigtsmæssigt er forbundet med et mærket reagens, i hvilket tilfælde den første membran er forbundet med den samme type DK 165932B reagens som ovennævnte mellemliggende membran.

10. Anordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, KENDETEGNET ved, AT den tredie zone i anordningen er forbundet med et i sig 5 selv kendt apparat til kvantitativ bestemmelse, såsom RIA, spektrofoto-meter, etc.

11. Anordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, KENDETEGNET ved, AT ovennævnte reaktionszoner er overlejret til dannelse af 10 et øvre trin indeholdende den første reaktionszone, et mellemtrin indeholdende den anden reaktionszone og et nedre trin indeholdende den tredie reaktionszone, samt, såfremt det er hensigtsmæssigt, et mellemliggende trin imellem det øvre trin og mellemtrinnet indeholdende den mellemliggende reaktionszone. 15

12. Fremgangsmåde til hurtig kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af en reaktiv ligand i et fluidum, ved hvilken en prøve af fluidet, som skal analyseres, i et første trin bringes i kontakt med et mærket reagens, såsom i særdeleshed et mærket antistof eller 20 antigen, i en zone, som midlertidigt er isoleret fra de zoner, hvori de efterfølgende fremgangsmådetrin finder sted, i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at ligand-reagens reaktionen kan finde sted, hvorefter isoleringen af den zone, hvori nævnte reaktion har fundet sted, brydes ved hjælp af en substans til opløsning eller af et passende lyserings- 25 middel, som er til stede i nævnte zone, overført samtidig med nævnte fluidum til en midlertidigt impermeabel membran, som opløses ved kontakt med nævnte substans eller middel, - hvilken gradvise og programmerede opløsning eller lysering af den isolerende membran sker samtidig med nævnte reaktioner -, således at eventuelt reaktionsprodukt i et andet 30 trin kan komme i kontakt med et andet, ikke-mærket reagens svarende til liganden, som skal identificeres i ovennævnte fluidumprøve, i en anden zone, som er midlertidigt isoleret fra den efterfølgende zone, hvorefter isoleringen af den anden zone brydes på gradvis, programmeret og samtidig vis ved hjælp af nævnte opløsende substans eller lyseringsmiddel, 35 således at produktet fra den første eller den anden reaktion, under tredie fremgangsmådetrin, kan komme i kontakt med midler til påvisning af tilstedeværelsen - eller fraværet - af liganden, som skal påvises. DK 165932 B

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, KENDETEGNET ved, AT fluidumprøven bringes i kontakt med et ikke-mærket reagens under første fremgangsmådetrin, og at der forud for det andet fremgangsmådetrin udføres et mellemliggende trin, under hvilket det under første trin dannede ligand- 5 ikke-mærket reagenskompleks bringes i kontakt med et mærket reagens af samme art som det reagens, der anvendtes under første trin, i en zone, som er midlertidigt isoleret fra næste trin.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, KENDETEGNET ved, AT det ikke- 10 mærkede reagens, som bringes i kontakt med fluidumprøven for analyse under det første fremgangsmådetrin indføres i en given mængde svarende til en kendt mængde ligand såsom den, der skal påvises, og overskydende ligand, dvs. den ligand som under første trin ikke er blevet bundet til reagenset, under det mellemliggende fremgangsmådetrin opfanges af det 15 mærkede reagens, som nævnte overskydende ligand bindes til, hvorved reaktionen til fremkaldelse af den eventuelt tilstedeværende ligand i analysefluidet kun er positiv, såfremt mængden af ligand i fluidet er større end ovennævnte mængde, hvilket muliggør en semikvantitativ bestemmelse af den i fluidet tilstedeværende ligand. 20

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst kravene 12-14, KENDETEGNET ved, AT det første fremgangsmådetrin er en absorptionsfase, det andet fremgangsmådetrin er en desorptionsfase, og det tredie fremgangsmådetrin er en absorptionsfase. 25

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, KENDETEGNET ved, AT når fremgangsmåden omfatter et mellemliggende trin skudt ind mellem det første og det andet fremgangsmådetrin, er dette mellemliggende trin en absorptionsfase ligesom det første trin. 30 35