WO2018168905A1 - 糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマトデバイス - Google Patents

糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマトデバイス Download PDF

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加藤　大介
志野 村松
友洋 服部
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デンカ生研株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatographic device for extracting and measuring sugar chain antigens, which can be subjected to nitrous acid extraction treatment of sugar chain antigens on an immunochromatographic test piece.
  • Rapid diagnostic drugs based on the general immunochromatography method can be measured quickly and easily by suspending a specimen in a specimen suspension and supplying the suspension to an immunochromatographic test piece.
  • sodium nitrite and a neutralizing reagent are preliminarily contained in an immunochromatographic test piece, and the nitrite extraction treatment is performed on the immunochromatographic test piece only by floating the sample in an acidic solution such as acetic acid and supplying the specimen to the immunochromatographic test piece.
  • An acidic solution such as acetic acid
  • sugar chain antigens are extracted and sugar chain antigens are measured.
  • Nitrous acid is required to extract sugar chain antigens. Since nitrous acid is unstable by itself, nitrite extraction and antigen solution (acetic acid, citric acid, tartaric acid, etc.) are mixed thoroughly and antigen is extracted by generating nitrous acid.
  • a nitrous acid solution or an acid solution When detecting by immunochromatography, either a nitrous acid solution or an acid solution may be applied and dried, and then incorporated into an immunochromatographic test piece.
  • a reagent form compared with a liquid reagent, a reagent mixing operation is not required and the operation is simplified.
  • nitrous acid is used when a sample is developed in a short time after mixing the reagents, as in a normal immunochromatography method. Since the extraction process is not performed sufficiently, there is a problem that the sensitivity is insufficient.
  • the sample In the reagent form where nitrous acid is extracted by mixing liquid reagents, the sample is usually extracted for 1-2 minutes. Therefore, in order to obtain the same sensitivity as the liquid form, it was necessary to hold the sample for 1 to 2 minutes upstream from which the sample is neutralized.
  • the present invention relates to an immunochromatography method for extracting and measuring sugar chain antigens by extraction with nitrous acid on an immunochromatographic test piece, and a method enabling measurement with sufficient sensitivity by performing nitrite extraction treatment over a sufficient period of time.
  • An object is to provide an immunochromatographic device.
  • the present invention is as follows.
  • a sample pad to which a sample mixed with nitrite or an acidic solution is added, a labeled region containing a labeled antibody labeled with an antibody against a sugar chain antigen, and a detection region on which the antibody against the sugar chain antigen is immobilized,
  • An immunochromatographic test piece for measuring a sugar chain antigen by forming an antibody-sugar chain antigen-labeled antibody complex in a detection region, and having a region impregnated with a neutralizing reagent upstream of the labeled body region, Further, when using a specimen mixed with nitrite upstream of the area impregnated with the neutralizing reagent, it has an area impregnated with a solid acidic reagent, and impregnating nitrite when using a specimen mixed with an acidic solution.
  • An immunochromatographic test strip for extracting and measuring sugar chain antigens in a specimen and a container for storing the specimen, and having an specimen addition port on the sample pad of the test specimen
  • a Mato device (i) Holding the added sample sample solution and supplying the sample sample solution to the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite in a short time allows extraction of sugar chain antigens with nitrite and the solid acidic reagent. Has a wide sample addition port to promote, (ii) There is no gap between the addition port and the sample pad so that the sample does not escape from the addition port. Immunochromatographic device.
  • the solid acid reagent or nitrite on the immunochromatographic test piece, or the pad impregnated with the neutralizing reagent is made of a highly hydrophobic material, and the development time of the sample solution is slowed, so that nitrite and solid.
  • the highly hydrophobic material is selected from the group consisting of polyethylene, polyester, polystyrene, polypropylene, rayon and nylon.
  • Pads impregnated with solid acidic reagent or nitrite or neutralizing reagent on the immunochromatographic test piece are made of a material with high hydrophilicity. By slowing down the development time of the sample solution, nitrite and solid The immunochromatographic device according to [1] or [2], which promotes extraction of a sugar chain antigen with an acidic reagent. [6] The immunochromatographic device according to [5], wherein the highly hydrophilic material is a thick filter paper.
  • the immunochromatographic device By adding a surfactant to a pad impregnated with solid acidic reagent or nitrite or neutralizing reagent on an immunochromatographic test piece, and adjusting the development time of the sample solution, nitrite and solid acidic
  • the immunochromatographic device according to any one of [1] to [6], which facilitates extraction of a sugar chain antigen with a reagent.
  • the surfactant is selected from the group consisting of polyoxyethylene octyl phenyl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, sodium cholate, deoxycholic acid, sodium lauryl sulfate and sodium dodecylbenzene sulfonate.
  • the immunochromatographic device according to [7].
  • [9] By adding a polymer compound having an immobilizing action to a pad impregnated with a solid acidic reagent or nitrite or a neutralizing reagent on an immunochromatographic test piece, and adjusting the development time of the specimen sample solution, The immunochromatographic device according to any one of [1] to [8], which promotes extraction of a sugar chain antigen with nitrate and a solid acidic reagent.
  • the immunochromatographic device wherein the polymer compound having an immobilizing action is PVA or PLL.
  • the immunochromatographic device according to any one of [1] to [10], wherein the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite is present on the sample pad or the pad coated with the labeling region.
  • the solid acidic reagent is selected from the group consisting of malonic acid, malic acid, maleic acid, citric acid and tartaric acid.
  • the neutralizing reagent is trishydroxylmethylaminomethane or sodium hydroxide.
  • the immunochromatographic device according to any one of [1] to [13], wherein the sugar chain antigen is a protozoan, fungal, bacterial, mycoplasma, rickettsia, chlamydia or viral sugar chain antigen.
  • sugar chain antigen is extracted from the specimen by the action of nitrous acid generated by the reaction of nitrite and solid acidic reagent, and impregnated with neutralizing reagent In the region, the acidic solution containing the sugar chain antigen is neutralized,
  • the development time of the specimen sample solution on the immunochromatographic test piece after sample addition can be adjusted.
  • the sample processing performed on the test piece can be sufficiently performed with the sample processing reagent contained on the immunochromatographic test piece.
  • FIG. 3A shows a device of the present invention having a wide addition port 9
  • FIG. 3B shows a conventional device having a narrow addition port 9.
  • FIG. 4A shows a device of the present invention having a wide addition port 9
  • FIG. 4B shows a conventional device having a narrow addition port 9.
  • the present invention relates to an immunochromatography device that simplifies the nitrous acid extraction treatment of a sugar chain antigen so as to be performed on an immunochromatographic test piece, and enables rapid and accurate measurement of a sugar chain antigen as a substance to be detected.
  • the immunochromatographic device includes an immunochromatographic test piece and a container for storing the immunochromatographic test piece, and can be manufactured by incorporating the immunochromatographic test piece into the immunochromatographic device.
  • the storage container can prevent deterioration due to, for example, ultraviolet rays or moisture in the air. Further, when using a sample sample having a contamination property or an infectivity property, it is possible to prevent the tester who performs the assay from the containment vessel from being contaminated or infected.
  • an appropriately sized resin case may be used as a storage container, and the apparatus of the present invention may be stored in the case. Further, the surface of the test piece on which the antigen or antibody is immobilized may be covered with a resin film or the like (top laminate).
  • An immunochromatographic test strip is added with a support having a detection region on which an antibody (antibody 1) for capturing a substance to be detected (antigen, etc.) is immobilized, a labeled region having a movable labeled antibody (antibody 2), and a sample.
  • an antibody for capturing a substance to be detected (antigen, etc.)
  • a labeled region having a movable labeled antibody (antibody 2)
  • the number of detection regions and the type of labeled antibody included in the labeled body region are not limited to one, and two or more antigens can be tested in the same test by using antibodies corresponding to a plurality of substances to be detected. It can be measured with a piece.
  • the support is a material having the ability to immobilize an antibody for capturing a substance (antigen) to be detected, and has a performance that does not prevent the liquid from passing in the horizontal direction.
  • it is a porous thin film (membrane) having a capillary action, and is a material capable of transporting a liquid and components dispersed therein by absorption.
  • the material forming the support is not particularly limited, and examples thereof include cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, polyvinylidene difluoride (PVDF), glass fiber, nylon, and polyketone. Of these, a thin film or membrane using nitrocellulose is more preferred. A membrane on which an antibody is immobilized is called an antibody-immobilized membrane.
  • the labeled body region is composed of a porous base material containing a labeled antibody, and the material of the base material can be a commonly used glass fiber (glass fiber), non-woven fabric, or the like.
  • the substrate is preferably in the form of a pad having a thickness of about 0.3 mm to 0.6 mm in order to impregnate a large amount of labeled antibody.
  • the porous substrate impregnated with the labeled antibody and dried is also referred to as a dry pad.
  • enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase, metal colloids such as gold colloid, silica particles, cellulose particles, colored polystyrene particles, and colored latex particles are often used.
  • metal colloids such as gold colloid, silica particles, cellulose particles, colored polystyrene particles, and colored latex particles
  • coloring occurs due to aggregation of these labeling reagents, and this coloring is measured.
  • the particles on which the antibody is immobilized are called antibody-immobilized particles.
  • the detection region refers to a partial region of the support on which an antibody that captures a substance to be detected (antigen) is immobilized.
  • the detection region is provided with at least one region on which an antibody for capturing an antigen is immobilized.
  • the detection region may be included in the support, and the antibody may be immobilized on the support.
  • the sample pad is a part for adding a specimen and is a porous material.
  • the sample pad is the most upstream site of the immunochromatographic test strip.
  • As the material generally used filter paper, glass fiber, nonwoven fabric, and the like can be used.
  • it is preferably a pad shape having a thickness of about 0.3 mm to 1 mm. Samples include samples prepared using samples, such as samples obtained by floating samples in other solutions.
  • the absorption band is a member for absorbing components that are supplied to the support and are not involved in the reaction in the detection region.
  • As the material filter paper, sponge, etc. having high water retention composed of general natural polymer compounds, synthetic polymer compounds, etc. can be used, but those having high water absorption are preferable for promoting the development of the specimen. .
  • the backing sheet is a member for affixing and fixing all the above-mentioned materials, that is, the support, the sample pad, the marker region, the absorption band, etc. with a partial overlap.
  • the backing sheet is not necessarily required as long as these materials are arranged and fixed at an optimal interval, but it is generally preferable to use the backing sheet for convenience in manufacturing or use.
  • the immunochromatographic test piece of the present invention may further have a control display region (member).
  • the control display area is a site indicating that the test has been performed correctly.
  • the control display area exists downstream of the detection area, and when the specimen sample passes through the detection area and reaches the control display area, a signal is emitted by coloring or the like.
  • a substance that binds to the antibody to which the labeling carrier is bound may be immobilized, or a reagent such as a pH indicator that changes color when the sample arrives is immobilized. Also good.
  • the antibody to which the labeling carrier is bound is a mouse monoclonal antibody, an anti-mouse IgG antibody may be used.
  • the size of the immunochromatographic test piece is not limited, but is, for example, about several centimeters to several tens of centimeters in length and several millimeters to several centimeters in length.
  • the specimen passes through a porous flow path formed by a series of connections such as a sample pad, a labeled body region, a support, a detection region, and an absorption band. Therefore, in this embodiment, all of these become the specimen movement area.
  • a porous flow path formed by a series of connections such as a sample pad, a labeled body region, a support, a detection region, and an absorption band. Therefore, in this embodiment, all of these become the specimen movement area.
  • the specimen does not permeate the inside of the material and passes through the interface.
  • the specimen movement region defined in this specification does not matter whether the specimen is inside or the interface.
  • the sugar chain antigen is extracted by treating a specimen containing the sugar chain antigen with nitrous acid.
  • Nitrous acid can be generated by mixing a nitrite such as sodium nitrite with an acid, and a specimen containing a sugar chain antigen may be treated with the nitrous acid thus generated.
  • the extracted antigen binds to the antibody immobilized on the immunochromatographic test strip by antigen-antibody reaction. At this time, if nitrous acid remains in the reaction system, the reaction system becomes strongly acidic and the antigen-antibody reaction is inhibited. . Therefore, it is necessary to neutralize nitrous acid in the reaction system.
  • nitrite and acid are mixed to generate nitrous acid
  • the sugar chain antigen in the sample is extracted with the nitrous acid, neutralized with nitrous acid, and then immobilized on an immunochromatographic test piece.
  • the following method can be mentioned as a method of extracting and measuring the sugar chain antigen.
  • extraction and neutralization of sugar chain antigens with nitrous acid is performed on an immunochromatographic test piece.
  • an acidic reagent or nitrite may be impregnated on the immunochromatographic test piece.
  • the immunochromatographic test strip may be impregnated with a neutralizing reagent.
  • a specimen and an acidic solution are mixed in advance and added to a sample pad of an immunochromatographic test piece impregnated with nitrite and a neutralizing reagent.
  • the mixed solution reaches a region containing nitrite, the nitrite and acid react to generate nitrous acid, and the sugar chain antigen in the sample is extracted.
  • the extract of the sugar chain antigen is neutralized in the region impregnated with the neutralizing reagent on the immunochromatographic test piece, and the sugar chain antigen is bound to the antibody immobilized on the immunochromatographic test piece and can be detected.
  • Examples of the acidic solution used in the method include acetic acid, hydrochloric acid, malonic acid, malic acid, maleic acid, citric acid, and tartaric acid.
  • a sample and a nitrite solution are mixed in advance and added to the sample pad of an immunochromatographic test piece impregnated with an acidic reagent and a neutralizing reagent. When the mixed solution reaches the region containing the acidic reagent, nitrite and acid are added. Reacts to generate nitrous acid, and the sugar chain antigen in the sample is extracted. The extract of the sugar chain antigen is neutralized in the region impregnated with the neutralization reagent on the neutralized immunochromatographic test piece, and the sugar chain antigen is bound to the antibody immobilized on the immunochromatographic test piece and can be detected.
  • the sample pad is located upstream of the labeled region (upstream of the specimen flow and on the side where the sample pad is present), that is, the sample pad.
  • An acidic reagent or nitrate and a neutralizing reagent are impregnated inside or between the sample pad and the labeled body region.
  • An immunochromatographic test strip impregnated with nitrite and a neutralizing reagent in the sample pad or between the sample pad and the labeled body region can be used in the method (A).
  • an immunochromatographic test piece in which an acidic reagent and a neutralizing reagent are impregnated in the sample pad or between the sample pad and the labeled body region can be used in the method (B).
  • a solid acidic reagent is used as the acidic reagent impregnated in the immunochromatographic test piece.
  • the solid acidic reagent or nitrite may be impregnated in a sample pad, or impregnated in a solid acidic reagent impregnated porous material impregnated in a pad made of a porous material such as a nonwoven fabric different from the sample pad.
  • the material or nitrite-impregnated porous material may be placed between the sample pad and the label area, ie upstream of the label area.
  • the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite and the sample pad or the label region may or may not be in contact.
  • the region impregnated with the reagent is also referred to as a pad impregnated with the reagent.
  • the neutralizing reagent is disposed downstream of the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite.
  • the neutralization reagent may be impregnated into the sample pad, may be impregnated into the support, or impregnated into a pad made of a porous material such as a nonwoven fabric other than the support, and the neutralization obtained.
  • the reagent-impregnated porous material may be disposed between the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite and the label region.
  • the region impregnated with the neutralizing reagent and the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite or the labeled region may or may not be in contact.
  • a region impregnated with a solid acidic reagent is called a solid acidic reagent region
  • a region impregnated with nitrite is called a nitrite region
  • a region impregnated with a neutralizing reagent is a neutralizing reagent region or basic reagent region.
  • An immunochromatographic test strip having a solid acidic reagent region or nitrite region and a neutralizing reagent region is a sample pad from the upstream on the support, a solid acidic reagent region or nitrite region, a neutralizing reagent region, a labeled region, and a detection. It has a region and an absorption band, and the solid acidic reagent region or nitrite region may be on the sample pad.
  • the sample pad, solid acidic reagent region or nitrite region, neutralizing reagent region, labeling region, detection region, and absorption band may or may not be in contact with each other.
  • the solid acidic reagent used in the present invention is solid at normal temperature and does not volatilize at high temperature.
  • Preferred examples of the solid acidic reagent used in the present invention include malonic acid, malic acid, maleic acid, citric acid, and tartaric acid.
  • an acid with a high valence such as citric acid can be used for extraction in a smaller amount.
  • the acid dissociation constant is smaller. For example, maleic acid and tartaric acid are efficient.
  • a reagent that is not colored on the immunochromatographic test piece specifically, a reagent that is white in a dry state or difficult to be colored by drying heat or oxidation is preferable.
  • nitrite used in the present invention examples include sodium nitrite and potassium nitrite.
  • the amount of the solid acidic reagent or nitrite used in the present invention is not particularly limited, but is usually about 0.01 ⁇ g to 1 mg per test piece of the immunochromatographic test piece, preferably Is about 0.1 ⁇ g to 0.1 mg. However, it is preferable to select an optimal amount that is effective depending on the type of solid acidic reagent or nitrite used, the composition of the sample suspension, the amount added, and the like.
  • the solid acidic reagent or nitrite is dissolved once, applied and dried.
  • the neutralizing reagent used in the present invention is solid at normal temperature and does not volatilize at high temperature.
  • Preferred neutralizing reagents used in the present invention include tris base (trishydroxylmethylaminomethane), sodium hydroxide, dipotassium hydrogen phosphate, trisodium citrate, and a good buffer having a buffer capacity in an alkaline region. it can.
  • the amount of the neutralizing reagent used in the present invention is not particularly limited, but is usually about 0.01 ⁇ g to 1 mg, preferably 0.1 ⁇ g to 1 ⁇ g per test strip. About 0.1mg. However, it is preferable to select an optimal amount that is effective depending on the type of neutralizing reagent to be used, the composition of the sample suspension, the amount added, and the like.
  • the neutralizing reagent is dissolved once, the solution is applied to the sample pad or the porous material, and then dried.
  • FIGS. 1 and 2 are diagrams showing a preferred embodiment of a typical immunochromatographic test piece.
  • the immunochromatographic test piece shown in FIGS. 1 and 2 is an immunochromatographic test piece impregnated with a solid acidic reagent and a neutralizing reagent, but it may be impregnated with nitrate instead of the solid acidic reagent.
  • An immunochromatographic test piece impregnated with nitrate and neutralizing reagent is obtained.
  • a person skilled in the art can appropriately design and manufacture an immunochromatographic test piece impregnated with nitrate and a neutralizing reagent.
  • the immunochromatographic test piece is not limited to those shown in FIGS. 1 and 2. 1 and 2, 1 is a support, 2 is a marker region, 3 is a detection region, 4 is a sample pad, 7 is an absorption band, and 8 is a backing sheet. Moreover, you may affix a top laminate on the whole test piece.
  • FIGS. 1B and 2B are cut cross-sectional views.
  • a support 1 an absorption band 7, a marker body region 2, a sample pad 4, etc., each having a single detection region 3 are laminated on a backing sheet 8 made of resin or the like.
  • a backing sheet 8 made of resin or the like.
  • the other end and one end of the sample pad 4 are overlapped with each other, the solid acid reagent is impregnated in the upstream part of the sample pad 4, and the neutralizing reagent is placed in the downstream part of the sample pad after a short interval. Impregnated.
  • a region impregnated with the solid acidic reagent is referred to as a solid acidic reagent region 5, and a region impregnated with the neutralizing reagent is referred to as a neutralizing reagent region 6.
  • the sample pad also serves as the solid acidic reagent region 5 and the neutralizing reagent region 6. That is, a solid acidic reagent region and a neutralizing reagent region exist on the sample pad.
  • the solid acidic reagent region and the neutralizing reagent region are provided in the form of a single porous material (pad), and thus may be referred to as a single-pad test piece.
  • a single porous material pad
  • the solid acidic reagent region 5 and / or the neutralizing reagent region 6 are present upstream of the labeled body region 2, and these are overlapped, thereby forming a continuous lateral flow channel. ing.
  • the solid acidic reagent region 5 also serves as a sample pad. That is, a solid acidic reagent region is present on the sample pad.
  • the solid acidic reagent region and the neutralizing reagent region are provided in the form of two separate porous materials (pads), they may be referred to as a two-pad test piece.
  • An additional sample pad may be present upstream of the solid acidic reagent region.
  • FIG. 1 An additional sample pad may be present upstream of the solid acidic reagent region.
  • the solid acidic reagent region 5 and the neutralizing reagent region 6 are impregnated in different porous materials, but the same porous material (like the sample pad of the test piece in FIG.
  • the solid acidic reagent region 5 may be provided in the upstream portion on the pad), and the neutralizing reagent region 6 may be provided in the downstream portion.
  • the above-mentioned chromatography test piece is accommodated in the storage container described in FIGS. 3 and 4 and used as an immunochromatographic device (FIGS. 3 and 4).
  • 3 and 4 comprises a lower container part and an upper lid part.
  • the storage container includes a specimen addition port (also referred to as an addition hole) 9 and a determination unit 10.
  • the sample addition port that can supply the sample sample solution to the sample pad is located above the sample pad, and the sample is added when the sample is added to the sample addition port of the container. Soak into the sample pad.
  • the determination unit is positioned on the detection region, and the detection region can be observed through the hole of the determination unit of the container.
  • the immunochromatography device of the present invention is capable of performing nitrous acid extraction treatment of a sugar chain antigen on an immunochromatographic test piece.
  • a sufficient amount of time is required for the nitrite extraction treatment. Can be done.
  • the following structural features are structural features related to the mechanism for adjusting the specimen sample development rate.
  • the immunochromatography device of the present invention has a wide addition port.
  • a conventional immunochromatographic device (Quick Navi TM -Strep A, containing an immunochromatographic test piece having a vertical length of 5 to 9 cm, preferably 7 cm, and a horizontal length of 0.3 to 0.7 cm, preferably 0.5 cm.
  • the addition port of Denka Seiken is provided as a substantially rectangular addition port having a size of about 3.5 mm x about 5.5 mm (19.25 mm 2 ), but the immunochromatography device of the present invention for storing an immunochromatographic test piece of the same size is provided.
  • the addition port is provided as a substantially rectangular addition port having a size of about 3.5 mm ⁇ about 11 mm (38.5 mm 2 ).
  • a 3-5 mm x 8-15 mm (24-75 mm 2 ) Is an immunochromatography device having a wide addition port, and can exhibit the effects of the immunochromatography device of the present invention.
  • the long side of the addition port is a side parallel to the long side of the chromatography test piece, that is, a side along the flow direction of the specimen sample solution.
  • the length of the long side of the addition port is called the addition port length, and the length of the short side is sometimes called the addition port width.
  • the above example is a case of a substantially rectangular addition port, but the shape of the addition port may be triangular or circular.
  • the size of the addition port of the immunochromatography device of the present invention is expressed in terms of area, it is 24 to 75 mm 2 , preferably 35 to 75 mm 2 .
  • the sample processing capacity is weak because the area where the sample solution is in contact with the region impregnated with the sample processing reagent is weak, and the immunochromatographic test is performed. Since the sample processing was performed while the pieces were gradually developed, there was a difference in concentration of the sample processing reagent between the sample solution developed first and the sample solution developed later. Therefore, the sample processing could not be performed reliably.
  • the addition port of the immunochromatography device of the present invention is widely provided, a region where a large amount of sample sample solution is impregnated with the sample treatment reagent on the immunochromatography in a short time, that is, a region impregnated with the solid acidic reagent Or it can supply to the area
  • the specimen sample solution that can be supplied at one time is 10 ⁇ L to 200 ⁇ L.
  • the immunochromatography device of the present invention is configured such that there is no gap between the addition port and the sample pad located therebelow so that the sample does not escape from the addition port.
  • the immunochromatography device of the present invention has a wide addition port, and a large amount of specimen sample solution is supplied at a time. Further, the edge portion which is the outline of the addition port has a certain height (1 to 5 mm), and the supplied sample material solution is temporarily stored in the addition port.
  • the immunochromatography device of the present invention supports the sample pad by a backing sheet having an outer size equal to or larger than the outer size of the addition port so that the sample does not escape from the addition port. Since a force that presses the sample pad against the addition port works by the backing sheet and there is no gap between the addition port and the sample pad, it is possible to prevent escape of the sample solution.
  • the portion where the thickness of the sample pad is thin easily forms a gap with the addition port, and the sample solution is likely to escape.
  • the thin portion of the sample bat has a high pedestal of the container of the device, and the thick portion has a low pedestal. Since it can be configured so that there is no escape, it is possible to prevent escape of the sample solution.
  • the material (nonwoven fabric) used for the manufacture of the pad to be impregnated with the solid acid reagent, nitrite, neutralizing reagent, etc. of the immunochromatographic test piece is selected as a highly hydrophobic material. It is possible to adjust the flow speed, that is, the time for the specimen sample solution to develop on the immunochromatographic test strip.
  • examples of the highly hydrophobic material include polyethylene, polyester, polystyrene, polypropylene, rayon, and nylon.
  • the material of the porous material used in the region to be impregnated with the neutralizing reagent is a woven fabric having a basis weight of 10 to 400 g / m 2 and a thickness of 0.1 to 2.0 mm, and has a water absorption per 1 cm / m 2. 10 ⁇ 100 ⁇ l / cm 2 , water absorption speed is 1.0 ⁇ 5.0 ⁇ l / sec, and 1cm / m 2 is wetted with the membrane in contact with the membrane and left to stand for 5 minutes.
  • the liquid spreading area after standing for 5 minutes is 20 mm 2 or less, that is, it has high water absorption and water retention (liquid retention ) And a porous material having three characteristics of low or long-term liquid release.
  • Specific examples include filter paper made of cellulose cotton fiber and glass filter paper made of glass fiber. Examples of such filter paper include No. 26-3 of Toyo Filter Paper Co., Ltd.
  • the volume of the filter paper to be used is large, and an acidic solution that arrives later than the sample from the upstream can be sufficiently retained.
  • the “weight per unit area” of the porous material used in the region impregnated with the neutralizing reagent is 10 to 400 g / m 2 .
  • “weight per unit” refers to the weight per unit area (1 m 2 ) of cloth or the like.
  • the basis weight can be appropriately changed depending on the amount and composition of the neutralizing reagent impregnated in the pad. When the basis weight is 30 g / m 2 or less, the porosity is high, and when impregnated with a neutralizing reagent, it becomes easy to tear off, and handling during immunochromatography is difficult, so the basis weight is preferably 50 g / m 2 or more.
  • the porosity is low and it depends on the composition of the neutralizing reagent, but the sample does not penetrate the material smoothly and cannot be mixed with the neutralizing reagent, so it is 300 g / m 2 or less. It is preferable.
  • the most preferred basis weight is 250 to 270 g / m 2 .
  • the “thickness” of the porous material used in the region impregnated with the neutralizing reagent is preferably 0.1 to 2.0 mm, but the thickness can be appropriately changed depending on the amount and composition of the neutralizing reagent impregnated into the pad. .
  • the thickness is 0.4 mm or less, it is easy to tear when impregnated with a neutralizing reagent, and handling at the time of immunochromatography production becomes difficult. Therefore, the preferred thickness is 0.4 to 0.8 mm, and the amount that can be impregnated with the neutralizing reagent is In view of easy adjustment and ease of handling during immunochromatography production, about 0.6 mm is more preferable.
  • water soluble water absorption amount per 1 cm / m 2 is 10 ⁇ 100 ⁇ l / cm 2, and the water absorption speed is preferably from 1.0 ⁇ 5.0 ⁇ l / sec.
  • the amount of water absorbed and the speed of water absorption was prepared by preparing a 200 ⁇ l colored solution (1% Tween20 + Red No. 102) in one cell of a 96-well EIA plate and pasting a 5 ⁇ 60mm material on the backing sheet. Place the piece and immerse it in the solution as the lower end of the test piece, measure the time until the solution reaches the upper end of the test piece, and after the solution reaches the upper end, immediately remove the test piece and remain in the cell Measure the amount of liquid to be used.
  • the amount of water absorption is the amount of liquid obtained by subtracting the amount of liquid remaining in the cell from 200 ⁇ l and dividing it by the area of 1 cm 2 of the material.
  • the water absorption speed is determined by the amount of water absorption / time taken to reach the upper end.
  • a material having a large water absorption amount and a slow water absorption speed is preferable.
  • the water absorption is preferably 30 ⁇ l / cm 2 or more.
  • the water absorption speed of the material of the porous material used in the region impregnated with the neutralizing reagent affects the time for extracting the sugar chain antigen in the specimen and the time for neutralizing the test solution after extraction.
  • the time for extracting the sugar chain antigen can be adjusted to some extent by the material or composition of the solid acidic reagent, but since it is not complete, the water absorption speed of the material used in the region impregnated with the neutralizing reagent is It is an important factor for extraction and neutralization of sufficient sugar chain antigens.
  • the water absorption speed is preferably 1.0 to 5.0 ⁇ l / sec, and a more preferable water absorption speed is 2.0 ⁇ l / sec or less.
  • Water retention is a 1 cm / m 2 fragment of the porous material used in the area to be impregnated with the neutralizing reagent, placed on the membrane, 70 ⁇ l of the solution (1% Tween20 + Red No. 102) is added thereto, It is obtained by measuring the weight before and after standing for 5 minutes.
  • the amount of water retention varies depending on the composition of the solution to be added (surfactant and protein amount), but the amount of water retention when tested with a 1% Tween 20 solution is preferably 10-100 ⁇ l / cm 2 , more A preferable water holding amount is 15 ⁇ l / cm 2 or more.
  • Releasability refers to placing a 1 cm / m 2 piece of the porous material used in the region to be impregnated with the neutralizing reagent on the membrane, adding 70 ⁇ l of the solution (1% Tween20 + red No. 102) to it, Measure by calculating the area of the liquid spread on the membrane after 5 minutes of standing. The area varies depending on the composition of the solution to be added (surfactant and protein amount), but the area when tested with a 1% Tween 20 solution is 30 mm 2 or less, and more preferably 20 mm 2 or less.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a sample pad to which a sample mixed with nitrite or an acidic solution is added, a labeled region containing a labeled antibody labeled with an antibody against a sugar chain antigen, and a detection region on which the antibody against the sugar chain antigen is immobilized
  • An immunochromatographic test piece for measuring a sugar chain antigen by forming an antibody-sugar chain antigen-labeled antibody complex in a detection region, and having a region impregnated with a neutralizing reagent upstream of the labeled body region, Further, when using a specimen mixed with nitrite upstream of the area impregnated with the neutralizing reagent, it has an area impregnated with a solid acidic reagent, and impregnating nitrite when using a specimen mixed with an acidic solution.
  • An immunochromatographic test piece for extracting and measuring a sugar chain antigen in a sample having a region
  • the material of the region impregnated with the neutralizing reagent is a filter paper or glass filter paper having three properties of high absorbability, high water retention, low release or continuous release
  • the acidic solution containing the sugar chain antigen is sufficiently neutralized by the high water absorption and the high water retention of the region impregnated with the neutralizing reagent, and the release property of the region impregnated with the neutralizing reagent is low or
  • An immunochromatographic test strip that suppresses non-specific reactions by suppressing the remaining acidic solution from reaching the detection region due to sustained release, or by continuously developing a sufficiently neutralized test solution in the detection region .
  • An immunochromatographic test piece for extracting and measuring a sugar chain antigen in a sample having a region An immunochromatographic test piece in which a material in a region impregnated with a neutralizing reagent is a woven fabric having a basis weight of 10 to 400 g / m 2 and a thickness of 0.1 to 2.0 mm.
  • the acidic solution containing the sugar chain antigen is sufficiently neutralized due to the high water absorption and water retention of the region impregnated with the neutralizing reagent, and the release property of the region impregnated with the neutralizing reagent
  • the immunochromatographic test piece according to any one of [1] to [3], wherein the non-specific reaction is suppressed by accumulating a sufficient neutralizing ability even when the acidic solution remaining due to the persistence reaches the detection region.
  • the acidic solution containing the sugar chain antigen is sufficiently neutralized due to the high water absorption and water retention of the region impregnated with the neutralizing reagent, and the release property of the region impregnated with the neutralizing reagent
  • the low acidity prevents the remaining acidic solution from reaching the detection region, suppresses non-specific reactions when negative, and prevents line color development after the determination time when positive [1] to [ 4]
  • the immunochromatographic test piece [6] The immunochromatographic test piece according to any one of [1] to [5], wherein the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite is present on the sample pad or the pad on which the labeled region is applied.
  • the neutralizing reagent is trishydroxylmethylaminomethane or sodium hydroxide.
  • the sugar chain antigen is a sugar chain antigen of a protozoan, fungus, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia, or virus.
  • [10] A method for measuring a sugar chain antigen in a specimen by an immunochromatography method using the immunochromatographic test piece according to any one of [1] to [9], When the immunochromatographic test piece has a region impregnated with a solid acidic reagent, the sample is mixed with a nitrite solution. When the immunochromatographic test piece has a region impregnated with a nitrite, the sample is mixed with an acidic solution, and the immunochromatographic test is performed.
  • sugar chain antigen is extracted from the specimen by the action of nitrous acid generated by the reaction of nitrite and solid acidic reagent, and impregnated with neutralizing reagent
  • the acidic solution containing the sugar chain antigen is neutralized
  • an antibody-sugar chain antigen-labeled antibody complex is formed.
  • the sugar chain antigen is clarified by the high water absorption and water retention of the region impregnated with the neutralizing reagent.
  • Test solution in which the acidic solution is sufficiently neutralized and the remaining acidic solution is prevented from reaching the detection region due to low release or sustained release of the region impregnated with the neutralizing reagent, or is sufficiently neutralized A method of measuring a sugar chain antigen in a sample by suppressing non-specific reaction by continuously adding to the detection region.
  • polyoxyethylene octylphenyl ethers such as Triton X-100 and Triton X-114 are used to impregnate a highly hydrophobic pad that is impregnated with a solid acidic reagent, a specimen treatment reagent such as nitrite or a neutralizing reagent; 20, Polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as Tween 80; Polyoxyethylene alkyl ethers such as Brij-35 and Brij-58; Cholic acid systems having a steroid skeleton such as sodium cholate and deoxycholic acid; Sodium lauryl sulfate, dodecyl
  • a surfactant such as an anionic surfactant such as sodium benzenesulfonate and controlling the hydrophobicity of the reagent, the sample processing time on the addition port can be designed to an arbitrary time.
  • the time can be sufficiently processed for the specimen, and the specimen sample solution can be appropriately developed. That is, the sample can be sufficiently treated with a solid acidic reagent or nitrite to extract the sugar chain antigen, and can be developed downstream with the pad impregnated with the neutralizing reagent.
  • Hydrophilicity as a material used in the manufacture of pads that are impregnated with solid acidic reagents, specimen processing reagents such as nitrites and neutralizing reagents in immunochromatographic test strips, rather than being controlled with highly hydrophobic pads and surfactants It is also possible to select a material having a high value and adjust the flow rate of the liquid, that is, the time for the specimen sample solution to develop on the immunochromatographic test piece.
  • An example of a highly hydrophilic material is a thick filter paper, and the thickness is 210 to 580 ⁇ m.
  • a surfactant for example, PVA (polyvinyl alcohol) or PLL (poly L-lysine)
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PLL poly L-lysine
  • the time for the added specimen sample solution to develop on the immunochromatographic test piece is lengthened, and the downstream neutralizing reagent is used. Development to the impregnated pad (neutralizing reagent region) can be delayed.
  • the immunochromatographic device having at least one of the structures (1), (2), and (3) above is not only a device for extracting nitrite of a sugar chain antigen on an immunochromatographic test piece, but also an immunochromatographic device. It can be used as an immunochromatographic device for treating a specimen on a test piece with a reagent impregnated on the test piece.
  • the present invention can be used not only for extraction with nitrous acid but also for the purpose of incubating the analyte for detection on the immunochromatographic reagent test device with pH or a compound.
  • a method of using the device of the present invention will be described based on the immunochromatographic device in which the immunochromatographic test piece having the form shown in FIG.
  • the following method of use is a method in which a sample is mixed with a nitrite solution and measured using an immunochromatography method impregnated with a solid acidic reagent and a neutralizing reagent.
  • a method of measuring using an immunochromatographic test method impregnated with a neutralizing reagent can also be performed with reference to the explanation of the following method of use.
  • the measurement is started by contacting and mixing a specimen or a sample prepared using the specimen with a nitrite solution, suspending the specimen in the nitrite solution, and adding it to the specimen addition port of the device. At this time, 5 to 100 ⁇ L of the sample and 0.01 to 2 mL of 0.1 M to 8 M nitrite may be mixed, and 5 to 200 ⁇ L may be supplied to the addition port.
  • nitrites include sodium nitrite and potassium nitrite.
  • a specimen containing a sugar chain antigen, which is a substance to be detected, provided to the addition port 9 moves to the sample pad and is developed into the solid acidic reagent region 5 and the neutralizing reagent region 6 on the sample pad 4 by capillary action. Furthermore, it expands
  • the nitrite mixed in the sample and the solid acidic reagent on the solid acidic reagent region 5 react to generate free nitrous acid. Is extracted.
  • the extracted sugar chain antigen moves to the neutralizing reagent region 6 together with the acidic developing solution, and the pH of the acidic developing solution containing the sugar chain antigen is neutralized in the neutralizing reagent region 6 and adjusted to the neutral region. .
  • the sugar chain antigen develops and moves further downstream under neutral conditions.
  • the labeled body region 2 the labeled antibody is released into the liquid and developed on the support 1 as the specimen sample is developed.
  • the sugar chain antigen is specifically captured by the capture antibody in the detection region 3 of the support 1, and the sugar chain antigen forms a complex by a specific reaction with the labeled antibody. To do.
  • an antibody sandwich via the sugar chain antigen is established in the detection region 3, and the labeled antibody-sugar chain antigen complex can be measured in the detection region 3.
  • the detection region can be observed through the determination unit of the immunochromatography device.
  • the sugar chain antigen in the sample is extracted on the immunochromatographic test strip, the sugar chain antigen in the sample is extracted in advance before the measurement using the immunochromatographic test strip.
  • the sugar chain antigen in the sample can be measured in one step.
  • the specimen addition port may have an area substantially the same as a pad containing a solid acidic reagent (solid acidic reagent region). By doing so, a larger number of samples can instantaneously come into contact with the solid acidic reagent. Furthermore, by adopting a non-hydrophobic non-woven fabric as a member to be applied / impregnated, it is possible to prevent the material from being spread to the pad (neutralizing reagent region) impregnated with the downstream neutralizing reagent immediately after the sample is added. By doing so, the sample is retained in the specimen addition part for 1 to 2 minutes, and sufficient antigen extraction can be performed.
  • the solid acidic reagent region or nitrite region and the neutralizing reagent region when the solid acidic reagent region or nitrite region and the neutralizing reagent region are in contact with each other, there is a liquid between the solid acidic reagent region or nitrite region and the neutralizing reagent region. It is provided so as to sandwich a sheet that does not pass through. By providing the sheet, the following three effects can be achieved.
  • (A) It is possible to suppress the movement of the reagent in two adjacent areas when storing the test piece. As a result, it is possible to prevent a reaction caused by contact between the solid acidic reagent or nitrite and the neutralizing reagent. As a result, the stability of the reagent can be improved.
  • the material of the sheet provided between the solid acidic reagent region or the nitrite region and the neutralizing reagent region is not limited as long as the material does not allow liquid to pass through.
  • a resin sheet such as a PET (polyethylene terephthalate) sheet or a polyethylene sheet Can be used.
  • the resin sheet is also called a resin film.
  • the sheet may be provided so that the solid acidic reagent region or nitrite region and the neutralizing reagent region are partially in contact with each other.
  • the length of the overlapping portion of the solid acidic reagent region or nitrite region and the neutralizing reagent region is preferably as short as possible, for example, 5 mm or less, preferably 3 mm or less, more preferably 2 mm or less.
  • the sheet may be provided such that the solid acidic reagent region or nitrite region and the neutralizing reagent region do not contact each other, and a pad impregnated with the acidic reagent or nitrite covers the PET sheet.
  • the neutralization region is completely covered with the sheet, and the solid acidic reagent region or the nitrous acid region may be provided on the sheet.
  • the liquid in the solid acidic reagent region or the nitrous acid region does not move directly to the neutralization region, but reaches the neutralization reagent region after flowing on the sheet.
  • the sheet may be provided only between the solid acidic reagent region or the nitrite region and the neutralizing reagent region.
  • the solid acidic reagent region or nitrous acid region is a sample other than the solid acidic reagent region or nitrous acid region.
  • attach it so that it covers the neutralization reagent area other than the sample pad, the label area, the support, the detection area, and the absorption band, and place the solid acidic reagent area or nitrite area above the neutralization reagent area. What is necessary is just to affix on the upper part of the affixed top laminate sheet.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a sample pad to which a sample mixed with nitrite or an acidic solution is added, a labeled region containing a labeled antibody labeled with an antibody against a sugar chain antigen, and a detection region on which the antibody against the sugar chain antigen is immobilized
  • An immunochromatographic test piece for measuring a sugar chain antigen by forming an antibody-sugar chain antigen-labeled antibody complex in a detection region, and having a region impregnated with a neutralizing reagent upstream of the labeled body region, Further, when using a specimen mixed with nitrite upstream of the area impregnated with the neutralizing reagent, it has an area impregnated with a solid acidic reagent, and impregnating nitrite when using a specimen mixed with an acidic solution.
  • An immunochromatographic test piece for extracting and measuring a sugar chain antigen in a sample having a region A resin sheet was sandwiched between the area impregnated with the solid acidic reagent or nitrite and the area impregnated with the neutralizing reagent so as to suppress the movement of the reagent between the two areas or the movement of the sample solution.
  • Immunochromatographic specimen [2] The immunochromatographic test piece according to [1], wherein a region impregnated with a solid acidic reagent or nitrite is present on the sample pad.
  • the sugar chain antigen is a sugar chain antigen of a protozoan, fungus, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia or virus.
  • [9] A method for measuring a sugar chain antigen in a specimen by an immunochromatography method using the immunochromatographic test piece according to any one of [1] to [8], When the immunochromatographic test piece has a region impregnated with a solid acidic reagent, the sample is mixed with a nitrite solution. When the immunochromatographic test piece has a region impregnated with a nitrite, the sample is mixed with an acidic solution, and the immunochromatographic test is performed.
  • sugar chain antigen is extracted from the specimen by the action of nitrous acid generated by the reaction of nitrite and solid acidic reagent, and impregnated with neutralizing reagent
  • the acidic solution containing the sugar chain antigen is neutralized
  • an antibody-sugar chain antigen-labeled antibody complex is formed.
  • the immunochromatography method controls the speed and direction of specimen development on the immunochromatographic test strip, and uses an acidic reagent, nitrite, and neutralizing reagent.
  • a biological sample to be a specimen is not particularly limited, and examples thereof include body fluids such as serum, plasma, blood, urine, feces, saliva, tissue fluid, spinal fluid, wiping fluid, and the like, or dilutions thereof.
  • the substance to be detected is a sugar chain antigen that can be measured by an immunoassay, that is, an assay using an antigen-antibody reaction.
  • the antigen include polysaccharides that are sugar chain antigens present on the cell walls of bacteria extracted by nitrite extraction treatment. Protozoa, fungi, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia, viruses and the like containing these substances can also be measured.
  • the subject's biological sample contains sugar chain antigens derived from protozoa, fungi, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia, virus, etc.
  • sugar chain antigens derived from protozoa, fungi, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia, virus, etc.
  • a sugar chain antigen it can be determined that the subject is suffering from an infection caused by protozoa, fungi, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia, viruses, and the like.
  • group A ⁇ -hemolytic streptococci Streptococcus pyogenes
  • Escherichia coli Legionella, Campylobacter, etc.
  • Example 1 Examination of size of addition port Immobilization of anti-Streptococcus pyogenes (Group A ⁇ -hemolytic streptococci) antibody on nitrocellulose membrane (support) Anti-Streptococcus pyogenes antibody diluted with purified water to 1.0 mg / mL and anti-rabbit IgG antibody The anti-Streptococcus pyogenes antibody was applied to the sample pad side of the nitrocellulose membrane lined with a PET (polyethylene terephthalate) film and the anti-rabbit IgG antibody was applied linearly to the absorption band side. Thereafter, the nitrocellulose membrane was dried at 45 ° C.
  • an anti-Streptococcus pyogenes antibody-immobilized membrane This membrane is referred to as “antibody-immobilized membrane” in this example.
  • antibody-immobilized membrane This membrane is referred to as “antibody-immobilized membrane” in this example.
  • Anti-Streptococcus pyogenes antibody was diluted with purified water to 1.0 mg / mL, and colored polystyrene particles were added to this to 0.1%. After stirring, carbodiimide was added. Add to 1% and stir further.
  • the immunochromatographic test piece is from the upstream along the sample flow, solid acid reagent-impregnated nonwoven fabric, neutralizing reagent (basic reagent) -impregnated nonwoven fabric, dry pad (labeled body region), antibody-immobilized membrane (detection region) ), Having an absorption band. 7).
  • Immunochromatography Device The immunochromatographic test piece of the present invention was incorporated into an immunochromatography device (conventional device) having an addition port length of 5 mm and an immunochromatography device (device of the present invention having a wide addition port), and the following tests were carried out. 8. Sample Streptococcus pyogenes was cultured, and the culture solution was adjusted to 1.0 ⁇ 10 7 CFU / mL with physiological saline.
  • Example 2 Examination of coating amount of surfactant The test results (Table 2) were compared and examined under the conditions of the solid acid reagent surfactant TritonX100 concentration of 0.5% and 2.0% in the production of the solid acid reagent impregnated nonwoven fabric.
  • the infection of group A ⁇ -hemolytic streptococci can be detected with high sensitivity using the immunochromatography device of the present invention.

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Abstract

イムノクロマト試験片上で亜硝酸抽出により糖鎖抗原を抽出し測定するイムノクロマト法において、亜硝酸抽出処理を十分な時間をかけて行うことにより十分な感度での測定を可能にする方法及びイムノクロマトデバイスの提供。　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片と該試験片を格納する容器よりなる、試験片のサンプルパッドに検体添加口を有するイムノクロマトデバイスであって、 (i)　添加した検体試料溶液を保持し検体試料溶液を前記固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域に短時間で供給することにより亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進するための広い検体添加口を有し、 (ii)　添加口から試料が逃げこぼれないよう、添加口とサンプルパッドの間に隙間がない、 イムノクロマトデバイス。

Description

糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマトデバイス
　本発明は、イムノクロマト試験片上で糖鎖抗原の亜硝酸抽出処理をすることが可能な、糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマトデバイスに関する。
　イムノクロマト法を原理とする迅速診断薬の多くは、ウイルス又は細菌感染症を迅速・簡便に測定し、治療方針を決定する一つの手段として広く使用されている。
　一般的なイムノクロマト法を原理とする迅速診断薬は、検体を検体浮遊液に浮遊させた後、その浮遊液をイムノクロマト試験片に供給することで迅速・簡便に測定できる。
　Ａ群β溶血性レンサ球菌（Ａ群β溶連菌）、口腔内レンサ球菌等ストレプトコッカス属に属する微生物を検出するためには糖鎖抗原を抽出し、糖鎖抗原を測定する必要がある。
　例えば、イムノクロマト試験片に予め亜硝酸ナトリウムと中和試薬を含ませておき、検体を酢酸等の酸性溶液に浮遊してイムノクロマト試験片に供給する操作のみで亜硝酸抽出処理をイムノクロマト試験片上で行う方法が報告されている（特許文献１）。
　また、イムノクロマト試験片に予め酸性試薬と中和試薬を含ませておき、検体を亜硝酸塩に浮遊してイムノクロマト試験片に供給する方法もある。
　イムノクロマト法においては、イムノクロマト試験片におけるクロマト展開スピードを制御する必要があることがあり、デバイス形状で制御するもの、貼り合わせ位置で制御するもの、使う素材（不織布などのマテリアル）で制御するもの、試薬で制御するもの等のイムノクロマト法が報告されている（特許文献２及び３）。
国際公開WO2005/121794号公報 特開2005-331471号公報 特開2005-331463号公報
　Ａ群β溶血性レンサ球菌（Ａ群β溶連菌）、口腔内レンサ球菌等ストレプトコッカス属に属する微生物を検出するためには糖鎖抗原を抽出し、糖鎖抗原を測定する。
　糖鎖抗原を抽出するためには、亜硝酸が必要である。亜硝酸は単独では不安定なので、亜硝酸抽出には、亜硝酸塩溶液と酸溶液（酢酸・クエン酸・酒石酸など）を用事混合し、亜硝酸を発生させることで抗原抽出を行っている。
　イムノクロマト法で検出する場合、亜硝酸溶液又は酸溶液のどちらか一方を、塗布・乾燥させ、イムノクロマト試験片に組み込めばよい。このような試薬形態では、液状試薬と比較して、試薬の混合操作が不要で操作が簡便になる一方で、試薬混合後、通常のイムノクロマト法のように短時間で試料が展開すると、亜硝酸抽出処理が十分に行われないため、感度不足になるという課題があった。
　液状試薬を混合して亜硝酸抽出をする試薬形態では、通常試料を1～2分抽出する。したがって、液状形態と同等の感度を出すためには、試料が中和される上流で、1～2分間保持されることが必要であった。
　本発明は、イムノクロマト試験片上で亜硝酸抽出により糖鎖抗原を抽出し測定するイムノクロマト法において、亜硝酸抽出処理を十分な時間をかけて行うことにより十分な感度での測定を可能にする方法及びイムノクロマトデバイスの提供を目的とする。
　本発明者らは、イムノクロマト試験片上で糖鎖抗原の亜硝酸抽出処理をすることが可能な、糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト法において、亜硝酸抽出処理を十分な時間をかけて行わせる技術について鋭意検討を行った。
　そこで、イムノクロマトデバイスの添加口を広くし、大量の検体を添加できるようにし、なおかつ、添加口から検体が流出せず、展開速度を調節する仕組みを組み込むことにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下のとおりである。
[１]　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片と該試験片を格納する容器よりなる、試験片のサンプルパッドに検体添加口を有するイムノクロマトデバイスであって、
(i)　添加した検体試料溶液を保持し検体試料溶液を前記固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域に短時間で供給することにより亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進するための広い検体添加口を有し、
(ii)　添加口から試料が逃げこぼれないよう、添加口とサンプルパッドの間に隙間がない、
イムノクロマトデバイス。
[２]　イムノクロマトデバイスの検体添加口が24～75mm2のサイズを有する、[１]のイムノクロマトデバイス。
[３]　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドが疎水性の高い素材からなり、検体試料溶液の展開時間を遅くすることにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、[１]又は[２]のイムノクロマトデバイス。
[４]　疎水性の高い素材が、ポリエチレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、レーヨン及びナイロンからなる群から選択される、[３]のイムノクロマトデバイス。
[５]　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドが親水度の高い素材からなり、検体試料溶液の展開時間を遅くすることにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、[１]又は[２]のイムノクロマトデバイス。
[６]　親水度の高い素材が厚みのある濾紙である、[５]のイムノクロマトデバイス。
[７]　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドに界面活性剤を添加し、検体試料溶液の展開時間を調節することにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、[１]～[６]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[８]　界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、ラウリル硫酸ナトリウム及びドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムからなる群から選択される、[７]のイムノクロマトデバイス。
[９]　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドに固定化作用のある高分子化合物を添加し、検体試料溶液の展開時間を調節することにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、[１]～[８]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[１０]　固定化作用のある高分子化合物がPVA又はPLLである、[９]のイムノクロマトデバイス。
[１１]　固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域が、サンプルパッド上もしくは、標識体領域が塗布されたパッド上に存在する、[１]～[１０]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[１２]　固形状酸性試薬が、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸からなる群から選択される、[１]～[１１]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[１３]　中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、[１]～[１２]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[１４]　糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、[１]～[１３]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[１５]　[１]～[１４]のいずれかのイムノクロマトデバイスを用いてイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法であって、
　イムノクロマトデバイスが固形状酸性試薬を含浸させた領域を有するときには検体を亜硝酸溶液と混合し、イムノクロマトデバイスが亜硝酸塩を含浸させた領域を有するときには検体を酸性溶液と混合し、前記イムノクロマトデバイスのサンプルパッドに添加することを含み、
　固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸塩を含浸させた領域において、亜硝酸塩と固形状酸性試薬の反応により発生した亜硝酸の作用により検体から糖鎖抗原が抽出され、　中和試薬を含浸させた領域において、前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が中和され、
　検出領域において、抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体が形成される、イムノクロマト法により、糖鎖抗原の抽出を促進して、検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-049163号の開示内容を包含する。
　本発明のイムノクロマトデバイスを用いた場合、試料添加後のイムノクロマト試験片上での検体試料溶液の展開時間を調節することができる。その結果、イムノクロマト試験片上に含ませた検体処理試薬により試験片上で行われる検体処理を十分に行うことができる。
固形状酸性試薬領域及び中和試薬領域を有するイムノクロマト試験片（１枚パッド試験片）の構造を模式的に示す図である。 固形状酸性試薬領域及び中和試薬領域を有するイムノクロマト試験片（２枚パッド試験片）の構造を模式的に示す図である。 イムノクロマトデバイスの外観を示す斜視図である。図３Ａは添加口９が広い本発明のデバイスであり、図３Ｂは添加口９が狭い従来のデバイスである。 イムノクロマトデバイスの外観を示す平面図である。図４Ａは添加口９が広い本発明のデバイスであり、図４Ｂは添加口９が狭い従来のデバイスである。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、糖鎖抗原の亜硝酸抽出処理をイムノクロマト試験片上で行えるように簡便化し、被検出物質である糖鎖抗原を迅速かつ正確に測定することを可能にするイムノクロマトデバイスに係る。イムノクロマトデバイスは、イムノクロマト試験片とそれを格納する容器からなり、イムノクロマト試験片をイムノクロマトデバイスに組込んで作製できる。該格納容器により、例えば紫外線や空気中の湿気による劣化を防ぐことができる。また、汚染性、感染性の有る検体試料を用いる場合、格納容器によりアッセイを行う試験者が汚染又は感染するのを防止することができる。例えば適当な大きさの樹脂製ケースを格納容器として用い、該ケース中に本発明の装置を収納すればよい。また、抗原又は抗体を固定化した試験片の表面を樹脂製フィルム等（トップラミネート）で覆ってもよい。
　イムノクロマト試験片は、被検出物質（抗原等）を捕捉する抗体（抗体１）が固定化された検出領域を有する支持体、移動可能な標識抗体（抗体２）を有する標識体領域、検体を添加するサンプルパッド、展開された検体液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシート等を具備する。
　なお、検出領域の数及び標識体領域に含まれる標識抗体の種類は１つに限られるものではなく、複数の被検出物質に対応する抗体を用いることで、２つ以上の抗原を同一の試験片にて測定することができる。
　支持体は、被検出物質（抗原）を捕捉するための抗体を固定化する性能を持つ材料であり、かつ液体が水平方向に通行することを妨げない性能を持つ。好ましくは、毛細管作用を有する多孔性薄膜（メンブレン）であり、液体及びそれに分散した成分を吸収により輸送可能な材料である。支持体を成す材質は特に限定されるものではなく、例えばセルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ガラス繊維、ナイロン、ポリケトンなどが挙げられる。このうちニトロセルロースを用いて薄膜又はメンブレンとしたものがより好ましい。抗体を固定化したメンブレンを抗体固定化メンブレンと呼ぶ。
　標識体領域は、標識抗体を含む多孔性基材から成り、基材の材質は一般的に用いられているガラス繊維（グラスファイバー）や不織布等を用いることができる。該基材は、多量の標識抗体を含浸させるために、厚さ0.3mm～0.6mm程度のパッド状であることが好ましい。標識抗体を含浸させ乾燥させた多孔性基材を乾燥パッドとも呼ぶ。
　標識抗体の標識には、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド、シリカ粒子、セルロース粒子、着色ポリスチレン粒子及び着色ラテックス粒子等が用いられることが多い。金属コロイド粒子、着色ポリスチレン粒子や着色ラテックス粒子等の着色粒子を用いる場合には、これらの標識試薬が凝集することによって着色が生じるので、この着色を測定する。抗体を固定化した粒子を抗体固定化粒子と呼ぶ。
　検出領域は、被検出物質（抗原）を捕捉する抗体が固定化された支持体の一部の領域を指す。検出領域は、抗原を捕捉するための抗体を固定化した領域を少なくとも１つ設ける。検出領域は支持体に含まれていればよく、支持体上に抗体を固定化すればよい。
　サンプルパッドは、検体を添加するための部位であり、多孔性材料である。サンプルパッドはイムノクロマト試験片の最も上流にある部位である。該材料には一般的に用いられる濾紙、ガラス繊維、不織布等を用いることができる。多量の検体を免疫測定に用いるために、厚さ0.3mm～1mm程度のパッド状であることが好ましい。検体には、検体を他の溶液に浮遊して得られる試料等、検体を用いて調製された試料も含む。
　吸収帯は、支持体に供給され検出領域で反応に関与しなかった成分を吸収するための部材である。該材料には、一般的な天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高い濾紙、スポンジ等を用いることができるが、検体の展開促進のためには吸水性が高いものが好ましい。
　バッキングシートは、前述の全ての材料、すなわち支持体、サンプルパッド、標識体領域、吸収帯等が、部分的な重なりをもって貼付・固定されるための部材である。バッキングシートは、これらの材料が最適な間隔で配置・固定されるのであれば、必ずしも必要ではないが、製造上あるいは使用上の利便性から、一般的には用いた方が好ましい。
　本発明のイムノクロマト試験片には、さらに対照表示領域(部材）が存在していてもよい。対照表示領域は試験が正確に実施されたことを示す部位である。例えば、対照表示領域は、検出領域の下流に存在し、検体試料が検出領域を通過し、対照表示領域に到達したときに着色等によりシグナルを発する。対照表示領域には、標識担体を結合させた抗体に結合する物質を固相化しておいてもよいし、検体が到達したときに色が変化するpHインジケーター等の試薬を固相化しておいてもよい。標識担体を結合させた抗体がマウスモノクローナル抗体の場合、抗マウスIgG抗体を用いればよい。
　イムノクロマト試験片の大きさは限定されないが、例えば、縦の長さ数cm～十数cm、横の長さ数mm～数cm程度である。
　上記の形態の試験片において、検体は、サンプルパッド、標識体領域、支持体、検出領域、吸収帯等の一連の接続により形成された多孔性流路を通過する。よって本形態においては、これら全てが検体移動領域となる。各構成材料の材質や形態によって、検体が材料内部を浸透せず界面を通行する形態もありうるが、本明細書で定義する検体移動領域は材料の内部か界面かを問わないため、該形態の試験片も本明細書の範囲に含まれる。
　本発明のイムノクロマト試験片を用いて検体中の糖鎖抗原を測定する場合、最初に検体中の糖鎖抗原を抽出する必要がある。糖鎖抗原の抽出は、糖鎖抗原を含む検体を亜硝酸で処理することにより行う。亜硝酸は亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩を酸と混合することにより発生させることができ、このようにして発生させた亜硝酸で糖鎖抗原を含む検体を処理すればよい。抽出した抗原はイムノクロマト試験片上に固相化した抗体に抗原抗体反応により結合するが、この際、反応系に亜硝酸が残っていると反応系は強酸性になり、抗原抗体反応が阻害される。そこで、反応系の亜硝酸を中和する必要がある。
　本発明において、亜硝酸塩と酸を混合し亜硝酸を発生させて、該亜硝酸により検体中の糖鎖抗原を抽出して、亜硝酸を中和した上で、イムノクロマト試験片上に固相化した抗体に糖鎖抗原を結合させ、糖鎖抗原を測定する方法において、糖鎖抗原を抽出して測定する方法として以下の方法が挙げられる。いずれの方法においても、亜硝酸による糖鎖抗原の抽出と中和はイムノクロマト試験片上で行う。亜硝酸による糖鎖抗原の抽出をイムノクロマト試験片上で行うためには、イムノクロマト試験片上に酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させておけばよい。中和をイムノクロマト試験片上で行うためには、イムノクロマト試験片上に中和試薬を含浸させておけばよい。
（Ａ）　予め検体と酸性溶液を混合し、亜硝酸塩と中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片のサンプルパッドに添加する。混合液が亜硝酸塩を含ませた領域に達すると亜硝酸塩と酸が反応し、亜硝酸が発生し、検体中の糖鎖抗原が抽出される。糖鎖抗原の抽出液はイムノクロマト試験片上の中和試薬を含浸させた領域で中和され、糖鎖抗原はイムノクロマト試験片上に固相化した抗体に結合し、検出できる。該方法において、用いる酸性溶液としては、酢酸、塩酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
（Ｂ）　予め検体と亜硝酸塩溶液を混合し、酸性試薬と中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片のサンプルパッドに添加する、混合液が酸性試薬を含ませた領域に達すると亜硝酸塩と酸が反応し、亜硝酸が発生し、検体中の糖鎖抗原が抽出される。糖鎖抗原の抽出液は中和イムノクロマト試験片上の中和試薬を含浸させた領域で中和され、糖鎖抗原はイムノクロマト試験片上に固相化した抗体に結合し、検出できる。
　上記の（Ａ）又は（Ｂ）の方法を行うための本発明のイムノクロマト試験片では、標識体領域よりも上流（検体の流れの上流でありサンプルパッドが存在する側）に、すなわち、サンプルパッド内又はサンプルパッドと標識体領域との間に、酸性試薬若しくは硝酸塩と中和試薬が含浸されている。サンプルパッド内又はサンプルパッドと標識体領域との間に、亜硝酸塩と中和試薬が含浸されているイムノクロマト試験片は上記（Ａ）の方法に用いることができる。また、サンプルパッド内又はサンプルパッドと標識体領域との間に、酸性試薬と中和試薬が含浸されているイムノクロマト試験片は上記（Ｂ）の方法に用いることができる。なお、イムノクロマト試験片に含浸させる酸性試薬としては、固形状酸性試薬が用いられる。これらの方法により、被検試料中の被検出物質を被検試料の試験に供される量によらず、正確に、特異的に測定することが可能になる。
　前記固形状酸性試薬又は亜硝酸塩は、サンプルパッドに含浸させてもよいし、サンプルパッドとは別の不織布等の多孔性材料からなるパッドに含浸させて、得られた固形状酸性試薬含浸多孔性材料又は亜硝酸塩含浸多孔性材料を、サンプルパッドと標識体領域との間、すなわち標識体領域の上流側に配置してもよい。ここで、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域とサンプルパッド又は標識体領域は接触していても、いなくてもよい。　　　
　本発明において、試薬を含浸させた領域を試薬を含浸させたパッドともいう。
　前記中和試薬は、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させる領域よりも下流に配置する。中和試薬は、サンプルパッドに含浸させてもよいし、支持体に含浸させてもよいし、支持体とは別の不織布等の多孔性材料からなるパッドに含浸させて、得られた中和試薬含浸多孔性材料を、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域と標識体領域との間に配置してもよい。すなわち、標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域を有する。ここで、中和試薬を含浸させた領域と固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域又は標識体領域は接触していても、いなくてもよい。
　固形状酸性試薬を含浸させた領域を固形状酸性試薬領域と呼び、亜硝酸塩を含浸させた領域を亜硝酸塩領域と呼び、中和試薬を含浸させた領域を中和試薬領域又は塩基性試薬領域と呼ぶ。
　固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域を有するイムノクロマト試験片は、支持体上に上流からサンプルパッド、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域、中和試薬領域、標識体領域、検出領域及び吸収帯を有し、固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域はサンプルパッド上にあってもよい。また、サンプルパッド、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域、中和試薬領域、標識体領域、検出領域及び吸収帯は、隣合う領域どうしで接触していても、いなくてもよい。さらに、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域、中和試薬領域、標識体領域は必ずしも別々の多孔性材料に含浸する必要はなく、複数又は全ての領域を同一の多孔性材料に含浸させてもよい。
　本発明で用いられる固形状酸性試薬は常温において固形状のものであり、高温において揮発しないものである。
　本発明に用いられる好ましい固形状酸性試薬としては、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸を挙げることができる。
　また、本発明で用いられる好ましい固形状酸性試薬としては、例えばクエン酸のような価数の多い酸を用いればより少ない量で抽出できる。また同じ価数ならより酸解離定数が小さい、例えばマレイン酸、酒石酸は効率が良い。
　また、本発明で用いられる好ましい固形状酸性試薬としては、イムノクロマト試験片上で着色されないような試薬、具体的には乾燥状態で白色又は乾燥熱や酸化で着色されにくい試薬が好ましい。
　本発明で用いられる亜硝酸塩としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等が挙げられる。
　本発明に用いられる固形状酸性試薬又は亜硝酸塩の使用量、すなわちイムノクロマト試験片に含浸させる量は、特に限定されないが、通常、イムノクロマト試験片の一試験片あたり0.01μg～1mg程度であり、好ましくは0.1μg～0.1mg程度である。もっとも、使用する固形状酸性試薬又は亜硝酸塩の種類、検体浮遊液の組成や添加量などにより効果が得られる最適な量を選択することが好ましい。
　固形状酸性試薬又は亜硝酸塩をサンプルパッド又は多孔性材料に含浸させるには、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を一度溶解させて塗布し乾燥させる。
　本発明に用いられる中和試薬は常温において固形状のものであり、高温において揮発しないものである。
　本発明に用いられる好ましい中和試薬としては、トリス塩基（トリスヒドロキシルメチルアミノメタン）、水酸化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸三ナトリウム、アルカリ領域に緩衝能をもつグッドバッファーを挙げることができる。
　本発明に用いられる中和試薬の使用量、すなわちイムノクロマト試験片に含浸させる量は、特に限定されないが、通常、イムノクロマト試験片の一試験片あたり0.01μg～1mg程度であり、好ましくは0.1μg～0.1mg程度である。もっとも、使用する中和試薬の種類、検体浮遊液の組成や添加量などにより効果が得られる最適な量を選択することが好ましい。
　中和試薬をサンプルパッド又は多孔性材料に含浸させるには、中和試薬を一度溶解させて、溶液をサンプルバッド又は多孔性材料に塗布し、その後乾燥させればよい。
　図１及び図２は、典型的なイムノクロマト試験片の好ましい１形態を示した図である。図１及び図２に示すイムノクロマト試験片は、固形状酸性試薬及び中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片であるが、固形状酸性試薬の代りに硝酸塩を含浸させてもよく、この場合は、硝酸塩及び中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片となる。当業者ならば、硝酸塩及び中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片を適宜設計し製造することができる。なお、イムノクロマト試験片は、図１及び図２に示すものに限定されるものではない。図１及び図２中、１が支持体、２が標識体領域、３が検出領域、４がサンプルパッド、７が吸収帯、８がバッキングシートを指している。また、試験片全体の上にトップラミネートを貼り付けてもよい。
　図１Ａ及び図２Ａが上面図、図１Ｂ及び図２Ｂが切断断面図である。図１の例では、樹脂等でできたバッキングシート８上に１個の検出領域３が形成された支持体１、吸収帯７、標識体領域２、サンプルパッド４等がそれぞれ積層されている。そして図１に示すように、吸収帯７の一方の端部と支持体１の一方の端部、支持体１の他方の端部と標識体領域２の一方の端部、標識体領域２の他方の端部とサンプルパッド４の一方の端部がそれぞれ重ね合わされており、サンプルパッド４の上流部に固形状酸性試薬が含浸され、少し間を離してサンプルバッドの下流部に中和試薬が含浸されている。固形状酸性試薬が含浸された領域を固形状酸性試薬領域５と呼び、中和試薬が含浸された領域を中和試薬領域６と呼ぶ。この試験片においては、サンプルパッドが固形状酸性試薬領域５及び中和試薬領域６を兼ねている。すなわち、固形状酸性試薬領域及び中和試薬領域がサンプルパッド上に存在する。この試験片においては、固形状酸性試薬領域及び中和試薬領域が１枚の多孔性材料（パッド）状に設けられているので、１枚パッド試験片と呼ぶことがある。図２の例では、標識体領域２の上流に固形状酸性試薬領域５及び／又は中和試薬領域６が存在し、これらが重ね合わされており、これにより連続したラテラルフローの流路が形成されている。図２に示す試験片においては、固形状酸性試薬領域５がサンプルパッドを兼ねている。すなわち、固形状酸性試薬領域がサンプルパッド上に存在する。この試験片においては、固形状酸性試薬領域及び中和試薬領域が別々の２枚の多孔性材料（パッド）状に設けられているので、２枚パッド試験片と呼ぶことがある。固形状酸性試薬領域の上流にさらにサンプルパッドが存在してもよい。また、図２に示す試験片では、固形状酸性試薬領域５及び中和試薬領域６は異なる多孔性材料に含浸させているが、図１の試験片のサンプルパッドのように同じ多孔性材料（パッド）上の上流部に固形状酸性試薬領域５を設け、下流部に中和試薬領域６を設けてもよい。
　上記のクロマトグラフィー試験片は図３及び４に記載の格納容器に収納され、イムノクロマトデバイス（図３及び４）として用いられる。図３及び４の格納容器は下の容器部分と上の蓋部分からなる。格納容器には、図３及び４に記載のように、検体添加口（添加穴とも呼ぶ）９と判定部１０がある。上記のクロマトグラフィー試験片を格納容器に収納したときに、サンプルパッドの上部に、サンプルパッドに検体試料溶液を供給できる検体添加口が位置し、容器の検体添加口に検体を添加したときに検体はサンプルパッドに浸み込む。また、クロマトグラフィー試験片を格納容器に収納したときに、検出領域上に判定部が位置し、容器の判定部の穴を通して、検出領域を観察することができる。
　本発明のイムノクロマトデバイスは、イムノクロマト試験片上で糖鎖抗原の亜硝酸抽出処理をすることが可能な、糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト法において、亜硝酸抽出処理を十分な時間をかけて行わせることができる。このために、以下の構造的特徴を有する。以下の構造的特徴は、検体試料の展開速度を調節する仕組み関する構造的特徴である。
（１）　本発明のイムノクロマトデバイスは添加口が広く設けられている。
　例えば、縦の長さが5～9cm、好ましくは7cm、横の長さが0.3～0.7cm、好ましくは0.5cmのイムノクロマト試験片を格納した従来のイムノクロマトデバイス（クイックナビ（商標）-Strep A、デンカ生研）の添加口は約3.5mm×約5.5mm(19.25mm2)のサイズを有する略矩形の添加口として設けられているが、同じサイズのイムノクロマト試験片を格納する本発明のイムノクロマトデバイスの添加口は約3.5mm×約11mm(38.5mm2)のサイズを有する略矩形の添加口として設けられている。イムノクロマトデバイス及びその中に格納されるイムノクロマト試験片の大きさは概ね類似サイズになるので、長さが横3cm、縦9cmのイムノクロマトデバイスにおいて略矩形で3～5mm×8～15mm(24～75mm2)の添加口を有するイムノクロマトデバイスは添加口が広いイムノクロマトデバイスであり、本発明のイムノクロマトデバイスの効果を奏し得る。添加口の長い辺は、クロマトグラフィー試験片の長い辺と平行な辺であり、すなわち検体試料溶液の流れ方向に沿った辺である。添加口の長い辺の長さを添加口長といい、短い辺の長さを添加口幅ということがある。上記の例は、略矩形の添加口の場合であるが、添加口の形状は、三角形でも円形でもよい。本発明のイムノクロマトデバイスの添加口の大きさを面積で表した場合、24～75mm2、好ましくは35～75mm2である。
　従来のイムノクロマト法において、イムノクロマト試験片上に設けた検体処理試薬で検体処理を行う際は、試料溶液が検体処理試薬を含浸した領域に接している面積が少ないため検体処理能力が弱く、なおかつイムノクロマト試験片を徐々に展開しながら検体処理が行われていたことから、最初に展開した試料溶液と後から展開した試料溶液には検体処理試薬の濃度差が起きていた。従って、検体処理確実に行うことができなかった。
　本発明のイムノクロマトデバイスの添加口は広く設けられていることから、一度に大量の検体試料溶液を短時間でイムノクロマト上の検体処理試薬を含浸させた領域、すなわち固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸を含浸させた領域に供給することができる。この結果、イムノクロマト試験片上における糖鎖抗原の抽出を促進することができる。一度に供給することができる検体試料溶液は、10μL～200μLである。
　その結果、時間差による検体処理試薬の濃度差が起きないことから、イムノクロマト上の検体処理を促進し確実に効率よく行うことができる。
（２）　本発明のイムノクロマトデバイスにおいては、添加口から試料が逃げこぼれないよう、添加口とその下に位置するサンプルパッドの間に隙間が無いよう構成されている。
　本発明のイムノクロマトデバイスは添加口が広く設けられており、一度に大量の検体試料溶液が供給される。また、添加口の外郭である縁部分には一定の高さ（1～5mm）があり、供給された検体資料溶液は添加口内に一旦貯まる。
　その結果、検体試料溶液の全液がイムノクロマト試験片に吸収されるまで時間が掛かることから、試料溶液がイムノクロマト試験片に吸収されずにイムノクロマト試験片外に逃げこぼれることがあった。
　本発明のイムノクロマトのデバイスは、サンプルパッドを支えるバッキングシートを添加口から試料が逃げこぼれないよう、添加口の外郭サイズと同等かそれより大きい外郭サイズのバッキングシートでサンプルパッドを支持することで、バッキングシートによりサンプルパッドを添加口に押さえつけるような力が働き、添加口とサンプルパッドの間に隙間が無いよう構成できることから、試料溶液の逃げ漏れを防ぐことができる。
　また、サンプルパッドの厚みに差がある場合は、サンプルパッドの厚みが薄い箇所は添加口との隙間ができやすく、試料溶液の逃げ漏れが発生しやすい。
　本発明においては、サンプルバットの薄い箇所はデバイスの容器の台座は高く、厚い箇所は台座を低く設計することで、パッドの厚みに差がある場合においても、添加口とパッドの間に隙間が無いよう構成できることから、試料溶液の逃げ漏れを防ぐことができる。
　この結果、この結果、イムノクロマト試験片上における糖鎖抗原の抽出を効率よくすることができる。
（３）　また、イムノクロマト試験片の固形状酸性試薬や亜硝酸塩や中和試薬等の検体処理試薬を含浸させるパッドの製造に使用する素材（不織布）を疎水性の高い素材を選択し、液の流れるスピード、すなわち検体試料溶液がイムノクロマト試験片上を展開する時間を遅く調節することが可能である。
　この場合の疎水性の高い素材とは例えば、ポリエチレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、レーヨン、ナイロン等が挙げられる。
　中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材としては、目付が10～400g/m2であり、かつ、厚みが0.1～2.0mmの織物であり、1cm/m2あたりの吸水量が10～100μl/cm2で、かつ吸水スピードが1.0～5.0μl/secであり、さらに1cm/m2の断片を濡れた状態でメンブレンに接触させ5分間静置後の保水量が10～100μl/cm2であり、好ましくは1cm/m2の断片を濡れた状態でメンブレンに接触させ5分間静置後の液の広がり面積が20mm2以下、つまり吸水力が高く、保水性（液体の保持力）が高く、さらに液体の放出性が低い又は持続するという特性の３つを有する多孔性材料が挙げられる。具体的には、セルロースの綿繊維でできた濾紙やガラス繊維でできたガラス濾紙等が挙げられる。このような濾紙として、例えば、東洋濾紙株式会社のNo.26-3が挙げられる。また、用いる濾紙の容積は大きく、上流から検体よりも遅れて到達する酸性溶液を十分に保持することができる。このような多孔性材料を用いることにより、亜硝酸塩と酸性試薬との反応で発生した亜硝酸で糖鎖抗原を抽出した検体を十分に中和することができる量の中和試薬を含浸させることができる。また、該パッドは大量の液体を吸収保持することができ、放出性が持続するため、イムノクロマト試験片の上流に残る亜硝酸を含む液が判定時間以降に展開した際にも十分な中和能力を有することができ、酸性溶液が抗体を固相化した検出領域に達するのを抑えることができる結果、非特異反応を抑制し、非特異反応を生じることがなく糖鎖抗原を検出することができる。一方、吸水力が高く、保水性が高く、放出性が低いガラス濾紙の場合、具体的には、東洋濾紙株式会社のGS-25が挙げられるが、吸水力が高いため、より多くの中和試薬を含浸でき、保水性が高く、放水性が低いため、酸性溶液が固相化した検出領域に達することを防ぐ。この結果、陰性の場合には非特異反応を抑制し、陽性の場合には判定時間以降のライン発色を防止することができる。
　中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材の「目付」は10～400g/m2である。ここで、「目付」とは、布等の単位面積(1m2)当たりの重量をいう。目付は該パッドに含浸せる中和試薬の量や組成により適宜変えることができる。目付が30g/m2以下だと空隙率が高く、中和試薬を含浸した際にちぎれやすくなり、イムノクロマト製造時の取扱いが難しくなることから、好ましくは目付50g/m2以上であり、目付が300g/m2以上の場合には、空隙率が低く、中和試薬の組成にもよるが、検体がスムーズに素材に浸透せず、中和試薬と混合できないため、300g/m2以下であることが好ましい。最も好ましい目付は250～270g/m2である。
　また、中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材の「厚み」は0.1～2.0mmが良いが、厚みは、該パッドに含浸せる中和試薬の量や組成により適宜変えることができる。厚みが0.4mm以下の場合、中和試薬を含浸した際にちぎれやすくなり、イムノクロマト製造時の取扱いが難しくなることから、好ましい厚みとしては、0.4～0.8mm、中和試薬を含浸させられる量が調節しやすく、かつ、イムノクロマト製造時のハンドリングのしやすさを考慮すると、0.6mm程度がより好ましい。
　「吸水性」は1cm/m2あたりの吸水量が10～100μl/cm2で、かつ吸水スピードが1.0～5.0μl/secのものが好ましい。吸水量と吸水スピードは、96穴のＥＩＡプレートの1セルに200μlの色づけした溶液（1％Tween20+赤色102号）を用意し、そこに5×60mmの大きさの素材をバッキングシートに貼付した試験片を入れ、溶液に浸漬させた方を試験片の下端とし、試験片の上端に溶液が達するまでの時間を測定し、さらに溶液が上端に達した後、直ちに試験片を取り出し、セルに残存する液量を測定する。吸水量は、200μlからセルに残った液量を差し引き、素材の1cm2面積あたりで割った液量であり、吸水スピードは、吸水量/上端到達までにかかった時間で求められる。中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材としては、吸水量が多く、吸水スピードが遅めの素材が好ましい。固形状酸性試薬の濃度と含水量にもよるが、吸水量が30μl/cm2以下の場合、イムノクロマト試験片として必要な中和試薬が含浸しきれない場合も考えられるため、具体的には、吸水量が30μl/cm2以上であることが好ましい。中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材の吸水スピードは、検体中の糖鎖抗原が抽出される時間及び抽出後の試験液が中和される時間に影響する。糖鎖抗原を抽出する時間は、固形状酸性試薬の素材もしくは組成で調節することがある程度までは可能であるが、完全でないため、中和試薬を含浸させる領域に使用する素材の吸水スピードは、十分な糖鎖抗原の抽出及び中和に重要な要素となる。具体的には、吸水スピードは1.0～5.0μl/secが好ましく、より好ましい吸水スピードは、2.0μl/sec以下である。
　「保水性」は、中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材の1cm/m2の断片をメンブレン上に置き、そこに70μlの溶液（1％Tween20+赤色102号）を添加し、5分間静置前後の重量を測定することで得られる。保水性の液量は、添加する溶液の組成（界面活性剤やタンパク量）によって変化するが、1%Tween20溶液で試験した場合の保水量が10～100μl/cm2であることが好ましく、より好ましい保水量は15μl/cm2以上である。
　「放出性」は、中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材の1cm/m2の断片をメンブレン上に置き、そこに70μlの溶液（1％Tween20+赤色102号）を添加し、5分間静置後にメンブレン上に広がった液の面積を求めることで測定する。面積は、添加する溶液の組成（界面活性剤やタンパク量）によって変化するが、1%Tween20溶液で試験した場合の面積が、30mm2以下、より好ましい放出性は20mm2以下である。
　すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
[１]　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片であって、
　中和試薬を含浸させた領域の素材が吸収性が高く、保水性が高く、かつ放出性の低い若しくは放出性が継続するという3つの特性を持つ濾紙又はガラス濾紙であり、
　中和試薬を含浸させた領域の吸水性の高さ及び保水性の高さにより前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が十分中和され、中和試薬を含浸させた領域の放出性の低さ又は放出性の持続により残った酸性溶液が検出領域に達するのを抑えるか、或いは十分に中和された試験液が継続的に検出領域に展開し続けることにより非特異反応を抑制する、イムノクロマト試験片。
［２］　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片であって、
　中和試薬を含浸させた領域の素材が目付が10～400g/m2であり、かつ、厚みが0.1～2.0mmの織物であるイムノクロマト試験片。
［３］　前記織物の1cm/m2あたりの吸水量が10～100μl/cm2で、かつ吸水スピードが1.0～5.0μl/secであり、さらに1cm/m2の断片を濡れた状態で検出領域に接触させ5分間静置後の保水量が10～100μl/cm2であり、1cm/m2の断片を濡れた状態でメンブレンに接触させ5分間静置後の液の広がり面積が20mm2以下である、［１］又は[２]に記載のイムノクロマト試験片。
[４]　中和試薬を含浸させた領域の吸水性の高さ及び保水性の高さにより前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が十分中和され、中和試薬を含浸させた領域の放出性の持続力により残った酸性溶液が検出領域に達する際にも十分な中和能力を蓄えることにより非特異反応を抑制する、[１]～[３]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[５]　中和試薬を含浸させた領域の吸水性の高さ及び保水性の高さにより前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が十分中和され、中和試薬を含浸させた領域の放出性の低さにより、残った酸性溶液が検出領域に達することを抑制し、陰性の場合には非特異反応を抑制し、陽性の場合には判定時間以降のライン発色を防止する、[１]～[４]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[６]　固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域が、サンプルパッド上若しくは標識体領域が塗布されたパッド上に存在する、[１]～[５]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[７]　固形状酸性試薬が、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸からなる群から選択される、[１]～[６]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[８]　中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、[１]～[７]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[９]　糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、[１]～[８]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[１０]　[１]～[９]のいずれかのイムノクロマト試験片を用いてイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法であって、
　イムノクロマト試験片が固形状酸性試薬を含浸させた領域を有するときには検体を亜硝酸溶液と混合し、イムノクロマト試験片が亜硝酸塩を含浸させた領域を有するときには検体を酸性溶液と混合し、前記イムノクロマト試験片のサンプルパッドに添加することを含み、
　固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸塩を含浸させた領域において、亜硝酸塩と固形状酸性試薬の反応により発生した亜硝酸の作用により検体から糖鎖抗原が抽出され、　中和試薬を含浸させた領域において、前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が中和され、
　検出領域において、抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体が形成される、イムノクロマト法により、中和試薬を含浸させた領域の吸水性の高さ及び保水性の高さにより前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が十分中和され、中和試薬を含浸させた領域の放出性の低さ或いは放出性の持続により残った酸性溶液が検出領域に達するのを抑える或いは十分に中和された試験液を継続的に検出領域に添加し続けることにより非特異反応を抑制して、検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
　この結果、イムノクロマト試験片上における糖鎖抗原の抽出を促進することができる。　　　
　さらに、固形状酸性試薬や亜硝酸塩や中和試薬等の検体処理試薬を含浸させる疎水性の高いパッドに含浸させる試薬にTriton X-100、Triton X-114等のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル；Tween 20、Tween 80等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；Brij-35、Brij-58等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；コール酸ナトリウム、デオキシコール酸等のステロイド骨格を有するコール酸系；ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の陰イオン系界面活性剤などの界面活性剤を添加し試薬の疎水度をコントロールすることで、添加口上における検体処理時間を任意の時間に設計することができる。好ましくは、界面活性剤を添加することにより、十分に検体を処理できる時間留まり、かつ検体試料溶液が適切に展開することが出来る。すなわち、検体を固形状酸性試薬又は亜硝酸塩で十分に検体を処理し糖鎖抗原を抽出することができ、なおかつ中和試薬を含浸させたパッドがある下流に展開できる。
　また疎水性の高いパッドと界面活性剤でコントロールするのではなく、イムノクロマト試験片の固形状酸性試薬や亜硝酸塩や中和試薬等の検体処理試薬を含浸させるパッドの製造に使用する素材として親水度の高い素材を選択し、液の流れるスピード、すなわち検体試料溶液がイムノクロマト試験片上を展開する時間を遅く調節することも可能である。親水度の高い素材としては、例えば厚みのある濾紙が挙げられ、その厚さは210～580μmである。
　さらに、試料溶液がパッドの上で保持されやすいように、界面活性剤ではなく、その他の固定化作用のある高分子化合物(例えば、PVA（ポリビニルアルコール）やPLL(ポリL-リジン)をもちいることも可能である。この方法でもイムノクロマト試験片上における糖鎖抗原の抽出を促進することができる。
　上記の（１）、（２）、（３）のいずれかの少なくとも１つの構造を有するイムノクロマトデバイスにおいて、添加した検体試料溶液がイムノクロマト試験片上を展開する時間を長くし、下流の中和試薬を含浸させたパッド（中和試薬領域）へ展開するのを遅らせることができる。
　また、上記の（１）、（２）、（３）のいずれかの少なくとも１つの構造を有するイムノクロマトデバイスはイムノクロマト試験片上で糖鎖抗原の亜硝酸抽出処理をするためのデバイスだけではなく、イムノクロマト試験片上に含浸させた試薬により試験片上で検体を処理するイムノクロマトデバイスとして利用することができる。
　本発明は、亜硝酸による抽出以外でも、pHや化合物により、検出目的とするアナライトをイムノクロマト試薬のテストデバイス上でインキュベートしたい場合に利用できる。
　図１の形態を有するイムノクロマト試験片を図４に格納容器に格納したイムノクロマトデバイスに基づき、本発明のデバイスの使用方法について述べる。以下の使用方法は、検体を亜硝酸溶液と混合し、固形状酸性試薬と中和試薬を含浸させたイムノクロマト法を用いて測定する方法であるが、検体を酸性溶液と混合し、亜硝酸塩と中和試薬を含浸させたイムノクロマトクロマト試験法を用いて測定する方法も以下の使用方法の説明を参考にして行うことができる。
　測定は、検体又は検体を用いて調製された試料を亜硝酸塩溶液と接触混合させ、検体を亜硝酸塩溶液に浮遊させ、デバイスの検体添加口に添加して供することにより開始される。この際、検体5～100μLと0.1M～8Mの亜硝酸塩0.01～2mLを混合し、5～200μLを添加口に供すればよい。亜硝酸塩として、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等が挙げられる。
　添加口９に供された被検出物質である糖鎖抗原を含む検体は、サンプルパッドに移動し、毛管作用によって、サンプルパッド４上の固形状酸性試薬領域５及び中和試薬領域６へ展開され、さらに、標識体領域２、支持体１、吸収帯７へと順次、水平方向に展開される。固形状酸性試薬領域５において、検体に混合した亜硝酸塩と固形状酸性試薬領域５上の固形状酸性試薬が反応し、遊離の亜硝酸が発生し、その亜硝酸の作用によって検体から糖鎖抗原が抽出される。抽出された糖鎖抗原は酸性の展開溶液と共に中和試薬領域６に展開移動し、中和試薬領域６で糖鎖抗原を含む酸性の展開溶液のpHが中和され中性域に調整される。その結果、糖鎖抗原は中性条件下においてさらに下流に展開移動する。標識体領域２では検体試料の展開と共に標識抗体が液中に放出され支持体１へと展開される。検体試料中に糖鎖抗原が存在する場合において、支持体１の検出領域３では捕捉抗体により糖鎖抗原が特異的に捕捉され、なおかつ糖鎖抗原は標識抗体とも特異的反応により複合体を形成する。これにより検出領域３では糖鎖抗原を介した抗体のサンドイッチが成立し、標識抗体－糖鎖抗原複合物を検出領域３にて測定することができる。検出領域はイムノクロマトデバイスの判定部を通して観察することができる。
　本発明のイムノクロマト試験片を用いた方法によれば、検体中の糖鎖抗原の抽出はイムノクロマト試験片上で行われるため、イムノクロマト試験片を用いた測定の前にあらかじめ検体中の糖鎖抗原を抽出する必要はなく、１ステップで検体中の糖鎖抗原を測定することができる。
　本発明により乾燥させた固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含むパッドを組み込んだイムノクロマト試験片において、試薬上で効率的に抽出を行うことができる。
　検体添加口を固形状酸性試薬を含むパッド（固形状酸性試薬領域）とほぼ同等の面積にしてもよい。こうすることにより、より多くの試料が瞬時に固形状酸性試薬と接触できるようなる。さらに、塗布・含浸させる部材に疎水性の高い不織布を採用することで、試料が添加されてから直ぐに下流の中和試薬を含浸させたパッド（中和試薬領域）へ展開しないようにできる。こうすることで、検体添加部に試料が1～2分保持され、十分な抗原抽出を行うことができる。
　また、本発明においては、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域が重なりあって接触している場合に、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域の間に液体を通過させないシートを挟み込むように設ける。シートを設けることにより、以下の３つの効果を奏することができる。
（Ａ）　試験片の保存時に隣接する２つの領域における試薬の移動を抑制することができる。この結果、固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩と中和試薬の接触による反応を防止することができる。この結果、試薬の安定性を向上させることができる。
（Ｂ）　また、亜硝酸塩又は酸性試薬と混合した検体を添加したときに、検体が固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域に到達し、その後すぐに中和試薬領域に移動してしまうことによる不十分な糖鎖抗原の抽出を防止することできる。すなわち、固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域から中和試薬領域へ検体を含む液体が移動する速度を低下させ、固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域に検体を含む液体が留まる時間を長くし、その結果、糖鎖抗原を十分に抽出し、測定感度を高める。
（Ｃ）　さらに、亜硝酸塩又は酸性試薬と混合した検体を添加したときに、検体が固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域に到達し、その後すぐに中和試薬領域に移動してしまい、移動した検体を含む液体が固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域に逆流し、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩の活性を低下させ、抽出効率が低下するのを防止することができる。すなわち、一旦中和試薬領域に到達した検体を含む液体が固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域に逆流するのを防止し、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩の活性の低下を防止し、亜硝酸による糖鎖抗原の抽出処理を効率よく進ませ、測定感度を高める。
　固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域の間に設けるシートの素材は液体を通過させない素材である限り限定されず、例えば、PET（ポリエチレンテレフタレート）シート、ポリエチレンシート等の樹脂製シートを用いることができる。樹脂製シートは樹脂製フィルムともいう。
　シートは、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域が部分的に接触して重なるように設けてもよい。この場合、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域の重なる部分の長さは、極力短くすることが好ましく、例えば、５mm以下、好ましくは３mm以下、さらに好ましくは２mm以下である。
　また、シートを固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域が接触しないように設け、酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたパッドがPETシート上に覆い被さる形状にしてもよい。この場合、中和領域がシートにより完全に覆われ、そのシート上に固形状酸性試薬領域又は亜硝酸領域を設ければよい。この場合、固形状酸性試薬領域又は亜硝酸領域内の液体は、直接中和領域に移動することはなく、シート上を流れた後に中和試薬領域に達する。
　シートは、例えば、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域の間にのみ設ければよい。一方、イムノクロマト試験片の上側を覆うように樹脂製シートをトップラミネートシートとして貼付するときに、トップラミネートシートを固形状酸性試薬領域又は亜硝酸領域以外、固形状酸性試薬領域又は亜硝酸領域がサンプルパッドを兼ねる場合はサンプルパッド以外の中和試薬領域、標識体領域、支持体、検出領域、吸収帯を覆うように貼付し、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域を中和試薬部分の上部に貼付したトップラミネートシートの上部に貼付すればよい。
　すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
[１]　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片であって、
　固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域と中和試薬を含浸させた領域の間に、両領域間の試薬の移動又は検体溶液の移動を抑制するように、樹脂製シートを挟み込ませた、イムノクロマト試験片。
[２]　サンプルパッド上に固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域が存在する、[１]のイムノクロマト試験片。
[３]　固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域と中和試薬を含浸させた領域が部分的に接触するように、樹脂製シートを挟み込ませた、[１]又は[２]のイムノクロマト試験片。
[４]　固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域と中和試薬を含浸させた領域が接触しないように、樹脂製シートを挟み込ませた、[１]又は[２]のイムノクロマト試験片。
[５]　イムノクロマト試験片上の最上流のサンプルパッド上に固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域が存在し、サンプルパッド以外の領域が樹脂製シートで覆われ、中和試薬を含浸させた領域の上部の樹脂製シートの上部に、固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたサンプルパッドが存在する、[２]～[４]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[６]　固形状酸性試薬が、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸からなる群から選択される、[１]～[５]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[７]　中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、[１]～[６]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[８]　糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、[１]～[７]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[９]　[１]～[８]のいずれかのイムノクロマト試験片を用いてイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法であって、
　イムノクロマト試験片が固形状酸性試薬を含浸させた領域を有するときには検体を亜硝酸溶液と混合し、イムノクロマト試験片が亜硝酸塩を含浸させた領域を有するときには検体を酸性溶液と混合し、前記イムノクロマト試験片のサンプルパッドに添加することを含み、
　固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸塩を含浸させた領域において、亜硝酸塩と固形状酸性試薬の反応により発生した亜硝酸の作用により検体から糖鎖抗原が抽出され、　中和試薬を含浸させた領域において、前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が中和され、
　検出領域において、抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体が形成される、イムノクロマト法により、イムノクロマト試験片上での検体の展開のスピードや方向を制御し、酸性試薬と亜硝酸塩と中和試薬による処理を制御して、検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
　本発明の方法において、検体となる生体試料は、特に限定されないが、血清、血漿、血液、尿、便、唾液、組織液、髄液、拭い液等の体液等又はその希釈物が挙げられる。
　本発明のイムノクロマトデバイスを用いた方法において、測定対象となる被検出物質はイムノアッセイ、すなわち抗原抗体反応を利用したアッセイで測定し得る糖鎖抗原である。抗原としては亜硝酸抽出処理によって抽出される細菌の細胞壁に存在する糖鎖抗原である多糖体等が挙げられる。これらの物質を含む原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等も測定し得る。本発明のイムノクロマト試験片を用いた方法により、被験体の生体試料中に原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等に由来する糖鎖抗原が含まれているか否かを確認することができ、糖鎖抗原が含まれている場合、被験体は原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等による感染症に罹患していると判断することができる。例えば、Ａ群β溶血性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、大腸菌、レジオネラ、カンピロバクター等の感染の有無を検出することができる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　以下の実施例において、％は、特に断らない場合はw/v％を示す。
実施例1:添加口の大きさの検討
１．抗Streptococcus pyogenes（Ａ群β溶血性レンサ球菌）抗体のニトロセルロースメンブレン（支持体）への固定化
　抗Streptococcus pyogenes抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液及び抗ウサギIgG抗体を準備し、PET（ポリエチレンテレフタレート）フィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンのサンプルパッド側に抗Streptococcus pyogenes抗体、吸収帯側に抗ウサギIgG抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブレンを45℃、30分間乾燥させ、抗Streptococcus pyogenes抗体固定化メンブレンを得た。このメンブレンを本実施例において、「抗体固定化メンブレン」と呼ぶ。
２．抗Streptococcus pyogenes抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
　抗Streptococcus pyogenes抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、0.04％抗Streptococcus pyogenes抗体結合着色ポリスチレン粒子浮遊液を得た。この粒子を、本実施例において、「抗体固定化粒子」と呼ぶ。
３．抗Streptococcus pyogenes抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
　２で作製した抗体固定化粒子浮遊液を不織布に所定量を塗布し、45℃、30分間乾燥させた。得られた不織布を、本実施例において、「乾燥パッド」と呼ぶ。
４．中和試薬（塩基性試薬）パッドの作製
　中和試薬（塩基性試薬）として、3M Trizma（商標名） Base（トリス塩基）、1.5% TritonX100を30μL/cm濾紙(東洋濾紙；No.26-3)に塗布した。
５．固形状酸性試薬パッドの作製
　固形状酸性試薬として、1.0M 酒石酸、0.5% TritonX100を13μL/cmで不織布(ユニチカ；エルベス(Elves))に塗布した。塗布後に直ちに45℃、１時間、乾燥して、固形状酸性試薬含浸不織布を得た。
６．Streptococcus pyogenes検出用イムノクロマト試験片の作製
　１で作製した抗体固定化メンブレン、３で作製した乾燥パッド、４で作製した中和試薬（塩基性試薬）パッド、５で作製した固形状酸性試薬パッドを他部材（バッキングシート、吸収帯）と貼り合せて５mm幅に切断し、Streptococcus pyogenes試験片とした。固形状酸性試薬及び中和試薬（塩基性試薬）含浸濾紙をサンプルパッドとして用いた試験片を本実施例において、「本発明イムノクロマト試験片」と呼ぶ。なお、イムノクロマト試験片は、検体の流れに沿って、上流から、固形状酸性試薬含浸不織布、中和試薬（塩基性試薬）含浸不織布、乾燥パッド（標識体領域）、抗体固定化メンブレン（検出領域）、吸収帯を具備するものである。
７．イムノクロマトデバイス
　本発明イムノクロマト試験片を添加口長5mmのイムノクロマトデバイス（従来のデバイス）と添加口長10mmのイムノクロマトデバイス（添加口を広くした本発明のデバイス）にそれぞれ組み込み、以下の試験を実施した。
８. 検体
　Streptococcus pyogenesを培養し、培養液を生理食塩水で菌数1.0×107CFU/mLに調製した。
　また、陰性検体として、生理食塩水を用いた。
９．測定
　検体20μLを亜硝酸ナトリウム溶液（2.0M NaNO3、1% Tween20）180μLに浮遊し、そのうち75μLを本発明のイムノクロマトデバイスの添加口に添加した。また、従来法として亜硝酸ナトリウムと塩酸を混合した亜硝酸抽出液に検体を浮遊した後、トリス溶液で中和した検体浮遊液を従来法のイムノクロマトデバイス（酸性試薬も中和試薬も固定化されていない）の添加口に50μＬ添加した。５分後に抗Streptococcus pyogenes抗体を固定化した所定位置上の着色ポリスチレン粒子の堆積の有無とその程度を目視判定にて行った。その線状の堆積の程度が強いものを順に＋＋＋、＋＋、＋とし、判定が難しい場合を±、堆積がみられなかったものを－とした。
１０．結果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示されるように添加口長が長い10mmのイムノクロマトデバイスの方が添加口長5mmのイムノクロマトデバイスよりも測定感度が高かった。これは亜硝酸処理による抗原抽出効率が上がったためと考えられる。
実施例２：界面活性剤の塗布量の検討
　実施例１の５．固形状酸性試薬含浸不織布の作製における固形状酸性試薬の界面活性剤TritonX100の濃度を0.5%、2.0%の条件で試験結果（表２）を比較検討した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果より、界面活性剤濃度が低い方が測定感度が高かった。これは亜硝酸処理による抗原抽出効率が上がったためと考えられる。
　１　支持体（検出領域を含む）
　２　標識体領域
　３　検出領域
　４　サンプルパッド
　５　固形状酸性試薬領域
　６　中和試薬領域
　７　吸収帯
　８　バッキングシート
　９　デバイスの添加口
　１０　デバイスの判定部
　本発明のイムノクロマトデバイスを用いてＡ群β溶血性レンサ球菌の感染を高感度で検出することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (15)

  1. 　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片と該試験片を格納する容器よりなる、試験片のサンプルパッドに検体添加口を有するイムノクロマトデバイスであって、
    (i)　添加した検体試料溶液を保持し検体試料溶液を前記固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域に短時間で供給することにより亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進するための広い検体添加口を有し、
    (ii)　添加口から試料が逃げこぼれないよう、添加口とサンプルパッドの間に隙間がない、
    イムノクロマトデバイス。
  2. 　イムノクロマトデバイスの検体添加口が24～75mm2のサイズを有する、請求項１記載のイムノクロマトデバイス。
  3. 　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドが疎水性の高い素材からなり、検体試料溶液の展開時間を遅くすることにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、請求項１又は２に記載のイムノクロマトデバイス。
  4. 　疎水性の高い素材が、ポリエチレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、レーヨン及びナイロンからなる群から選択される、請求項３記載のイムノクロマトデバイス。
  5. 　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドが親水度の高い素材からなり、検体試料溶液の展開時間を遅くすることにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、請求項１又は２に記載のイムノクロマトデバイス。
  6. 　親水度の高い素材が厚みのある濾紙である、請求項５記載のイムノクロマトデバイス。
  7. 　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドに界面活性剤を添加し、検体試料溶液の展開時間を調節することにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、請求項１～６のいずれか１項に記載のイムノクロマトデバイス。
  8. 　界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、ラウリル硫酸ナトリウム及びドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項７記載のイムノクロマトデバイス。
  9. 　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドに固定化作用のある高分子化合物を添加し、検体試料溶液の展開時間を調節することにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、請求項１～８のいずれか１項に記載のイムノクロマトデバイス。
  10. 　固定化作用のある高分子化合物がPVA又はPLLである、請求項９記載のイムノクロマトデバイス。
  11. 　固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域が、サンプルパッド上もしくは、標識体領域が塗布されたパッド上に存在する、請求項１～１０のいずれか１項記載のイムノクロマトデバイス。
  12. 　固形状酸性試薬が、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載のイムノクロマトデバイス。
  13. 　中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、請求項１～１２のいずれか１項に記載のイムノクロマトデバイス。
  14. 　糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、請求項１～１３のいずれか１項に記載のイムノクロマトデバイス。
  15. 　請求項１～１４のいずれか１項に記載のイムノクロマトデバイスを用いてイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法であって、
    　イムノクロマトデバイスが固形状酸性試薬を含浸させた領域を有するときには検体を亜硝酸溶液と混合し、イムノクロマトデバイスが亜硝酸塩を含浸させた領域を有するときには検体を酸性溶液と混合し、前記イムノクロマトデバイスのサンプルパッドに添加することを含み、
    　固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸塩を含浸させた領域において、亜硝酸塩と固形状酸性試薬の反応により発生した亜硝酸の作用により検体から糖鎖抗原が抽出され、　中和試薬を含浸させた領域において、前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が中和され、
    　検出領域において、抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体が形成される、イムノクロマト法により、糖鎖抗原の抽出を促進して、検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
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