JP2005331463A - デバイスおよび検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 メンブランストリップ部の一方の端に吸収パッド部、もう一方の端に基質パッド部、前記メンブランストリップ部に標識部、該標識部と前記吸収パッド部の間に検出部が設けられており、基質パッド部の底面が検出部より低い位置に存在するエンザイムイムノアッセイデバイスならびに該エンザイムイムノアッセイデバイスを用いて検体試料液中の被検出物の検出方法。
【選択図】 なし
Description
図1は、本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの好ましい実施態様の模式図である。
メンブランストリップ部の材質は、特に限定されないが、多孔性の吸水性の材質であり、検体試料液や基質液が毛管現象により展開し得る材質である。ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる材質が用いられ、好ましくはニトロセルロースメンブランが用いられる。
吸収パッド部は、本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの一端に設けられデバイスを展開する液体を吸収することによりメンブラン上の液体の流れを促進する。
検出部は、検出すべき抗原または抗体と抗原抗体反応により特異的に結合して検出すべき抗原または抗体を捕捉するための抗体または抗原が固相化されている。抗体または抗原は、例えばライン状に固相化すればよい。固相化は、タンパク質をニトロセルロースメンブラン等の固相に固相化するための公知の方法で行うことができる。抗体は、精製したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が用いられる。抗原は、精製した天然の抗原またはリコンビナント抗原が用いられる。
吸水性の材質、例えばスポンジ及びガラス繊維などでできた不織布等の材質が用いられ、その大きさは、特に限定されないが、通常、3mm〜10mm×3mm〜10mm、厚さ0.5mm〜3mm程度で、酵素標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている。標識部は、上記の吸水性の材質に標識抗体または標識抗原を含浸させ、乾燥させればよい。標識抗体または標識抗原は、検出すべき抗原または抗体と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体または抗原に酵素を標識したものが用いられる。抗体は、精製したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が用いられる。抗原は、精製した天然の抗原またはリコンビナント抗原が用いられる。
吸水性の材質、例えば吸水性のあるスポンジ及びガラス繊維などの不織布等の材質が用いられ、その大きさは、特に限定されないが、通常、3mm〜10mm×8mm〜30mm、厚さ0.5mm〜3mm程度で、酵素の基質が乾燥状態で含有されている。基質パッド部は、吸水パッドと反対側のメンブランストリップ部上に設けられている。基質パッド部は、メンブランストリップ上の検出部よりも低い位置に設けられている。検出部より低い位置に設けられているとは、アッセイデバイスを検査用作業机上などの水平面に置いて検出を行うときに、基質パッド部と検出部の鉛直線方向における位置を比較した場合、基質バッド部が検出部より低い位置に存在することをいう。このように、基質パッド部が検出部より低い位置に存在すると、基質パッド部に添加した基質溶解液の展開が重力に逆らって起こるので、展開速度が遅くなる。基質パッド部の底面が検出部より、2〜8mm低い位置に設けることが好ましいが、これに限定されない。標識部および/または吸収パッドの鉛直線方向の位置は、限定されず検出部と同一の高さで存在していてもよいし、基質パッド部と同一の高さで存在していてもよい。また、標識部および/または吸収パッドは基質パッド部と検出部の間の位置に存在していてもよい。本発明のアッセイデバイスの一つの態様として、図1に示すデバイスが挙げられ、該デバイスにおいては、基質パッド部のみが検出部、標識部、吸収パッド部よりも低い位置に存在しており、検出部、標識部、吸収パッド部はほぼ同一平面上に存在する。
基質溶解液は、用いる基質により適宜選択されるが、緩衝液又は精製水が用いられ、通常、50〜300μLを検出時に基質パッド部に加えるがこれらに限定されない。
本発明にいう検体試料液は、咽頭あるいは鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液、唾液、血清、便懸濁液、尿、培養液及びそれらを緩衝液で希釈したものを用いることができるがこれらに限定されない。
本発明にいう検出すべき抗原は、何ら限定されず、検出しようとするいかなる物質であってもよい。たとえば、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、RSウイルス、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、レジオネラ属菌、溶連菌、MRSA等の細菌抗原、ホルモン等をあげることができるが、これらに限定されない。
本発明のアッセイデバイスに、図2に示すように試料部を設けてもよい。試料部は、検体試料液を加え標識部と基質パッド部に吸収させるための部位で、検体試料液をメンブランに直接加えることが好ましいが、吸水性のある材質、例えばスポンジ、ガラス繊維などの不織布等のパッドをメンブラン上に設けその部分に加えることもできる。この場合、試料部のパッドと基質パッド部および/または標識部は接触していてもいなくてもよい。試料部は標識部と基質パッド部の間に設けられ、基質パッド部または標識部と同じ位置にあってもよい。このような試料部を設けることにより、検体試料液を試料部に加えて1回の操作で標識抗体または標識抗原と基質を検体試料液のみで溶解して移動させ、連続した一連の反応により起こる前記検出部における着色の有無を観察することにより検体試料液中の被検出物を検出する。
使用時に、本発明のデバイスを用い、検体試料液を標識部4に加え、つづいて基質溶解液を基質パッド部3に加える。検体試料液は標識抗体または標識抗原を溶解させ、標識抗体または標識抗原は、検体試料液中に検出すべき抗原または抗体が存在すれば抗原抗体反応しながら移動し、検出部5に到達すると固相化されている抗体または抗原に捕捉される。基質液も同方向に移動し、捕捉された標識抗体または標識抗原の標識酵素が基質と反応するので検出部5が着色する。
1.抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の作製
(1)抗A型インフルエンザウイルスNP抗体
A型インフルエンザウイルス抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3X63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、A型インフルエンザウイルスNP抗原を固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。
B型インフルエンザウイルス抗原を用い、(1)と同様の方法で、2種類の精製抗B型インフルエンザウイルスNP抗体を得た。
(1)アルカリフォスファターゼ標識抗A型インフルエンザウイルスNP抗体の作製
精製抗A型インフルエンザウイルスNP抗体のうち1種類について45mgを0.1Mクエン酸緩衝液(pH3.6)で透析後、ペプシン10mgを添加し、37℃で1時間、Fab’消化処理を行った。処理液をウルトロゲルAcA34カラムで分画して抗A型インフルエンザウイルスNP抗体F(ab’)2精製画分を得た。前記画分を約10mg/mLまで濃縮後、0.1Mメルカプトエチルアミンと10:1の体積比で混合し、37℃で90分間還元処理を行った。処理液をウルトロゲルAcA34カラムで分画して抗A型インフルエンザウイルスNP抗体Fab’精製画分を得た後、約1mLにまで濃縮した。
10mg/mLのアルカリフォスファターゼ1.5mLを1mM塩化マグネシウムならびに0.1mM塩化亜鉛を含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.6)に透析後、N−(6−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド0.7mgを添加し、30℃で1時間処理した。処理後の溶液をセファデックスG−25カラムで分画し、最初のピークを回収してマレイミド−アルカリフォスファターゼを得た後、約1mLにまで濃縮した。
Fab’は、0.15M塩化ナトリウム、1%(W/V)ウシ血清アルブミン、1.5mM塩化マグネシウム、0.15mM塩化亜鉛、0.09%アジ化ナトリウムを含む10mMトリス緩衝液(pH8.0)の組成からなる標識抗体希釈液で希釈した後、0.22μm孔径の濾過フィルターで濾過し、アルカリフォスファターゼ標識抗A型インフルエンザウイルスNP抗体を得た。
精製抗B型インフルエンザウイルスNP抗体のうち1種類について、(1)と同様の方法で、アルカリフォスファターゼ標識抗B型インフルエンザウイルスNP抗体を得た。
(1)A型インフルエンザウイルス用デバイス
ニトロセルロースメンブラン(HiFlow Plus HF06504 ミリポア社製)を20cm×5cmに切り、このニトロセルロースメンブランの吸収パッド部側のメンブラン端から1cmの位置に精製水を用いて至適濃度に希釈した抗A型インフルエンザウイルスNP抗体液(上記と別のクローン)で幅0.5mmの20cmラインを描き、減圧下で乾燥して抗体を固相化し、カッターで5mm×5cmのストリップに裁断してメンブランストリップ部を作製した。濾紙(WA1.5 ワットマン社製)を5mm×3cmの大きさに裁断し、メンブランストリップ部の端に5mm重ねて吸収パッド部を設けた。
(1)と同様の方法で、B型インフルエンザウイルス用デバイスを作製した。
検出
検体としてA型インフルエンザウイルス抗原液並びにB型インフルエンザウイルス抗原液をそれぞれ用いた。
同時に、従来法デバイスを作製して、操作し比較試験を行った。
A型インフルエンザウイルス用デバイスを用いた時、A型インフルエンザウイルス抗原は 6×104(pfu/mL)まで陽性で、B型インフルエンザウイルス抗原は陰性となり特異的にA型インフルエンザウイルス抗原を検出できることが確かめられた。
得られた結果を表1及び表2に示す。
2 吸収パッド部
3 基質パッド部
4 標識部
5 検出部
6 メンブランストリップ部
7 吸収パッド部
8 基質展開液パッド部
9 標識体部
10 検出部
11 基質部
12 メンブランストリップ部
13 吸収パッド部
14 基質パッド部
15 標識部
16 検出部
Claims (2)
- 検体試料液中の被検出物を検出するための、メンブランストリップを用いたエンザイムイムノアッセイデバイスであって、メンブランストリップ部の一方の端に吸収パッド部、もう一方の端のメンブランストリップ部上に酵素の基質が乾燥状態で含有されている基質パッド部、前記メンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原を酵素で標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている標識部、該標識部と前記吸収パッド部の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原が固相化された検出部が設けられており、基質パッド部の底面が検出部より低い位置に存在するエンザイムイムノアッセイデバイス。
- 請求項1記載のエンザイムイムノアッセイデバイスを用いて検体試料液中の被検出物を検出する方法であって、検体試料液を標識部に加え、つづいて基質溶解液を基質パッド部に加えて泳動させ、連続した一連の反応により起こる前記検出部における着色の有無を観察することにより検体試料液中の被検出物を検出する方法。
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