KR20190120334A - 검체의 전개를 제어할 수 있는, 당쇄항원을 추출하고 측정하기 위한 이뮤노크로마토그래피 시험편 - Google Patents

검체의 전개를 제어할 수 있는, 당쇄항원을 추출하고 측정하기 위한 이뮤노크로마토그래피 시험편 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서의 검체의 전개 스피드나 방향을 제어하고, 산성 시약과 아질산염과 중화 시약에 의한 처리를 적절하게 제어하는 방법 또는 이뮤노크로마토그래피 시험편을 제공하는 것을 목적으로 한다.
아질산염 또는 산성 용액과 혼합한 검체를 첨가하는 샘플 패드, 당쇄항원에 대한 항체를 표지한 표지항체를 포함하는 표지체 영역 및 상기 당쇄항원에 대한 항체를 고상화(固相化)한 검출 영역을 포함하고, 검출 영역에 있어서 항체-당쇄항원-표지항체의 복합체를 형성시키고, 당쇄항원을 측정하는 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서, 상기 표지체 영역의 상류에 중화 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 또한 상기 중화 시약을 함침시킨 영역의 상류에, 아질산염과 혼합한 검체를 사용할 때는 고형상 산성 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 산성 용액과 혼합한 검체를 사용할 때는 아질산염을 함침시킨 영역을 가지는, 검체 중의 당쇄항원을 추출하고 측정하기 위한 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서,
고형상 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 영역과 중화 시약을 함침시킨 영역 사이에, 양쪽 영역 사이의 시약의 이동 또는 검체 용액의 이동을 억제하도록, 수지제 시트를 끼워넣은, 이뮤노크로마토그래피 시험편.

Description

검체의 전개를 제어할 수 있는, 당쇄항원을 추출하고 측정하기 위한 이뮤노크로마토그래피 시험편
본 발명은, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서 당쇄항원의 아질산 추출 처리를 하는 것이 가능한, 당쇄항원을 추출하고 측정하기 위한 이뮤노크로마토그래피 시험편에 관한 것이다.
이뮤노크로마토그래피법을 원리로 하는 신속진단약의 대부분은, 바이러스 또는 세균감염증을 신속·간편하게 측정하고, 치료 방침을 결정하는 하나의 수단으로서 널리 사용되고 있다.
일반적인 이뮤노크로마토그래피법을 원리로 하는 신속진단약은, 검체를 검체 부유액에 부유시킨 후, 그 부유액을 이뮤노크로마토그래피 시험편에 공급함으로써 신속·간편하게 측정할 수 있다.
A군β용혈성 연쇄상구균(A군β용연균), 구강 내 연쇄상구균 등 스트렙토코커스속에 속하는 미생물을 검출하기 위해서는 당쇄항원을 추출하고, 당쇄항원을 측정할 필요가 있다.
예를 들면, 이뮤노크로마토그래피 시험편에 미리 아질산 나트륨과 중화 시약을 포함시킴으로써, 검체를 아세트산 등의 산성 용액에 부유하고 이뮤노크로마토그래피 시험편에 공급하는 조작만으로 아질산 추출 처리를 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서 행하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1).
또한, 이뮤노크로마토그래피 시험편에 미리 산성 시약과 중화 시약을 포함시켜 두고, 검체를 아질산염에 부유하고 이뮤노크로마토그래피 시험편에 공급하는 방법도 있다.
이뮤노크로마토그래피법에 있어서는, 이뮤노크로마토그래피 시험편에서의 크로마토그래피 전개(展開) 스피드를 제어할 필요가 있는 경우가 있고, 디바이스 형상으로 제어하는 것, 접합 위치로 제어하는 것, 사용하는 소재(부직포 등의 머티리얼(material))로 제어하는 것, 시약으로 제어하는 것 등의 이뮤노크로마토그래피법이 보고되어 있다(특허문헌 2 및 3). 또한, 라미네이트에 사용하는 PET 시트로 유속(流速)을 빠르게 하도록 컨트롤하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 4).
국제공개 WO2005/121794호 공보 일본공개특허 제2005-331471호 공보 일본공개특허 제2005-331463호 공보 일본공개특허 제2016-102790호 공보
이뮤노크로마토그래피 시험편을 사용하여 A군β용혈성 연쇄상구균(A군β용연균) 등을 검출하는 방법으로서, 이뮤노크로마토그래피 시험편에 미리 아질산염과 중화 시약을 포함시킴으로써, 검체를 아세트산 등의 산성 용액에 부유하고 이뮤노크로마토그래피 시험편에 공급하는 조작만으로 아질산 추출 처리를 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서 행하는 방법이나 이뮤노크로마토그래피 시험편에 미리 산성 시약과 중화 시약을 포함시켜 두고, 검체를 아질산염에 부유하고 이뮤노크로마토그래피 시험편에 공급하는 조작만으로 아질산 추출 처리를 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서 행하는 방법이 있었다. 이들 방법에 사용하는 이뮤노크로마토그래피 시험편에 있어서 건조 상태의 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 패드와 중화 시약(염기성 시약)을 함침시킨 패드를 접촉시켜 접합시킨 상태로 장기 보존하면, 양쪽 시약끼리 조금씩 반응하게 되어, 각각의 활성이 저하되는 문제가 있었다.
또한, A군β용연균의 검출에서는 아질산염 용액과 산성 용액을 혼합함으로써 발생시키는 아질산에 의해 A군β용연균의 항원 추출이 행해지지만, 건조 상태의 산성 시약을 함침시킨 패드를 사용한 경우, 산성 시약을 함침시킨 패드로부터 단시간에, 다음 중화 시약을 함침시킨 패드로 검체가 이동하게 되어, 아질산염과 산성 시약의 혼합 시간이 짧고, 충분한 추출이 행해지지 않아, 필요한 감도 성능이 얻어지지 않는 문제가 있었다.
또한, 건조 상태의 산성 시약을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드를 접합시킨 형태를 가지는 이뮤노크로마토그래피 시험편에서는, 검체 시료 첨가 후에 산성 시약을 함침시킨 패드로부터 중화 시약을 함침시킨 패드로 검체의 일부가 이동함으로써, 일단 산성 시약을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드의 양쪽이 젖은 상태로 되면, 중화 시약이 산성 시약을 함침시킨 패드의 방향으로 역류하여, 산성 시약의 활성을 저하시킴으로써 아질산 처리에 의한 항원의 추출이 효율적으로 실시되지 않아, 감도 저하로 이어지는 리스크도 있었다.
이 문제를 방지하고자, 산성 시약을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드의 중첩 부분을 지나치게 작게 하면(1mm 이하), 제조 면에서의 제어가 곤란하고, 2개의 패드를 중첩할 때의 약간의 어긋남에 의해 중첩되는 부분이 없어지게 될 우려가 있어, 이 경우에, 시료가 흐르지 않게 되거나, 흐름이 지나치게 늦어지는 문제가 있었다.
또한, 산성 시약을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드를 길게 함으로써, 물리적으로 산성 시약과 중화 시약의 사이의 거리를 크게 하고, 장기 보존 안정성을 확보하는 것도 고려할 수 있다. 그러나, 길게 한만큼, 이뮤노크로마토그래피 시험편에 전개하는 데도 필요한 검체 시료량이 증가한다. 테스트에 필요한 시료량이 증가하면, 튜브에 잘게 나눈 검체에 혼합하기 위한 아질산염 용액이 보다 많이 필요하게 된다. 이 경우에, 검체채취용 스왑(swab)에 채취된 검체가 희석되어, 결과적으로 성능(감도)이 저하하게 된다.
또한, 1장의 긴 패드에, 산성 시약과 중화 시약을 퍼지도록 혼합하지 않도록 도포·건조시키고, 각각의 시약의 건조시킨 부분이 접하지 않도록 하는 것도 고려할 수 있다. 그러나, 장기 보존 중에 공기 중의 습도에 의해 건조시킨 시약이 용해하고 퍼져, 산성 시약과 중화 시약이 접함으로써 중화 반응이 일어나고, 결과적으로 아질산 처리의 효율을 손상시키는 문제가 있다.
상기한 문제는, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에 산성 시약 대신, 아질산염을 함침시킨 경우에도 일어날 수 있는 문제이다.
본 발명은, 상기한 각종 문제를 해소하기 위하여, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서의 검체의 전개 스피드나 방향을 제어하고, 산성 시약과 아질산염과 중화 시약에 의한 처리를 적절하게 제어하는 방법 또는 이뮤노크로마토그래피 시험편을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서의 검체의 전개를 제어하고, 산성 시약과 아질산염과 중화 시약에 의한 처리를 적절하게 제어하는 방법에 대하여 예의(銳意) 검토를 행하였다.
그 결과, 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드 사이에 PET(폴리에틸렌테레프탈레이트) 시트 등의 수지제 시트를 끼워넣고, 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드가 접촉하는 폭을 극력 저감하는 것(2mm 이하)에 의해, 양쪽 시약의 패드의 장기 보존 안정성을 향상시키는 것을 발견하였다.
또한, PET 시트를 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드의 접촉면 폭이 최소한으로 되도록 양쪽 패드의 중첩 부분 사이에 끼워넣도록 설치하고, 아질산염을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드가 부분적으로 접촉하도록 하고, 시료가 즉시 중화 시약을 함침시킨 패드로 이동하지 않고, 또한 검체가 중화 시약을 함침시킨 패드로부터 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 패드로 역류하기 어려운 구조로 함으로써, 검체의 항원의 추출 시간을 충분히 얻을 수 있고, 그 결과 검출 감도를 향상시킬 수 있는 것을 발견하였다.
이러한 지견에 기초하여, 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드 사이에, 양쪽 패드가 접촉하지 않거나, 혹은 약간 접촉하도록 수지제 시트를 끼워넣은 이뮤노크로마토그래피 시험편을 제작하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
[1] 아질산염 또는 산성 용액과 혼합한 검체를 첨가하는 샘플 패드, 당쇄항원에 대한 항체를 표지한 표지항체를 포함하는 표지체 영역 및 상기 당쇄항원에 대한 항체를 고상화(固相化)한 검출 영역을 포함하고, 검출 영역에 있어서 항체-당쇄항원-표지항체의 복합체를 형성시키고, 당쇄항원을 측정하는 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서, 상기 표지체 영역의 상류에 중화 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 또한 상기 중화 시약을 함침시킨 영역의 상류에, 아질산염과 혼합한 검체를 사용할 때는 고형상 산성 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 산성 용액과 혼합한 검체를 사용할 때는 아질산염을 함침시킨 영역을 가지는, 검체 중의 당쇄항원을 추출하고 측정하기 위한 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서,
고형상 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 영역과 중화 시약을 함침시킨 영역 사이에, 양쪽 영역 사이의 시약의 이동 또는 검체 용액의 이동을 억제하도록, 수지제 시트를 끼워넣은, 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[2] 샘플 패드 상에 고형상 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 영역이 존재하는, [1]의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[3] 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 영역과 중화 시약을 함침시킨 영역이 부분적으로 접촉하도록, 수지제 시트를 끼워넣은, [1] 또는 [2]의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[4] 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 영역과 중화 시약을 함침시킨 영역이 접촉되지 않도록, 수지제 시트를 끼워넣은, [1] 또는 [2]의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[5] 이뮤노크로마토그래피 시험편 상의 최상류에 샘플 패드 상에 고형상 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 영역이 존재하고, 샘플 패드 이외의 영역이 수지제 시트로 덮어지고, 중화 시약을 함침시킨 영역의 상부의 수지제 시트의 상부에, 고형상 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 샘플 패드가 존재하는, [2]∼[4] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[6] 고형상 산성 시약이, 말론산, 말산, 말레산, 시트르산 및 타르타르산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]∼[5] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[7] 중화 시약이, 트리스하이드록실메틸아미노메탄 또는 수산화나트륨인, [1]∼[6] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[8] 당쇄항원이, 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라즈마(mycoplasma), 리케차(rickettsia), 클라미디아(chlamydia) 또는 바이러스의 당쇄항원인, [1]∼[7] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[9] [1]∼[8] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편을 사용하여 이뮤노크로마토그래피법에 의해 검체 중의 당쇄항원을 측정하는 방법으로서,
이뮤노크로마토그래피 시험편이 고형상 산성 시약을 함침시킨 영역을 가질 때는 검체를 아질산 용액과 혼합하고, 이뮤노크로마토그래피 시험편이 아질산염을 함침시킨 영역을 가질 때는 검체를 산성 용액과 혼합하고, 상기 이뮤노크로마토그래피 시험편의 샘플 패드에 첨가하는 공정을 포함하고,
고형상 산성 시약을 함침시킨 영역 또는 아질산염을 함침시킨 영역에 있어서, 아질산염과 고형상 산성 시약의 반응에 의해 발생한 아질산의 작용에 의해 검체로부터 당쇄항원이 추출되고, 중화 시약을 함침시킨 영역에 있어서, 상기 당쇄항원을 포함하는 산성 용액이 중화되고,
검출 영역에 있어서, 항체-당쇄항원-표지항체의 복합체가 형성되는, 이뮤노크로마토그래피법에 의해, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서의 검체의 전개 스피드나 방향을 제어하고, 산성 시약과 아질산염과 중화 시약에 의한 처리를 제어하여, 검체 중의 당쇄항원을 측정하는 방법.
본 명세서는 본원의 우선권 기초가 되는 일본특허출원번호 2017-049213호의 개시 내용을 포함한다.
산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드 사이에, 양쪽 패드가 접촉하지 않도록, 혹은 약간 접촉하도록 수지제 시트를 끼워넣음으로써, 건조 상태의 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드를 접합시킨 상태에서의 보존 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한, 검체가 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 패드로부터 중화 시약을 함침시킨 패드로 이동하는 시간을 길게 하고, 혹은, 검체가 중화 시약을 함침시킨 패드로부터 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 패드로 역류하지 않도록 할 수 있고, 그 결과, 아질산에 의한 항원의 추출을 효율적으로 행함으로써 감도의 향상 효과가 얻어진다.
도 1은 고형상 산성 시약 영역 및 중화 시약 영역을 가지는 이뮤노크로마토그래피 시험편(2장 패드 시험편)의 구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 PET 시트가 고형상 산성 시약 영역과 중화 시약 영역 사이에 첩부된, 고형상 산성 시약 영역 및 중화 시약 영역을 가지는 이뮤노크로마토그래피 시험편의 구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 PET 시트가 고형상 산성 시약 영역과 중화 시약 영역의 사이에 첩부된, 고형상 산성 시약 영역 및 중화 시약 영역을 가지는 이뮤노크로마토그래피 시험편의 구조를 모식적으로 나타낸 도면이며, 각 파트(part) 사이의 거리를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, 당쇄항원의 아질산 추출 처리를 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서 행할 수 있도록 간편화하고, 피검출 물질인 당쇄항원을 신속하게 또한 정확하게 측정하는 것을 가능하게 하는 이뮤노크로마토그래피 시험편에 관한 것이다.
이뮤노크로마토그래피 시험편은, 피검출 물질(항원 등)을 포착하는 항체(항체 1)가 고정화된 검출 영역을 가지는 지지체, 이동 가능한 표지항체(항체 2)를 가지는 표지체 영역, 검체를 첨가하는 샘플 패드, 전개된 검체액을 흡수하는 흡수대(吸收帶), 이들 부재를 하나로 접합시키기 위한 배킹(backing) 시트 등을 구비한다.
본 발명의 이뮤노크로마토그래피 시험편은, 저장 용기 내에 수용되어 있어도 되고, 상기 저장 용기에 의해, 예를 들면, 자외선이나 공기 중의 습기에 의한 열화를 방지할 수 있다. 또한, 오염성, 감염성이 있는 검체 시료를 사용하는 경우, 저장 용기에 의해 앗세이를 행하는 시험자가 오염 또는 감염하는 것을 방지할 수 있다. 예를 들면, 적절한 크기의 수지제 케이스를 저장 용기로서 사용하여, 상기 케이스 중에 본 발명의 장치를 수납하면 된다. 또한, 항원 또는 항체를 고정화한 시험편의 표면을 수지제 필름 등(PET 시트)로 덮어도 된다. 저장 용기와 그 안에 수납된 시험편을, 일체로서 이뮤노크로마토 디바이스라고 하는 경우가 있다.
그리고, 검출 영역의 수 및 표지체 영역에 포함되는 표지항체의 종류는 1개로 한정되지 않고, 복수의 피검출 물질에 대응하는 항체를 사용함으로써, 2개 이상의 항원을 동일한 시험편으로 측정할 수 있다.
지지체는, 피검출 물질(항원)을 포착하기 위한 항체를 고정화하는 성능을 가지는 재료이며, 또한 액체가 수평 방향으로 통행하는 것을 방해하지 않는 성능을 가진다. 바람직하게는, 모세관 작용을 가지는 다공성 박막(멤브레인(membrane))이며, 액체 및 그것에 분산된 성분을 흡수에 의해 수송 가능한 재료이다. 지지체를 이루는 재질은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF), 유리섬유, 나일론, 폴리케톤 등이 있다. 이들 중 니트로셀룰로오스를 사용하여 박막 또는 멤브레인으로 한 것이 보다 바람직하다. 항체를 고정화한 멤브레인를 항체 고정화 멤브레인이라고 한다.
표지체 영역은, 표지항체를 포함하는 다공성 기재(基材)로 이루어지고, 기재의 재질은 일반적으로 사용되고 있는 유리섬유(글래스파이버(glass fiber))나 부직포 등을 사용할 수 있다. 상기 기재는, 다량의 표지항체를 함침시키기 위하여, 두께 0.3mm∼0.6mm 정도의 패드 길이인 것이 바람직하다. 표지항체를 함침시키고 건조시킨 다공성 기재를 건조 패드라고도 한다.
표지항체의 표지에는, 알칼리포스파타아제나 서양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소, 금 콜로이드와 같은 금속 콜로이드, 실리카 입자, 셀룰로오스 입자, 착색 폴리스티렌 입자 및 착색 라텍스 입자 등이 사용되는 경우가 많다. 금속 콜로이드 입자, 착색 폴리스티렌 입자나 착색 라텍스 입자 등의 착색 입자를 사용하는 경우에는, 이 표지 시약이 응집함으로써 착색이 생기므로, 이 착색을 측정한다. 항체를 고정화한 입자를 항체 고정화 입자라고 한다.
검출 영역은, 피검출 물질(항원)을 포착하는 항체가 고정화된 지지체의 일부 영역을 지칭한다. 검출 영역은, 항원을 포착하기 위한 항체를 고정화한 영역을 적어도 1개 설치한다. 검출 영역은 지지체에 포함되어 있으면 되고, 지지체 상에 항체를 고정화하면 된다.
샘플 패드는, 검체를 첨가하기 위한 부위이며, 다공성 재료이다. 샘플 패드는 이뮤노크로마토그래피 시험편의 가장 상류에 있는 부위이다. 상기 재료에는 일반적으로 사용되는 여과지, 유리섬유, 부직포 등을 사용할 수 있다. 다량의 검체를 면역 측정에 사용하기 위해, 두께 0.3mm∼1mm 정도의 패드형인 것이 바람직하다. 검체에는, 검체를 다른 용액에 부유하여 얻어지는 시료 등, 검체를 사용하여 조제된 시료도 포함한다.
흡수대는, 지지체에 공급되고 검출 영역에서 반응에 관여하지 않은 성분을 흡수하기 위한 부재이다. 해당 재료에는, 일반적인 천연 고분자 화합물, 합성 고분자 화합물 등으로 이루어지는 보수성(保水性)이 높은 여과지, 스폰지 등을 사용할 수 있지만, 검체의 전개 촉진을 위해서는 흡수성이 높은 것이 바람직하다.
배킹 시트는, 전술한 모든 재료, 즉 지지체, 샘플 패드, 표지체 영역, 흡수대 등이, 부분적인 중첩을 가지며 첩부·고정되기 위한 부재이다. 배킹 시트는, 이들 재료가 최적 간격으로 배치·고정되어 있으면, 반드시 필요한 것은 아니지만, 제조 상 혹은 사용 상의 편리성을 고려하면, 일반적으로는 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 이뮤노크로마토그래피 시험편에는, 대조 표시 영역(부재)이 더 존재하고 있어도 된다. 대조 표시 영역은 시험이 정확하게 실시된 것을 나타내는 부위이다. 예를 들면, 대조 표시 영역은, 검출 영역의 하류에 존재하고, 검체 시료가 검출 영역을 통과하고, 대조 표시 영역에 도달했을 때 착색 등에 의해 시그널을 발한다. 대조 표시 영역에는, 표지담체를 결합시킨 항체에 결합하는 물질을 고상화해 두어도 되고, 검체가 도달했을 때 색이 변화되는 pH 인디케이터 등의 시약을 고상화해 두어도 된다. 표지담체를 결합시킨 항체가 마우스 모노클로널 항체인 경우, 항마우스IgG항체를 사용하면 된다.
이뮤노크로마토그래피 시험편의 크기는 한정되지 않지만, 예를 들면, 세로의 길이 수 cm∼십수 cm, 가로의 길이 수 mm∼수 cm 정도이다.
상기한 형태의 시험편에 있어서, 검체는, 샘플 패드, 표지체 영역, 지지체, 검출 영역, 흡수대 등의 일련의 접속에 의해 형성된 다공성 유로(流路)를 통과한다. 따라서 본 형태에 있어서는, 이들 모두가 검체 이동 영역이 된다. 각 구성 재료의 재질이나 형태에 의해, 검체가 재료 내부를 침투하지 않고 계면을 통행하는 형태도 있을 수 있지만, 본 명세서에서 정의한 검체 이동 영역은 재료의 내부나 계면을 묻지 않으므로, 해당 형태의 시험편도 본 명세서의 범위에 포함된다.
본 발명의 이뮤노크로마토그래피 시험편을 사용하여 검체 중의 당쇄항원을 측정하는 경우, 처음에 검체 중의 당쇄항원을 추출할 필요가 있다. 당쇄항원의 추출은, 당쇄항원을 포함하는 검체를 아질산으로 처리하는 것에 의해 행한다. 아질산은 아질산 나트륨 등의 아질산염을 산과 혼합함으로써 발생시킬 수 있고, 이와 같이 하여 발생시킨 아질산으로 당쇄항원을 포함하는 검체를 처리하면 된다. 추출한 항원은 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에 고상화한 항체에 항원항체반응에 의해 결합되지만, 이때, 반응계에 산이 남아있으면 반응계는 산성이 되어, 항원항체반응이 저해된다. 따라서, 반응계의 산을 중화할 필요가 있다.
본 발명에 있어서, 아질산염과 산을 혼합하고 아질산을 발생시켜, 상기 아질산에 의해 검체 중의 당쇄항원을 추출하고, 산을 중화한 후에, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에 고상화한 항체에 당쇄항원을 결합시키고, 당쇄항원을 측정하는 방법에 있어서, 당쇄항원을 추출하여 측정하는 방법으로서 하기 방법을 예로 들 수 있다. 어느 방법에 있어서도, 아질산에 의한 당쇄항원의 추출과 중화는 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서 행한다. 아질산에 의한 당쇄항원의 추출을 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서 행하기 위해서는, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에 산성 시약 또는 아질산염을 포함시켜 두면 된다. 중화를 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서 행하기 위해서는, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에 중화 시약을 함침시켜 두면 된다.
(A) 미리 검체와 산성 용액을 혼합하고, 아질산염과 중화 시약을 함침시킨 이뮤노크로마토그래피 시험편의 샘플 패드에 첨가한다. 혼합액이 아질산염을 함침시킨 영역에 도달하면 아질산염과 산이 반응하고, 아질산이 발생하고, 검체 중의 당쇄항원이 추출된다. 당쇄항원의 추출액은 이뮤노크로마토그래피 시험편 상의 중화 시약을 함침시킨 영역에서 중화되고, 당쇄항원은 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에 고상화한 항체에 결합하여, 검출할 수 있다. 상기한 방법에 있어서, 사용하는 산성 용액으로서는, 아세트산, 염산, 말론산, 말산, 말레산, 시트르산, 타르타르산 등을 예로 들 수 있다.
(B) 미리 검체와 아질산염 용액을 혼합하고, 산성 시약과 중화 시약을 함침시킨 이뮤노크로마토그래피 시험편의 샘플 패드에 첨가한다. 혼합액이 산성 시약을 함침시킨 영역에 도달하면 아질산염과 산이 반응하고, 아질산이 발생하고, 검체 중의 당쇄항원이 추출된다. 당쇄항원의 추출액은 이뮤노크로마토그래피 시험편 상의 중화 시약을 함침시킨 영역에서 중화되고, 당쇄항원은 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에 고상화한 항체에 결합하여, 검출할 수 있다.
상기한 (A) 또는 (B)의 방법을 행하기 위한 본 발명의 이뮤노크로마토그래피 시험편에서는, 표지체 영역보다 상류(검체의 흐름의 상류이며 샘플 패드가 존재하는 쪽)에, 즉, 샘플 패드 내에 고형상 산성 시약 또는 아질산염이 함침되어 있거나, 혹은, 샘플 패드 내에 아질산염이 함침되어 있는 이뮤노크로마토그래피 시험편은 상기 (A)의 방법에 사용할 수 있다. 또한, 샘플 패드 내에 산성 시약이 함침되어 있는 이뮤노크로마토그래피 시험편은 상기 (B)의 방법에 사용할 수 있다. 그리고, 산성 시약으로서는, 고형상 산성 시약이 사용된다. 이러한 방법에 의해, 피험 시료 중의 피검출 물질을 피험 시료의 시험에 제공되는 양에 의하지 않고, 정확하게, 특이적으로 측정하는 것이 가능하게 된다.
상기 고형상 산성 시약 또는 아질산염은, 샘플 패드에 함침시켜도 되고, 샘플 패드와는 다른 부직포 등의 다공성 재료로 이루어지는 패드에 함침시켜, 얻어진 고형상 산성 시약 함침 다공성 재료 또는 아질산염 함침 다공성 재료를, 샘플 패드와 표지체 영역 사이, 즉 표지체 영역의 상류 측에 배치해도 된다. 여기서, 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 영역과 샘플 패드 또는 표지체 영역은 접촉하고 있어도 되고, 접촉하고 있지 않아도 된다.
본 발명에 있어서, 시약을 함침시킨 영역을 시약을 함침시킨 패드라고도 한다.
상기 중화 시약은, 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 함침시키는 영역보다 하류에 배치한다. 중화 시약은, 지지체에 함침시켜도 되고, 지지체와는 다른 부직포 등의 다공성 재료로 이루어지는 패드에 함침시켜, 얻어진 중화 시약 함침 다공성 재료를, 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 영역과 표지체 영역 사이에 배치해도 된다. 즉, 표지체 영역의 상류에 중화 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 또한 상기 중화 시약을 함침시킨 영역의 상류에 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 영역을 가진다. 여기서, 중화 시약을 함침시킨 영역과 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 영역 또는 표지체 영역은 접촉하고 있어도 되고, 접촉하고 있지 않아도 된다.
여기서, 중화 시약을 함침시킨 영역과 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 영역 또는 표지체 영역은 접촉하고 있어도 되고, 접촉하고 있지 않아도 된다.
중화 시약을 함침시키는 영역에 사용하는 다공성 재료의 소재로서는, 단위면적당중량이 10∼400 g/m2이며, 또한, 두께가 0.1∼2.0 mm인 직물이며, 1cm/m2당의 흡수량이 10∼100 μl/cm2이며, 또한 흡수 스피드가 1.0∼5.0 μl/sec이며, 1cm/m2의 단편을 젖은 상태로 멤브레인에 접촉시켜 5분간 정치한 후의 보수량(保水量)이 10∼100 μl/cm2이며, 바람직하게는 1cm/m2의 단편을 젖은 상태로 멤브레인에 접촉시켜 5분간 정치한 후의 액의 퍼짐 면적이 20mm2 이하, 즉 흡수력이 높고, 보수성(액체의 유지력)이 높고, 또한 액체의 방출성이 낮거나 또는 지속하는 특성의 3개를 가지는 다공성 재료를 예로 들 수 있다. 구체적으로는, 셀룰로오스의 면섬유로 된 여과지나 유리섬유로 된 유리 여과지 등을 예로 들 수 있다. 이와 같은 여과지로서, 예를 들면, 도요로시(東洋濾紙) 가부시키가이샤의 No. 26-3이 있다. 또한, 사용하는 여과지의 용적은 크고, 상류로부터 검체보다 늦게 도달하는 산성 용액을 충분히 유지할 수 있다. 이와 같은 다공성 재료를 사용함으로써, 아질산염과 산성 시약의 반응에 의해 발생된 아질산으로 당쇄항원을 추출한 검체를 충분히 중화할 수 있는 양의 중화 시약을 함침시킬 수 있다. 또한, 상기 패드는 대량의 액체를 흡수 유지할 수 있고, 방출성이 지속되므로, 이뮤노크로마토그래피 시험편의 상류에 남는 아질산을 포함하는 액이 판정 시간 이후에 전개했을 때도 충분한 중화 능력을 가질 수 있고, 산성 용액이 항체를 고상화한 검출 영역에 달하는 것을 억제할 수 있고, 그 결과 비특이 반응을 억제하여, 비특이 반응이 생기지 않고 당쇄항원을 검출할 수 있다. 한편, 흡수력이 높고, 보수성이 높고, 방출성이 낮은 유리 여과지의 경우, 구체적으로는, 도요로시 가부시키가이샤의 GS-25를 예로 들 수 있지만, 흡수력이 높으므로, 보다 많은 중화 시약을 함침할 수 있고, 보수성이 높고, 방수성이 낮으므로, 산성 용액이 고상화한 검출 영역에 도달하는 것을 방지한다. 그 결과, 음성인 경우에는 비특이 반응을 억제하고, 양성인 경우에는 판정 시간 이후의 라인 발색을 방지할 수 있다.
중화 시약을 함침시키는 영역에 사용되는 다공성 재료의 소재의 「단위면적당중량」은 10∼400 g/m2이다. 여기서, 「단위면적당중량」이란, 천 등의 단위면적(1m2)당의 중량을 일컫는다. 단위면적당중량은 해당 패드에 함침시키는 중화 시약의 양이나 조성에 따라 적절하게 변경할 수 있다. 단위면적당중량이 30g/m2 이하이면 공극율(空隙率)이 높고, 중화 시약을 함침했을 때 찢어지기 쉬워, 이뮤노크로마토그래피 제조 시의 취급이 곤란하므로, 바람직하게는 단위면적당중량 50g/m2 이상이며, 단위면적당중량이 300g/m2 이상인 경우에는, 공극율이 낮으며, 중화 시약의 조성에도 좌우되지만, 검체가 원활하게 소재에 침투하지 않고, 중화 시약과 혼합할 수 없으므로, 300g/m2 이하인 것이 바람직하다. 가장 바람직한 단위면적당중량은 250∼270 g/m2이다.
또한, 중화 시약을 함침시키는 영역에 사용하는 다공성 재료의 소재의 「두께」는 0.1∼2.0 mm가 바람직하지만, 두께는, 해당 패드에 함침시키는 중화 시약의 양이나 조성에 따라 적절하게 변경할 수 있다. 두께가 0.4mm 이하인 경우, 중화 시약을 함침했을 때 찢어지기 쉬워져, 이뮤노크로마토그래피 제조 시의 취급이 곤란하므로, 바람직한 두께로서는, 0.4∼0.8 mm, 중화 시약을 함침시키는 양을 조절하기 쉽고, 또한, 이뮤노크로마토그래피 제조 시의 핸들링의 용이성을 고려하면, 0.6mm 정도가 보다 바람직하다.
「흡수성」은 1cm/m2당의 흡수량이 10∼100 μl/cm2이며, 또한 흡수 스피드가 1.0∼5.0 μl/sec인 것이 바람직하다. 흡수량과 흡수 스피드는, 96구멍의 EIA 플레이트의 1셀에 200μl의 착색한 용액(1% Tween20＋적색102호)을 준비하고, 거기에 5×60 mm의 크기의 소재를 배킹 시트에 부착한 시험편을 넣고, 용액에 침지시킨 쪽을 시험편의 하단으로 하고, 시험편의 상단에 용액이 도달할 때까지의 시간을 측정하고, 또한 용액이 상단에 도달한 후, 즉시 시험편을 꺼내고, 셀에 잔존하는 액량을 측정한다. 흡수량은, 200μl로부터 셀에 남은 액량을 뺄셈하여 제하고, 소재의 1cm2 면적당으로 나눗셈한 액량이며, 흡수 스피드는, 흡수량/상단 도달까지 걸린 시간으로 구해진다. 중화 시약을 함침시키는 영역에 사용되는 다공성 재료의 소재로서는, 흡수량이 많고, 흡수 속도가 느린 소재가 바람직하다. 고형상 산성 시약의 농도와 함수량에도 좌우되지만, 흡수량이 30μl/cm2 이하인 경우, 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서 필요한 중화 시약이 전부는 함침할 수 없는 경우도 고려할 수 있으므로, 구체적으로는, 흡수량이 30μl/cm2 이상인 것이 바람직하다. 중화 시약을 함침시키는 영역에 사용되는 다공성 재료의 소재 흡수 스피드는, 검체 중의 당쇄항원이 추출되는 시간 및 추출 후의 시험액이 중화되는 시간에 영향을 준다. 당쇄항원을 추출하는 시간은, 고형상 산성 시약의 소재 혹은 조성으로 조절하는 것이 어느 정도까지는 가능하지만, 완전하지는 않으므로, 중화 시약을 함침시키는 영역에 사용하는 소재의 흡수 스피드는, 충분한 당쇄항원의 추출 및 중화에 중요한 요소가 된다. 구체적으로는, 흡수 스피드는 1.0∼5.0 μl/sec가 바람직하고, 보다 바람직한 흡수 스피드는, 2.0μl/sec 이하이다.
「보수성」은, 중화 시약을 함침시키는 영역에 사용되는 다공성 재료의 소재 1cm/m2의 단편을 멤브레인 상에 두고, 거기에 70μl의 용액(1% Tween20＋적색102호)을 첨가하고, 5분간 정치 전후의 중량을 측정함으로써 얻어진다. 보수성의 액량은, 첨가하는 용액의 조성(계면활성제나 단백질량)에 의해 변화하지만, 1% Tween20 용액으로 시험한 경우의 보수량이 10∼100 μl/cm2인 것이 바람직하고, 보다 바람직한 보수량은 15μl/cm2 이상이다.
「방출성」은, 중화 시약을 함침시키는 영역에 사용되는 다공성 재료의 소재 1cm/m2의 단편을 멤브레인 상에 두고, 거기에 70μl의 용액(1% Tween20＋적색102호)을 첨가하고, 5분간 정치한 후에 멤브레인 상에 퍼진 액의 면적을 구함으로써 측정한다. 면적은, 첨가하는 용액의 조성(계면활성제나 단백질량)에 의해 변화하지만, 1% Tween20 용액으로 시험한 경우의 면적이, 30mm2 이하, 보다 바람직한 방출성은 20mm2 이하이다.
즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
[1] 아질산염 또는 산성 용액과 혼합한 검체를 첨가하는 샘플 패드, 당쇄항원에 대한 항체를 표지한 표지항체를 포함하는 표지체 영역 및 상기 당쇄항원에 대한 항체를 고상화한 검출 영역을 포함하고, 검출 영역에 있어서 항체-당쇄항원-표지항체의 복합체를 형성시키고, 당쇄항원을 측정하는 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서, 상기 표지체 영역의 상류에 중화 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 또한 상기 중화 시약을 함침시킨 영역의 상류에, 아질산염과 혼합한 검체를 사용할 때는 고형상 산성 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 산성 용액과 혼합한 검체를 사용할 때는 아질산염을 함침시킨 영역을 가지는, 검체 중의 당쇄항원을 추출하고 측정하기 위한 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서,
중화 시약을 함침시킨 영역의 소재가 흡수성이 높고, 보수성이 높고, 또한 방출성이 낮고 혹은 방출성이 계속하는 3개의 특성을 가지는 여과지 또는 유리 여과지이며,
중화 시약을 함침시킨 영역의 흡수성의 높이 및 보수성의 높이에 의해 상기 당쇄항원을 포함하는 산성 용액이 충분히 중화되고, 중화 시약을 함침시킨 영역의 방출성의 낮음 또는 방출성의 지속에 의해 남은 산성 용액이 검출 영역에 달하는 것을 억제하거나, 혹은 충분히 중화된 시험액이 계속적으로 검출 영역에 계속해서 전개함으로써 비특이 반응을 억제하는, 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[2] 아질산염 또는 산성 용액과 혼합한 검체를 첨가하는 샘플 패드, 당쇄항원에 대한 항체를 표지한 표지항체를 포함하는 표지체 영역 및 상기 당쇄항원에 대한 항체를 고상화한 검출 영역을 포함하고, 검출 영역에 있어서 항체-당쇄항원-표지항체의 복합체를 형성시키고, 당쇄항원을 측정하는 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서, 상기 표지체 영역의 상류에 중화 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 또한 상기 중화 시약을 함침시킨 영역의 상류에, 아질산염과 혼합한 검체를 사용할 때는 고형상 산성 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 산성 용액과 혼합한 검체를 사용할 때는 아질산염을 함침시킨 영역을 가지는, 검체 중의 당쇄항원을 추출하고 측정하기 위한 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서,
중화 시약을 함침시킨 영역의 소재가 단위면적당중량이 10∼400 g/m2이며, 또한, 두께가 0.1∼2.0 mm의 직물인 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[3] 상기 직물의 1cm/m2당의 흡수량이 10∼100μl/cm2이며, 또한 흡수 스피드가 1.0∼5.0 μl/sec이며, 또한 1cm/m2의 단편을 젖은 상태로 검출 영역에 접촉시키고 5분간 정치한 후의 보수량이 10∼100μl/cm2이며, 1cm/m2의 단편을 젖은 상태로 멤브레인에 접촉시키고 5분간 정치한 후의 액의 퍼짐 면적이 20mm2 이하인, [1] 또는 [2]에 기재된 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[4] 중화 시약을 함침시킨 영역의 흡수성의 높이 및 보수성의 높이에 의해 상기 당쇄항원을 포함하는 산성 용액이 충분히 중화되고, 중화 시약을 함침시킨 영역의 방출성의 지속력에 의해 남은 산성 용액이 검출 영역에 달할 때도 충분한 중화 능력을 비축함으로써 비특이 반응을 억제하는, [1]∼[3] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[5] 중화 시약을 함침시킨 영역의 흡수성의 높이 및 보수성의 높이에 의해 상기 당쇄항원을 포함하는 산성 용액이 충분히 중화되고, 중화 시약을 함침시킨 영역의 방출성의 낮음에 의해, 남은 산성 용액이 검출 영역에 도달하는 것을 억제하고, 음성인 경우에는 비특이 반응을 억제하고, 양성인 경우에는 판정 시간 이후의 라인 발색을 방지하는, [1]∼[4] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[6] 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 영역이, 샘플 패드 상 혹은 표지체 영역이 도포된 패드 상에 존재하는, [1]∼[5] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[7] 고형상 산성 시약이, 말론산, 말산, 말레산, 시트르산 및 타르타르산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]∼[6] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[8] 중화 시약이, 트리스하이드록실메틸아미노메탄 또는 수산화나트륨인, [1]∼[7] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[9] 당쇄항원이, 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라즈마, 리케차, 클라미디아 또는 바이러스의 당쇄항원인, [1]∼[8] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편.
[10] [1]∼[9] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토그래피 시험편을 사용하여 이뮤노크로마토그래피법에 의해 검체 중의 당쇄항원을 측정하는 방법으로서,
이뮤노크로마토그래피 시험편이 고형상 산성 시약을 함침시킨 영역을 가질 때는 검체를 아질산 용액과 혼합하고, 이뮤노크로마토그래피 시험편이 아질산염을 함침시킨 영역을 가질 때는 검체를 산성 용액과 혼합하고, 상기 이뮤노크로마토그래피 시험편의 샘플 패드에 첨가하는 공정을 포함하고,
고형상 산성 시약을 함침시킨 영역 또는 아질산염을 함침시킨 영역에 있어서, 아질산염과 고형상 산성 시약의 반응에 의해 발생한 아질산의 작용에 의해 검체로부터 당쇄항원이 추출되고, 중화 시약을 함침시킨 영역에 있어서, 상기 당쇄항원을 포함하는 산성 용액이 중화되고,
검출 영역에 있어서, 항체-당쇄항원-표지항체의 복합체가 형성되는, 이뮤노크로마토그래피법에 의해, 중화 시약을 함침시킨 영역의 흡수성의 높이 및 보수성의 높이에 의해 상기 당쇄항원을 포함하는 산성 용액이 충분히 중화되고, 중화 시약을 함침시킨 영역의 방출성의 낮음 혹은 방출성의 지속에 의해 남은 산성 용액이 검출 영역에 달하는 것을 억제하거나 또는 충분히 중화된 시험액을 계속적으로 검출 영역에 계속해서 첨가함으로써 비특이 반응을 억제하여, 검체 중의 당쇄항원을 측정하는 방법.
고형상 산성 시약을 함침시킨 영역을 고형상 산성 시약 영역이라고 하고, 아질산염을 함침시킨 영역을 아질산염 영역이라고 하고, 중화 시약을 함침시킨 영역을 중화 시약 영역 또는 염기성 시약 영역이라고 한다.
고형상 산성 시약 영역 혹은 아질산염 영역과 중화 시약 영역을 가지는 이뮤노크로마토그래피 시험편은, 지지체 상에 상류로부터 샘플 패드, 고형상 산성 시약 영역 혹은 아질산염 영역, 중화 시약 영역, 표지체 영역, 검출 영역 및 흡수대를 가지고, 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산염 영역은 샘플 패드 상에 있어도 된다. 또한, 샘플 패드, 고형상 산성 시약 영역 혹은 아질산염 영역, 중화 시약 영역, 표지체 영역, 검출 영역 및 흡수대는, 이웃이 되는 영역끼리 접촉하고 있어도 되고, 접촉하고 있지 않아도 된다.
본 발명에서 사용되는 고형상 산성 시약은 상온에 있어서 고형상이며, 고온에 있어서 휘발하지 않는 것이다.
본 발명에 사용되는 바람직한 고형상 산성 시약으로서는, 말론산, 말산, 말레산, 시트르산, 타르타르산을 예로 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 바람직한 고형상 산성 시약으로서는, 예를 들면, 시트르산과 같은 가수(價數)가 많은 산을 사용하면 보다 적은 양으로 추출할 수 있다. 또한 동일한 가수라면 보다 산해리상수가 작은, 예를 들면, 말레산, 타르타르산은 효율이 양호하다.
또한, 본 발명에서 사용되는 바람직한 고형상 산성 시약으로서는, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서 착색되지 않는 시약, 구체적으로는 건조 상태에서 백색 또는 건조열이나 산화에 의해 착색되기 어려운 시약이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 아질산염으로서는, 아질산 나트륨, 아질산 칼륨 등을 예로 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 고형상 산성 시약 또는 아질산염의 사용량, 즉 이뮤노크로마토그래피 시험편에 함침시키는 양은, 특별히 한정되지 않지만, 통상, 이뮤노크로마토그래피 시험편의 1시험편당 0.01μg∼1mg 정도이며, 바람직하게는 0.1μg∼1mg 정도이다. 다만, 사용하는 고형상 산성 시약 또는 아질산염의 종류, 검체 부유액의 조성이나 첨가량 등에 의해 효과가 얻어지는 최적인 양을 선택하는 것이 바람직하다.
고형상 산성 시약 또는 아질산염을 샘플 패드 또는 다공성 재료에 함침시키기 위해서는, 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 한번 용해시켜서 도포하고 건조시킨다.
본 발명에 사용되는 중화 시약은 상온에 있어서 고형상이며, 고온에 있어서 휘발하지 않는 것이다.
본 발명에 사용되는 바람직한 중화 시약으로서는, 트리스 염기(트리스하이드록실메틸아미노메탄), 수산화나트륨, 인산수소 이칼륨, 시트르산 삼나트륨, 알칼리 영역에 완충능을 가지는 굿 버퍼를 예로 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 중화 시약의 사용량, 즉 이뮤노크로마토그래피 시험편에 함침시키는 양은, 특별히 한정되지 않지만, 통상, 이뮤노크로마토그래피 시험편의 1시험편당 0.01μg∼1mg 정도이며, 바람직하게는 0.1μg∼1mg 정도이다. 다만, 사용하는 중화 시약의 종류, 검체 부유액의 조성이나 첨가량 등에 의해 효과가 얻어지는 최적인 양을 선택하는 것이 바람직하다.
중화 시약을 다공성 재료에 함침시키기 위해서는, 중화 시약을 한번 용해시켜, 용액을 다공성 재료에 도포하고, 그 후 건조시키면 된다.
도 1은, 전형적인 이뮤노크로마토그래피 시험편의 바람직한 1형태를 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 이뮤노크로마토그래피 시험편은, 고형상 산성 시약 및 중화 시약을 함침시킨 이뮤노크로마토그래피 시험편이지만, 고형상 산성 시약 대신 아질산염을 함침시켜도 되며, 이 경우에는, 아질산염 및 중화 시약을 함침시킨 이뮤노크로마토그래피 시험편이 된다. 당업자라면, 아질산염 및 중화 시약을 함침시킨 이뮤노크로마토그래피 시험편을 적절하게 설계하여 제조할 수 있다. 그리고, 이뮤노크로마토그래피 시험편은, 도 1에 나타낸 것으로 한정되는 것은 아니다. 도 1 중, 부호 1이 지지체, 부호 2가 표지체 영역, 부호 3이 검출 영역, 부호 7이 흡수대, 부호 8이 배킹 시트를 나타내고 있다.
도 1의 A가 상면도, 도 1의 B가 절단 단면도이다. 도 1의 예에서는, 표지체 영역(2)의 상류에 고형상 산성 시약 영역(5) 및/또는 중화 시약 영역(6)이 존재하고, 이들이 중첩되어 있고, 이로써, 연속된 래터럴 플로우의 유로가 형성되어 있다. 도 1에 나타낸 시험편에 있어서는, 고형상 산성 시약 영역(5)이 샘플 패드를 겸하고 있다. 즉, 고형상 산성 시약 영역이 샘플 패드 상에 존재한다. 이 시험편에 있어서는, 고형상 산성 시약 영역 및 중화 시약 영역이 별도의 2장의 다공성 재료(패드)상으로 형성되어 있으므로, 2장 패드 시험편이라고 하는 경우가 있다. 고형상 산성 시약 영역의 상류에 샘플 패드가 더욱 존재할 수도 있다.
본 발명에 있어서는, 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산염 영역과 중화 시약 영역이 중첩하여 접촉하고 있는 경우에, 고형상 산성 시약 영역 혹은 아질산염 영역과 중화 시약 영역 사이에 액체를 통과시키지 않는 시트를 끼워넣도록 설치한다. 시트를 설치함으로써, 하기 3개의 효과를 얻을 수 있다.
(A) 시험편의 보존 시에 인접하는 2개의 영역에서의 시약의 이동을 억제할 수 있다. 이 결과, 고형상 산성 시약 혹은 아질산염과 중화 시약의 접촉에 의한 반응을 방지할 수 있다. 이 결과, 시약의 안정성을 향상시킬 수 있다.
(B) 또한, 아질산염 또는 산성 시약과 혼합한 검체를 첨가했을 때, 검체가 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산염 영역에 도달하고, 그 후 즉시 중화 시약 영역에 이동하는 것에 의한 불충분한 당쇄항원의 추출을 방지할 수 있다. 즉, 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산염 영역으로부터 중화 시약 영역으로 검체를 포함하는 액체가 이동하는 속도를 저하시키고, 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산염 영역에 검체를 포함하는 액체가 머무는 시간을 길게 하고, 그 결과, 당쇄항원을 충분히 추출하고, 측정 감도를 높인다.
(C) 또한, 아질산염 또는 산성 시약과 혼합한 검체를 첨가했을 때, 검체가 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산염 영역에 도달하고, 그 후 즉시 중화 시약 영역으로 이동하고, 이동한 검체를 포함하는 액체가 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산염 영역으로 역류하고, 고형상 산성 시약 또는 아질산염의 활성을 저하시키고, 추출 효율이 저하되는 것을 방지할 수 있다. 즉, 일단 중화 시약 영역에 도달한 검체를 포함하는 액체가 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산염 영역으로 역류하는 것을 방지하고, 고형상 산성 시약 또는 아질산염의 활성 저하를 방지하고, 아질산에 의한 당쇄항원의 추출 처리를 효율적으로 진행시켜, 측정 감도를 높인다.
고형상 산성 시약 영역 혹은 아질산염 영역과 중화 시약 영역 사이에 설치하는 시트의 소재는 액체를 통과시키지 않는 소재인 한 한정되지 않고, 예를 들면, PET(폴리에틸렌테레프탈레이트) 시트, 폴리에틸렌 시트 등의 수지제 시트를 사용할 수 있다. 수지제 시트는 수지제 필름이라고도 한다.
시트는, 고형상 산성 시약 영역 혹은 아질산염 영역과 중화 시약 영역이 부분적으로 접촉하여 중첩되도록 설치할 수도 있다. 이 경우에, 고형상 산성 시약 영역 혹은 아질산염 영역과 중화 시약 영역이 중첩하는 부분의 길이는, 극력 짧게 하는 것이 바람직하고, 예를 들면, 5mm 이하, 바람직하게는 3mm 이하, 보다 바람직하게는 2mm 이하이다
또한, 시트를 고형상 산성 시약 영역 혹은 아질산염 영역과 중화 시약 영역이 접촉되지 않도록 설치하고, 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 패드가 PET 시트 상에 덮이는 형상으로 해도 된다. 이 경우에, 중화 영역이 시트에 의해 완전히 덮어지고, 그 시트 위에 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산 영역을 설치하면 된다. 이 경우에, 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산 영역 내의 액체는, 직접 중화 영역으로 이동하지 않고, 시트 상을 흐른 후에 중화 시약 영역에 도달한다.
시트는, 예를 들면, 고형상 산성 시약 영역 혹은 아질산염 영역과 중화 시약 영역 사이에만 설치하면 된다. 한편, 이뮤노크로마토그래피 시험편의 상측을 덮도록 수지제 시트를 탑 라미네이트 시트로서 접착할 때, 도플러 라미네이트 시트를 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산 영역 이외, 고형상 산성 시약 영역 또는 아질산 영역이 샘플 패드를 겸하는 경우에는 샘플 패드 이외의 중화 시약 영역, 표지체 영역, 지지체, 검출 영역, 흡수대를 덮도록 첩부하고, 고형상 산성 시약 영역 혹은 아질산염 영역을 중화 시약 부분의 상부에 첩부한 도플러 라미네이트 시트의 상부에 첩부하면 된다.
도 2 및 도 3의 형태에 기초하여, 본 발명의 시험편 사용 방법에 대하여 기술한다. 이하의 사용 방법은, 검체를 아질산 용액과 혼합하고, 고형상 산성 시약과 중화 시약을 함침시킨 이뮤노크로마토그래피 시험편을 사용하여 측정하는 방법이지만, 검체를 산성 용액과 혼합하고, 아질산염과 중화 시약을 함침시킨 이뮤노크로마토그래피 시험편을 사용하여 측정하는 방법도 이하의 사용 방법의 설명을 참고로 하여 행할 수 있다.
측정은, 검체 또는 검체를 사용하여 조제된 시료를 아질산염 용액과 접촉 혼합시키고, 검체를 아질산염 용액에 부유시키고, 샘플 패드를 겸하는 고형상 산성 시약 영역(5)에 첨가하여 제공함으로써 개시된다. 이 때, 검체 5∼100 μL와 0.1M∼8M의 아질산염 0.01∼2 mL를 혼합하여, 5∼200 μL를 샘플 패드를 겸하는 고형상 산성 시약 영역(5)에 제공하면 된다. 아질산염으로서, 아질산 나트륨, 아질산 칼륨 등을 예로 들 수 있다.
샘플 패드를 겸하는 고형상 산성 시약 영역(5)에 제공된 피검출 물질인 당쇄항원을 포함하는 검체는 모세관 작용에 의해, 샘플 패드를 겸하는 고형상 산성 시약 영역(5) 및 중화 시약 영역(6)으로 전개된다. 이 때, 고형상 산성 시약 영역(5)과 중화 시약 영역(6) 사이에는, PET 시트인 도플러 라미네이트 시트가 존재한다. 이에 따라, 고형상 산성 시약 영역(5)으로부터 중화 시약 영역(6)으로의 검체의 흐름은 억제되고, 또한, 일단 중화 시약 영역(6)에 들어간 검체가 고형상 산성 시약 영역(5)으로 역류하는 것을 방지할 수 있다. 다음으로, 검체는 표지체 영역(2), 지지체(1), 흡수대(7)로 순차적으로, 수평 방향으로 전개된다. 고형상 산성 시약 영역(5)에 있어서, 검체에 혼합한 아질산염과 고형상 산성 시약 영역(5) 상의 고형상 산성 시약이 반응하여, 유리(遊離)의 아질산이 발생하고, 이 아질산의 작용에 의해 검체로부터 당쇄항원이 추출된다. 추출된 당쇄항원은 산성의 전개 용액과 함께 중화 시약 영역(6)으로 전개 이동하고, 중화 시약 영역(6)에서 당쇄항원을 포함하는 산성의 전개 용액의 pH가 중화되어 중성 영역으로 조정된다. 그 결과, 당쇄항원은 중성 조건 하에 있어서 더욱 하류로 전개 이동한다. 표지체 영역(2)에서는 검체 시료의 전개와 함께 표지항체가 액 중에 방출되고 지지체(1)로 전개된다. 검체 시료 중에 당쇄항원이 존재하는 경우에 있어서, 지지체(1)의 검출 영역(3)에서는 포착 항체에 의해 당쇄항원이 특이적으로 포착되고, 그리고 당쇄항원은 표지항체와도 특이적 반응에 의해 복합체를 형성한다. 이로써, 검출 영역(3)에서는 당쇄항원을 개재한 항체의 샌드위치가 성립하고, 표지항체-당쇄항원 복합물을 검출 영역(3)에서 측정할 수 있다.
본 발명의 이뮤노크로마토그래피 시험편을 사용한 방법에 의하면, 검체 중의 당쇄항원의 추출은 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서 행해지므로, 이뮤노크로마토그래피 시험편을 사용한 측정 전에 미리 검체 중의 당쇄항원을 추출할 필요가 없어, 1스텝으로 검체 중의 당쇄항원을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 검체가 되는 생체 시료는, 특별히 한정되지 않지만, 혈청, 혈장, 혈액, 오줌, 변, 타액, 조직액, 수액(髓液), 닦은 액 등의 체액 등 또는 그 희석물을 예로 들 수 있다.
본 발명의 이뮤노크로마토그래피 시험편을 사용한 방법에 있어서, 측정 대상이 되는 피검출 물질은 이뮤노 앗세이, 즉 항원 항체 반응을 이용한 앗세이로 측정할 수 있는 당쇄항원이다. 항원으로서는 아질산 추출 처리에 의해 추출되는 세균의 세포벽에 존재하는 당쇄항원인 다당체 등을 예로 들 수 있다. 이들 물질을 포함하는 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라즈마, 리케차, 클라미디아, 바이러스 등도 측정할 수 있다. 본 발명의 이뮤노크로마토그래피 시험편을 사용한 방법에 의해, 피험체의 생체 시료 중에 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라즈마, 리케차, 클라미디아, 바이러스 등에 유래하는 당쇄항원이 포함되어 있는지의 여부를 확인할 수 있고, 당쇄항원이 포함되어 있는 경우, 피험체는 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라즈마, 리케차, 클라미디아, 바이러스 등에 의한 감염증에 감염되어 있는 것으로 판단할 수 있다. 예를 들면, A군β용혈성 연쇄상구균, 대장균, 레지오넬라, 캄필로박터 등의 감염의 유무를 검출할 수 있다.
본 발명의 방법은, 이뮤노크로마토그래피 시험편에, 산성 시약과 염기성 시약을 함침시키는 경우로 한정되지 않고, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에 복수 개, 즉 2개로부터 n개의 효과가 상이한 시약으로서, 보존 중의 반응을 회피해야 할 시약을 함침시킬 때도 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 이뮤노크로마토 디바이스는 첨가구를 넓게 설치할 수도 있다.
예를 들면, 세로 길이가 5∼9 cm, 바람직하게는 7cm, 가로 길이가 0.3∼0.7 cm, 바람직하게는 0.5cm인 이뮤노크로마토그래피 시험편을 저장한 종래의 이뮤노크로마토 디바이스(퀵네비게이터(상표)-Strep A, 덴카세이켄)의 첨가구는 약 3.5mm× 약 5.5mm(19.25mm2)의 사이즈를 가지는 대략 직사각형의 첨가구로서 설치되어 있지만, 동일한 사이즈의 이뮤노크로마토그래피 시험편을 저장하는 본 발명의 이뮤노크로마토 디바이스의 첨가구는 약 3.5mm×약 11mm(38.5mm2)의 사이즈를 가지는 대략 직사각형의 첨가구로서 설치되어 있다. 이뮤노크로마토 디바이스 및 그 안에 저장되는 이뮤노크로마토그래피 시험편의 크기는 대략 유사 사이즈가 되므로, 길이가 가로 3cm, 세로 9cm인 이뮤노크로마토 디바이스에 있어서 대략 직사각형으로 3∼5 mm×8∼15 mm(24∼75 mm2)의 첨가구를 가지는 이뮤노크로마토 디바이스는 첨가구가 넓은 이뮤노크로마토 디바이스이며, 본 발명의 이뮤노크로마토 디바이스의 효과를 나타낼 수 있다. 첨가구의 긴 변은, 크로마토그래피 시험편의 긴 변과 평행한 변이며, 즉 검체 시료 용액의 흐름 방향을 따른 변이다. 첨가구의 긴 변의 길이를 첨가구 길이라고 하고, 짧은 변의 길이를 첨가구 폭이라고 하는 경우가 있다. 상기한 예는, 대략 직사각형의 첨가구의 경우이지만, 첨가구의 형상은, 삼각형이라도 되고 원형이라도 된다. 본 발명의 이뮤노크로마토 디바이스의 첨가구의 크기를 면적으로 나타내는 경우, 24∼75 mm2, 바람직하게는 35∼75 mm2이다.
종래의 이뮤노크로마토그래피법에 있어서, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에 설치한 검체 처리 시약에서 검체 처리를 행할 때에는, 시료 용액이 검체 처리 시약을 함침한 영역에 접하고 있는 면적이 적기 때문에 검체 처리 능력이 약하며, 그리고 이뮤노크로마토그래피 시험편을 서서히 전개하면서 검체 처리가 행해지고 있었으므로, 최초로 전개한 시료 용액과 나중에 전개한 시료 용액에는 검체 처리 시약의 농도차가 생기고 있었다. 따라서, 검체 처리를 확실하게 행할 수 없었다.
본 발명의 이뮤노크로마토 디바이스의 첨가구는 넓게 설치되어 있으므로, 한번에 대량의 검체 시료 용액을 단시간에 이뮤노크로마토 상의 검체 처리 시약을 함침시킨 영역, 즉 고형상 산성 시약을 함침시킨 영역 또는 아질산을 함침시킨 영역에 공급할 수 있다. 그 결과, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서의 당쇄항원의 추출을 촉진할 수 있다. 한번에 공급할 수 있는 검체 시료 용액은, 10μL∼200μL이다.
그 결과, 시간차에 의한 검체 처리 시약의 농도차가 생기지 않으므로, 이뮤노크로마토 상의 검체 처리를 촉진하고 확실하게 효율적으로 행할 수 있다.
본 발명의 이뮤노크로마토 디바이스에 있어서는, 첨가구로부터 시료가 흘러 넘치지 않도록, 첨가구와 그 아래에 위치하는 샘플 패드 사이에 간극이 없도록 구성되어 있다.
본 발명의 이뮤노크로마토 디바이스는 첨가구가 넓게 형성되어 있고, 한번에 대량의 검체 시료 용액이 공급된다. 또한, 첨가구의 외곽인 둘레 부분에는 일정한 높이(1∼5 mm)가 있어, 공급된 검체 자료 용액은 첨가구 내에 일단 모인다.
그 결과, 검체 시료 용액 전액(全液)이 이뮤노크로마토그래피 시험편에 흡수될 때까지 시간이 걸리므로, 시료 용액이 이뮤노크로마토그래피 시험편에 흡수되지 않고 이뮤노크로마토그래피 시험편 밖으로 흘러 넘치는 경우가 있었다.
본 발명의 이뮤노크로마토의 디바이스는, 샘플 패드를 유지하는 배킹 시트를 첨가구로부터 시료가 흘러 넘치지 않도록, 첨가구의 외곽 사이즈와 동등하거나 그것보다 큰 외곽 사이즈의 배킹 시트로 샘플 패드를 지지함으로써, 배킹 시트에 의해 샘플 패드를 첨가구에 견고하게 가압하는 힘이 작용하여, 첨가구과 샘플 패드 사이에 간극이 없도록 구성할 수 있으므로, 시료 용액의 누출을 방지할 수 있다.
또한, 샘플 패드의 두께에 차이가 있는 경우에는, 샘플 패드의 두께가 얇은 개소는 첨가구와의 간극이 생기기 쉬워, 시료 용액의 누출이 발생하기 쉽다.
본 발명에 있어서는, 샘플 패드의 얇은 개소는 디바이스의 용기 시트는 높게, 두꺼운 개소는 시트를 낮게 설계함으로써, 패드의 두께에 차이가 있는 경우에도, 첨가구과 패드 사이에 간극이 없도록 구성할 수 있으므로, 시료 용액의 누출을 방지할 수 있다.
그 결과, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서의 당쇄항원의 추출을 효율적으로 할 수 있다.
즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
[1] 아질산염 또는 산성 용액과 혼합한 검체를 첨가하는 샘플 패드, 당쇄항원에 대한 항체를 표지한 표지항체를 포함하는 표지체 영역 및 상기 당쇄항원에 대한 항체를 고상화한 검출 영역을 포함하고, 검출 영역에 있어서 항체-당쇄항원-표지항체의 복합체를 형성시켜, 당쇄항원을 측정하는 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서, 상기 표지체 영역의 상류에 중화 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 또한 상기 중화 시약을 함침시킨 영역의 상류에, 아질산염과 혼합한 검체를 사용할 때는 고형상 산성 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 산성 용액과 혼합한 검체를 사용할 때는 아질산염을 함침시킨 영역을 가지는, 검체 중의 당쇄항원을 추출하고 측정하기 위한 이뮤노크로마토그래피 시험편과 상기 시험편을 저장하는 용기로 이루어지는, 시험편의 샘플 패드에 검체 첨가구를 가지는 이뮤노크로마토 디바이스로서,
(i) 첨가한 검체 시료 용액을 유지하고 검체 시료 용액을 상기 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 영역에 단시간에 공급함으로써 아질산염과 고형상 산성 시약에 의한 당쇄항원의 추출을 촉진하기 위한 넓은 검체 첨가구를 가지고,
(ii) 첨가구로부터 시료가 흘러 넘치지 않도록, 첨가구와 샘플 패드 사이에 간극이 없는,
이뮤노크로마토 디바이스.
[2] 이뮤노크로마토 디바이스의 검체 첨가구가 24∼75 mm2의 사이즈를 가지는, [1]의 이뮤노크로마토 디바이스.
[3] 이뮤노크로마토그래피 시험편 상의 고형상 산성 시약 혹은 아질산염, 혹은 중화 시약을 함침시킨 패드가 소수성이 높은 소재로 이루어지고, 검체 시료 용액의 전개 시간을 늦게 함으로써, 아질산염과 고형상 산성 시약에 의한 당쇄항원의 추출을 촉진하는, [1] 또는 [2]의 이뮤노크로마토 디바이스.
[4] 소수성이 높은 소재가, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 레이온 및 나일론으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [3]의 이뮤노크로마토 디바이스.
[5] 이뮤노크로마토그래피 시험편 상의 고형상 산성 시약 혹은 아질산염, 혹은 중화 시약을 함침시킨 패드가 친수도가 높은 소재로 이루어지고, 검체 시료 용액의 전개 시간을 늦게 함으로써, 아질산염과 고형상 산성 시약에 의한 당쇄항원의 추출을 촉진하는, [1] 또는 [2]의 이뮤노크로마토 디바이스.
[6] 친수도가 높은 소재가 두께가 있는 여과지인, [5]의 이뮤노크로마토 디바이스.
[7] 이뮤노크로마토그래피 시험편 상의 고형상 산성 시약 혹은 아질산염, 혹은 중화 시약을 함침시킨 패드에 계면활성제를 첨가하여, 검체 시료 용액의 전개 시간을 조절함으로써, 아질산염과 고형상 산성 시약에 의한 당쇄항원의 추출을 촉진하는, [1]∼[6] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토 디바이스.
[8] 계면활성제가, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 콜산 나트륨, 디옥시콜산, 라우릴황산 나트륨 및 도데실벤젠술폰산 나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [7]의 이뮤노크로마토 디바이스.
[9] 이뮤노크로마토그래피 시험편 상의 고형상 산성 시약 혹은 아질산염, 혹은 중화 시약을 함침시킨 패드에 고정화 작용이 있는 고분자화합물을 첨가하여, 검체 시료 용액의 전개 시간을 조절함으로써, 아질산염과 고형상 산성 시약에 의한 당쇄항원의 추출을 촉진하는, [1]∼[8] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토 디바이스.
[10] 고정화 작용이 있는 고분자화합물이 PVA 또는 PLL인, [9]의 이뮤노크로마토 디바이스.
[11] 고형상 산성 시약 또는 아질산염을 함침시킨 영역이, 샘플 패드 상 혹은, 표지체 영역이 도포된 패드 상에 존재하는, [1]∼[10] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토 디바이스.
[12] 고형상 산성 시약이, 말론산, 말산, 말레산, 시트르산 및 타르타르산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]∼[11] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토 디바이스.
[13] 중화 시약이, 트리스하이드록실메틸아미노메탄 또는 수산화나트륨인, [1]∼[12] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토 디바이스.
[14] 당쇄항원이, 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라즈마, 리케차, 클라미디아 또는 바이러스의 당쇄항원인, [1]∼[13] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토 디바이스.
[15] [1]∼[14] 중 어느 하나의 이뮤노크로마토 디바이스를 사용하여 이뮤노크로마토그래피법에 의해 검체 중의 당쇄항원을 측정하는 방법으로서,
이뮤노크로마토 디바이스가 고형상 산성 시약을 함침시킨 영역을 가질 때는 검체를 아질산 용액과 혼합하고, 이뮤노크로마토 디바이스가 아질산염을 함침시킨 영역을 가질 때는 검체를 산성 용액과 혼합하고, 상기 이뮤노크로마토 디바이스의 샘플 패드에 첨가하는 공정을 포함하고,
고형상 산성 시약을 함침시킨 영역 또는 아질산염을 함침시킨 영역에 있어서, 아질산염과 고형상 산성 시약의 반응에 의해 발생한 아질산의 작용에 의해 검체로부터 당쇄항원이 추출되고, 중화 시약을 함침시킨 영역에 있어서, 상기 당쇄항원을 포함하는 산성 용액이 중화되고,
검출 영역에 있어서, 항체-당쇄항원-표지항체의 복합체가 형성되는, 이뮤노크로마토그래피법에 의해, 당쇄항원의 추출을 촉진하여, 검체 중의 당쇄항원을 측정하는 방법.
[실시예]
본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예에 있어서, %는, 특별히 언급하지 않는 경우에는 w/v%를 나타낸다.
A군용연균 연쇄상구균 측정 이뮤노크로마토그래피 시험편의 예
아질산염(액상 시약) 2.0M 아질산 나트륨, 1% Tween20
고형상 산성 시약(이뮤노크로마토그래피 시험편에 함침) 1.0M 유기산(타르타르산), 0.2% TritonX100
중화 시약(이뮤노크로마토그래피 시험편에 함침) 3.0M Tris HCl(pH 9.0), 1.5% TritonX100
1. 항Streptococcus pyogenes(A군β용혈성 연쇄상구균)항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인(지지체)로의 고정화
항Streptococcus pyogenes항체를 1.0mg/mL가 되도록 정제수로 희석한 액 및 항토끼IgG항체를 준비하고, PET 필름으로 덧댄 니트로셀룰로오스 멤브레인의 샘플 패드 측에 항Streptococcus pyogenes항체, 흡수대 측에 항토끼IgG항체를 각각 선형으로 도포했다. 그 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인을 45℃, 30분간 건조시켜, 항Streptococcus pyogenes항체 고정화 멤브레인를 얻었다. 이 멤브레인를 본 실시예에 있어서, 「항체 고정화 멤브레인」이라고 한다.
2. 항Streptococcus pyogenes항체의 착색 폴리스티렌 입자로의 고정화
항Streptococcus pyogenes항체를 1.0mg/mL가 되도록 정제수로 희석하고, 여기에 착색 폴리스티렌 입자를 0.1%가 되도록 가하고, 교반한 후, 카르보디이미드를 1%가 되도록 가하고, 더욱 교반한다. 원심분리 조작에 의해 상청액을 제거하고, 50mM Tris(pH 9.0), 3% BSA에 재부유하여, 0.04% 항Streptococcus pyogenes항체 결합 착색 폴리스티렌 입자 부유액을 얻었다. 이 입자를, 본 실시예에 있어서, 「항체 고정화 입자」라고 한다.
3. 항Streptococcus pyogenes항체 결합 착색 폴리스티렌 입자의 도포·건조
2에서 제작한 항체 고정화 입자 부유액을 부직포에 소정량을 도포하고, 45℃, 30분간 건조시켰다. 얻어진 부직포를, 본 실시예에 있어서, 「건조 패드」라고한다.
4. 중화 시약(염기성 시약)의 도포
상기한 중화 시약(염기성 시약)을 30μL/cm로 여과지(도요로시; No.26-3)에 도포했다.
5. 고형상 산성 시약 함침 부직포의 제작
상기한 고형상 산성 시약을 13μL/cm로 부직포(유니티카; 엘베스(Elves))에 도포했다. 도포 후에 즉시 45℃, 1시간, 건조하여, 고형상 산성 시약 함침 부직포를 얻었다.
6. Streptococcus pyogenes 검출용 이뮤노크로마토그래피 시험편의 제작
스트립의 배킹 시트에, 먼저 멤브레인(지지체)(30mm 폭)을 하류에서 20mm의 부분에 첩부했다.
멤브레인의 하류에, 액을 흡수시키기 위한 흡수대를 첩부했다.
멤브레인의 상류에 멤브레인과의 사이에 2mm로 중첩되게 하여, 항체 결합 라텍스가 도포된 10mm 폭의 유리섬유(C. Pad)를 첩부했다.
C. Pad와 중화 시약을 함침시킨 패드의 중첩이 4mm로 되도록, 중화 시약 함침 패드를 첩부했다.
이뮤노크로마토그래피 시험편의 상부에 맞추어서, PET 시트인 도플러 라미네이트 시트(60mm)를 첩부했다.
마지막으로, 고형상 산성 시약을 함침시킨 패드를, 중화 시약을 함침시킨 패드 위에 사이에 도플러 라미네이트 시트가 개재하고, 또한 고형상 산성 시약을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드가 접촉하도록, 이뮤노크로마토그래피 시험편의 상류(하단)에 맞추어서 첩부했다.
이와 같이 하여 제작한 이뮤노크로마토그래피 시험편의 구조를 도 2에 나타낸다. 또한, 도 3에 모식도를 각 파트간의 거리(mm)와 함께 나타낸다. 그리고, 도 2 및 도 3에 있어서, 고형상 산성 시약을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드는, 양쪽 패드의 사이에 탑 라미네이트가 존재하지 않는 부위에서도 접촉하지 않고 이격되게 표시되지만, 실제로는, 탑 라미네이트가 없는 부분에서 양쪽 패드는 접촉하고 있다.
고형상 산성 시약을 함침시킨 영역과 중화 시약을 함침시킨 영역 사이에, PET 시트를 끼워넣지 못하게 한 이뮤노크로마토그래피 시험편을, 종래 기술의 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서 사용했다.
결과를 표 1에 나타내었다. 표 1은 5분 판정 시의 발색 강도를 나타낸다.
표 1의 「Over」는, 종래의 방법으로 탑 라미네이트를 첩부한 시험편이며, 고형상 산성 시약을 함침시킨 패드의 상부에 탑 라미네이트가 있는 시험편을 사용한 시험 결과를 나타낸다. 다만, 고형상 산성 시약을 함침시킨 패드의 전체면에 탑 라미네이트가 덮여 있는 것은 아니며, 상기 패드의 하류부의 3mm 정도의 부분에 덮여 있다.
표 1의 「In between」은, 본 발명의 시험편이며, 고형상 산성 시약을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드의 사이에 탑 라미네이트를 첩부하고 있다. 고형상 산성 시약을 함침시킨 패드와 중화 시약을 함침시킨 패드가 직접 접촉하는 접촉면은 2mm이다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 시험편을 사용하여 시험한 경우 (「in between」) 쪽이, 1∼2 관감도가 높았다.
[표 1]
Figure pct00001
[산업상 이용가능성]
본 발명의 이뮤노크로마토 디바이스를 사용하여 A군β용혈성 연쇄상구균의 감염을 고감도로 검출할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
1: 지지체(검출 영역을 포함함)
2: 표지체 영역
3: 검출 영역
5: 고형상 산성 시약 영역(샘플 패드)
6: 중화 시약 영역
7: 흡수대
8: 배킹 시트
9: 도플러 라미네이트 시트

Claims (9)

  1. 아질산염 또는 산성 용액과 혼합한 검체를 첨가하는 샘플 패드, 당쇄항원에 대한 항체를 표지한 표지항체를 포함하는 표지체 영역 및 상기 당쇄항원에 대한 항체를 고상화(固相化)한 검출 영역을 포함하고, 검출 영역에 있어서 항체-당쇄항원-표지항체의 복합체를 형성시키고, 당쇄항원을 측정하는 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서, 상기 표지체 영역의 상류에 중화 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 또한 상기 중화 시약을 함침시킨 영역의 상류에, 아질산염과 혼합한 검체를 사용할 때는 고형상 산성 시약을 함침시킨 영역을 가지고, 산성 용액과 혼합한 검체를 사용할 때는 아질산염을 함침시킨 영역을 가지는, 검체 중의 당쇄항원을 추출하고 측정하기 위한 이뮤노크로마토그래피 시험편으로서,
    고형상 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 영역과 중화 시약을 함침시킨 영역 사이에, 양쪽 영역 사이의 시약의 이동 또는 검체 용액의 이동을 억제하도록, 수지제 시트를 끼워넣은, 이뮤노크로마토그래피 시험편.
  2. 제1항에 있어서,
    샘플 패드 상에 고형상 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 영역이 존재하는, 이뮤노크로마토그래피 시험편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    고형상 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 영역과 중화 시약을 함침시킨 영역이 부분적으로 접촉하도록, 수지제 시트를 끼워넣은, 이뮤노크로마토그래피 시험편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    고형상 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 영역과 중화 시약을 함침시킨 영역이 접촉되지 않도록, 수지제 시트를 끼워넣은, 이뮤노크로마토그래피 시험편.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    이뮤노크로마토그래피 시험편 상의 최상류에 샘플 패드 상에 고형상 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 영역이 존재하고, 샘플 패드 이외의 영역이 수지제 시트로 덮어지고, 중화 시약을 함침시킨 영역의 상부의 수지제 시트의 상부에, 고형상 산성 시약 혹은 아질산염을 함침시킨 샘플 패드가 존재하는, 이뮤노크로마토그래피 시험편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    고형상 산성 시약이, 말론산, 말산, 말레산, 시트르산 및 타르타르산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 이뮤노크로마토그래피 시험편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    중화 시약이, 트리스하이드록실메틸아미노메탄 또는 수산화나트륨인, 이뮤노크로마토그래피 시험편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    당쇄항원이, 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라즈마(mycoplasma), 리케차(rickettsia), 클라미디아(chlamydia) 또는 바이러스의 당쇄항원인, 이뮤노크로마토그래피 시험편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노크로마토그래피 시험편을 사용하여 이뮤노크로마토그래피법에 의해 검체 중의 당쇄항원을 측정하는 방법으로서,
    이뮤노크로마토그래피 시험편이 고형상 산성 시약을 함침시킨 영역을 가질 때는 검체를 아질산 용액과 혼합하고, 이뮤노크로마토그래피 시험편이 아질산염을 함침시킨 영역을 가질 때는 검체를 산성 용액과 혼합하고, 상기 이뮤노크로마토그래피 시험편의 샘플 패드에 첨가하는 공정을 포함하고,
    고형상 산성 시약을 함침시킨 영역 또는 아질산염을 함침시킨 영역에 있어서, 아질산염과 고형상 산성 시약의 반응에 의해 발생한 아질산의 작용에 의해 검체로부터 당쇄항원이 추출되고,
    중화 시약을 함침시킨 영역에 있어서, 상기 당쇄항원을 포함하는 산성 용액이 중화되고,
    검출 영역에 있어서, 항체-당쇄항원-표지항체의 복합체가 형성되는, 이뮤노크로마토그래피법에 의해, 이뮤노크로마토그래피 시험편 상에서의 검체의 전개(展開) 스피드나 방향을 제어하고, 산성 시약과 아질산염과 중화 시약에 의한 처리를 제어하여, 검체 중의 당쇄항원을 측정하는 방법.
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