KR20080080364A

KR20080080364A - 다제 내성 포도상구균의 이뮤노크로마토그래피 검출법 및 진단 키트

Info

Publication number: KR20080080364A
Application number: KR1020087016976A
Authority: KR
Inventors: 히로미 이또
Original assignee: 덴카 세이켄 가부시키가이샤
Priority date: 2005-12-14
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2008-09-03
Also published as: EP1970706B1; CA2633875C; HK1124390A1; US20100221747A1; EP1970706A1; AU2006325982A1; CA2633875A1; WO2007069673A1; AU2006325982B2; EP1970706A4; NZ569004A; CN101395476B; ES2553153T3; US20120064538A1; CN101395476A; JP5361191B2; KR101382986B1; US8431351B2; JPWO2007069673A1

Abstract

본 발명은 이뮤노크로마토그래피 검출법에 의해 양호한 감도로 간편ㆍ신속하게 다제 내성 포도상구균속균이 특이적으로 생산하는 PBP2'를 검출하고, 다제 내성 포도상구균에의 감염을 판정할 수 있는 이뮤노크로마토그래피 검출 장치 및 상기 검출 장치를 이용한 진단 방법 및 상기 검출 장치를 포함하는 진단 키트의 제공을 목적으로 하고, 본 발명은 시트형 고상 지지체 상에 다제 내성 포도상구균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액을 공급하는 검체 공급 부위, PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체를 표지한 표지 시약을 고상 지지체 상에서 전개 가능하게 유지한 표지 시약 부위, PBP2'와 표지 시약의 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화시킨 포착 시약 부위가 포함되고, 포착 시약 부위 또는 포착 시약 부위 상류의 고상 지지체 상에 양쪽이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및 또는 비이온성 계면 활성제가 포함되는 다제 내성 포도상구균 검출용 이뮤노크로마토그래피 검출 장치이다.

이뮤노크로마토그래피 검출법, 진단 키트, 다제 내성 포도상구균, 계면 활성제

Description

다제 내성 포도상구균의 이뮤노크로마토그래피 검출법 및 진단 키트 {IMMUNOCHROMATOGRAPHIC DETECTION METHOD FOR MULTIDRUG-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AND DIAGNOSTIC KIT}

본 발명은 이뮤노크로마토그래피 검출법 및 이것을 응용한 키트에 관한 것이다.

포도상구균속에는 40 이상의 균종이 포함되지만, 임상적으로는 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)와 코아귤라제 음성 포도상구균(Coagulase-negative staphylococci)(이하 CNS라 함)으로 크게 구별된다. 황색 포도상구균은 병원균으로서, CNS는 비병원성균으로서 취급되고 있다.

감염증 치료에는 항생 물질이 이용되지만, 포도상구균은 약제 내성을 갖는 주가 대부분이고, 임상적 견지에서 내성 유무에 의해서 분류된다.

병원성균으로서 임상적으로 중요한 황색 포도상구균 중, 메티실린 내성 황색 포도상구균(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)(MRSA)은 메티실린 등의 페니실린제를 비롯한 β 락탐제에 내성을 나타내는 황색 포도상구균이지만, 동시에 아미노산 배당체, 매크로라이드제 등의 많은 약제에 내성을 나타내는 것이 대부분이고, 그 때문에 임상상으로는 다제 내성 황색 포도상구균(Multi-drug resistant Staphylococcus aureus)으로서 취급된다. 한편 메티실린에 감수성을 나타내는 황색 포도상구균은 메티실린 감수성 황색 포도상구균(Methcillin-sensitive Staphylococcus aureus)(이하 MSSA)이라 불린다.

황색 포도상구균은 엔테로톡신, 독소성 쇼크 증후군 독소, 용혈소, 표피 박탈 독소를 비롯한 다양한 독소를 생산하고(비특허 문헌 1), 그의 감염에 의해서 장염, 폐렴, 피부염, 장기 부전 등을 발증시키고, 심한 경우에는 죽음에 이르게 되는 경우도 있다. 따라서 환자로부터 황색 포도상구균이 분리된 경우, MRSA인가 아닌가를 한시라도 빨리 알아, MRSA 감염증인 경우에는 MRSA에 효과적인 반코마이신, 황산아르베카신 등의 적절한 약제를 선택, 투여하는 것이 필요하다.

한편, 황색 포도상구균 이외의 포도상구균은 상재(常在) 세균이고, 통상은 정상인에 대하여 비병원성이다. 그러나, 장기 이식환자의 수술 후의 감염증 대책 등으로서 면역 억제제를 사용한 경우, 또는 노화에 따른 체력 감쇠 등의 요인에 의해 면역력이 저하된 소위 감염 용이성 환자는 일화견(日和見) 감염을 일으키는 경우가 있다.

황색 포도상구균 이외의 포도상구균에 있어서도 메티실린 내성이나 다제 내성을 획득한 것이 있고, 이들은 각각 메티실린 내성 코아귤라제 음성 포도상구균(Methicillin-resistant Coagulase-negative staphylococci)(이하 MRCNS) 또는 다제 내성 코아귤라제 음성 포도상구균(Multi-drug resistant Coagulase-negative staphylococci)라 총칭된다. MRSA와 동일하게 MRCNS는 감염되기 쉬운 사람에게 감염된 경우에는 치료에 효과적인 약제가 한정되기 때문에 의학상 문제가 되었다.

이들 MRSA와 MRCNS는 둘다 모두 다제 내성 포도상구균이라 총칭된다.

MRSA, MRCNS의 약제 내성의 본질은, 포도상구균의 세포벽의 구성 성분인 뮤레인을 가교하여 세포벽을 합성하는 효소인 4종류의 페니실린 결합 단백(PBP1, PBP2, PBP3, PBP4)에 새로운 효소로서 PBP2'의 발현에 의한 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 2). 포도상구균이 공통적으로 보유하는 PBP1 내지 4는 세포벽 합성 효소로서 기질 아날로그인 페니실린계 항생 물질에 의해 불활성화되고, 균은 세포벽 합성 불능이 됨으로써 이윽고 사멸된다. 그러나 MRSA, MRCNS는 β 락탐계 항생 물질에 대하여 친화성이 낮은, 즉 불활성화되지 않는 새로운 세포벽 합성 효소 PBP2'를 발현하고, 세포벽 합성의 역할을 대체함으로써 계속 증식하는 것이 가능해진다고 생각되었다. MRSA, MRCNS는 다른 항생 물질에 대한 내성 기구도 획득하여 많은 항생 물질에 내성이 되는 다제 내성이 대부분이다. 이들은 단순히 β 락탐계 항생 물질에 내성을 갖는 포도상구균으로서가 아니라, 다제 내성의 포도상구균으로서 취급된다.

일반적인 포도상구균의 분리법ㆍ판정법은, 비강 스와브, 인두 스와브, 객담, 혈액, 고름, 분변(糞便) 등을 임상 검체로 하고, 한천 배지나 액체 한천 배지를 이용한 분리 배양을 행한다. 한천 배지를 이용하여 배양된 경우에는, 발육한 콜로니 중 포도상구균이 의심되는 콜로니를 추가로 순배양하고, 그람 염색에 의한 염색상의 검경, 코아귤라제 생산능, 만니트 분해능 등의 생화학적 성상 시험 등에 의해 포도상구균 또는 황색 포도상구균의 동정을 행한다. 액체 배지에서 배양된 경우에는, 콜로니 단리를 위해 배양액을 한천 배지에 접종하여 배양하고, 동일하게 포도 상구균이 의심되는 콜로니에 대하여 순배양 후, 동정을 행한다. 황색 포도상구균 또는 포도상구균이라고 동정된 균은 약제 감수성 시험 등에 사용되고, 그 시험 결과로부터 MRSA인가 MSSA, 또는 MRCNS인가 아닌가의 판정이 행해진다. 약제 감수성 시험에는, 희석법, 디스크 감수성 시험 등의 배양에 의한 시험 방법이 일반적으로 이용되고 있다. 이들 약제 감수성 시험은 배양 시간이 16 시간 내지 24 시간 필요한 것(분리 배양, 순배양에 따르면 임상 검체의 분리부터 판정까지 3 일 이상 소요됨), 이 약제 감수성 시험에서는 접종균 농도, 배양 온도, 배지 조성 또는 사용되는 약제 등에 의해서 시험 성적에 차이가 있는 것으로 알려져 있고, 수기적(手技的)으로도 숙련이 필요하다.

최근 순배양, 분리 배양, 또는 임상 검체로부터 직접 약제 내성 기구의 본체인 PBP2'를 코딩하는 mecA 유전자를 PCR법에 의해서 검출하고, 피검균주에서의 mecA 유전자의 보유 상황으로써 항생 물질 내성의 감별을 행하는 방법이 개발되었다. 그러나, mecA 유전자의 보유는 반드시 항생 물질 내성의 발현을 나타내는 것으로 한정되지는 않고, 유전자를 보유하고 있음에도 불구하고 내성을 획득하지 못한 주가 존재한다.

한편, PBP2'의 생산이 다제 내성을 발현하는 데 있어서 중요한 역할을 담당하는 것은 상술한 바와 같고, 포도상구균으로부터 PBP2'를 검출하는 것은 그 주의 내성 획득 여부를 아는 유용한 수단이 될 수 있다.

MRSA를 비롯한 다제 내성 포도상구균속균이 특이적으로 생산하는 PBP2'를 항원 항체 반응에 기초하는 면역학적 수단에 의해서 검출하고자 하는 방법으로서는, 웨스턴 블롯법, 방사 면역 측정법, 슬라이드 라텍스 응집법이 알려져 있다(특허 문헌 1 참조). 그러나, 이들 PBP2'의 검출법에는 이하의 문제점이 있다. 웨스턴 블롯법은, 방법 그 자체가 번잡하여 신속하게 다수 검체를 처리하는 것은 곤란하다. 방사 면역 측정법은 방사성 동위체를 사용하는 것, 측정법 조작 중에서 항원 항체 복합체와 그 이외의 비결합 항원 또는 항체를 분리하는 BF 분리의 조작이 필요한 것, 균체로부터의 항원 추출에 사용된 변성제가 반응계에 존재함으로써 측정 시간에 수시간이 소요되는 것 등 일상 검사의 관점에서 실용적이지 않다. 슬라이드 라텍스 응집법은, 협잡균으로 인한 위양성(false positive)(예를 들면, 비특이 반응에 의한 위양성)과 저감도 때문에 순배양균에서의 검출이 요구되므로, 분리 배양, 순배양의 최저 2회의 배양 조작이 불가결해져 판정까지는 검체 채취로부터 2 일 내지 3 일이 소요되는 것, 순배양의 배지대로서 비용이 높아지는 것, 판정 시간은 3 분으로 짧지만 판정 시간을 초과하면 응집이 진행되기 때문에 위양성이 일어날 가능성이 있는 것, 균체로부터 PBP2'를 추출하는 전처리에 있어서 PBP2'를 포함하는 상청과 세포벽 유래의 파편을 분리하기 위해서 원심 조작이 요구되기 때문에 시간이 걸리며 검사실의 환경 오염이 문제가 되는 것, 피펫 조작에 의해 원심 후의 상청을 옮기는 등의 번잡한 조작을 수반하는 것, 비등 처리를 수반하는 것 등의 문제가 있다. 따라서 이들 검사를 대신하는, 다제 내성 포도상구균속균이 특이적으로 생산하는 PBP2'를 특이적으로 양호한 감도로 신속하게 검출할 수 있는 검사 방법이 요망되었다.

[특허 문헌 1] 일본 특허 제3638731호 공보

[비특허 문헌 1] 이가라시 히데오: TSST-1, 침습과 면역, 3, 3-10(1994)

[비특허 문헌 2] Utsui, Y., and Yokota, T.: Role of an altered penicillin-binding protein in methicillin-and cephem-resistant Staphyloccus aureus., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 28, 397-403 (1985)

<발명의 개시>

<발명이 해결하고자 하는 과제>

따라서 본 발명은 이뮤노크로마토그래피식 검사법에 의해 양호한 감도로 간편ㆍ신속하게 다제 내성 포도상구균속균이 특이적으로 생산하는 PBP2'를 검출하여 다제 내성 포도상구균의 감염을 판정할 수 있는 이뮤노크로마토그래피 검출 장치 및 상기 검출 장치를 이용한 진단 방법 및 상기 검출 장치를 포함하는 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

<과제를 해결하기 위한 수단>

본 발명자들은 다제 내성 포도상구균속균으로부터 번잡한 조작을 행하지 않고 간편하면서 또한 신속하게 PBP2'를 추출하여 측정하는 방법에 대하여 예의 검토하였다. 본 발명자들은 PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체를 표지한 표지 시약 및 PBP2'와 표지 시약의 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 이용한 이뮤노크로마토그래피 검출 장치에 의해 간편하게 측정하는 것에 성공하고, 또한 검체를 측정에 사용하기 전에 알칼리 용액로 처리하고 이어서 중화 처리하여 이뮤노크로마토그래피 검출 장치에 사용함으로써 번잡한 원심 조작 등의 필요없이 PBP2'를 추출하여 측정할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 양쪽이온성 계면 활성제 등의 계면 활성제를 이뮤노크로마토그래피식 검출 장치의 포착 시약을 고정화시킨 포착 시약 부위에 사용함으로써 위양성을 발생시키지 않고 측정할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법으로서, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 항원 항체 반응에 기초하는 이뮤노크로마토그래피 검출법을 이용하여 검출하는 것을 특징으로 하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[2] [1]에 있어서, 시트형 고상 지지체 상에 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액을 공급하는 검체 공급 부위, PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체를 표지한 표지 시약을 고상 지지체 상에서 전개 가능하게 유지한 표지 시약 부위, PBP2'와 표지 시약의 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화시킨 포착 시약 부위가 포함되는 이뮤노크로마토그래피 검출 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[3] [1] 또는 [2]에 있어서, PBP2'와 표지 시약이 고상 지지체와 분리된 부위에서 미리 접촉되고, 검체 공급 부위에 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액 및 PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체를 표지한 표지 시약을 포함하는 검체 시약 혼합 용액을 검체 공급 부위에 공급하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[4] [2] 또는 [3]에 있어서, 표지 시약이, 불용성 담체에 항체가 결합된 것인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[5] [2] 내지 [4] 중 어느 한 항에 있어서, 포착 시약 부위에 양쪽이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및/또는 비이온성 계면 활성제를 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[6] [2] 내지 [5] 중 어느 한 항에 있어서, 포착 시약 부위에 술포베타인형 계면 활성제를 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[7] [2] 또는 [6]에 있어서, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액에, 상기 용액을 검체 공급 부위에 공급하기 전에 이온화 경향이 큰 음이온을 첨가하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[8] [7]에 있어서, 이온화 경향이 큰 음이온이 염화물 이온, 브롬화물 이온 및 요오드화물 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 음이온인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[9] [5] 내지 [8] 중 어느 한 항에 있어서, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액에, 상기 용액을 검체 공급 부위에 공급하기 전에 이온화 경향이 큰 양이온을 첨가하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[10] [9]에 있어서, 이온화 경향이 큰 양이온이 칼륨 이온, 칼슘 이온, 나트륨 이온 및 마그네슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 양이온인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[11] [1] 내지 [10] 중 어느 한 항에 있어서, 검체를 알칼리 처리 및 중화에 의해 전처리하는 공정을 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[12] [11]에 있어서, 알칼리 처리가 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염의 수용액을 이용하여 행해지는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[13] [12]에 있어서, 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염 수용액의 pH가 11 이상인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[14] [12] 또는 [13]에 있어서, 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염의 농도가 0.01 N 내지 1.0 N인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[15] [11] 내지 [14] 중 어느 한 항에 있어서, 완충액으로 알칼리 처리 후의 수용액을 중화시키는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[16] [1] 내지 [15] 중 어느 한 항에 있어서, 검체 공급 부위가 유리계 섬유로 이루어지는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[17] [1] 내지 [16] 중 어느 한 항에 있어서, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균이 다제(多劑) 내성 포도상구균인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.

[18] 시트형 고상 지지체 상에 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액을 공급하는 검체 공급 부위, PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체를 표지한 표지 시약을 고상 지지체 상에서 전개 가능하게 유지한 표지 시약 부위, PBP2'와 표지 시약의 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화시킨 포착 시약 부위가 포함되고, 포착 시약 부위에 양쪽이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및/또는 비이온성 계면 활성제가 포함되는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 이뮤노크로마토그래피 검출 장치.

[19] [18]에 있어서, 포착 시약 부위에 술포베타인형 계면 활성제를 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 이뮤노크로마토그래피 검출 장치.

[20] [18] 또는 [19]에 있어서, 검체 공급 부위가 유리계 섬유로 이루어지는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 이뮤노크로마토그래피 검출 장치.

[21] [18] 내지 [20] 중 어느 한 항에 있어서, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균이 다제 내성 포도상구균인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 이뮤노크로마토그래피 검출 장치.

[11] [18] 내지 [21] 중 어느 한 항에 기재된 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 이뮤노크로마토그래피 검출 장치, 및 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액에 첨가하기 위한 이온화 경향이 큰 음이온 또는 양이온 용액을 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.

[23] [22]에 있어서, 이온화 경향이 큰 음이온이 염화물 이온, 브롬화물 이온 및 요오드화물 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 음이온인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.

[24] [22]에 있어서, 이온화 경향이 큰 양이온이 칼륨 이온, 칼슘 이온, 나트륨 이온 및 마그네슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 양이온인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.

[25] [22] 내지 [24] 중 어느 한 항에 있어서, 검체 알칼리 처리용 알칼리 용액 및 중화용 완충액을 더 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.

[26] [25]에 있어서, 알칼리 용액이 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염의 수용액인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.

[27] [26]에 있어서, 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염 수용액의 pH가 11 이상인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.

[28] [26] 또는 [27]에 있어서, 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염의 농도가 0.01 N 내지 1.0 N인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.

[28] [22] 내지 [28] 중 어느 한 항에 있어서, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균이 다제 내성 포도상구균인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.

<발명의 효과>

본 발명의 이뮤노크로마토그래피 검출 장치를 이용함으로써 고감도로 PBP2'를 검출할 수 있게 되기 때문에, 분리 배양 후의 1 콜로니균량으로부터 시험 가능해진다. 그 결과, 임상 검체로부터 분리 후 불과 1회, 1 일의 배양으로 MRSA인가 아닌가의 판정, 또는 MRCNS인가 아닌가의 판정이 가능해지므로, 검사에 소요되는 시간과 순배양에 이용하였던 배지의 비용을 대폭 삭감시킬 수 있다. 또한 MRSA에 의한 균혈증, 패혈증의 검사에서 행해지는 혈액(액체) 배양으로 양성 배지로부터 직접 검출을 할 수 있게 되기 때문에, 효과적인 치료의 조기 개시에 의한 치료 기간의 단축화가 가능해진다.

또한 항체 고상화 지지체 상의 검체 공급 부재에 여과 효과를 갖게 함으로써 원심 조작이 불필요해지고, 검사실의 위생면이 유지된다.

이뮤노크로마토그래피 검출 장치의 포착 부위에 계면 활성제를 포함시킴으로써, 항원 이외의 균 파쇄물의 표지 시약 및/또는 포착 부위에의 결합, 즉 위양성을 막는 것, 및 감도 향상의 효과를 갖게 하는 것이 가능해진다. 그 때문에 종래 조작에서는 필수이었던 균의 전처리 공정 중의 비등 조작이 불필요해진다.

본 명세서는 본원 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2005-360984호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1은 표지 시약 부위를 포함하는 본 발명의 검출 장치의 일례를 나타낸 도면이다.

도 2는 표지 시약 부위를 포함하지 않는 본 발명의 검출 장치의 일례를 나타낸 도면이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

1 검체 공급 부위

2 표지 시약 부위

3 포착 시약(캡쳐 항체) 부위

4 대조 부위(컨트롤) 부위

5 고상 지지체(니트로셀룰로오스막)

6 흡수 부위(흡수 패드)

7 톱 라미네이트 또는 하우징

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명은 이뮤노크로마토그래피식 검사법에 의해 양호한 감도로 간편ㆍ신속하게 다제 내성 포도상구균류 등의 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균에 특이적으로 존재하는 PBP2'를 검출하여 다제 내성 포도상구균 등의 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균에의 감염을 판정할 수 있는 이뮤노크로마토그래피 검출 장치 및 진단 키트이다.

본 발명에서의 검체란, 피의환자으로부터의 뇨, 농즙, 수액, 분비물이나 천자(穿刺)액 등의 검사 재료를 혈액 한천 배지, 보통 한천 배지, 하트 인퓨젼 한천 배지, 브레인 하트 인퓨젼 한천 배지, 대두ㆍ카제인ㆍ다이제스트 한천 배지, 초콜릿 한천 배지, 난황 첨가 만니트 식염 한천 배지, MRSA 선택 배지 등의 증균 배지에 도말하고, 호기적 조건하에 35 ℃ 내지 37 ℃, 18 시간 이상 배양된 균을 현탁시킨 용액 외, 액체 배양 배지, 혈액 배양 배지 등으로 동일하게 호기적 조건하에 35 ℃ 내지 37 ℃, 18 시간 이상 진탕 배양된 배양액을 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균, 보다 구체적으로는 다제 내성 포도상구균을 포함하는 것으로 추정되는 용액을 가리킨다. 또한, 이들 균 현탁액의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 추출액도 포함한다. 여기서 「세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균」에는 다제 내성 포도상구균이 포함되고, 「다제 내성 포도상구균」에는 다제 내성 황색 포도상구균(MRSA) 및 다제 내성 코아귤라제 음성 포도상구균(MRCNS)이 포함된다. 피의환자로부터의 뇨, 농즙, 수액, 분 비물이나 천자액 등의 검사 재료를 생리 식염수 또는 인산 완충액 등에 직접 현탁시킨 액도 검체가 될 수 있지만, 검출 감도면에서 상기 방법으로 배양한 균을 포함하는 액을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 이뮤노크로마토그래피 검출 장치는 시험편을 포함하는 이뮤노크로마토그래피 시험편이고, 예를 들면 도 1에 나타낸 바와 같이 배치되어 구성된다. 시트형 고상 지지체 상에 검체를 공급하는 검체 공급 부위 (1), 및 PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체를 표지한 표지 시약을 고상 지지체 상에서 전개 가능하게 유지한 표지 시약 부위 (2), PBP2'와 표지 시약의 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화시킨 포착 시약 부위 (3)을 포함한다. 검체 공급 부위 (1)에 검체를 공급하면, 검체는 표지 시약 부위 (2), 포착 시약 부위 (3)의 순서로 통과하도록 구성되어 있다. 본 발명에서는 또한, 검체와 PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체를 표지한 표지 시약과의 혼합물을 검체 공급 부위 (1)에 공급할 수도 있고, 이 경우 고상 지지체 상의 표지 시약 부위 (2)를 생략할 수 있다(도 2). 검체와 PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체를 표지한 표지 시약과의 혼합물을 검체 공급 부위 (1)에 공급하는 경우, 검체에 포함되는 PBP2'와 표지 시약은 고상 지지체와 분리된 부위에서 미리 접촉된다. 여기서 「피분석 물질과 표지 시약이 고상 지지체와 분리된 부위에서 미리 접촉된다」란, 이뮤노크로마토그래피 검출 장치에 있어서는 표지 시약이 고상 지지체에 포함되지 않거나, 또는 고상 지지체와 접촉되어 있으며 액체가 고상 지지체와 연락될 수 있는 부위, 예를 들면 검체 첨가 부위 등에도 포함되지 않은 것을 말한다. 이 경우, 피분석 물질과 표지 시약은 고상 지지 체 및 고상 지지체와 접촉되어 있는 부위 이외에서 미리 접촉된다.

본 발명의 이뮤노크로마토그래피 검출 장치는 또한 대조용 시약을 포함할 수도 있고, 또한 흡수부를 포함할 수도 있다. 대조용 시약은 한정되지 않지만, 예를 들면 표지 시약 중의 항체가 결합되는 물질을 사용할 수 있다. 대조용 시약은 포착 시약 부위의 하류에 고정화시킬 수 있고, 도 1에서는 대조 부위 (4)가 해당된다. 흡수부는 포착부를 통과한 검체를 흡수함으로써 검체의 흐름을 제어하는 액체 흡수성을 갖는 부위이고, 검출 장치의 최하류에 설치할 수 있으며 도 1에서는 흡수 부위 (6)이 해당한다. 흡수부는 예를 들면 종이제의 것을 흡수 패드로서 이용할 수 있다.

본 발명의 이뮤노크로마토그래피 검출 장치에서 검체 공급 부위는 고상 지지체의 일단을 그대로 사용할 수도 있지만, 고상 지지체와는 다른 부재로 구성할 수도 있다. 후자에서의 검체 공급 부위는 일단 검체 또는 검체와 표지 시약의 혼합물을 흡수하고, 이어서 흡수한 검체 또는 혼합물을 고상 지지체에 공급하도록, 고상 지지체와 모세류에 의해 용액이 전개 이동 가능해지도록 접촉되어 배치된다. 고상 지지체와는 다른 부재란, 예를 들면 니트로셀룰로오스, 아세트산셀룰로오스, 나일론, 폴리에테르술폰, 폴리비닐알코올, 폴리에스테르, 유리 섬유, 폴리올레핀, 셀룰로오스, 폴리스티렌 등의 천연, 합성 중합체, 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 부재를 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 이뮤노크로마토그래피 검출 장치에서 표지 시약이란, PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체와 적당한 표지 물질을 결합시킨 콘쥬게이트(conjugate)이 고, 표지 물질로서 금 콜로이드 등의 금속 콜로이드, 셀레늄콜로이드 등의 비금속 콜로이드, 착색 수지 입자 등의 불용성 물질을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 이들 표지 물질을 불용성 담체라 부르는 경우가 있다. 불용성 담체는 바람직하게는 마이너스 차지를 갖는 불용성 담체이다. 일반적으로 표지 시약은 고상 지지체와는 다른 부재에 함침시켜 건조시키고, 그것을 고상 지지체와 연속적으로 연결되는 위치에 둔다. 또는, 표지 시약은 고상 지지체 상에 직접 도포하여 건조시키더라도 상관없다. 검체가 표지 시약을 포함하는 표지 시약 부위에 도달하면 표지 시약은 검체 중에 용해되고, 고상 지지체를 전개시킬 수 있다. 즉, 표지 시약은 표지 시약 부위에 전개 가능하게 유지되어 있다.

본 발명의 이뮤노크로마토그래피 검출 장치에 있어서 포착 시약이란, PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체이고, 포착 시약 부위는 PBP2'와 표지 시약의 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있으며 표지 시약-PBP2'-포착 시약 복합체가 형성된다. 일반적으로 포착 시약은 고상 지지체에 직접 도포하여 건조시키는 방법으로 제조되지만, 이것으로 한정되지 않고, 고상 지지체와는 다른 부재에 함침시켜 건조시킨 것을 고상 지지체 상에 두는 방법으로 제조하여도 상관없다. 또한, 포착 시약의 고상 지지체에의 고정화는 흡착에 의한 방법으로 한정되지 않고, 아미노기, 카르복실기 등의 관능기를 이용하여 화학적으로 결합시키는 방법 등 공지된 방법으로 행할 수 있다.

포착 시약으로서 이용되는 항체와 표지 시약으로서 이용하는 항체는 동일할 수도 있지만, PBP2' 중에 상기 물질과 결합하는 부위가 하나밖에 존재하지 않는 경 우에는, 표지 시약-PBP2'-포착 시약 복합체가 형성되지 않는다. 따라서 이 경우 포착 시약과 표지 시약은 각각 PBP2'가 다른 부위에 결합할 필요가 있다.

고상 지지체는 모관 현상에 의해 시료 검체가 흡수되어 유동할 수 있는 것이면, 어떤 것이어도 좋다. 예를 들면, 지지체는 니트로셀룰로오스, 아세트산셀룰로오스, 나일론, 폴리에테르술폰, 폴리비닐알코올, 폴리에스테르, 유리 섬유, 폴리올레핀, 셀룰로오스, 폴리스티렌 등의 천연, 합성 중합체, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 고상 지지체는 바람직하게는 스트립 형상을 갖는다.

다제 내성 포도상구균속균이 특이적으로 생산하는 세포벽 합성 효소 PBP2'는 세포벽 내측에 있는 세포막 상에 존재한다. 다제 내성 포도상구균의 세포벽을 붕괴시키거나 또는 융해시키기 위한 전처리를 행함으로써, 포착 시약 및 표지 시약은 보다 PBP2'를 인식하기 쉬워진다. 다제 내성 포도상구균의 세포벽을 붕괴시키거나 또는 융해시키기 위한 추출 시약으로서, 세포벽 용균 효소, 또는 특정 양이온성 계면 활성제ㆍ양쪽이온성 계면 활성제 등의 살균 작용을 갖는 특정 계면 활성제가 알려져 있지만, 이들 시약은 고가인 것, 이뮤노크로마토그래피 검출법에서의 항원 항체 반응을 강하게 저해하는 것 등의 이유에 의해 이용하는 것이 곤란하다. 따라서 본 발명의 이뮤노크로마토그래피 검출법에 의한 PBP2'의 추출 시약에는 묽은 알칼리액을 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 0.01 N 내지 1.0 N 농도의 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염의 수용액을 들 수 있다. 상기 묽은 알칼리액의 pH는 11 이상인 것이 바람직하다.

상기와 같이 묽은 알칼리액으로 균액을 전처리한 경우, 전처리 후의 pH 11 이상으로 유지되면 항원-항체 반응이 저해된다. 따라서 알칼리 조건의 용액을 중화시키는 것이 필요해진다. 중화액으로서는 특별히 한정되지 않지만, 이뮤노크로마토그래피 검출법에 의한 반응계의 적합한 pH인 pH 6 내지 pH 8에 완충능을 나타내는 인산 완충액, 트리스 완충액, 또는 MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, 트리신, 비신, TAPS 등의 양호한 완충액을 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 균의 전처리란, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균, 보다 구체적으로는 다제 내성 포도상구균을 포함한다고 생각되는 균액을 알칼리 조건에 노출시킴으로써 항원인 PBP2'를 추출하는 공정, 및 알칼리 조건을 중화시키는 공정을 말한다. 전처리는 균을 포함하는 검체액에 알칼리 용액을 첨가함으로써 알칼리 처리하고, 그 후 중화액을 첨가할 수 있다. 또는 백금이나 면봉으로 채취한 균을 직접 알칼리 용액에 현탁시키고, 그 후 중화액을 첨가할 수도 있다. 첨가량은 한정되지 않지만, 중화 후의 검체액의 pH가 pH 6 내지 9 부근이 되도록 첨가할 수 있다. 또한, 중화액은 미리 검체 공급부에 함침시키고, 건조시켜 둘 수도 있다.

본 발명에서는 균액을 전처리 후 중화한 액에, 염, 계면 활성제, 단백질, 고분자 중합체, 산성 화합물, 염기성 화합물 등의 첨가제를 첨가하고, 충분히 혼합한 후에 이뮤노크로마토그래피 검출 장치의 검체 공급부에 검체를 공급하는 것이 가능하다. 이들 첨가제에 의해 항원 항체 반응의 감도 상승이나 위양성(예를 들면, 비특이 반응에 의한 위양성) 경감을 기대할 수 있다. 또한, 상기 묽은 알칼리액이나 중화액에 미리 상기한 첨가제를 혼합하여 둠으로써 조작수를 하나 감소시킬 수 있 다.

다제 내성 포도상구균을 검출하고자 하는 경우, 다제 내성이 아닌 포도상구균(MSSA, MSCNS) 또는 포도상구균 이외의 균 유래 물질이 표지 시약 및 포착 시약인 항체와 결합함으로써 위양성을 나타내는 경우가 있다. 그 때문에 라텍스 응집법에 의한 PBP2' 검출 시약에서는 균액을 알칼리 시약 존재하에서 비등 처리함으로써 IgG와 결합성을 나타내는 황색 포도상구균의 세포벽에 존재하는 프로틴 A 등의 위양성의 원인 물질을 불활성화하며 원심 조작에 의해 균 파쇄 후의 잔해를 제거하여 원심 후의 상청을 시험에 이용할 필요가 있었다. 본 발명에 의한 이뮤노크로마토그래피 검출법에서는 비등 처리에 의해 위양성의 원인 물질을 불활성화하지 않고도 이뮤노크로마토그래피 검출 장치 중의 포착 시약 부위에 계면 활성제를 포함시킴으로써 위양성 원인 물질과 포착 항체의 결합을 저해하는 것이 가능해진다. 계면 활성제는 양쪽이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 비이온성 계면 활성제인 것이 바람직하고, 어느 1종 이상이 포함되어 있으면 된다. 계면 활성제에 의한 위양성의 원인 물질과 포착 항체의 결합을 저해하는 것은 항체의 위양성의 원인 물질 결합 부위를 계면 활성제가 마스킹하는 것에 의한 것으로 생각된다. 따라서 계면 활성제의 분자량이 크고, 또한/또는 환상 구조를 많이 가질수록 효과가 크다고 생각된다. 예를 들면, 분자량 646, 육원환 1개의 비이온성 계면 활성제(상품명: Tx100, 나까라이 테스크사 제조), 분자량 364, 육원환이 없는 양쪽이온성 계면 활성제(상품명: SB3-14, 칼바이오켐사 제조), 분자량 615, 육원환 3개 오원환 1개의 양쪽이온성 계면 활성제(상품명: CHAPS, 도진 가가꾸사 제조), 분자량 878, 육 원환 3개 오원환 1개의 비이온성 계면 활성제(상품명: BIGCHAP, 도진 가가꾸사 제조)를 이용한 경우, 계면 활성제 미첨가와 비교하면, 어느 조건에서도 다제 내성이 아닌 황색 포도상구균 유래의 위양성 억제 효과는 얻어졌지만, Tx100 및 SB3-14보다 CHAPS 및 BIGCHAP의 효과가 큰 결과가 되었다. 따라서 계면 활성제의 분자량은 300 이상인 것이 바람직하고, 600 이상인 것이 보다 바람직하고, 육원환 등의 환상 구조를 많이 포함하는 것이 바람직하다고 생각된다. 위양성을 억제할 목적에서는 불용성 담체와 동일한 차지를 유지하는 계면 활성제를 이용하는 것이 바람직하고, 불용성 담체가 마이너스 차지인 라텍스 또는 금 콜로이드인 경우에는 계면 활성제도 마이너스 차지인 것이 바람직하다.

특히 위양성이 우려되는 것은, 황색 포도상구균의 세포막에 존재하는 프로틴 A이다. 프로틴 A는 면역 글로불린 G의 Fc 부분에 강한 결합성을 갖는다. 표지 시약과 포착 시약에는 PBP2'를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한다. 항체는 면역 글로불린 G, 면역 글로불린 M 등 특별히 종류는 상관없지만, 면역 글로불린 G를 사용하는 경우, Fc 부분을 제거한 상태로 사용하고 포착 시약 부분에서는 상기 계면 활성제와 조합시킴으로써, 프로틴 A에 의한 위양성을 회피할 수 있다. Fc 부분의 제거는 펩신이나 파파인 등의 기지의 분해 효소를 사용함으로써 용이하게 행할 수 있다.

그룹 G의 연쇄 구균의 세포벽 중에 포함되는 프로틴 G도 면역 글로불린 G의 Fc 부분과 특이적으로 결합한다. 그 때문에 검체액에 그룹 G의 연쇄 구균이 포함된 경우, 프로틴 A와 동일하게 표지 시약, 또는 포획 시약과 비특이 반응을 일으키 는 것으로 예상되고, 이 위양성의 회피에도 상기 방법을 동일하게 사용할 수 있다.

포착 시약 부분에 첨가하는 계면 활성제 중, 특히 이온성 계면 활성제는 포착 시약 부분을 통과하는 용액 내의 음이온 또는 양이온 농도에 의해서 그 성질이 변화된다. 그 때문에 사용되는 계면 활성제의 종류나 농도, 성질에 의해서 용액 내의 음이온 또는 양이온의 적합한 농도를 구할 필요가 있다. 음이온으로서는, 예를 들면 이온화 경향이 큰 염화물 이온, 브롬화물 이온, 요오드화물 이온 등을 들 수 있다. 또한, 양이온으로서는 이온화 경향이 큰 칼륨 이온, 칼슘 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온 등을 들 수 있다. 이 때, 복수개의 음이온 또는 복수개의 양이온을 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법인, 술포베타인 영역을 포함한 계면 활성제를 포착 시약 부위에 첨가함으로써 감도 상승 효과가 얻어진다. 라텍스 응집법에 의한 PBP2' 검출 시약에서는 양호한 감도로 PBP2'를 검출할 수 없기 때문에, 균액의 알칼리 시약 존재하에서의 비등 처리에 의해 세포벽을 파괴하여 완전히 PBP2'를 추출할 필요가 있었다. 이번 발명에서의 술포베타인 영역을 포함한 계면 활성제의 첨가에 의해 감도 상승시킴으로써, 비등 처리를 행하지 않은 불완전한 PBP2'의 용출 상태에서도 양호한 감도로 검출하는 것이 가능해졌다. 또한, 알칼리 시약 존재하에서의 비등 처리를 행함으로써 PBP2'의 분해, 또는 구조 변화에 의한 항체 인식 부위의 변성 등에 의한 감도 저하가 발생하지만, 비등 처리를 행하지 않음으로써 감도가 유지되는 이점도 있다.

술포베타인 영역을 포함하는 계면 활성제로서는, CHAPS, CHAPSO, 미리스틸술 포베타인(SB3-14), 도데실디메틸아미노부탄술포네이트(DDABS) 등을 들 수 있다.

상기 위양성의 원인 물질과 포착 항체의 결합을 저해하는 계면 활성제 및 감도를 상승시키는 위한 계면 활성제는, 포착 시약 부위에 포착 시약을 고상화시킬 때, 포착 시약에 계면 활성제를 미리 첨가해둔다. 위양성 원인 물질과 포착 항체의 결합을 저해하는 계면 활성제와, 감도를 상승시키는 효과가 있는 술포베타인형 계면 활성제는, 한쪽만을 사용할 수도 있고 병용할 수도 있다. 또한, 위양성 원인 물질과 포착 항체의 결합을 저해하는 계면 활성제가 술포베타인형일 수도 있고, 이 경우에는 감도를 상승시키는 효과를 기대할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 바람직하게는 분자량 300 이상, 보다 바람직하게는 600 이상이며 술포베타인 영역을 포함한 계면 활성제를 포착 시약 부위에 첨가함으로써 위양성의 원인 물질과 포착 항체의 결합을 저해하는 효과 및 감도를 상승시키는 효과를 둘다 가질 수 있다. 구체예로서는 CHAPS, SB3-14가 바람직하고, CHAPS가 특히 바람직하다. 복수개의 계면 활성제를 포착 시약 부위에 첨가할 수도 있다.

또한, 상기와 같이 음이온 또는 양이온을 첨가하는 경우에는, 음이온 또는 양이온을 다제 내성 포도상구균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액에 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은, 포착 시약 부위에 위양성의 원인 물질이 도달하는 것을 피함으로써 위양성 원인 물질의 영향을 방지하는 방법도 포함한다. 예를 들 면, 본 발명의 장치의 포착 시약 부위 상류부에서 위양성 원인 물질을 제거할 수 있다. 위양성 원인 물질을 제거하는 방법으로서, 이뮤노크로마토그래피 검출 장치 상의 검체 공급 부위를 유리계 섬유로 하는 것이 바람직하다. 세균 유래의 위양성 원인 물질이 유리계 섬유에 흡착되고, 위양성 원인 물질이 포착 시약 상을 통과하는 것을 저해하여, 결과적으로 위양성을 억제하는 것으로 연결된다.

본 발명의 방법은 세포벽 합성 효소 PBP2'를 항원으로 하고, 이에 대한 항체를 이용한 항원 항체 반응에 기초하는 검출법이다. 따라서 검체 중에 세포벽 합성 효소 PBP2'가 존재하면 본 발명의 방법으로 검출 가능하다. 일반적으로 세포벽 합성 효소 PBP2'는 다제 내성 포도상구균에 의해서 특이적으로 생산되고, 균체 내에 특이적으로 존재한다고 생각된다.

다제 내성 포도상구균 이외의 균에서 PBP2'를 생산하는 균의 존재는 현재 알려져 있지 않다. 본 명세서에서는, 「세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균」으로 기술하는 대신에 하나의 구체예로서 「다제 내성 포도상구균」을 이용하여 설명하는 부분이 있지만, 이들 기술은 「다제 내성 포도상구균」으로 한정하는 의도는 아니다. 이들은 본 발명의 방법이 실시 가능한 범위 내에서 「세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균」이라고도 읽을 수 있다. 즉, 다제 내성 포도상구균 이외로서 PBP2'를 생산하는 균도 본 발명의 방법으로 검출 가능하다. 또한, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 균체 내에 포함하는 균도 본 발명의 방법으로 검출 가능하다. 또한, 일반적으로 세포벽 합성 효소 PBP2'는 다제 내성 포도상구균의 세포벽 내측에 있는 세포막 상에 특이적으로 존재한다고 생각된다. 본 발명의 방법은 균의 세포벽을 붕괴시키거나 또는 융해시키기 위한 전처리를 위한 PBP2'의 추출 시약을 포함한다. 따라서 세포벽 합성 효소 PBP2'를 세포벽 내측에 포함하는 균은 본 발명의 방법으로 효과적으로 검출 가능하다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

이뮤노크로마토그래피 검출법에 의한 MRSA의 PBP2'의 검출(도 1)

(1) 항체 감작 라텍스 입자의 제조 및 건조화

항 PBP2' 모노클로날 항체를 통상법에 의해 펩신으로 처리하여 F(ab')2를 얻었다. 이것을 0.4 ㎛의 라텍스 입자에 감작시키고, 폴리스티렌 부직포에 분무하였다. 이어서 감압 장치 내에서 1 시간 감압 건조시켜 건조 라텍스 항체 패드로 만들었다. 사용시에는 4 mm 간격으로 재단하고, 표지 부위 (2)로서 이용하였다.

(2) 이뮤노크로마토그래피 검출 장치의 제작

라텍스 감작에 이용한 항 PBP2' 모노클로날 항체와는 인식 부위를 달리하는 제2 항 PBP2' 모노클로날 항체를 통상법에 의해 펩신으로 처리하여 F(ab')2를 얻었다. 이것을 0.075 ％ CHAPS를 포함하는 시트르산 완충액(pH 6)으로 희석하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(고상 지지체 (5))에 도포하여 충분히 건조시켰다(포착 시약 부위 (3)). 대조용 시약으로서 항-마우스 IgG를 동일하게 니트로셀룰로오스 멤브레인에 도포하여 충분히 건조시켰다(대조 부위 (4)).

소수성 시트 (7) 상에 포착 시약 부위 (3) 및 대조 부위 (4)를 포함하는 고상 지지체 (5)를 배치하고, 표지 시약 부위 (2), 검체 공급 부위 (1)로서 유리계 섬유, 흡수 부위 (6)으로서 여과지를 이용하여 임의의 장소에 배치하였다.

(3) 검체의 전처리

황색 포도상구균 14주를 혈액 한천 배지 상에서 35 ℃ 밤새 배양하고, 0.2 N NaOH에 1백금이량을 직접 현탁시켰다. 동일하게 콜로니 1개를 조균(釣菌) 후 0.2 N NaOH 100 ㎕에 현탁시켰다. 그 후, 비이온성 계면 활성제 및 소혈청 알부민, 토끼 IgG를 포함하는 0.6 M 트리스 염산염 완충액 50 ㎕로 중화시켰다.

(4) 어쎄이

검체 전처리된 액이 들어간 1.5 mL 튜브에 이뮤노크로마토그래피 검출 장치를 투입하고, 10 분 후에 포착 시약 (3)에서의 정색(呈色)을 육안으로 평가하고, 정색이 있는 것을 양성, 정색이 보이지 않는 것을 음성이라 하였다.

(5) 약제 감수성 시험

(3)과 동일한 방법으로 배양한 균주를 멸균시킨 0.9 ％ 염화나트륨 용액에 부유시키고, 578 nm의 흡광도가 0.3이 되도록 제조한 액을, 6 ㎍/mL 옥사실린, 4 ％ 염화나트륨을 포함하는 뮬러-힌톤 한천 배지에 접종하고, 35 ℃에서 24 시간 배양 후, 발육한 것을 MRSA, 발육하지 않은 것을 MSSA라 하였다.

(6) 결과

결과를 표 1에 나타내었다.

표 1로부터 양자(兩者)의 양성 일치율: 100 ％(4/4), 음성 일치율: 100 ％(10/10), 따라서 전체 일치율: 100 ％(14/14)인 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터 본 발명의 우위성을 확인할 수 있었다.

실시예 2 보충 시약 부위에의 계면 활성제 첨가의 효과

(1) 항체 감작 라텍스 입자의 제조 및 건조화

실시예 1에서 제조한 것을 사용하였다.

(2) 이뮤노크로마토그래피 검출 장치의 제작

실시예 1과 동일하게 제조하였다. 이 때, 포착 시약 부위에 0.05 ％의 CHAPS, Tx100, SB3-14, BIGCHAP, DTAC(도데실트리메틸암모늄클로라이드)를 첨가한 것과 첨가하지 않은 것을 제조하고, 이것을 이용하였다.

(3) 검체의 전처리

약제 감수성 시험에서 감수성, 즉 MSSA라 판정된 균주 1주 및 약제 감수성 시험에서 내성, 즉 MRSA라고 판정된 균주 1주를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하고, MSSA에 대해서는 2백금이량 및 3백금이량, MRSA에 대해서는 1백금이량을 조균 후, 전처리하였다.

(4) 어쎄이

MSSA 1주는 희석하지 않고 실시예 1과 동일하게 시험하였다. MRSA 1주는 또한 0.2 N NaOH와 비이온성 계면 활성제 및 소혈청 알부민, 토끼 IgG를 포함하는 0.6 M 트리스 염산염을 2:1로 혼합한 용액으로 2 단계 희석하고, 1024배 희석 이상의 희석 배율 150 ㎕에 대하여 실시예 1과 동일하게 시험하였다.

(5) 결과

포착 시약 부위에 계면 활성제를 첨가한 것과 미첨가한 것을 비교하였다. MSSA를 이용한 결과를 표 2에 나타내었다. 음성 판정을 -, 위양성의 강약을 +의 수로 표시하였다. MRSA를 이용한 결과를 표 3에 나타내었다. 음성 판정을 -, 양성 판정을 +로 표시하였다.

계면 활성제 미첨가 및 양이온 계면 활성제인 DTAC 첨가에서는 MSSA 2백금이량에서 위양성을 나타내었다. 또한 비교적 분자량이 작은 Tx100 첨가 또는 SB3-14 첨가에서는, 미첨가 또는 DTAC 첨가만큼은 아니지만 3백금이량에서 위양성을 나타내었다. 한편 비교적 분자량이 큰 CHAPS 첨가 또는 BIGCHAP 첨가에 있어서는 2백금이량, 3백금이량에서 음성을 나타내었다.

표 2로부터 비이온성 계면 활성제인 Tx100, BIGCHAP 또는 양쪽이온성 계면 활성제인 CHAPS 또는 SB3-14를 포착 시약 부위에 첨가함으로써, MSSA 유래의 위양성을 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한, 환상 구조를 많이 포함하며 분자량이 큰 CHAPS 또는 BIGCHAP에서는 위양성의 억제 효과가 보다 큰 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터, 포착 시약 부위에 계면 활성제를 첨가하는 것에 대한 우위성을 확인할 수 있었다.

포착 시약 부위에 CHAPS 또는 SB3-14를 첨가함으로써 감도가 상승하였다. DTAC를 첨가한 것에서는 위양성이라 생각되었다.

표 3으로부터 술포베타인형 계면 활성제인 SB3-14 또는 CHAPS를 포착 시약 부위에 첨가함으로써, 계면 활성제 미첨가 및 술포베타인형이 아닌 계면 활성제인 Tx100 또는 BIGCHAP를 첨가한 것과 비교하여, 감도를 상승시키는 효과가 있는 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터 술포베타인형 계면 활성제를 포착 시약 부위에 첨가하는 것에 대한 우위성을 확인할 수 있었다.

실시예 2의 결과로부터, 특히 CHAPS가 위양성을 억제하는 높은 효과 및 감도를 상승시키는 높은 효과 둘다를 가지고, 특히 유용한 것을 알 수 있었다.

실시예 3 이뮤노크로마토그래피 검출법에 의한 MRCNS의 PBP2'의 검출

(1) 항체 감작 라텍스 입자의 제조 및 건조화

실시예 1에서 제조한 것을 사용하였다.

(2) 이뮤노크로마토그래피 검출 장치의 제조

실시예 1과 동일하게 제조한 것을 사용하였다.

(3) 검체의 전처리

그람 염색에서 포도상구균의 성상을 나타내고, 캐탈라제 시험에서 양성, 코아귤라제 시험에서 음성이라 판정된 포도상구균 중, 약제 감수성 시험에서 메티실린 감수성, 즉 MSCNS라 판정된 균주 2주 및 약제 감수성 시험에서 메티실린 내성, 즉 MRCNS라 판정된 균주 1주를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하고, 1백금이량 조균 후, 전처리하였다.

(4) 어쎄이

실시예 1과 동일하게 실시하였다.

(5) 약제 감수성 시험

실시예 1과 동일한 방법으로 행하였다.

(6) 결과 결과를 표 4에 나타내었다. 약제 감수성 시험에서 감수성을 S, 내성을 R, 본 발명에서 양성 판정을 +, 음성 판정을 -라 표시하였다.

약제 감수성 시험에서 감수성, 즉 MSCNS라 판정된 균 2주에 대해서는 음성을, 약제 감수성 시험에서 내성, 즉 MRCNS라 판정된 균 1주에 대해서는 양성을 나타내었다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서에서 포함하는 것으로 한다.

Claims

세포벽 합성 효소 PBP2'를 항원 항체 반응에 기초하는 이뮤노크로마토그래피 검출법을 이용하여 검출하는 것을 특징으로 하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제1항에 있어서, 시트형 고상 지지체 상에 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액을 공급하는 검체 공급 부위, PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체를 표지한 표지 시약을 고상 지지체 상에서 전개 가능하게 유지한 표지 시약 부위, PBP2'와 표지 시약의 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화시킨 포착 시약 부위가 포함된 이뮤노크로마토그래피 검출 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, PBP2'와 표지 시약이 고상 지지체와 분리된 부위에서 미리 접촉되고, 검체 공급 부위에 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액 및 PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체를 표지한 표지 시약을 포함하는 검체 시약 혼합 용액을 검체 공급 부위에 공급하 는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 표지 시약이, 불용성 담체에 항체가 결합된 것인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 포착 시약 부위에 양쪽이온성(ampholytic) 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및/또는 비이온성 계면 활성제를 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 포착 시약 부위에 술포베타인형 계면 활성제를 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액에, 상기 용액을 검체 공급 부위에 공급하기 전에 이온화 경향이 큰 음이온을 첨가하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제7항에 있어서, 이온화 경향이 큰 음이온이 염화물 이온, 브롬화물 이온 및 요오드화물 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 음이온인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액에, 상기 용액을 검체 공급 부위에 공급하기 전에 이온화 경향이 큰 양이온을 첨가하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제9항에 있어서, 이온화 경향이 큰 양이온이 칼륨 이온, 칼슘 이온, 나트륨 이온 및 마그네슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 양이온인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 검체를 알칼리 처리 및 중화에 의해 전처리하는 공정을 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제11항에 있어서, 알칼리 처리가 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염의 수용액을 이용하여 행해지는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제12항에 있어서, 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염 수용액의 pH가 11 이상인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염의 농도가 0.01 N 내지 1.0 N인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액으로 알칼리 처리 후의 수용액을 중화시키는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 검체 공급 부위가 유리계 섬유로 이루어지는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균이 다제(多劑) 내성 포도상구균인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균의 검출 방법.
시트형 고상 지지체 상에 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액을 공급하는 검체 공급 부위, PBP2'에 특이적으로 결합하는 항체를 표지한 표지 시약을 고상 지지체 상에서 전개 가능하게 유지한 표지 시약 부위, PBP2'와 표지 시약의 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화시킨 포착 시약 부위가 포함되고, 포착 시약 부위에 양쪽이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및/또는 비이온성 계면 활성제가 포함되는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 이뮤노크로마토그래피 검출 장치.
제18항에 있어서, 포착 시약 부위에 술포베타인형 계면 활성제를 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 이뮤노크로마토그래피 검출 장치.
제18항 또는 제19항에 있어서, 검체 공급 부위가 유리계 섬유로 이루어지는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 이뮤노크로마토그래피 검출 장치.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균이 다제 내성 포도상구균인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 이뮤노크로마토그래피 검출 장치.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 이뮤노크로마토그래피 검출 장치, 및 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균을 포함하는 것으로 추정되는 검체 용액 또는 검체의 전처리에 의해 세포 벽에서 유리된 PBP2'를 포함하는 것으로 추정되는 용액에 첨가하기 위한 이온화 경향이 큰 음이온 또는 양이온 용액을 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.
제22항에 있어서, 이온화 경향이 큰 음이온이 염화물 이온, 브롬화물 이온 및 요오드화물 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 음이온인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.
제22항에 있어서, 이온화 경향이 큰 양이온이 칼륨 이온, 칼슘 이온, 나트륨 이온 및 마그네슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 양이온인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 검체 알칼리 처리용 알칼리 용액 및 중화용 완충액을 더 포함하는, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.
제25항에 있어서, 알칼리 용액이 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염의 수용액인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.
제26항에 있어서, 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염 수용액의 pH가 11 이상인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.
제26항 또는 제27항에 있어서, 알칼리 금속의 수산화물 또는 탄산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물 또는 탄산염의 농도가 0.01 N 내지 1.0 N인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.
제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균이 다제 내성 포도상구균인, 세포벽 합성 효소 PBP2'를 생산하는 균 검출용 키트.