DE3852166T2

DE3852166T2 - Analytische Vorrichtung für enzymimmunologische Tests.

Info

Publication number: DE3852166T2
Application number: DE3852166T
Authority: DE
Inventors: Yoshihiro Ashihara; Toshikage Hiraoka; Shigeki Kageyama; Isao Nishizono; Yukio Sudo; Tetsuji Tanimono
Original assignee: Fujirebio Inc; Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujirebio Inc; Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1987-09-30
Filing date: 1988-09-29
Publication date: 1995-04-06
Anticipated expiration: 2008-09-30
Also published as: DE3852166D1; EP0310940A2; EP0310940A3; EP0310940B1; US5603898A

Description

Diese Erfindung betrifft ein immunologisch nützliches, mehrschichtiges analytisches Element vom Trockentyp für den Immunoassay gemäß dem Enzym-Immunoassay unter Verwendung der Antigen/Antikörper-Reaktion.
Für die Bestimmung von in Körperflüssigkeiten oder ähnlichem enthaltenen biochemischen Substanzen sind verschiedene Methoden bekannt, und unter diesen ist der Enzym-Immunoassay als Methode bekannt, die in der Lage ist, sie mit einer relativ hohen Empfindlichkeit zu messen. Andererseits wurde die Methode, ein analytisches Element vom Trockentyp zu verwenden, auch in Hinblick auf Einfachheit und Schnelligkeit entwickelt (US-A-4 292 272, japanische Patente KOKAI Nrn. 53888/1974, 102388/1984, etc.) . Es wurde angestrebt, ein analytisches Element vom Trockentyp für den Immunoassay zu entwickeln, das sowohl die Nachteile der Methode des analytischen Elements vom Trockentyp als auch des Enzym-Immunoassays durch ihre Kombination ausschaltet. Darum versuchten die Erfinder den Enzym-Immunoassay unter Verwendung eines in den japanischen Patenten KOKAI Nrn. 80049/1986 und 80050/1986 beschriebenen, wasserunlöslichen makromolekularen Substrats als Substrat für ein Enzym-Antikörper-Konjugat in ein analytisches Element vom Trockentyp einzuarbeiten. Beim Einarbeiten des wasserunlöslichen makromolekularen Substrats in das analytische Element vom Trockentyp traten jedoch oft Schwierigkeiten auf und als Folge waren die Ergebnisse nicht zufriedenstellend. Die Erfinder forschten weiter und fanden, daß die vorhergenannten Probleme durch die Verwendung eines wasserlöslichen makromolekularen Substrats als Substrat für das Enzym-Antikörper-Konjugat deutlich verbessert werden konnten.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein mehrschichtiges analytisches Element vom Trockentyp für den Immunoassay bereitzustellen, das zur Durchführung eines Enzym-Immunoassays mit hoher Empfindlichkeit durch einen einfachen Vorgang in der Lage ist.
Die oben genannte Aufgabe konnte durch ein mehrschichtiges analytisches Element für den Immunoassay gelöst werden, umfassend eine wasserpermeable Schicht zur Messung eines Liganden in einer Probenflüssigkeit gemäß einem Enzym-Immunoassay, wobei die Reagensschicht
A) ein wasserlösliches makromolekulares Substrat und
B) ein Enzym-Antikörper-Konjugat aus einem Enzym mit der Fähigkeit, auf das vorstehende wasserlösliche makromolekulare Substrat einzuwirken, mit einem Antikörper, der mit dem Liganden in der Probenflüssigkeit reagiert, enthält.
Die oben genannte Aufgabe konnte ebenfalls durch ein mehrschichtiges analytisches Element vom Trockentyp gelöst werden, das weiterhin
C) ein makromolekulares Antigen, das ein Konjugat des Liganden oder seines Derivats mit einer makromolekularen Verbindung in der Reagensschicht des analytischen Elements ist, enthält.
Fig. 1 zeigt eine Kalibrierungskurve des mehrschichtigen analytischen Elements vom Trockentyp für den Immunoassay für die Analyse von Theophyllin in Beispiel 1.
Fig. 2 zeigt eine Kalibrierungskurve des mehrschichtigen analytischen Elements vom Trockentyp für den Immunoassay für die Analyse von Theophyllin in Beispiel 2.
Fig. 3 zeigt eine Kalibrierungskurve des mehrschichtigen analytischen Elements vom Trockentyp für den Immunoassay für die Analyse von Ferritin in Beispiel 3.
Fig. 4 zeigt eine Kalibrierungskurve des mehrschichtigen analytischen Elements vom Trockentyp für den Immunoassay für die Analyse von Ferritin in Beispiel 4.
Bei den zu analysierenden Substanzen (Analyten) für das erfindungsgemäße mehrschichtige analytische Element vom Trokkentyp für den Immunoassay handelt es sich um in einer Probe enthaltene Liganden mit einer antigenen Determinante. Die Art der Probe ist nicht eingeschränkt und schließt Blut, wie Vollblut, Blutplasma und Blutserum, Lymphe und Urin ein. Für Blutplasma, Blutserum, Lymphe und Urin ist normalerweise keine spezielle Vorbehandlung notwendig und die Probe kann so gemessen werden wie sie ist.
Der Ligand hat eine oder mehrere antigene Determinanten und schließt unterschiedliche in Organen, Blut oder Urin existierende Antigene ein, wie medizinische Substanzen, die Digoxin, Theophyllin, Phenobarbital, Phenytoin, Penicillin und Amikacin einschließen, aus verschiedenen endokrinen Drüsen herrührende Hormone, die Prostaglandin, Testosteron, Progesteron und Thyroxin einschließen, Plasmaproteine, die Immunoglobulin, Albumin und Ferritin einschließen, virale Antigene, die HB-Antigen einschließen, Bakterien, α-Fetoprotein, Antigene im Zusammenhang mit Krebs und ähnliche. Das erfindungsgemäße mehrschichtige analytische Element vom Trockentyp für den Immunoassay ist bei der Messung eines Liganden mit hohem Molekulargewicht, beispielsweise mit einem Molekulargewicht von über 20.000, besonders effektiv.
Ein Ligand mit niedrigem Molekulargewicht, beispielsweise mit einem Molekulargewicht von weniger als 20.000, kann jedoch gemessen werden, indem das makromolekulare Antigen eingearbeitet wird, das ein Konjugat des Liganden oder seines Derivats mit einer makromolekularen Verbindung ist. Wenn das Makromolekül eingearbeitet wird, reagiert der Antikörper, der Bestandteil des Enzym-Antikörper-Konjugats ist, konkurrierend mit einer antigenen Determinante des zu messenden Liganden und des Liganden am makromolekularen Antigen.
Der Antikörper gegen den Liganden kann nach einer bekannten Methode für die Herstellung eines Antikörpers hergestellt werden. Beispielsweise wird der Ligand oder ein Konjugat aus dem Liganden und einem Protein ein oder mehrmals subkutan in den Rücken, Fußballen oder Oberschenkelmuskel eines warmblütigen Tieres, wie Kaninchen, Ziege, Pferd, Meerschweinchen oder Huhn, in einer Menge von 0,3 bis 2 mg pro kg zusammen mit einem Adjuvans injiziert, wodurch der Antikörper in der Körperflüssigkeit gebildet wird. Das Serum kann als Antikörper verwendet werden oder es kann nach einer bekannten Reinigungsmethode für Antikörper, d. h. Immunoglobuline, aus Serum gereinigt werden.
Andererseits kann dieser Antikörper als monoclonaler Antikörper hergestellt werden. In diesem Fall wird der oben genannte Ligand oder das Konjugat mehrmals zusammen mit einem Adjuvans in die Bauchhöhle einer Maus injiziert und ihre Milz wird entfernt. Die Milzzellen werden mit Maus-Myelomzellen nach einer konventionellen Methode, wie durch Verwendung von Polyethylenglykol, verschmolzen. Das so erhaltene Hybridom wird kultiviert und cloniert und die Zellen werden erhalten, die in der Lage ist den angestrebten Antikörper zu produzieren. Diese Zellen werden in die Bauchhöhle einer Maus injiziert und vermehrt. Dann wird Bauchhöhlenflüssigkeit entnommen und der angestrebte Antikörper wird aus der Bauchhöhlenflüssigkeit abgetrennt. Bei dem Antikörper kann es sich um sein Fragment, wie F(ab')&sub2;, Fab' oder Fab, handeln.
Anschließend reagiert das Enzym, das Bestandteil des Enzym- Antikörper-Konjugats ist, mit dem wasserlöslichen makromolekularen Substrat. Es ist günstig, ein Enzym zu verwenden, dessen Aktivität leicht gemessen werden kann. Diese schließen Amylase, Dextranase, Cellulase, Collagenase, Mannase, Protease, Elastase, Lipase und Glucoamylase ein.
Das wasserlösliche makromolekulare Substrat, auf das das Enzym einwirkt, schließt Enzymsubstrate, wie Stärke, Amylose, Amylopectin und Peptide, sowie Beispiele anderer wasserlöslicher Substrate ein, die in "Koso (Enzyme) Handbook" (Hrsg. Maruo et al., Asakura-Shoten, Tokyo, 1982) und "Seikagaku (Biochemical) Handbook" (Hrsg. The Japanese Biochemical Society, Maruzen, Tokyo, 1980) beschrieben sind. Eine direkt oder indirekt detektierbare funktionelle Gruppe oder Verbindung kann an das makromolekulare Substrat gebunden sein.
Die Kupplungsmethode für das Enzym und den Antikörper kann ausgewählt werden, indem man die funktionellen Gruppen beider Substanzen in Betracht zieht. Diese funktionellen Gruppen schließen Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, Thiolgruppen, Imidazolgruppen, Phenylgruppen und ähnliche ein. Hinsichtlich der Kupplungsmethode für Aminogruppen sind viele Methoden bekannt, wie die Diisocyanat-Methode, die Glutaraldehyd-Methode, die Difluorbenzol-Methode, die Benzochinon-Methode und ähnliche. Hinsichtlich der Methode für die Kupplung einer Aminogruppe an eine Carboxylgruppe sind die Peptidkupplungs-Methode einer Carboxylgruppe an einen Succinimidester, die Carbodiimid-Methode, die Methode mit dem Woodward-Reagens und ähnliche bekannt. Die Periodatoxidations-Methode (Nakane-Methode), bei der eine Brücke zwischen einer Aminogruppe und einer Zuckerkette entsteht, wird ebenfalls verwendet. Falls die Thiolgruppe verwendet wird, wird beispielsweise eine Carboxylgruppe zunächst in einen Succinimidester umgewandelt, diese Estergruppe läßt man dann mit Cystein reagieren, um die Thiolgruppe einzuführen und beide Thiolgruppen werden unter Verwendung eines Thiol-reaktiven bifunktionellen Quervernetzungsreagens, wie Phenylenbismaleinimid, verbunden. Als Methode unter Verwendung einer Phenylgruppe werden die Diazotierungs-Methode und die Alkylierungs-Methode verwendet. Über die oben genannten hinaus kann eine geeignete Methode aus den zahlreichen in "Methods in Immunology and Immunochemistry" (C.A. Williams et al., Academic Press, N.Y., 1976) und "Koso Meneki Sokutei-ho" "(Enzyme Immunoassay)" (E. Ishikawa et al., Igakushoin (Japan), 1978) beschriebenen Methoden ausgewählt werden. Das Molverhältnis der Kombination ist nicht auf 1 : 1 beschränkt und geeignete Verhältnisse können ausgewählt werden. Nach der Kupplungsreaktion wird das hergestellte Enzym- Antikörper-Konjugat durch Gelfiltration, Ionenaustausch- Chromatographie oder Affinitäts-Chromatographie oder einer Kombination dieser gereinigt und, falls notwendig, lyophilisiert.
Falls andererseits die Probe ein Enzym von derselben Art wie das Enzym des Konjugats enthält, ist es bevorzugt, daß man einen Enzyminhibitor, der das Enzym in der Probe stärker inhibiert als er das Enzym des Konjugats inhibiert, in Kontakt mit dem Enzym in der Probe treten läßt.
Der am meisten anzustrebende Enzyminhibitor inaktiviert das in der Probe enthaltene Enzym und inhibiert nicht das Enzym des Konjugats. In der Praxis ist jedoch ausreichend, daß der Blindwert während der Messung nicht ansteigt und die Enzymaktivität nach der Messung wiederhergestellt werden kann, beispielsweise durch die Inaktivierung des Enzyminhibitors. Der Enzyminhibitor kann das freie Enzym inaktivieren aber nicht das an den Antikörper gebundene Enzym. Der Enzyminhibitor kann ein bekannter Enzyminhibitor sein mit der entsprechenden Spezifität. Ferner kann, wenn das in der Probe enthaltene Enzym in ein fremdes Tier injiziert wird, um den Antikörper zu dem Enzym zu bilden, dieser Antikörper auch als Enzyminhibitor verwendet werden. Die Herstellung des Antikörpers kann nach der vorstehend erwähnten Methode durchgeführt werden.
Wenn die Verringerung der Enzymaktivität durch den Liganden im Fall der Messung von Liganden mit hohem Molekulargewicht unzureichend ist, ist es bevorzugt, einen zweiten Antikörper zu verwenden, der eine andere antigene Determinante im selben Liganden erkennt, die sich von der von dem Antikörper des Konjugats erkannten antigenen Determinante unterscheidet. Für den zweiten Antikörper wird beispielsweise eine Maus mit einem Antigen immunisiert, wodurch monoclonale Antikörper erhalten werden, und zwei oder mehr Arten der Antikörper, die mit voneinander unterschiedlichen antigenen Determinanten reagieren, werden isoliert. Einer der unterschiedlichen Antikörper kann dann als zweiter Antikörper verwendet werden.
Ein Ligand mit niedrigem Molekulargewicht kann gemessen werden, indem man das makromolekulare Antigen, das ein Konjugat des Liganden oder seines Derivats mit einer makromolekularen Verbindung ist, zu der wasserpermeablen Schicht des erfindungsgemäßen mehrschichtigen analytischen Elements vom Trokkentyp für den Immunoassay hinzufügt, die das wasserlösliche makromolekulare Substrat und das Enzym-Antikörper-Konjugat enthält. Der Ligand für die Herstellung des makromolekularen Antigens hat eine oder mehrere antigene Determinanten mit dem Liganden in der Probe gemeinsam und normalerweise ist es dieselbe Substanz wie der Ligand in der Probe. Das Derivat des Liganden schließt den Liganden ein, in den eine Aminogruppe, Carboxylgruppe, Thiolgruppe oder dergleichen eingeführt wurde, beispielsweise ist 8-Propylcarboxytheophyllin ein Derivat des Theophyllins.
Ferner kann das Derivat des Liganden ein Derivat einer mit dem Antikörper zum Liganden kreuzreagierenden Verbindung sein. Wenn beispielsweise der Antikörper zu Theophyllin als Ligand mit Koffein kreuzreagiert, kann ein Derivat von Koffein als Derivat des Theophyllins verwendet werden.
Für das makromolekulare Antigen sind wasserlösliche makromolekulare Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100.000 Dalton als makromolekulare, an den Liganden oder sein Derivat gebundene, Verbindung geeignet. Die Beispiele für solche makromolekularen Verbindungen schließen Polysaccharide und ihre Derivate, wie lösliches Dextran, Carboxymethyldextran, Dextran mit induzierten Aminogruppen und Amylose, Proteine, wie Gelatine, Hämocyanin und Ferritin und Polyethylenglykol, ein. Sie können die oben erwähnten Bedingungen im an den Liganden oder sein Derivat gekoppelten Zustand in ausreichendem Maß erfüllen und schließen beispielsweise ein Polymer eines relativ kleinen Moleküls, wie Rinderserumalbumin, ein.
Das makromolekulare Antigen kann auch ein Polymer des Liganden oder seines Derivats sein. Das Polymerisationsverfahren kann aus den folgenden Kupplungsmethoden für den Liganden oder sein Derivat an die makromolekulare Verbindung ausgewählt werden, beispielsweise kann der Ligand oder sein Derivat durch Verwendung eines bifunktionellen Quervernetzungsreagens, wie Carbodiimid, Glutaraldehyd oder dergleichen, polymerisiert werden.
Die Kupplungsmethode für den Liganden oder sein Derivat an die makromolekulare Verbindung kann unter Berücksichtigung der funktionellen Gruppen beider Substanzen ausgewählt werden. Diese funktionellen Gruppen schließen Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, Thiolgruppen, Imidazolgruppen, Phenylgruppen und dergleichen ein, und die Kupplungsmethode für diese Gruppen kann aus den oben erwähnten Methoden für die Kupplung des Enzyms an den Antikörper ausgewählt werden. Das Molverhältnis der Kombination ist nicht auf 1 : 1 beschränkt und geeignete Verhältnisse können ausgewählt werden. Nach der Kupplungsreaktion wird das hergestellte Konjugat durch Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie oder deren Kombination gereinigt und, falls notwendig, lyophilisiert.
Das erfindungsgemäße mehrschichtige analytische Element vom Trockentyp kann einen ähnlichen Schichtaufbau, wie verschiedene bekannte mehrschichtige analytische Elemente vom Trokkentyp, haben, wie ein Mehrschichtaufbau, der nicht nur die später beschriebene Reagensschicht (auch als Immunoassayreagensschicht bezeichnet) enthält, sondern auch einen Träger, eine Ausbreitungsschicht, eine Registrierungsschicht, eine Lichtsperrschicht, eine Bindeschicht, eine Filterschicht, eine Wasserabsorptionsschicht, eine Grundierungsschicht und dergleichen. Beispiele für analytische Elemente mit einem solchen Schichtaufbau sind beispielsweise in US-A-3 992 158 und dem japanischen Patent KOKAI Nr. 164356/1980 beschrieben.
Falls ein lichtdurchlässiger wasserundurchlässiger Träger verwendet wird, sind die folgenden Schichtaufbauten für das erfindungsgemäße mehrschichtige analytische Element vom Trockentyp für den Immunoassay praktisch einsetzbar. Die Schichtaufbauten sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
1) Eine Ausbreitungsschicht, eine Reagensschicht und der Träger, in dieser Weise übereinander angeordnet.
2) Eine Ausbreitungsschicht, eine Reagensschicht, eine Registrierungsschicht und der Träger, in dieser Weise übereinander angeordnet.
3) Eine Ausbreitungsschicht, eine lichtreflektierende Schicht, eine Reagensschicht und der Träger, in dieser Weise übereinander angeordnet.
4) Eine Ausbreitungsschicht, eine lichtreflektierende Schicht, eine Reagensschicht, eine Registrierungsschicht und der Träger, in dieser Weise übereinander angeordnet.
5) Eine Ausbreitungsschicht, eine Reagensschicht, eine lichtreflektierende Schicht, eine Registrierungsschicht und der Träger, in dieser Weise übereinander angeordnet.
6) Eine Ausbreitungsschicht, eine erste Reagensschicht, eine lichtreflektierende Schicht, eine zweite Reagensschicht und der Träger, in dieser Weise übereinander angeordnet.
7) Eine Ausbreitungsschicht, eine erste Reagensschicht, eine lichtreflektierende Schicht, eine zweite Reagensschicht, eine Registrierungsschicht und der Träger, in dieser Weise übereinander angeordnet.
8) Eine Reagens enthaltende Ausbreitungsschicht, eine Registrierungsschicht und der Träger, in dieser Weise übereinander angeordnet.
9) Eine Reagens enthaltende Ausbreitungsschicht, eine lichtreflektierende Schicht, eine Registrierungsschicht und der Träger, in dieser Weise übereinander angeordnet.
In den obigen Schichtaufbauten (1) bis (5) kann die Reagensschicht aus mehreren unterschiedlichen Schichten zusammengesetzt sein. Außerdem kann die Reagensschicht eine Immunoassayreagensschicht sein, die die in einer immunologischen Reaktion reagierende(n) Komponente(n) enthält. Zwischen der Reagensschicht oder der Registrierungsschicht und dem Träger kann eine Wasserabsorptionsschicht angeordnet sein. In den obigen Schichtaufbauten (1) bis (3) und (6) kann eine Filterschicht zwischen der Reagensschicht und der Ausbreitungsschicht oder der Registrierungsschicht angeordnet sein. In den obigen Schichtaufbauten (3) bis (7) kann eine Filterschicht zwischen der lichtreflektierenden Schicht und der Ausbreitungsschicht, der Reagensschicht oder der Registrierungsschicht, zwischen der Reagensschicht und der Registrierungsschicht oder zwischen der Ausbreitungsschicht und der Reagensschicht angeordnet sein. Wenn die Reagensschicht aus zwei oder mehr Schichten zusammengesetzt ist, kann eine Filterschicht zwischen einer Reagensschicht und einer weiteren Reagensschicht angeordnet sein.
Bevorzugte Materialien für den lichtdurchlässigen, wasserundurchlässigen Träger sind Polyethylenterephthalat, Polystyrol und dergleichen.
Um eine hydrophile Schicht zuverlässig zu binden, wird im allgemeinen eine Grundierungsschicht auf den Träger aufgebracht oder die Oberfläche des Trägers wird einer hydrophilen Behandlung unterzogen. Andererseits kann der Träger ein lichtreflektierender oder lichtundurchlässiger (opaker) Film sein, wie ein weißer oder milchig-weißer opaker Polyethylenterephthalatfilm, in dem Titandioxidteilchen oder Bariumsulfatteilchen dispergiert enthalten sind.
Die wasserpermeable Reagensschicht des erfindungsgemäßen mehrschichtigen analytischen Elements vom Trockentyp kann eine im wesentlichen einheitliche, ein hydrophiles Polymer enthaltende Schicht oder eine poröse Schicht sein, wie sie beispielsweise in den japanischen Patenten KOKAI Nrn. 701635/1983, 4959/1986, 116258/1987, 138756/1987, 138757/1987 und 138758/1987 beschrieben sind. Das hydrophile Polymer kann aus Gelatine, Gelatinederivaten, wie phthalierter Gelatine, Cellulose, Agarose, Polyacrylamid, Polymethacrylamid, Copolymeren von Acrylamid oder Methacrylamid und unterschiedlichen Vinylmonomeren und dergleichen ausgewählt sein.
Das Material aus dem sich die poröse Schicht zusammensetzt, kann Filterpapier, Vliesstoff, gewebter Stoff, wie Stoff mit Leinwandbindung, gewirkter Stoff, wie Trikotstoff, Glasfaserfilterpapier oder dergleichen sein. Als Ausbreitungsschicht sind von diesen gewebte Stoffe und gewirkte Stoffe bevorzugt. Die gewebten Stoffe und dergleichen können mit Glimmentladungen behandelt werden, wie im japanischen Patent KOKAI Nr. 66359/1982 beschrieben. Ein hydrophiles Polymer oder ein oberflächenaktives Mittel kann in die Ausbreitungsschicht eingearbeitet sein, um die Ausbreitungsfläche, die Ausbreitungsgeschwindigkeit und dergleichen zu kontrollieren, wie in den japanischen Patenten KOKAI Nrn. 222770/1985, 219397/1988, 112999/1988 und 182652/1987 beschrieben.
Die Immunoassayreagensschicht ist wie oben angegeben eine wasserpermeable Schicht, die einen Teil oder alle der Hauptkomponenten der Immunoassay-Reagenszusammensetzung des erfindungsgemäßen analytischen Elements enthält. Diese sind:
A) das wasserlösliche makromolekulare Substrat,
B) das Enzym-Antikörper-Konjugat aus einem Enzym mit der Fähigkeit, auf das vorstehende wasserlösliche makromolekulare Substrat einzuwirken, mit einem Antikörper, der mit dem Liganden in der Probenflüssigkeit reagiert,
C) ein makromolekulares Antigen, das ein Konjugat des Liganden oder seines Derivats mit einer makromolekularen Verbindung ist.
Wenn das erfindungsgemäße analytische Element den zweiten Antikörper enthält, enthält auch diese Schicht einen Teil oder alles des zweiten Antikörpers. Die Immunoassayreagensschicht kann sich aus mehreren Schichten zusammensetzen, und in diesem Fall können die obigen Komponenten jeweils in unterschiedlichen Schichten getrennt vorliegen.
Im einzelnen kann das erfindungsgemäße mehrschichtige analytische Element vom Trockentyp, das Enzym-Antikörper-Konjugat (L1), das makromolekulare Antigen (L2) und das wasserlösliche makromolekulare Substrat (S) jeweils in den folgenden Ausführungsformen enthalten sein. Die Zahl im Kreis gibt die Nummer der Ausführungsform an. Reagensschicht A Reagensschicht B Reagensschicht C
Bei jeder Ausführungsform kann eine Ausbreitungsschicht auf der dem Träger gegenüberliegenden Seite der Reagensschicht angeordnet sein oder die Ausbreitungsschicht kann mit der Reagensschicht kombiniert werden. Eine weitere Reagensschicht, die ein oder mehrere von L1, L2 und S abweichende Reagenzien, wie ein Färbereagens, enthält, kann in jede der obigen Ausführungsformen 1 bis 16 eingearbeitet werden.
Die Reagensschicht kann einen Puffer, wie einen Carbonat-, einen Borat-, einen Phosphat-, Good's-Puffer, beschrieben in Biochemistry, Bd. 5, Nr. 2, S. 467-477 (1966) oder dergleichen, enthalten. Der Puffer kann entsprechend "Tanpakushitsu Koso no Kisojikken-Ho (Fundamental Experimentation Method of Proteins, Enzymes)" (Autoren: Horio et al., Nankodo, 1981) der obigen Biochemistry Literaturstelle, etc., ausgewählt werden.
Falls die poröse Schicht als Ausbreitungsschicht verwendet wird, hat die poröse Schicht vorzugsweise eine regulierende Wirkung, die darin besteht, daß eine auf die Ausbreitungsschicht getüpfelte Probe sich mit einer festgelegten Menge pro Flächeneinheit, ohne ungleichmäßige Verteilung irgendeiner Komponente in der Probe, in die lateralen Richtungen ausbreitet.
Eine Bindeschicht kann auf der Reagensschicht, der Lichtsperrschicht, der Filterschicht, der Wasserabsorptionsschicht, der Registrierungsschicht oder dergleichen, angeordnet sein, um eine poröse Schicht zu binden. Die Bindeschicht besteht vorzugsweise aus einem hydrophilen Polymeren, das in der Lage ist, eine poröse Schicht zu binden, wenn das Polymere im gequollenen Zustand ist, wie Gelatine, Gelatinederivate, Polyacrylamid oder Stärke.
Die lichtreflektierende Schicht schirmt die Farbe der auf die Ausbreitungsschicht getüptelten Probe, insbesondere die rote Farbe von Hämoglobin in einer Vollblutprobe, ab, wenn die optisch detektierbare Veränderung, wie Einfärbung oder Entfärbung, die in der Reagensschicht, Registrierungsschicht oder dergleichen stattfindet, durch Reflexionsphotometrie von der gegenüberliegenden Seite der Ausbreitungsschicht her gemessen wird. Zusätzlich wirkt sie auch als Hintergrundsschicht. Die lichtreflektierende Schicht ist vorzugsweise eine wasserpermeable Schicht, die aus einem hydrophilen Polymeren als Bindemittel besteht, worin lichtreflektierende Teilchen, wie Titandioxid oder Bariumsulfat, dispergiert sind. Bevorzugte hydrophile Polymere sind Gelatine, Gelatinederivate, Polyacrylamid, Stärke und dergleichen.
Die lichtreflektierenden Teilchen können auch in eine Ausbreitungsschicht, eine Reagensschicht, eine Registrierungsschicht oder dergleichen, zusätzlich zu oder anstelle von einer lichtreflektierenden Schicht eingearbeitet sein.
Das erfindungsgemäße analytische Element kann nach einer in den vorhergehenden Patenten beschriebenen bekannten Methode hergestellt werden.
Das erfindungsgemäße integrale mehrschichtige analytische Element wird vorzugsweise in quadratische Stücke mit einer Kantenlänge von etwa 15 mm bis etwa 30 mm oder in kreisförmige Stücke mit einer vergleichbaren Größe oder dergleichen geschnitten und in einen Rahmen eines Objektträgers, beschrieben in US-A-4 169 751, japanisches Patent KOKAI Nr. 63452/1982, US-A-4 387 990 und japanisches Gebrauchsmuster KOKAI Nr. 32350/1983, US-A-4 169 751, US-A-4 387 990, PCT- Anmeldung WO 83/00391, eingesetzt. Dieser analytische Objektträger ist hinsichtlich Herstellung, Verpackung, Transport, Lagerung, Meßvorgang und dergleichen bevorzugt. Andererseits kann das analytische Element in Form eines in einer Kassette oder einem Magazin verpackten langen Bandes oder in Form von kleinen Stücken, die auf eine Karte mit einer Öffnung aufgeklebt oder darin eingesetzt sind, geliefert werden.
Die Messung wird zum Beispiel auf die in den Beschreibungen der vorhergehenden Patente beschriebene Weise durchgeführt. Etwa 5 ul bis etwa 30 ul, vorzugsweise etwa 8 ul bis etwa 15 ul, einer wäßrigen Probe, wie Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Lymphe oder Urin, wird auf die Ausbreitungsschicht getüpfelt und bei einer definierten Temperatur im Bereich von etwa 20ºC bis etwa 40ºC, vorzugsweise etwa 37ºC oder in der Nähe davon, während etwa 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 2 bis 7 Minuten, inkubiert. Anschließend wird die in dem analytischen Element aufgetretene Einfärbung oder Entfärbung von der Trägerseite her durch Reflexionsphotometrie unter Verwendung von sichtbarem oder ultraviolettem Licht mit der Wellenlänge eines Absorptionsmaximums oder in dessen Nähe gemessen. Der Ligandengehalt der Probe wird nach dem Prinzip der Kolorimetrie bestimmt, wobei eine vorher erstellte Kalibrierungskurve verwendet wird. Statt dessen ist es auch möglich, daß die vom analytischen Element emittierte Fluoreszenzintensität gemessen wird, und der Ligandengehalt der Probe unter Verwendung einer vorher erstellten Kalibrierungskurve bestimmt wird. Eine quantitative Analyse des Liganden kann mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden, indem man die aufgetüpfelte Menge an flüssiger Probe, die Inkubationszeit und die Temperatur festlegt. Bei der Ausführungsform unter Verwendung eines lichtreflektierenden oder opaken Trägers wird die im analytischen Element aufgetretene Einfärbung oder Entfärbung von der Seite der obersten Schicht her, die die dem Träger entgegengesetzte Schicht ist, durch Reflexionsphotometrie gemessen.
Wenn diese Messung unter Verwendung des chemisch-analytischen Apparates, der in US-A-4 488 810, US-A-4 424 191 und US-A-4 424 191 beschrieben ist, durchgeführt wird, können problemlos Resultate hoher Genauigkeit durch ein einfaches Verfahren erhalten werden.

Beispiele

Beispiel 1

(1) Herstellung des Enzym-Antikörper-Konjugats

i) Herstellung von CHM-induzierter α-Amylase

5 mg Bacillus subtilis α-Amylase wurden in 1 ml 0,1 M Glycerophosphatpufferlösung vom pH 6,3 gelöst. 100 ul einer 350 mg/ml Dimethylformamid-(DMF)-Lösung von 4-Maleimidomethylcyclohexan-1-carbonsäure-N-hydroxysuccinimidester (CHMS) wurde zu dieser α-Amylaselösung gegeben und bei Raumtemperatur eine Stunde lang stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde in eine Sephadex®G-25-Säule gegeben, und eine Gelfiltration wurde unter Verwendung von 0,1 M Glycerophosphatpufferlösung vom pH 7,0 durchgeführt. Die Ausschluß-Fraktionen wurden gesammelt, um die gewünschte CHM-induzierte α-Amylase zu erhalten.

ii) Herstellung von Anti-Theophyllin-Maus-IgG F(ab')&sub2;

300 ug Papain wurden zu 2 ml 0,1 M Acetatpufferlösung vom pH 5,5, die 10 mg Anti-Theophyllin-Maus-IgG enthielt, gegeben und bei 37ºC 18 Stunden lang gerührt. Diese durch Zugabe von 0,1 N NaOH auf pH 6,0 eingestellte Reaktionslösung wurde in eine-vorher mit 0,1 M Phosphat-gepufferter 1 mM EDTA-Lösung vom pH 6,3 equilibrierte AcA-44-Gelsäule gegeben und mit der obigen Phosphatpufferlösung eluiert. Der im Bereich des Molekulargewichts von 100.000 eluierte Peakanteil wurde gesammelt und auf 1 ml konzentriert, um das angestrebte Anti- Theophyllin-Maus-IgG F(ab')&sub2; zu erhalten.

iii) Herstellung des α-Amylase-Anti-Theophyllin-Maus-IgG Fab'-Konjugats

1 ml 0,1 M Phosphat-gepufferter 1 mM EDTA-Lösung vom pH 6,0, die 6 mg des obigen Anti-Theophyllin-Maus-IgG F(ab')&sub2; enthielt, wurde mit 100 ul einer 10 mg/ml wäßrigen Lösung von 2-Mercaptoethylaminhydrochlorid gemischt und bei 37ºC 90 Minuten lang stehengelassen. Unter Verwendung einer vorher mit 0,1 M Glycerophosphatpufferlösung vom pH 7 equilibrierten Sephadex®G-25-Säule wurde eine Gelfiltration durchgeführt, und nicht-umgesetztes 2-Mercaptoethylamin wurde entfernt, um HS-Fab' zu erhalten. 2 mg der unter Punkt i) hergestellten CHM-induzierten α-Amylase wurden zugegeben und bei 37ºC 90 Minuten lang reagieren gelassen. Anschließend wurde diese Reaktionslösung unter Verwendung einer mit 0,1 M Glycerophosphat-gepufferter 5 mM Calciumchloridlösung vom pH 7,0 equilibrierten AcA-34-Säule durch Gelfiltration aufgetrennt, und die Molekulargewichten von mehr als 200.000 entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden aufkonzentriert, um das angestrebte Konjugat zu erhalten.

(2) Synthese des makromolekularen Antigens (Pferde-Ferritin- Theophyllin-Konjugat)

5 mg in 1 ml Dimethylformamid (DMF) gelöstes 8-Propylcarboxytheophyllin wurden mit 3 mg N-Hydroxysuccinimid und 5 mg wasserlöslichem Carbodiimid gemischt und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt, um aktiviertes Theophyllin zu erhalten. 500 ul der obigen aktivierten Theophyllinlösung wurden zu 10 mg in 1 ml 0,1 M wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gelöstem Pferde-Ferritin gegeben und bei Raumtemperatur eine Stunde lang stehengelassen. Nicht-umgesetzte Substanzen wurden mit Hilfe einer vorher mit einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung von pH 7,0 equilibrierten Sephadex® G-25- Gelsäule entfernt, um 9 mg des angestrebten makromolekularen Antigens des Pferde-Ferritin-Theophyllin-Konjugats zu erhalten.

(3) Herstellung eines analytischen Elements vom Trockentyp

Auf einen 180 um dicken farblosen transparenten Polyethylenterephthalat-(PET)-Folienträger, der mit einer Gelatinegrundierungsschicht versehen war, wurde die folgende wäßrige Lösung appliziert, um zu der folgenden Menge an Beschichtung zu führen. Sie wurde getrocknet, um eine Vernetzungsagensenthaltende Wasserabsorptionsschicht zu bilden.
Alkali-behandelte Gelatine 6,6 g/m²
Nonylphenoxypolyglycidol 330 mg/m² (enthält im Mittel 10 Glycidoleinheiten)
Bis [(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]methan 380 mg/m²
Auf die Vernetzungsagens-enthaltende Wasserabsorptionsschicht wurde die folgende wäßrige Suspension appliziert, um zu der folgenden Menge an Beschichtung zu führen. Sie wurde getrocknet, um eine Registrierungsschicht zu bilden.
Säurebehandelte Gelatine 10 g/m²
Wäßriges Polymerlatex (1)* 3 g/m² (10% Feststoffgehalt)
Nonylphenoxypolyglycidol 2 g/m² (enthält im Mittel 10 Glycidoleinheiten)
* [(p-Divinylbenzol)·(Styrol)y((1-piperidininmethyl)styrolchlorid)w]terpolymer x:y:w = 5 : 47,5 : 47,5
Auf die Registrierungsschicht wurde die folgende wäßrige Suspension appliziert, um zu der folgenden Menge an Beschichtung zu führen. Sie wurde getrocknet, um eine Lichtsperrschicht mit einer Trockendicke von 7 um zu bilden.
Alkali-behandelte Gelatine 2,9 g/m²
Titandioxidteilchen vom Rutiltyp 13 g/m²
Nonylphenoxypolyglycidol 400 mg/m² (enthält im Mittel 10 Glycidoleinheiten)
Auf die Lichtsperrschicht wurde die folgende wäßrige Lösung appliziert, um zu der folgenden Menge an Beschichtung zu werden. Sie wurde getrocknet, um eine Bindeschicht mit einer Trockendicke von 5 um zu bilden.
Alkali-behandelte Gelatine 6,7 g/m²
Nonylphenoxypolyglycidol 600 mg/m² (enthält im Mittel 10 Glycidoleinheiten)
Die Oberfläche der Bindeschicht wurde gleichmäßig mit 30 g/m² Wasser befeuchtet, und ein etwa 250 um dicker durch Verstricken von gesponnenem 50 Denier PET-Garn unter Verwendung eines Gauge von 36 hergestellter Trikotstoff wurde leicht, fast gleichmäßig gepreßt, um ihn darauf als poröse Ausbreitungsschicht auf zulaminieren.
Anschließend wurde die folgende, ein Substrat und eine immunologische Reagenszusammensetzung enthaltende, wäßrige Lösung auf die poröse Ausbreitungsschicht aufgebracht und getrocknet.
DyAmyl (Handelsname einer Farbstoff- 3 g/m² gekuppelten Stärke)
Amylase-Anti-Theophyllin-Maus-IgG Fab' 4,0 mg/m²
Pferde -Ferritin-Theophyllin 4,2 mg/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol 500 mg/m² (enthält im Mittel 40 Hydroxyethyleneinheiten)
Das auf diese Weise hergestellte integrale mehrschichtige analytische Element für den Immunoassay wurde in quadratische Stückchen mit einer Kantenlänge von 15 mm geschnitten und jedes Stück wurde in einen, im japanischen Patent KOKAI Nr. 32350/1983 beschriebenen, Objektträgerrahmen eingesetzt, um einen mehrschichtigen analytischen Objektträger (1) für die Analyse von Theophyllin fertigzustellen.

(4) Evaluierungstest

20 ul einer 50 mM Glycerophosphatpufferlösung vom pH 7, die eine bekannte Menge an Theophyllin enthielt, wurde auf die Ausbreitungsschicht des obigen mehrschichtigen analytischen Objektträgers (1) für die Analyse von Theophyllin aufgetüpfelt. Nach 20minütigem Inkubieren bei 37ºC wurde die optische Reflexionsdichte bei 540 nm von der Trägerseite her gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
Durch die Kalibrierungskurve von Fig. 1 wurde gefunden, daß der Gehalt an Theophyllin durch das analytische Element vom Trockentyp für den Immunoassay für die Analyse von Theophyllin genau bestimmt werden kann.

Beispiel 2

(1) Herstellung des analytischen Elements vom Trockentyp

Die ein quervernetzendes Agens enthaltende Wasserabsorptionsschicht, die Registrierungsschicht, die Lichtsperrschicht und die Bindeschicht wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 nacheinander auf den Träger auf laminiert.
Die Oberfläche der Bindeschicht wurde gleichmäßig mit 30 g/m² Wasser befeuchtet, und ein Celluloseacetatmembranfilter mit einer nominellen Porengröße von 3,0 um und einer Dicke von etwa 140 um wurde darauf auf laminiert. Die folgende wäßrige Lösung wurde darauf aufgebracht, um eine poröse Reagensschicht zu bilden.
Amylase-Anti-Theophyllin-Maus-IgG Fab' 4,0 mg/m² (Beispiel (1))
Nonylphenoxypolyethoxyethanol 200 mg/m²
Ein etwa 250 um dicker Trikotstoff, der durch Verstricken von 50 Denier gesponnenem PET-Garn unter Verwendung eines Gauge von 36 hergestellt wurde, und der die folgende Zusammensetzung von Substrat und immunologischem Reagens enthielt, wurde auf die poröse Reagensschicht als poröse Ausbreitungsschicht auf laminiert.
DyAmyl (Handelsname) 3 g/m²
Pferde - Ferritin-Theophyllin 4,2 mg/m² (Beispiel 1 (2))
Nonylphenoxypolyethoxyethanol 500 mg/m²
Das auf diese Weise hergestellte integrale mehrschichtige analytische Element für den Immunoassay wurde in quadratische Stückchen mit einer Kantenlänge von 15 mm geschnitten und jedes Stückchen wurde in einen, im japanischen Patent KOKAI Nr. 32350/1983 beschriebenen, Objektträgerrahmen eingesetzt, um einen mehrschichtigen analytischen Objektträger (2) für die Analyse von Theophyllin fertigzustellen.

(2) Evaluierungstest

Unter Verwendung des obigen mehrschichtigen analytischen Objektträgers (2) wurde die Theophyllinkonzentration auf dieselbe Weise wie bei dem Evaluierungstest von Beispiel 1 gemessen, und die in Fig. 2 dargestellten Resultate wurden erhalten.
Durch die Kalibrierungskurve von Fig. 2 wurde gefunden, daß der Gehalt an Theophyllin durch das analytische Element vom Trockentyp für den Immunoassay für die Analyse von Theophyllin genau bestimmt werden kann.

Beispiel 3

(1) Herstellung des Enzym-Antikörper-Konjugats

i) Herstellung von Anti-Human-Ferritin-Ziege-IgG F(ab')&sub2;

0,5 mg Pepsin wurden zu 2 ml 0,1 M Acetatpufferlösung vom pH 4,2, die 10 mg Anti-Human-Ferritin-Ziegen-IgG enthielt, gegeben und bei 37ºC über Nacht gerührt. Diese durch Zugabe von 0,1 N NaOH auf pH 7,0 eingestellte Reaktionslösung wurde in eine AcA-44-Gelsäule gegeben, die vorher mit 0,1 M Phosphat-gepufferter 1 mM EDTA-Lösung vom pH 6,0 equilibriert worden war, und wurde mit der obigen Phosphatpufferlösung eluiert. Der im Bereich eines Molekulargewichts von 100.000 eluierte Peakanteil wurde gesammelt und auf 1 ml konzentriert, um das angestrebte Anti-Human-Ferritin-Ziege-IgG F(ab')&sub2; zu erhalten.

ii) Herstellung des α-Amylase-Anti-Human-Ferritin-Ziege-IgG Fab'-Konjugats

1 ml einer 6 mg des obigen Anti-Human-Ferritin-Ziege-IgG F(ab')&sub2; enthaltenden 0,1 M Phosphat-gepufferten 1 mM EDTA- Lösung vom pH 6,0 wurde mit 100 ul einer 0,1 M wäßrigen 2- Mercaptoethylaminhydrochlorid-Lösung gemischt und bei 37ºC 2 Stunden lang inkubiert. Eine Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex®G-25-Säule, die vorher mit 0,1 M Glycerophosphatpufferlösung vom pH 7,0 equilibriert worden war, wurde durchgeführt und nicht-umgesetztes 2-Mercaptoethylamin wurde entfernt, um 5 mg Fab'-SH zu erhalten. 0,62 mg der in Beispiel 1 (1)i) hergestellten CHM-induzierten α-Amylase wurde zu der Fab'-SH-Lösung gegeben und bei 4ºC über Nacht stehengelassen. Anschließend wurde diese Reaktionslösung mit PEG 20000 auf 1 ml konzentriert und dann durch Gelfiltration unter Verwendung einer Sephacryl®S-300 Säule, die mit 0,1 M Glycerophosphat-gepufferter 5 mM Calciumchloridlösung vom pH 7 equilibriert worden war, getrennt. Die Molekulargewichten von etwa 200.000 bis etwa 300.000 Dalton entsprechenden Proteinfraktionen wurden gesammelt, um das angestrebte Konjugat zu erhalten.

(2) Herstellung eines analytischen Elements vom Trockentyp

Ein analytisches Element vom Trockentyp wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, mit Ausnahme des Substrats und der Zusammensetzung des immunologischen Reagens.
Die folgende, Substrat und immunologische Reagenszusammensetzung enthaltende, wäßrige Lösung wurde auf die poröse Ausbreitungsschicht aufgebracht und getrocknet.
DyAmyl (Handelsname) 3,5 g/m²
α-Amylase-Anti-Human-Ferritin-Ziege-IgG Fab' 1 mg/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol 500 mg/m² (enthält im Mittel 40 Hydroxyethyleneinheiten)
Das auf diese Weise hergestellte integrale mehrschichtige analytische Element für den Immunoassay wurde in quadratische Stückchen mit einer Kantenlänge von 15 mm geschnitten und jedes Stückchen wurde in einen, im japanischen Patent KOKAT Nr. 32350/1983 beschriebenen, Objektträgerrahmen eingesetzt, um einen mehrschichtigen analytischen Objektträger (3) für die Analyse von Ferritin fertigzustellen.

(3) Evaluierungstest

10 ul einer 50 mM Glycerophosphatpufferlösung vom pH 7,0, die eine bekannte Menge an Ferritin enthielt, wurde auf die Ausbreitungsschicht des obigen mehrschichtigen analytischen Objektträgers (3) für die Analyse von Ferritin getüpfelt. Nach 30minütigem Inkubieren bei 37ºC wurde die optische Reflexionsdichte bei 540 nm von der Trägerseite her gemessen. Die Resultate sind in Fig. 3 dargestellt.
Durch die Kalibrierungskurve von Fig. 3 wurde gefunden, daß der Gehalt an Ferritin mit dem analytischen Element vom Trockentyp für den Immunoassay für die Analyse von Ferritin genau bestimmt werden kann.

Beispiel 4

(1) Herstellung des analytischen Elements vom Trockentyp

Ein analytisches Element vom Trockentyp wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 hergestellt, außer daß die folgenden Reagentien als das Reagens verwendet wurden, das in die poröse Reagensschicht und die poröse Ausbreitungsschicht eingearbeitet wurde.
Die folgende Reagenszusammensetzung wurde auf die poröse Reagensschicht aufgebracht und getrocknet.
DyAmyl (Handelsname) 3,5 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol 100 mg/m² (enthält im Mittel 10 Hydroxyethyleneinheiten)
Die folgende immunologische Reagenszusammensetzung wurde in die poröse Ausbreitungsschicht eingearbeitet.
α-Amylase-Anti-Human-Ferritin-Ziege-IgG Fab' 2 mg/m² (Beispiel 3 (1))
Nonylphenoxypolyethoxyethanol 500 mg/m²
Das auf diese Weise hergestellte integrale mehrschichtige analytische Element für den Immunoassay wurde in quadratische Stückchen mit einer Kantenlänge von 15 mm geschnitten und jedes Stückchen wurde in einen, im japanischen Patent KOKAI Nr. 32350/1983 beschriebenen, Objektträgerrahmen gesetzt, um einen mehrschichtigen analytischen Objektträger (4) für die Analyse von Ferritin zu vervollständigen.

(2) Evaluierungstest

Unter Verwendung des obigen mehrschichtigen analytischen Objektträgers (4) wurde die Ferritinkonzentration auf dieselbe Weise wie im Evaluierungsstest von Beispiel (3) gemessen, und die in Fig. 4 gezeigten Resultate wurden erhalten.
Durch die Kalibrierungskurve von Fig. 4 wurde gefunden, daß der Gehalt an Ferritin mit dem analytischen Element vom Trockentyp für den Immunoassay für die Analyse von Ferritin genau bestimmt werden kann.

Claims

1. Mehrschichtiges analytisches Element vom Trockentyp für den Immunoassay, umfassend eine wasserpermeable Reagensschicht zur Messung eines Liganden in einer Probenflüssigkeit gemäß einem Enzymimmunoassay, wobei die Schicht

(A) ein wasserlösliches makromolekulares Substrat und

(B) ein Enzym-Antikörper-Konjugat aus einem Enzym mit der Fähigkeit, auf das vorstehende wasserlösliche makromolekulare Substrat einzuwirken, mit einem Antikörper, der mit dem Liganden in der Probenflüssigkeit reagiert,

enthält.

2. Analytisches Element nach Anspruch 1 mit mindestens einer weiteren wasserpermeablen Schicht, wobei mindestens eine der wasserpermeablen Schichten eine poröse Schicht ist.

3. Analytisches Element nach Anspruch 1 oder 2, umfassend weiterhin einen zweiten Antikörper, der eine andere antigene Determinante in dem gleichen Liganden erkennt, die sich von der antigenen Determinante, die von dem Antikörper des Konjugats in der Reagensschicht erkannt wird, unterscheidet.

4. Analytisches Element nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend weiterhin

(C) ein makromolekulares Antigen, das ein Konjugat des Liganden oder seines Derivats mit einer makromolekularen Verbindung in der Reagensschicht ist.

5. Analytisches Element nach Anspruch 1 oder 2, worin die Reagensschicht eine poröse Ausbreitungsschicht ist.