DE68918504T2 - Analyseelement vom Trockentyp für einen Immuntest. - Google Patents
Analyseelement vom Trockentyp für einen Immuntest.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein immunologisch nützliches, mehrschichtiges, analytisches Element vom Trockentyp für einen Enzymimmunoassay unter Verwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion.
- Verschiedene Verfahren sind bekannt, um biochemische Substanzen, die in einer Körperflüssigkeit oder dgl. enthalten sind, zu bestimmen und darunter ist der Enzymimmunoassay als ein Verfahren bekannt, das sie mit einer relativ hohen Empfindlichkeit messen kann. Andererseits wurde das Verfahren der Verwendung eines analytischen Elements vom Trockentyp ebenfalls im Hinblick auf die Empfindlichkeit und Schnelligkeit entwickelt USP 4 292 272, USP 3 992 158, DE 33 43 695A etc.). Es war zweckmäßig, ein analytisches Element vom Trockentyp für einen Immunoassay zu entwickeln, bei dem sowohl die Nachteile des Verfahrens mit einem analytischen Element vom Trockentyp, als auch eines Enzymimmunoassays beseitigt werden, indem man sie kombiniert. Darauf versuchten die Erfinder den Enzymimmunoassay unter Verwendung eines wasserunlöslichen, makromolekularen Substrats als Substrat für ein Enzym-Antikörper- Konjugat, wie in den japanischen Patenten KOKAI Nrn. 80049/1986 und 80050/1986 beschrieben, in ein analytisches Element vom Trockentyp einzuarbeiten. Nach sorgfältiger Durchführung verschiedener Untersuchungen gelang es ihnen, ein analytisches Element vom Trockentyp für einen Immunoassay zu vollenden, bei dem ein wasserunlösliches, makromolekulares Material als Substrat und ein Enzym-Antikörper-Konjugat eingearbeitet sind. Als Ergebnis fanden sie, daß das analytische Element keine komplizierten Arbeitsschritte, wie Zentrifugation des Substrats oder eine Vorreaktion, wie eine Antigen-Antikörper-Reaktion, benötigt und rasch durch einen einfachen Verfahrensschritt analysieren kann. Die EP-A- 0 310 940, die zum Stand der Technik nach Art. 54(3) EPC gehört, offenbart ein analytisches Element, das sich von dem erfindungsgemäßen, analytischen Element dahingehend unterscheidet, daß das makromolekulare Substrat wasserlöslich statt wasserunlöslich ist.
- Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein analytisches Element vom Trockentyp für einen Immunoassay bereitzustellen, das einen Enzymimmunoassay mit hoher-Empfindlichkeit durch einen einfachen Arbeitsschritt durchführen kann.
- Die vorstehende Aufgabe wurde durch ein mehrschichtiges, analytisches Element vom Trockentyp für einen Immunoassay gelöst, das mindestens eine wasserpermeable Schicht zur Messung eines Liganden in einer flüssigen Probe gemäß einem Enzymimmunoassay besitzt, wobei die Schicht
- (A) ein wasserunlösliches, makromolekulares Substrat, und
- (B) einen Antikörper, der mit dem Liganden in der Probe reagiert, der mit einem Enzym konjugiert ist, das auf das wasserunlösliche, makromolekulare Substrat einwirken kann, besitzt.
- Die vorstehende Aufgabe wurde auch durch ein mehrschichtiges, analytisches Element vom Trockentyp gelöst, welches weiterhin
- (C) eine makromolekulare Substanz, die ein Konjugat des Liganden oder ein Derivat davon mit einer makromolekularen Verbindung ist, in der vorstehenden wasserpermeablen Schicht des vorstehenden analytischen Elements vom Trockentyp enthält.
- Die Fig. 1 zeigt eine Kalibrationskurve von Theophyllin, bei dem ein analytisches Element vom Trockentyp für den in Beispiel 1 erhaltenen Immunoassay verwendet wird.
- Die Fig. 2 zeigt eine Kalibrationskurve von Ferritin, bei der ein analytisches Element vom Trockentyp für den in Beispiel 2 erhaltenen Immunoassay verwendet wird.
- Die zu analysierenden Substanzen (Analyten) des erfindungsgemäßen, mehrschichtigen, analytischen Elements vom Trockentyp für den Immunoassay sind ein Ligand mit einer oder mehreren antigenen Determinanten, der in einer flüssigen Probe enthalten ist. Die Art der Probe ist nicht beschränkt und umfaßt humorale Flüssigkeiten, wie Vollblut, Plasma, Serum, Lymphe und Urin. Im Falle von Plasma, Serum, Lymphe und Urin ist eine spezielle Vorbehandlung üblicherweise nicht nötig, und die Probe kann direkt gemessen werden.
- Der Ligand besitzt eine oder mehrere antigene Determinanten und umfaßt verschiedene Antigene, die in Organen, Blut oder Urin vorkommen, wie medizinische Substanzen einschließlich Digoxin, Theophyllin, Phenobarbital, Phenytoin, Penicillin und Amidacin oder Hormone aus verschiedenen endocrinen Drüsen einschließlich Prostaglandin, Testosteron, Progesteron und Thyroxin oder Plasmaproteine einschließlich Immunglobulin und Albumin oder virale Antigene einschließlich des HB-Antigens, Bakterien oder krebsverwandte Antigene, wie α-Fetoprotein, ferritin und CEA. Das erfindungsgemäße, mehrschichtige, analytische Element vom Trockentyp für den Immunoassay ist besonders zur Messung eines Liganden mit einem hohen Molekulargewicht, beispielsweise mit einem Molekulargewicht von mehr als 20.000, effektiv.
- Ferner kann ein Ligand mit einem niedrigen Molekulargewicht, beispielsweise mit einem Molekulargewicht von weniger als 20.000, dadurch gemessen werden, daß man die makromolekulare Substanz, die ein Konjugat des Liganden oder dessen Derivat ist und eine makromolekulare Verbindung einarbeitet. Wenn die makromolekulare Substanz eingearbeitet wird, reagiert der mit dem Enzym konjugierte Antikörper kompetitiv mit einer antigenen Determinante des zu messenden Liganden und der des Liganden auf der makromolekularen Substanz.
- Der für den Liganden spezifische Antikörper kann nach einem bekannten Verfahren zur Produktion eines Antikörpers erhalten werden. Beispielsweise wird der Ligand oder ein Protein, das den Liganden bindet, im Gemisch mit einem Adjuvanz ein oder mehrere Male subkutan in die Rückenhaut, den Fußballen oder den Oberschenkelmuskel eines warmblütigen Tieres, wie eines Kaninchen, einer Ziege, eines Pferdes, eines Meerschweinchens oder eines Huhns in einer Menge von 0,3 bis 2 mg pro kg Gewicht injiziert, und dadurch wird der Antikörper in der humoralen Flüssigkeit produziert. Das Serum kann als der Antikörper verwendet werden, oder es kann nach einem bekannten Verfahren für einen Antikörper, d.h. Immunglobulin, aus dem Serum gereinigt werden.
- Andererseits kann dieser Antikörper als monoklonaler Antikörper erhalten werden. In diesem Falle wird der vorstehende Ligand oder das Protein, das den Liganden bindet, mit einem Adjuvanz vermischt und mehrere Male in die Bauchhöhle einer Maus injiziert, und deren Milz wird herausgeschnitten. Die Milzzelle wird mit einer Mausmyelomazelle nach einem herkömmlichen Verfahren, wie beispielsweise unter Verwendung von Polyethylenglykol, fusioniert. Das so erhaltene Hybridom wird gezüchtet und cloniert, und die Zelle mit der Fähigkeit, den gewünschten Antikörper zu produzieren, wird ausgewählt. Diese Zelle wird in die Bauchhöhle einer Maus injiziert und vermehrt. Dann werden die Ascitesflüssigkeiten gewonnen und der gewünschte Antikörper wird aus den Ascitesflüssigkeiten gereinigt. Der Antikörper kann dessen Fragment sein, wie beispielsweise F(ab')&sub2;, Fab' oder fab.
- Anschließend wirkt das an den Antikörper gebundene Enzym auf das wasserlösliche, makromolekulare Substrat ein. Es ist zweckdienlich, das Enzym zu verwenden, dessen Aktivität leicht gemessen werden kann. Diese umfassen Amylase, Dextranase, Cellulase, Collagenase, Mannase, Protease, Elastase, Lipase und Glukoamylase.
- Das wasserunlösliche, makromolekulare Substrat, auf das das Enzym einwirkt, umfaßt Substrate des Enzyms, wie Stärke, Amylose, Amylopectin, Peptid und Cellulose, und Beispiele anderer wasserunlöslicher Substrate sind in "Koso (Enzyme) Handbook" (herausgegeben von Maruo et al., Asakura-Shoten, Tokyo, 1982) und "Seikagaku (Biochemical) Handbook" (herausgegeben von The Japanese Biochemical Society, Maruzen, Tokyo, 1980) beschrieben.
- Eine direkt oder indirekt nachweisbare funktionelle Gruppe oder Verbindung kann an das makromolekulare Substrat gebunden werden. Die direkt oder indirekt nachweisbare funktionelle Gruppe oder Verbindung umfaßt die Verbindungen mit einem Farbstoffanteil und Verbindungen mit der Fähigkeit, Fluoreszenz oder Lumineszenz zu produzieren. Sie kann eine farbstoffbildende Verbindung, wie ein Kuppler, wie in der US-PS 4 268 628, dem japanischen Patent KOKAI Nr. 59-30063 beschrieben, oder dgl. sein. Bezüglich der Mittel zum Nachweis des vorstehenden Substrats mit der direkt oder indirekt nachweisbaren funktionellen Gruppe oder Verbindung eignet sich eine optische Messung des transmittierten oder reflektierten Lichts bei einer maximalen Absorptionswellenlänge, während visuelle Beobachtung gemäß der benötigten Aufgabe oder Genauigkeit verwendet werden kann. Die optische Messung der Fluoreszenz oder Lumineszenz wird bevorzugt in der Nähe der Hauptwellenlänge der Fluoreszenz oder Lumineszenz durchgeführt. Das Bindungsverfahren der funktionellen Gruppe oder Verbindung an das makromolekulare Substrat kann aus den Verfahren, bei denen ein Reaktivfarbstoff, der in "The Chemistry of Synthetic Dyes", Band 6 (herausgegeben von K. Venkatarman, Academic Press, 1972), den Verfahren, die in der US-PS 4 268 628, den japanischen Patent KOKAI Nr. 59-30063 oder dgl. beschrieben sind, ausgewählt werden. Ein bevorzugtes Substrat mit einer direkt oder indirekt nachweisbaren funktionellen Gruppe oder Verbindung ist farbstoffmarkierte Stärke, die chemisch gebundene und gefärbte Stärke ist.
- Das Verfahren zur Bindung des Enzyms und des Antikörpers kann hinsichtlich der funktionellen Gruppen beider Substanzen ausgewählt werden. Solche funktionellen Gruppen umfassen Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, Thiolgruppen, Imidazolylgruppen, Phenylgruppen und dgl. Hinsichtlich des Verfahrens zur Bindung der Aminogruppen sind viele Verfahren bekannt, wie das Diisocyanatverfahren, das Glutaraldehydverfahren, das Difluorbenzolverfahren, das Benzochinonverfahren und dgl. Hinsichtlich des Verfahrens zur Bindung der Aminogruppe an die Carboxylgruppe sind das Verfahren der Peptidbindung der Carboxylgruppe an einen Succinimidester, das Carbodiimidverfahren, das Woodward-Reagenzverfahren und dgl. bekannt. Das Periodatoxidationsverfahren (Nakane-Verfahren), bei dem eine Brücke zwischen der Aminogruppe und der Zuckerkette gebildet wird, wird ebenfalls verwendet. Im falle der Verwendung einer Thiolgruppe beispielsweise wird eine Carboxylgruppe zuerst in einen Succinimidester umgewandelt, und diese Estergruppe läßt man dann mit Cystein reagieren, wodurch die Thiolgruppe induziert wird, und beide Thiolgruppen werden unter Verwendung eines bifunktionellen, thiolreaktiven Vernetzungsmittels, wie Phenylenbismaleimid, gebunden. Hinsichtlich des Verfahrens der Verwendung einer Phenylgruppe werden das Diazotisierungsverfahren und das Alkylierungsverfahren verwendet. Außer den vorstehenden Verfahren kann ein geeignetes Verfahren aus den verschiedenen Verfahren, die in "Method in Immunology and Immunochemistry" (C. A. Williams et al., Academic Press, N.Y., 1976) und "Koso Meneki Sokutei-ho" (Enzyme Immunoassay)" (E. Ishikawa et al., Igaku-Shoin, Japan, 1978) beschrieben sind, ausgewählt werden. Das Molverhältnis der Bindung ist nicht auf 1:1 beschränkt und geeignete Verhältnisse können ausgewählt werden. Nach der Bindungsreaktion wird der mit dem Enzym konjugierte Antikörper durch Gelfiltration, Ionenaustauschchromatografie oder Affinitätschromatografie oder eine Kombination davon gereinigt und ggf. lyophilisiert.
- Wenn andererseits die Probe ein Enzym der gleichen Art wie das Enzym des Konjugats enthält, ist es bevorzugt, daß ein Enzyminhibitor, dessen Grad zur Hemmung des Enzyms in der Probe größer ist als der Grad zur Hemmung des Enzyms des Konjugats, mit dem Enzym in der Probe in Kontakt gelassen wird.
- Der zweckmäßigste Enzyminhibitor inaktiviert das Enzym, das in der Probe enthalten ist und hemmt das Enzym des Konjugats nicht. Jedoch ist es praktisch ausreichend, daß der Leerwert während der Messung nicht ansteigt und daß die Enzymaktivität nach der Messung wiedergewonnen werden kann, beispielsweise durch Inaktivierung des Enzyminhibitors. Der Enzyminhibitor kann das freie Enzym, aber nicht das an den Antikörper gebundene Enzym inaktivieren. Der Enzyminhibitor kann ein bekannter Enzyminhibitor mit einer solchen Spezifität sein. Abgesehen davon, wenn das Enzym, das in der Probe enthalten ist, einem fremden warmblütigen Tier injiziert wird, um den Antikörper gegen das Enzym zu produzieren, kann dieser Antikörper ebenfalls als Enzyminhibitor verwendet werden. Die Produktion des Antikörpers kann nach dem vorstehend erwähnten Verfahren durchgeführt werden.
- Wenn die Erniedrigung der Enzymaktivität durch Bindung des Liganden an das Konjugat im Falle der Messung eines Liganden mit hohem Molekulargewicht nicht ausreicht, ist es bevorzugt, einen anderen Antikörper, d.h. einen zweiten Antikörper, zu verwenden, der für eine antigene Determinante in dem gleichen Liganden spezifisch ist, die sich von der gegen den mit dem Enzym konjugierten Antikörper unterscheidet. Hinsichtlich des zweiten Antikörpers wird beispielsweise eine Maus mit einem Antigen immunisiert, um monoclonale Antikörper zu erhalten und zwei oder mehrere Arten der Antikörper, die mit verschiedenen antigenen Determinanten in dem Liganden reagieren, werden isoliert. Dann kann eine der verschiedenen Antikörper als der zweite Antikörper verwendet werden.
- Ein Ligand mit einem niedrigen Molekulargewicht kann durch Zugabe der makromolekularen Substanz, die ein Konjugat aus dem Liganden oder dessen Derivat mit einer makromolekularen Verbindung ist, in der wasserpermeablen Schicht des erfindungsgemäßen, mehrschichtigen, analytischen Elements vom Trockentyp für den erfindungsgemäßen Immunoassay, welcher das wasserunlösliche, molekulare Substrat und den mit dem Enzym konjugierten Antikörper enthält, gemessen werden. Der Ligand zur Herstellung des makromolekularen Antigens besitzt eine oder mehrere antigene Determinanten, die dem Liganden in der Probe gemeinsam sind, und es ist üblicherweise die gleiche Substanz, wie der Ligand in der Probe. Das Derivat des Liganden umfaßt die Verbindungen, die eine Aminogruppe, Carboxylgruppe, Thiolgruppe oder dgl., eingeführt in den Liganden besitzen und beispielsweise ist 8-Propylcarboxytheophyllin ein Derivat von Theophyllin.
- Abgesehen davon kann das Derivat des Liganden ein Derivat einer kreuzreagierenden Verbindung für den Antikörper gegen den Liganden sein. Wenn beispielsweise der theophyllinspezifische Antikörper, der mit Coffein kreuzreagierende Ligand ist, kann ein Coffeinderivat als Theophyllinderivat verwendet werden.
- In dem makromolekularen Antigen sind wasserlösliche, makromolekulare Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100.000 Dalton als makromolekulare Verbindung, die an den Liganden oder dessen Derivat gebunden ist, geeignet. Beispiele für eine solche makromolekulare Verbindung umfassen Polysaccharide und ihre Derivate, wie lösliches Dextran, Carboxymethyldextran, dextraninduzierte Aminogruppe und Amylose oder Proteine, wie Gelatine, Hämocyanin und ferritin oder Polyethylenglykol. Sie können ausreichend sein, um die vorstehend erwähnten Bedingungen in einem an den Liganden oder dessen Derivat gebundenen Zustand zu erfüllen und umfassen beispielsweise ein Polymeres eines relativ kleinen Moleküls wie Rinderserumalbumin.
- Die makromolekulare Substanz kann auch ein Polymeres des Liganden oder dessen Derivat sein. Das Polymerisationsverfahren kann aus den folgenden Bindungsverfahren des Liganden oder dessen Derivat an die makromolekulare Verbindung ausgewählt werden und beispielsweise kann der Ligand oder dessen Derivat unter Verwendung eines bifunktionellen Vernetzungsreagenses, wie Carbodiimid, Glutaraldehyd oder dgl., polymerisiert werden.
- Das Bindungsverfahren des Liganden oder dessen Derivat an die makromolekulare Verbindung kann durch Berücksichtigung der funktionellen Gruppen beider Substanzen ausgewählt werden. Solche funktionellen Gruppen umfassen Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, Thiolgruppen, Imidazolylgruppen, Phenylgruppen und dgl., und das Verfahren zur Bindung dieser Gruppen kann aus den vorstehend erwähnten Verfahren zur Bindung des Enzyms an den Antikörper ausgewählt werden. Das Molverhältnis der Bindung ist nicht auf 1:1 beschränkt und geeignete Verhältnisse können ausgewählt werden. Nach der Bindungsreaktion wird das produzierte Konjugat durch Gelfiltration, Ionenaustauschchromatografie, Affinitätschromatografie oder eine Kombination daraus gereinigt und ggf. lyophilisiert.
- Das erfindungsgemäße, mehrschichtige, analytische Element vom trockenen Typ kann einen ähnlichen Schichtenaufbau wie verschiedene bekannte, mehrschichtige, analytische Elemente vom Trockentyp besitzen, wie beispielsweise ein mehrschichtiges Element, das nicht nur die poröse Schicht und/oder die Reagensschicht, wie nachstehend beschrieben, sondern auch einen Träger, eine Ausbreitungsschicht, eine Registrierschicht, eine Lichtblockierschicht oder eine Lichtreflexionssschicht, eine Adhäsionsschicht, eine Filterschicht, Wasserabsorptionsschicht, eine Unterzugsschicht und dgl., enthält. Beispiele für das analytische Element mit einem solchen Schichtenaufbau sind beispielsweise in der US-PS-3 992 158 und US-PS 4 292 272 offenbart.
- Im falle der Verwendung eines lichtdurchlässigen, wasserundurchlässigen Trägers sind die folgenden Schichtenaufbaue praktisch auf das erfindungsgemäße, mehrschichtige, analytische Element vom Trockentyp für den Immunoassay verwendbar. Jedoch ist der Schichtenaufbau nicht darauf beschränkt.
- (1) Eine Ausbreitungsschicht, eine Reagensschicht und der Träger, in dieser Reihenfolge aufeinander angebracht.
- (2) Eine Ausbreitungsschicht, eine Reagensschicht, eine Registrierschicht und der Träger, in dieser Reihenfolge aufeinander angebracht.
- (3) Eine Ausbreitungsschicht, eine Lichtreflexionsschicht, eine Reagensschicht und der Träger, in dieser Reihenfolge aufeinander angeordnet.
- (4) Eine Ausbreitungsschicht, eine Lichtreflexionsschicht, eine Reagensschicht, eine Registrierschicht und der Träger, in dieser Reihenfolge aufeinander angebracht.
- (5) Eine Ausbreitungsschicht, eine Reagensschicht, eine Lichtreflexionsschicht, eine Registrierschicht und der Träger, in dieser Reihenfolge aufeinander angebracht.
- (6) Eine Ausbreitungsschicht, eine erste Reagensschicht, eine Lichtreflexionsschicht, eine zweite Reagensschicht und der Träger, in dieser Reihenfolge aufeinander angebracht.
- (7) Eine Ausbreitungsschicht, eine erste Reagensschicht, eine Lichtreflexionsschicht, eine zweite Reagensschicht, eine Registrierschicht und der Träger, in dieser Reihenfolge aufeinander angebracht.
- (8) Eine das Immunoassayreagens enthaltende Ausbreitungsschicht, eine Registrierschicht und der Träger, in dieser Reihenfolge aufeinander angebracht.
- (9) Eine das Immunoassayreagens enthaltende Ausbreitungsschicht, eine Lichtreflexionsschicht, eine Registrierschicht und der Träger, in dieser Reihenfolge aufeinander angebracht.
- Bei dem vorstehenden Schichtenaufbau (1) bis (5) kann die Reagensschicht aus mehreren verschiedenen Schichten zusammengesetzt sein. Abgesehen davon kann die Reagensschicht eine Immunoassayreagensschicht, die die Komponente(n), die bei der immunologischen Reaktion reagiert bzw. reagieren, enthält, sein. Eine Wasserabsorptionsschicht kann zwischen der Reagensschicht oder der Registrierschicht und dem Träger angeordnet sein. Bei dem vorstehenden Schichtenaufbau (1) bis (3) und (6) kann eine Filterschicht zwischen der Reagensschicht und der Ausbreitungsschicht oder der Registrierschicht vorhanden sein. Bei dem vorstehenden Schichtenaufbau (3) bis (6) kann eine Filterschicht zwischen der lichtreflektierenden Schicht und der Ausbreitungsschicht, der Reagensschicht oder der Registrierschicht zwischen der Reagensschicht und der Registrierschicht oder zwischen der Ausbreitungsschicht und der Reagensschicht vorhanden sein. Wenn die Reagensschicht aus zwei oder mehreren Schichten besteht, kann eine filterschicht zwischen einer Reagensschicht und einer anderen Reagensschicht vorhanden sein. Die Reagensschicht oder die Registrierschicht kann eine poröse Reagensschicht oder eine poröse Registrierschicht, die der porösen Schicht, wie nachstehend beschrieben, ähnlich ist, sein.
- Bevorzugte Materialien für den lichtdurchlässigen, wasserundurchlässigen Träger sind Polyethylenterephthalat, Polystyrol und dgl.
- Um eine hydrophile Schicht sicher zu binden, wird bevorzugt eine Unterzugsschicht auf dem Träger angebracht oder die Oberfläche des Trägers wird mit einer hydrophilen Behandlung behandelt. Andererseits kann der Träger eine lichtreflektierende oder lichtundurchlässige (opake) Schicht sein, wie ein weißer oder milchweißer, opaker Polyethylenterephthalatfilm, der teilchenförmiges Titandioxid oder teilchenförmiges Bariumsulfat darin dispergiert, enthält.
- Die wasserpermeable Schicht des erfindungsgemäßen, mehrschichtigen, analytischen Elements des Trockentyps kann eine im wesentichen gleichförmige Schicht sein, die ein hydrophiles Polymeres oder eine poröse Schicht enthält, und ist beispielsweise in der EP-O 166 365A, EP-O 226 465A, den japanischen Patenten KOKAI Nrn. 701635/1983 und 116258/1987 offenbart. Das hydrophile Polymere kann aus Gelatine, Gelatinederivaten, wie phthalierte Gelatine, Cellulose, Agarose, Polyacrylamid, Polymethacrylamid, Copolymeren von Acrylamid oder Methacrylamid und verschiedenen Vinylmonomeren und dgl. ausgewählt sein.
- Das Material, aus dem die poröse Schicht besteht, kann Filterpapier, nicht-gewirktes Flächengebilde, gewirktes Flächengebilde, wie ein glattgewebtes Tuch, gewirktes Tuch, wie Trikotgewebe, Glasfaserfilterpapier oder dgl. sein. Als Ausbreitungsschicht sind gewirkte und gestrickte Flächengebilde davon bevorzugt. Die gewirkten Flächengebilde und dgl. können mit einer Glimmentladung, wie in der GB 2 087 074A beschrieben, behandelt sein. Ein hydrophiles Polymeres oder ein grenzflächenaktives Mittel kann in die Ausbreitungsschicht eingearbeitet werden, um die Ausbreitungsfläche, die Ausbreitungsgeschwindigkeit und dgl. zu kontrollieren, wie in der EP 0 162 301A und der DE 37 17 913A offenbart ist.
- Die Immunoassayreagensschicht ist eine wasserpermeable Schicht, die einen Teil oder die Gesamtheit der Hauptkomponenten der Immunoassayreagenszusammensetzung in dem erfindungsgemäßen analytischen Element enthält, die sind:
- (A) das wasserunlösliche, makromolekulare Substrat,
- (B) ein Antikörper, der mit dem Liganden in der Probe reagiert, mit einem Enzym konjugiert ist, das auf das vorstehende wasserunlösliche, makromolekulare Substrat wirken kann,
- (C) die makromolekulare Substanz, die ein Konjugat des Liganden oder seines Derivats mit einer makromolekularen Verbindung ist.
- Wenn das erfindungsgemäße analytische Element den zweiten Antikörper enthält, enthält diese Schicht auch einen Teil oder die Gesamtmenge des zweiten Antikörpers. Ein geeigneter Gehalt des makromolekularen Antigens beträgt etwa 0,1 bis 100 mg/m², bevorzugt etwa 1 bis 10 mg/m²; ein geeigneter Gehalt des wasserunlöslichen, makromolekularen Substrats beträgt etwa 1 mg/m² bis etwa 20 g/m², bevorzugt etwa 4 bis 10 g/m² und ein geeigneter Gehalt des Enzym-Antikörper-Konjugats beträgt etwa 0,1 bis 100 mg/m², bevorzugt etwa 1 bis 10 mg/m². Die Immunoassayreagensschicht kann aus mehreren Schichten bestehen, und in diesem falle können die vorstehenden jeweiligen Komponenten in verschiedene Schichten aufgetrennt sein.
- Genauer kann das erfindungsgemäße, mehrschichtige, analytische Element vom Trockentyp jeden Bestandteil des Enzym-Antikörper-Konjugats (L1), des makromolekularen Antigens (L2) und des wasserunlöslichen, makromolekularen Substrats (S) in den folgenden Ausführungsformen enthalten. Die Figur in dem Kreis bezeichnet die Nummer der Ausführungsform. Reagensschicht
- In jeder Ausführungsform kann eine Ausbreitungsschicht auf der gegenüberliegenden Seite der Reagensschicht zu dem Träger vorhanden sein oder die Ausbreitungsschicht kann mit der Reagensschicht kombiniert sein. Eine andere Reagensschicht, die ein oder mehrere Reagentien außer L1, L2 und S enthält, wie ein farbreagens, kann in jede der vorstehenden Ausführungsformen 1 bis 16 eingearbeitet sein.
- Die Reagensschicht kann einen Puffer, wie ein Carbonat-, Borat-, Phosphat-Goods-Puffer, wie in Biochemistry, Band 5, Nr. 2, S. 467-477 (1966) beschrieben oder dgl. enthalten. Der Puffer kann gemäß "Tanpakushitsu Koso no Kisojikken-Ho (fundamental Experimentation Method of Proteins, Enzymes)" (Autoren: Horio et al., Nankodo, 1981) und der vorstehenden Druckschrift Biochemistry etc. ausgewählt werden.
- Im falle der Verwendung einer porösen Schicht als Ausbreitungsschicht besitzt die poröse Schicht bevorzugt eine Dosierwirkung, die so ist, daß eine auf die Ausbreitungsschicht aufgetropfte Probe sich in einer festen Menge pro Flächeneinheit ohne ungleichmäßige Verteilung irgendeiner Komponente der Probe in lateralen Richtungen ausbreitet.
- Eine adhäsive Schicht kann auf einer Reagensschicht, einer Lichtblockierungsschicht oder einer lichtreflektierenden Schicht, einer Filterschicht, einer Wasserabsorptionsschicht, einer Registrierschicht oder dgl. vorgesehen sein, um eine poröse Schicht zu binden. Die adhäsive Schicht besteht bevorzugt aus einem hydrophilen Polymeren mit der Fähigkeit, an der porösen Schicht zu haften oder sie zu integrieren, wenn das Polymere in einem gequollenen Zustand vorliegt, wie Gelatine, Gelatinederivate, Polyacrylamid oder Stärke.
- Die lichtblockierende Schicht oder eine lichtreflektierende Schicht blockiert die Farbe der auf eine Ausbreitungsschicht aufgetropften Probe, insbesondere die rote farbe des Hämoglobins in einer Vollblutprobe, wenn die optisch nachweisbare Veränderung, wie eine Färbung oder eine Entfärbung, die in einer Reagensschicht, einer Registrierschicht oder dgl. eintritt, durch Reflexionsfotometrie, von der der Ausbreitungsschicht gegenüberliegenden Seite gemessen wird. Zusätzlich funktioniert sie auch als Hintergrundschicht. Die lichtreflektierende Schicht ist bevorzugt eine wasserpermeable Schicht aus einem hydrophilen Polymeren als Bindemittel, in dem lichtreflektierende Teilchen, wie Titandioxid oder Bariumsulfat dispergiert sind. Bevorzugte hydrophile Polymere sind Gelatine, Gelatinederivate, Polyacrylamid, Stärke und dgl.
- Die lichtreflektierenden Teilchen können auch in eine Ausbreitungsschicht, eine Reagensschicht, eine Registrierschicht oder dgl. zusätzlich zu oder anstelle von der lichtreflektierenden Schicht eingearbeitet sein.
- Das erfindungsgemäße Analysenelement kann nach einem bekannten Verfahren, das in den vorstehenden Patenten beschrieben ist, hergestellt werden.
- Das erfindungsgemäße, integrale, mehrschichte, analytische Element wird bevorzugt in quadratförmige Stücke mit einer Seite von etwa 15 mm bis etwa 30 mm oder kreisförmige Stücke mit einer ähnlichen Größe oder dgl. geschnitten und in einen Rahmen für einen Objektträger gegeben, wie in der US-PS 4 169 751, dem japanischen Patent KOKAI Nr. 63452/1982, der US-PS 4 387 990, dem japanischen Gebrauchsmuster KOKAI Nr. 32350/1983, der US-PS 4 169 751, der US-PS 4 387 990, der internationalen Publikation WO 83/00391 etc. beschrieben ist. Dieser analytische Objektträger ist hinsichtlich der Produktion, der Verpackung, des Transports, der Lagerung, des Arbeitsschritts der Messung und dgl. bevorzugt. Das analytische Element kann in Form eines langen Bands, das in eine Kassette oder ein Magazin verpackt ist, oder in Form kleiner Stücke, die auf eine Kartusche mit einer Öffnung geklebt oder darin angebracht sind, bereitgestellt werden.
- Die Messung wird beispielsweise nach dem Verfahren, das in der Beschreibung der vorstehenden Patente offenbart ist, durchgeführt. Etwa 5 ul bis etwa 30 ul, bevorzugt etwa 8 ul bis etwa 15 ul einer wäßrigen Probe, wie Vollblut, Plasma, Serum, Lymphe oder Urin, werden auf die Ausbreitungsschicht aufgetropft und bei einer definierten Temperatur im Bereich von etwa 20ºC bis etwa 40ºC, bevorzugt bei 37ºC oder in der Nähe 1 bis 10 min, bevorzugt 2 bis 7 min, inkubiert. Danach wird die Färbung oder Entfärbung, die in dem analytischen Element eintrat, von der Seite des Trägers reflektionsfotometrisch unter Verwendung von sichtbarem oder ultraviolettem Licht mit einer Wellenlänge der maximalen Absorption oder dessen Nähe gemessen. Der Gehalt des Liganden in der Probe wird kolorimetrisch unter Verwendung einer zuvor aufgestellten Kalibrationskurve bestimmt. Stattdessen ist es auch möglich, daß die von dem analytischen Element emittierte Fluoreszenzintensität gemessen wird, und der Ligandengehalt der Probe wird unter Verwendung einer zuvor aufgestellten Kalibrationskurve bestimmt. Eine quantitative Analyse des Liganden kann mit hoher Genauigkeit durch Fixieren der aufgetropften Menge einer flüssigen Probe, der Inkubationszeit und der Temperatur durchgeführt werden. Bei der Ausführungsform, bei der ein lichtreflektierender oder opaker Träger verwendet wird, wird die Färbung oder Entfärbung, die in dem analytischen Element auftrat, von der Seite der obersten Schicht, die die dem Träger gegenüberliegende Seite ist, reflektionsfotometrisch gemessen.
- Wenn diese Messung unter Verwendung der in der US-PS 4 488 810, der US-PS 4 424 191 und der US-PS 4 424 191 beschriebenen, chemisch analytischen Vorrichtung durchgeführt wird, können sehr genaue Ergebnisse leicht durch einen einfachen Verfahrensschritt erhalten werden.
- 5 mg Bacillus subtilis α-Amylase wurden in 1 ml 0,1 M Glycerinphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,3 aufgelöst. 100 ul 2 mg/ml 4-Maleimidomethylcyclohexan-1-carbonsäure-N-hydroxysuccinimidester (CHMS)-Dimethylformamid (DMF)-Lösung wurden dieser α-Amylaselösung zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Sephadex G25-Säule aufgebracht, und eine Gelfiltration wurde unter Verwendung von 0,1 M Glycerinphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,3 durchgeführt. Die Leerfraktionen wurden gewonnen, um die gewünschte CHM-induzierte α-Amylase zu erhalten.
- 300 ug Papain wurden zu 2 ml 0,1 M Acetatpufferlösung mit einem pH- Wert von 5,5, enthaltend 10 mg Anti-Theophyllin-Maus IgG gegeben und 18 h lang bei 37ºC gerührt. Diese Reaktionslösung wurde auf einen pH-Wert von 6,0 durch Zugabe von 0,1 N NaOH eingestellt und auf eine AcA-44-Gelsäule, die zuvor mit 0,1 M phosphatgepufferter 1 mM EDTA-Lösung mit einem pH- Wert von 6,3 äquilibriert worden war, gegeben und durch die vorstehende Phosphatpufferlösung eluiert. Der Hauptanteil eluierte bei einem Molekulargewicht von 100.000 und wurde gewonnen und auf 1 ml eingeengt, wodurch das gewünschte Anti-Theophyllin-Maus IgG F(ab')&sub2; erhalten wurde.
- 1 ml 0,1 M phosphatgepufferter 1 mM EDTA-Lösung mit einem pH-Wert von 6,0, enthaltend 6 mg des vorstehenden Anti-Theophyllin-Maus-IgG F(ab')&sub2; wurde mit einer 100 ul wäßrigen 2-Mercaptoethylaminhydrochloridlösung in einer Konzentration von 10 mg/ml vermischt und 90 min lang bei 37ºC stehengelassen. Es wurde eine Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex G25-Säule, die zuvor mit 0,1 M Glycerinphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 äquilibriert worden war, durchgeführt und nicht-umgesetztes 2-Mercaptoethylamin wurde entfernt, um Fab' zu erhalten. 2 mg der in Punkt i) hergestellten CHM-induzierten α-Amylase wurden zugesetzt und 90 min lang bei 37ºC reagieren gelassen. Anschließend wurde diese Reaktionslösung durch Gelfiltration unter Verwendung einer AcA-34- Säule, die mit 0,1 M acetatgepufferter 5 mM Calciumchloridlösung mit einem pH-Wert von 7,0 äquilibriert worden war, abgetrennt und die Fraktionen, die Molekulargewichten von größer als 200.000 entsprachen, wurden gewonnen. Die Fraktionen wurden eingeengt, wodurch das gewünschte Konjugat erhalten wurde.
- 5 mg 8-Propylcarboxytheophyllin, aufgelöst in 100 ul Dimethylformamid (DMF) wurden mit 3 mg N-Hydroxysuccinimid und 5 mg wasserlöslichem Carbodiimid vermischt und 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Dadurch wurde aktiviertes Theophyllin erhalten. 500 ul der vorstehenden aktivierten Theophyllinlösung wurden zu 10 mg Pferde-Ferritin, aufgelöst in 1 ml einer wäßrigen 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung, gegeben und bei Raumtemperatur 1 h lang stehengelassen. Nicht-umgesetzte Substanzen wurden unter Verwendung einer Sephadex G-25-Gelsäule, die zuvor mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,0 äquilibriert worden war, entfernt, wodurch 9 mg des gewünschten makromolekularen Antigens des Pferde-Ferritin-Theophyllin-Konjugats erhalten wurden.
- 40 g Carboxymethylstärke ("Explotab", Kimura Sangyo Co., Ltd.) wurden in 1500 ml destilliertem Wasser suspendiert. 8 g Diamira-Brillant-Blue R (C.I. Nummer 61200, Mitsubishi Chemical Industries) wurden der Suspension zugegeben und 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt. 150 g Natriumsulfatanhydrat wurden der Suspension zugesetzt und weiter 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 45 g Natriumcarbonat zugesetzt und bei 45ºC über Nacht gerührt. Dann wurde die Suspension zentrifugiert, und die Präzipitate wurden gewonnen. Die Präzipitate wurden in destilliertem Wasser suspendiert und dann zentrifugiert, um sie zu isolieren. Das vorstehende Waschverfahren wurde wiederholt, bis der Überstand nicht gefärbt war. Schließlich wurden die Präzipitate mit Ethanol gewaschen und getrocknet.
- Auf einen farblosen, transparenten Polyethylenterephthalat (PET)- Filmträger mit einer Dicke von 180 um, auf dem eine Gelatineunterzugsschicht angebracht war, wurde die folgende wäßrige Lösung aufgebracht, damit die folgende Beschichtungsmenge erhalten wurde, und getrocknet, wodurch eine das Vernetzungsmittel enthaltende Wasserabsorptionsschicht gebildet wurde.
- Alkalibehandelte Gelatine 10 g/m²
- Nonylphenoxypolyglycidol 330 mg/m²
- (enthaltend 10 Glycidoleinheiten im Durchschnitt)
- Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]methan 400 mg/m²
- Auf die das Vernetzungsmittel enthaltende Wasserabsorptionsschicht wurde die folgende wäßrige Suspension aufgebracht, wodurch die folgende Beschichtungsmenge erhalten wurde, und es wurde unter Bildung einer Registrierschicht getrocknet.
- Säurebehandelte Gelatine 10 g/m²
- Polymerer wäßriger Latex (1)* 3 g/m²
- (enthaltend 10 % Feststoffe)
- Nonylphenoxypolyglycidol 2 g/m²
- (enthaltend 10 Glycidoleinheiten im Durchschnitt)
- * [(p-Divinylbenzol)x-(styrol)y-((1-piperidininmethyl)stryrolchlorid)w]terpolymeres x:y:w = 5:47,5:47,5
- Auf die Registrierschicht wurde die folgende wäßrige Suspension aufgebracht, wodurch die folgende Beschichtungsmenge erhalten wurde, und es wurde unter Bildung einer lichtblockierenden Schicht mit einer Trockendicke von 7 4m getrocknet.
- Alkalibehandelte Gelatine 2,9 g/m²
- Teilchenförmiges Titandioxid vom Rutiltyp 13 g/m²
- Nonylphenoxypolyglycidol 400 mg/m²
- (enthaltend 10 Glycidoleinheiten im Durchschnitt)
- Auf die lichtblockierende Schicht wurde die folgende wäßrige Lösung aufgebracht, wodurch die folgende Beschichtungsmenge erhalten wurde. Es wurde getrocknet, wodurch eine Bindungsschicht mit einer Trockendicke von 5 um erhalten wurde.
- Alkalibehandelte Gelatine 6,7 g/m²
- Nonylphenoxypolyglycidol 600 mg/m²
- (enthaltend 10 Glycidoleinheiten im Durchschnitt)
- Die Oberfläche der Bindungsschicht wurde gleichförmig mit 30 g/m² Wasser befeuchtet und ein Celluloseacetatmembranfilter mit einer Dicke von etwa 140 um mit einer nominalen Porengröße von 3,0 um wurde darauf als poröse Registrierschicht laminiert.
- Anschließend wurde die folgende Zusammensetzung auf die poröse Registrierschicht aufgebracht und getrocknet.
- Amylase-Anti-Theophyllin-Maus IgG Fab' 4,0 mg/m²
- Nonylphenoxypolyethoxyethanol 200 mg/m²
- Ein gewebtes Flächengebilde mit einer Dicke von etwa 250 um, das durch Verstricken von 50 Denier PET-Spinngarn unter Verwendung von 36 Gauge hergestellt worden war und die folgende Reagenszusammensetzung enthielt, wurde als poröse Ausbreitungsschicht durch Laminieren dieser auf die poröse Registrierschicht bereitgestellt.
- Unlösliche, farbstoffmarkierte Stärke 7 g/m²
- Pferde-Ferritin-Theophyllin 4,2 mg/m²
- Nonylphenoxypolyethoxyethanol 500 mg/m²
- Das so hergestellte, integrale, mehrschichtige, analytische Element für den Immunoassay wurde in quadratförmige Stückchen mit einer Größe von 15 mm geschnitten, und jedes Stückchen wurde in einen Objektträger, wie er in dem japanischen Patent KOKAI Nr. 63452/1982 offenbart ist, gegeben, wodurch ein mehrschichtiges, analytisches Element (1) zur Analyse von Theophyllin vervollständigt wurde.
- 20 ul einer 50 mM Glycerinphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7, enthaltend eine bekannte Theophyllinmenge, wurde auf die Ausbreitungsschicht des vorstehenden mehrschichtigen, analytischen Elements (1) zur Analyse von Theophyllin aufgetropft. Nach 20-minütiger Inkubation bei 37ºC wurde die optische Reflexionsdichte bei 640 nm von der Seite des Trägers gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.
- Anhand der Kalibrationskurve von Fig. 1 wurde herausgefunden, daß der Theophyllingehalt mit dem analytischen Element vom Trockentyp für den Immunoassay zur genauen Analyse von Theophyllin bestimmt werden kann.
- 0,5 mg Pepsin wurden zu 2 ml 0,1 M Acetatpufferlösung, pH 4,2, enthaltend 10 mg Anti-menschliches Ferritin-Ziege IgG gegeben und bei 37ºC über Nacht gerührt. Diese Reaktionslösung wurde durch Zugabe von 0,1 N NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und auf eine AcA-44-Gelsäule, die zuvor mit 0,1 M phosphatgepufferter 1 mM EDTA-Lösung mit einem pH- Wert von 6,0 äquilibriert worden war, gegeben und mit der vorstehenden Phosphatpufferlösung eluiert. Der Hauptanteil eluierte bei dem Molekulargewicht von 100.000, wurde gesammelt und auf 1 ml eingeengt, wodurch das gewünschte Anti-menschliches Ferritin-Ziege IgG F(ab')2 erhalten wurde.
- 1 ml 0,1 M phosphatgepufferter 1 mM EDTA-Lösung mit einem pH-Wert von 6,0, enthaltend 6 mg des vorstehenden Anti-menschliches Ferritin-Ziege IgG F(ab')2, wurden mit 100 ul einer wäßrigen 0,1 M 2-Mercaptoethylenaminhydrochloridlösung vermischt und 2 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex G25-Säule, die zuvor mit einer 0,1 M Glycerinphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 äquilibriert worden war, wurde durchgeführt und nicht-umgesetztes 2-Mercaptoethylamin wurde entfernt, wodurch 5 mg Fab' erhalten wurden. 0,62 mg der in Beispiel 1 (1) i) hergestellten CHM-induzierten α-Amylase wurden der Fab'-Lösung zugesetzt und über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Anschießend wurde diese Reaktionslösung auf 1 ml mit PEG 20.000 eingeengt und dann durch Gelfiltration unter Verwendung einer Sephacryl S-300-Säule, die mit einer 0,1 M glycerinphosphatgepufferter 5 mM Calciumchloridlösung mit einem pH-Wert von 7,0 äquilibriert worden war, abgetrennt. Die den Molekulargewichten von etwa 200.000 bis 300.000 Dalton entsprechenden Proteinfraktionen wurden gewonnen, um das gewünschte Konjugat zu erhalten.
- Eine ein Vernetzungsmittel enthaltende Wasserabsorptionsschicht wurde auf einem PET-Träger wie in Beispiel 1 angebracht.
- Auf die das Vernetzungsmittel enthaltende Wasserabsorptionsschicht wurde die folgende wäßrige Lösung aufgebracht, wodurch die folgende Beschichtungsmenge erhalten wurde, und es wurde unter Bildung einer Bindungsschicht mit einer Trockendicke von 5 4m getrocknet.
- Alkalibehandelte Gelatine 6,7 g/m²
- Nonylphenoxypolyglycidol 600 mg/m²
- (enthaltend 10 Glycidoleinheiten im Durchschnitt)
- Die Oberfläche der Bindungsschicht wurde gleichförmig mit 30 g/m² Wasser befeuchtet, und ein Celluloseacetatmembranfilter mit einer Dicke von etwa 140 um mit einer nominalen Porengröße von 3,0 um wurde darauf als poröse Registrierschicht laminiert.
- Ein gewebtes Flächengebilde mit einer Dicke von etwa 250 um wurde durch Stricken von 50 Denier PET-Spinngarn unter Verwendung von 36 Gauge hergestellt und enthielt die folgende Reagenszusammensetzung. Es wurde als poröse Ausbreitungsschicht durch Laminieren dieser auf die poröse Registrierschicht bereitsgestellt.
- Unlösliche, farbstoffmarkierte Stärke 7,2 g/m²
- α-Amylase-Anti-menschliches Ferritin-Ziege-IgG Fab' 2 mg/m²
- Nonylphenoxypolyethoxyethanol 500 mg/m²
- (enthaltend 10 Hydroxyethyleneinheiten im Durchschnitt)
- Das so hergestellte integrale, mehrschichtige, analytische Element für den Immunoassay wurde in quadratförmige Stückchen mit einer Seite von 15 mm geschnitten, und jedes Stückchen wurde in einen Objektträger, der in dem japanischen Patent KOKAI Nr. 63452/1982 offenbart ist, gegeben, wodurch ein mehrschichtiges, analytisches Element (2) zur Analyse von Ferritin vervollständigt wurde.
- 20 ul 50 mM Glycerinphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0, enthaltend eine bekannte Menge Ferritin, wurden auf die Ausbreitungsschicht des vorstehenden mehrschichtigen, analytischen Elements (2) zur Analyse von Ferritin aufgetropft. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37ºC wurde die optische Reflexionsdichte bei 640 nm von der Seite des Trägers gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.
- Anhand der Kalibrationskurve von Fig. 2 wurde gefunden, daß der Ferritingehalt durch das analytische Element vom Trockentyp zum Immunoassay für die Analyse von Ferritin genau bestimmt werden kann.
Claims (7)
1. Mehrschichtiges analytisches Element vom Trockentyp
für den Immunoassay mit mindestens einer wasserpermeablen
Schicht zur Messung eines Liganden in einer flüssigen Probe
gemäß einem Enzymimmunoassay, dadurch
gekennzeichnet, daß die Schicht enthält:
(A) ein wasserunlösliches makromolekulares Substrat,
und
(B) einen Antikörper, der mit dem Liganden in der
Probe reagiert, mit einem Enzym mit der Fähigkeit auf das
wasserunlösliche makromolekulare Substrat einzuwirken,
konjugiert ist.
2. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß es weiterhin enthält:
(C) eine makromolekulare Substanz, die ein Konjugat
des Liganden oder ein Derivat davon mit einer
makromolekularen Verbindung in der wasserpermeablen Schicht ist.
3. Analytisches Element nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß es mindestens zwei
wasserpermeable Schichten besitzt und mindestens eine der
wasserpermeablen Schichten eine poröse Schicht ist.
4. Analytisches Element nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die wasserpermeable
Schicht weiterhin einen anderen Antikörper enthält, der für
eine andere antigene Determinante als die gegen die der mit
dem Enzym konjugierte Antikörper spezifisch ist, spezifisch
ist.
5. Analytisches Element nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche
makromolekulare Substrat in die poröse Schicht eingearbeitet ist.
6. Analytisches Element nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche
makromolekulare Substrat an eine nachweisbare funktionelle
Gruppe oder Verbindung gebunden ist.
7. Analytisches Element nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche
makromolekulare Substrat an eine Verbindung mit einer
Farbstoffeinheit gebunden ist.
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