DE3924239A1 - Verfahren zur bestimmung von immunologisch nachweisbaren substanzen - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von immunologisch nachweisbaren substanzenInfo
- Publication number
- DE3924239A1 DE3924239A1 DE19893924239 DE3924239A DE3924239A1 DE 3924239 A1 DE3924239 A1 DE 3924239A1 DE 19893924239 DE19893924239 DE 19893924239 DE 3924239 A DE3924239 A DE 3924239A DE 3924239 A1 DE3924239 A1 DE 3924239A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- solid phase
- binding
- receptors
- antibodies
- different
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von
immunologisch nachweisbaren Substanzen nach dem Prinzip
des heterogenen Immunoassays durch Inkubation mit min
destens zwei Rezeptoren R1 und R2, von denen R1 die
Bindung an die feste Phase vermittelt und R2 ein Konju
gat ist aus einem mit einer zu bestimmenden Substanz
bindefähigen Liganden und einer Markierung unter Ver
wendung einer Festphase, an die eine spezifisch binde
fähige Komponente gebunden ist, Trennung der festen von
der flüssigen Phase und Bestimmung der Markierung in
einer der beiden Phasen sowie ein dazu geeignetes Rea
genz.
Eine Vielzahl klinisch wertvoller Parameter wird mit
immunologischen Nachweisverfahren bestimmt. Für die
Immunoassays gibt es eine große Auswahl von homogenen
und heterogenen Verfahrensvarianten. Häufig wird ein
Verfahren nach dem Sandwich-Prinzip oder einer davon
abgeleiteten Verfahrensvariante benutzt. Üblicherweise
wird die Probelösung mit einem Rezeptor, der mit der
nachzuweisenden Substanz bindefähig ist und eine Mar
kierung trägt und einem an die Festphase gebundenen,
oder einem die Bindung an die feste Phase vermittelnden,
mit der nachzuweisenden Substanz spezifisch bindefähigen
Rezeptor inkubiert. Dabei bilden sich an die Festphase
über den die Bindung an die Festphase vermittelnden
Rezeptor gebundene Komplexe von nachzuweisender Substanz
und markiertem Rezeptor. Durch Trennung der festen von
der flüssigen Phase kann die gebundene Markierung von
der ungebundenen Markierung leicht isoliert werden und
in einer der beiden Phasen nachgewiesen werden. Die
Menge der Markierung ist ein Maß für den Gehalt an
nachzuweisender Substanz.
Es gibt nun verschiedene Situationen, bei denen nicht
nur ein Test, sondern parallel mehrere verschiedene
Tests durchgeführt werden müssen. Dies ist beispiels
weise der Fall bei der Diagnostik von gegen bestimmte
Viren gerichteten Antikörpern, wie z.B. Anti-HIV-Anti
körpern oder gegen Hepatitis-Antigene gerichteten Anti
körpern. Generell werden gegen ein Antigen oder Hapten
vom Körper eine Vielzahl verschiedener Antikörper
gebildet, d.h. Antikörper, die mit verschiedenen Epito
pen bindefähig sind. Einige Viren haben die Eigenschaft,
ihre Oberfläche ständig zu verändern, so daß es sehr
schwierig ist, entweder Antikörper zu finden, die einen
zuverlässigen Nachweis des Antigens erlauben oder
Modellsubstanzen zu finden, mit denen alle gegen ein
bestimmtes Virus gebildeten Antikörper erfaßt werden
können. Aus diesem Grunde versucht man in parallelen
Tests durch Einsatz verschiedener Antikörper, die mit
verschiedenen viralen Antigenen bindefähig sind, oder
durch Einsatz verschiedener antigener Determinanten, die
Nachweisgenauigkeit zu erhöhen. Weiterhin ist es bei
vielen Krankheitsbildern wichtig, parallel verschiedene
Parameter nachzuweisen, beispielsweise in der Tumor
diagnostik bei der Suche nach Tumormarkern oder bei der
Untersuchung von Allergie-Patienten für den Nachweis von
Allergenen bzw. von Anti-Allergen-Antikörpern. Auch bei
der Untersuchung von Blut für Transfusionen ist es not
wendig, verschiedene Tests parallel auszuführen, um
festzustellen, ob das Blut irgendwelche Risikofaktoren
wie HIV-Antikörper, Hepatitis-Erreger etc. enthält.
Bisher ist es sehr aufwendig, verschiedene Antigene oder
Antikörper parallel nachzuweisen, da für jede einzelne
Substanz ein gesonderter Test durchgeführt werden muß,
was zeit- und arbeitsaufwendig ist. Es wurde auch schon
vorgeschlagen, simultan mehrere Antikörper nebeneinander
zu bestimmen, indem man verschiedene Antigene an der
Festphase immobilisiert. Dieses Verfahren brachte jedoch
in der Regel keine befriedigenden Ergebnisse, da einer
seits Störreaktionen auftraten und andererseits für
solche Tests die Bindekapazität der Festphase so gering
war, daß die Empfindlichkeit unter den Anforderungen der
Praxis lag.
Es war nun Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ver
fahren zur Verfügung zu stellen, mit dem mehrere Para
meter gleichzeitig mit hoher Genauigkeit und geringem
Zeitaufwand bestimmt werden können.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Be
stimmung von immunologisch nachweisbaren Substanzen nach
dem Prinzip des heterogenen Immunoassays durch Inkuba
tion mit mindestens zwei Rezeptoren R1 und R2, von denen
R1 die Bindung an die feste Phase vermittelt und R2 ein
Konjugat aus einem mit einer zu bestimmenden Substanz
bindefähigen Liganden und einer Markierung ist, unter
Verwendung einer Festphase, an die eine spezifisch bin
defähige Reaktionskomponente gebunden ist, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man als Festphase ein Material
verwendet, an dessen Oberfläche spezifisch bindefähige
Partner gebunden sind und daß man die Probelösung mit
mehreren verschiedenen Rezeptoren R1 inkubiert, wobei
jeder Rezeptor R1 sowohl Bindestellen für den an der
Festphase gebundenen spezifisch bindefähigen Partner als
auch Bindestellen für eine der zu bestimmenden Substan
zen aufweist.
Überraschenderweise gelingt es mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren, simultan verschiedene Substanzen zu bestim
men. Es kann in einfacher Weise und mit geringem Zeit
aufwand ein ganzes Spektrum gewünschter Parameter
abgedeckt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für alle Va
rianten des heterogenen Immunoassays.
Für das erfindungsgemäße Verfahren wird eine feste Phase
verwendet, an deren Oberfläche spezifisch bindende
Partner gebunden sind. Für die Festphase können die an
sich bekannten Materialien wie Kunststoff, Glas, Pa
pierträger, Keramik, Latex, Magnetteilchen und andere
verwendet werden. Die feste Phase kann z.B. in Form von
Reaktionsröhrchen, Reagenzträgerstreifen oder Kugeln
vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt
die feste Phase in Form eines Reaktionsgefäßes, beson
ders bevorzugt als Küvette ausgebildet vor, dessen Wände
zumindest teilweise an der Innenoberfläche mit spezi
fisch bindenden Partnern beschichtet sind. Als Material
für das Reaktionsgefäß sind die bekannten Materialien
geeignet. Bevorzugt sind hier Polystyrol, Copolymere des
Polystyrols, Polycarbonate, Polyacrylate und Polymeth
acrylate.
Die Beschichtung des Trägermaterials mit den spezifisch
bindenden Partnern kann entweder direkt, über ein Trä
germaterial oder einen Spacer erfolgen. Geeignet ist
beispielsweise die Bindung an ein lösliches Protein mit
einem Molekulargewicht über 500 000, das dann an der
Innenoberfläche des Reaktionsgefäßes adsorbiert wird.
Ebenso geeignet ist die Bindung über einen Spacer, der
über eine funktionelle Gruppe an der Oberfläche des
Reaktionsgefäßes kovalent oder adsorptiv gebunden werden
kann. Verfahren und Mittel hierzu sind bekannt. In einer
bevorzugten Ausführungsform wird als feste Phase ein
Trägermaterial verwendet, das nach dem in DE-A-
36 40 412.8 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die
feste Phase ein Reagenzpapier, das erhalten wurde, indem
ein Faservlies aus einer Cellulose/Synthesefasermischung
durch Behandlung mit Perjodat aktiviert wurde und mit
dem spezifisch bindenden Partner, der vorher sauer be
handelt wurde, beladen wurde. Ein Verfahren zur Her
stellung derartiger Reagenzpapiere ist beschrieben in
DE-A-35 43 749.
An die Oberfläche der Festphase wird ein spezifisch
bindender Partner gebunden. Dieser Partner muß mit einem
Teil von Rezeptor R1 bindefähig sein. Da die Bindung
zwischen dem an der Festphase gebundenen Partner und dem
Rezeptor R1 die Bindefähigkeit des Rezeptors R1 mit der
nachzuweisenden Substanz nicht beeinträchtigen soll,
werden entweder, wenn Rezeptor R1 ein Antikörper ist,
gegen den Fc-Teil dieses Antikörpers gerichtete Anti
körper oder Protein A verwendet oder es werden Partner
P1 eines spezifisch bindenden Paares immobilisiert. Als
spezifisch bindende Paare sind beispielsweise Antigen-
Antikörper, Hapten-Antikörper, Lektin-Kohlenhydrate,
Biotin-Antibiotin-Antikörper, Biotin-Streptavidin sowie
Biotin-Avidin geeignet. Bevorzugt werden an der Fest
phase mit Biotin bindefähige Partner immobilisiert,
insbesondere Streptavidin oder Avidin. Wird als P1 oder
P2 Protein A verwendet, so sollte in dem Immunoassay nur
Rezeptor R1 ein vollständiger Antikörper sein, während
als markierter Rezeptor ein Fab- oder F(ab′)2-Fragment
verwendet werden sollte, um keine unspezifische Bindung
des markierten Rezeptors mit der Festphase zu verur
sachen, die zu einer Verfälschung des Ergebnisses führen
würde.
Die Probelösung wird mit verschiedenen Rezeptoren R1
inkubiert. Als Rezeptoren R1 werden Rezeptoren verwen
det, die sowohl Bindestellen für den an der Festphase
gebundenen Partner als auch Bindestellen für eine der
nachzuweisenden Substanzen haben. Als Rezeptoren R1
können vollständige Antikörper aller Subklassen, die mit
einer der nachzuweisenden Substanzen bindefähig sind,
verwendet werden. In diesem Fall werden an der Oberflä
che der Festphase entweder gegen den Fc-Teil des für R1
verwendeten Antikörpers gerichtete Antikörper oder Pro
tein A gebunden. Im letzteren Fall sollte der markierte
Rezeptor kein vollständiger Antikörper sein, um keine
unspezifische Bindung an der Festphase zu verursachen,
die zu einer Verfälschung des Ergebnisses führen würde.
In einer weiteren Ausführungsform werden als Rezeptoren
R1 Konjugate aus zu dem an der Festphase gebundenen
Partner P1 komplementären Partnern P2 sowie einem mit
einer der nachzuweisenden Substanzen bindefähigen
Liganden eingesetzt. Über den Partner P2, der mit Part
ner P1 bindet, wird die Immobilisierung bewirkt. Bevor
zugt enthält Rezeptor R1 als Partner P1 ein Hapten wie
FITC, p-Nitrophenol, Saponin, Digoxin, besonders bevor
zugt Biotin. Der Ligand bindet mit einer der nachzuwei
senden Substanzen. Abhängig von der nachzuweisenden
Substanz kann der Ligand ein Antikörper, Antikörper
fragment, Antigen, Hapten oder Bindeprotein sein. Als
Antigene können vollständige oder gereinigte Teile von
Krankheitserregern wie bakterielle Antigene, Protozoen-
Antigene, Allergene oder virale Antigene, verwendet
werden. Die Antigene können aus nativem Material,
rekombinantem Material oder aus chemisch synthetisierten
oder modifizierten Peptiden oder Kohlenhydraten beste
hen. So werden beispielsweise als Liganden für die
Rezeptoren R1 beim Nachweis von HIV-Antikörpern ver
schiedene antigene Determinanten wie p24, gp41 und gp32
verwendet. Soll beispielsweise Art und Verlauf einer
Hepatitis-Erkrankung nachgewiesen werden, so können für
Rezeptor R1 als Liganden die verschiedenen Virus-Anti
gene HBcAg, HBsAg, HBeAg, HAV etc. verwendet werden.
Wird das Verfahren zum Nachweis von Allergien einge
setzt, so werden als Liganden die verschiedenen
Allergene verwendet, um das Vorliegen von entsprechenden
Antikörpern nachzuweisen. Für den Nachweis von Tumor
markern werden die entsprechenden verschiedenen Anti
körper für Rezeptor R1 eingesetzt, beispielsweise können
Antikörper gegen CEA, AFP, CA153 nebeneinander für die
Rezeptoren R1 verwendet werden. Zur Hormonbestimmung
kommen Antikörper gegen TSH, LH, FSH, Cortisol, Prolac
tin etc. in Frage. Ebenso können zum Nachweis von
Krankheiten Antikörper gegen verschiedene virale, bak
terielle oder Protozoen-Antigene eingesetzt werden.
Statt der Antikörper können selbstverständlich auch
deren Fragmente wie Fab-, Fab′- oder F(ab′) 2-Fragmente
verwendet werden. Die Antikörper können polyklonal oder
monoklonal sein.
Der zweite, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwen
dete Rezeptor R2 ist ein Konjugat aus einem mit einer
der zu bestimmenden Substanzen bindefähigen Liganden und
einer Markierung. Zur Markierung sind viele Möglichkei
ten bekannt und hier im vorliegenden Verfahren geeignet.
Als Beispiele können radioaktive Isotope wie 125J, 131J,
51Cr, 35S und 3H, Enzyme wie Peroxidase, β-Galactosidase
oder alkalische Phosphatase, fluoreszierende, chemilu
mineszierende oder in anderer Weise nachweisbare Sub
stanzen verwendet werden. Der für R2 verwendete Ligand
kann entweder eine mit allen nachzuweisenden Substanzen
bindefähige Komponente sein, z.B. in dem Fall, in dem
verschiedene Antigene zum Nachweis ganz bestimmter
Antikörper, wie z.B. HIV, verwendet werden. In diesem
Fall ist auch die Markierung für alle Rezeptoren R2
gleich. Analoges gilt für die Simultanbestimmung von
IgE-Antikörper verschiedener Allergene. Wenn verschie
dene Parameter nebeneinander bestimmt werden sollen,
können für die Rezeptoren R2 jeweils verschiedene, mit
den einzelnen nachzuweisenden Substanzen spezifisch
bindefähige Liganden verwendet werden. Die Bestimmung
der einzelnen Parameter nebeneinander kann in zwei
Varianten erfolgen. In einer ersten Variante wird das
Verfahren mehrphasig durchgeführt. Hier werden die
verschiedenen Rezeptoren R2, die jeweils die gleiche
Markierung tragen, nacheinander zugegeben. Da jeder
Rezeptor R2 jeweils nur mit einer nachzuweisenden
Substanz reagieren kann, kann nach Zugabe des Rezeptors
jeweils der Anteil an gebundener oder ungebundener Mar
kierung bestimmt werden und ist ein Maß für die jewei
lige nachzuweisende Substanz. In einer zweiten Variante
wird das Verfahren einphasig durchgeführt. Diese
Variante ist bevorzugt, da sie auch in Analyseautomaten
durchgeführt werden kann. Hier tragen die verschiedenen
Rezeptoren R2 jeweils verschiedene Markierungen, die
eine gleichzeitige Bestimmung ermöglichen, z.B. ver
schiedene Isotope mit unterscheidbaren Emissionen oder
auf verschiedenen Wellenlängen fluoreszierende Verbin
dungen. Ebenso geeignet ist die Markierung mit ver
schiedenen Enzymen. Hier werden zur Auswertung
verschiedene Substrate zugegeben, die bei der Einwirkung
der jeweiligen Enzyme Farben bilden, die ihr Absorp
tionsmaximum bei unterschiedlichen Wellenlängen haben.
Als Liganden für Rezeptor R2 sind die gleichen Liganden
wie für Rezeptor R1 geeignet. Die für Rezeptor R2 ver
wendeten Liganden können abhängig von der durchzufüh
renden Bestimmung identisch mit den für Rezeptor R1
verwendeten Liganden sein oder davon verschieden. Für
den Nachweis von Antigenen können als Liganden gegen die
Antigene gerichtete Antikörper oder deren Fragmente
sowie Bindeproteine verwendet werden.
Für den Nachweis von Antikörpern können z.B. gegen IgG,
IgA, IgM, IgE gerichtete Antikörper oder deren Fragmente
oder die mit den nachzuweisenden Antikörpern bindefähi
gen Antigene oder Haptene eingesetzt werden. Die Rezep
toren R2 können in Form von Mischungen oder in Form
vernetzter Produkte eingesetzt werden. Eine Vernetzung
kann in an sich bekannter Weise erfolgen, beispielsweise
durch Einsatz von bi- oder polyfunktionellen Linkern.
Verfahren hierzu sind dem Fachmann bekannt und bedürfen
keiner näheren Erläuterung.
Die Probelösung kann entweder mit allen Rezeptoren
gleichzeitig oder zuerst mit Rezeptor R1 und dann mit
den verschiedenen Rezeptoren R2 inkubiert werden.
Weitere Verfahrensvarianten sind möglich und dem Fach
mann bekannt. Die Reaktion mit den beiden Rezeptoren R1
und R2 erfolgt dabei in homogener Phase.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt es, Simul
tanbestimmungen für viele verschiedene Parameter durch
zuführen. Die einfache Verfahrensführung ermöglicht die
Simultanbestimmung in Analysenautomaten.
Durch die erfindungsgemäße Verwendung einer mit einem
Partner eines spezifisch bindefähigen Paares beschich
teten Oberfläche steht genug Bindungskapazität zur Ver
fügung, so daß alle Parameter genau und reproduzierbar
nachgewiesen werden können.
Das Verfahren eignet sich auch für die Schnelldiagnose.
Durch simultanen Nachweis von HIV-Antikörpern und HBsAg
können Blutproben, die diese Risikofaktoren enthalten,
sofort ausgeschieden werden, ohne daß eine genauere
Diagnostik notwendig wäre. Andererseits kann bei Unter
suchungen in einem Schnelltest vorweg geprüft werden, ob
Risikofaktoren vorliegen und falls dies der Fall ist,
dann eine genauere Diagnose angeschlossen werden. Es ist
somit erfindungsgemäß möglich, sehr schnell festzustel
len, ob bestimmte Hinweise auf eine Erkrankung vorhanden
sind, die dann die weiteren Untersuchungen vereinfa
chen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Bei
spiele erläutert.
Fig. 1 zeigt ein Schema für eine simultane Bestimmung
von HIV-Antikörpern und HBsAg.
Fig. 2 zeigt ein Schema für eine Simultanbestimmung
verschiedener Tumormarker.
In Fig. 1 ist schematisch die simultane Bestimmung von
HIV-Antikörpern und HBsAg dargestellt. An einer Fest
phase sind Antikörper, die gegen Fluoresceinisothiocya
nat (FITC) gerichtet sind, immobilisiert. Die
Probelösung wird inkubiert mit verschiedenen Konjugaten
als Rezeptoren R1, die alle FITC und jeweils mindestens
ein mit HIV-Antikörpern bindefähiges Epitop bzw. Anti-
HBsAg-Antikörper enthalten. Nach einem Waschschritt wird
die Probe inkubiert mit markierten Anti-Human-IgG-Anti
körpern und Anti-HBsAg-Antikörpern als Rezeptoren R2.
Die Markierung ist radioaktives Jod. Es bilden sich dann
Komplexe aus den Rezeptoren R1, HIV-Antikörpern bzw.
HBsAg und aus Rezeptoren R2, die durch die Bindung von
FITC an die immobilisierten Anti-FITC-Antikörper an der
Festphase gebunden werden.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung einer simul
tanen Bestimmung von Tumor-Antigenen. Hier wird an der
Festphase Anti-Fcγ-Antikörper immobilisiert. Als Rezep
toren R1 werden jeweils gegen Tumorantigene gerichtete
Antikörper verwendet. Als Rezeptor R2 wird vernetzte
Peroxidase, die Fab-Fragmente von gegen Tumorantigene
gerichteten Antikörpern trägt, verwendet. Bei der Inku
bation binden die Anti-Tumor-Antigen-Antikörper die in
der Probe vorhandenen Tumor-Antigene. Weiterhin binden
die vernetzten POD-Moleküle über die entsprechenden Fab-
Antikörper ebenfalls an die Tumor-Antigene. Die Immo
bilisierung erfolgt durch Bindung über die Anti-Fcγ-An
tikörper.
HIV-Antikörper werden in einem 2-Schritt-Sandwich-Im
munoassay bestimmt. Zum Nachweis werden die Reagenzien
mit folgender Zusammensetzung verwendet.
jeweils 10-7 mol/l eines oder mehrerer biotinylierter
HIV-Antigene,
40 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0
0,9 Gew.-% Kochsalz
10 Vol.-% Rinderserum.
40 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0
0,9 Gew.-% Kochsalz
10 Vol.-% Rinderserum.
Als Antigene wurden dabei folgende verwendet: gentech
nologisch hergestellte HIV-Antigene entsprechend HIV1-
gp41 (gp41-rek., CentocorTM-p121) und HIV1-p24
(p24-rek., CentocorTM-pg2), chemisch synthetisierte
Peptide aus HIV1-gp41 (gp41-pep, Wand et al., PNAS, 83,
6159, 1986) und HIV2-gp32 (gp32-pep, Gnann, J.W. et al.,
Science, 237, 1346, 1987). Diese Antigene wurden wie von
Leary et al., PNAS, 80, 4045 (1983) beschrieben mit
Biotin markiert.
20 mU/ml eines Konjugates aus Schafantikörper gegen
Human-Immunglobulin und POD
40 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0
0,05 Gew.-% Tween 20
0,2% Rinderserumalbumin
0,2% Rinder-IgG.
40 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0
0,05 Gew.-% Tween 20
0,2% Rinderserumalbumin
0,2% Rinder-IgG.
Thermisch aggregiertes RSA, im folgenden als Thermo-RSA
bezeichnet, wurde in folgender Weise hergestellt: 1 g
RSA wurde in 100 ml 50 mmol Kaliumphosphatlösung bei
einem pH von 7,0 gelöst, auf 70°C erhitzt und 4 Stunden
unter leichtem Rühren bei dieser Temperatur gehalten.
Die Lösung wurde abgekühlt, filtriert und auf eine Kon
zentration von 50 mg/ml eingestellt. Anschließend wurde
gegen das 30fache Volumen bidest. Wasser dialysiert.
Herstellung eines Konjugats von Streptavidin mit Thermo-
RSA: Aus Streptomyces avidinii gewonnenes Streptavidin
wurde mit Maleimido-hexanoyl-N-hydroxy-succinimid umge
setzt, und man erhielt auf diese Weise ein Maleimido
gruppen tragendes Streptavidin. Thermo-RSA wurde mit S-
Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid umgesetzt und an
schließend die geschützten SH-Gruppen durch Zugabe von
Hydroxylamin freigesetzt. Das Maleimidogruppen enthal
tende Streptavidin wurde sodann mit dem SH-Gruppen ent
haltenden Thermo-RSA vermischt unter Bildung des
gewünschten Konjugats.
Kunststofftubes aus Polystyrol wurden dann mit dem
Streptavidin-Thermo-RSA-Konjugat beladen. Das Beladen
der Tubes erfolgte mit 1,5 ml einer Streptavidin-Thermo-
RSA-Lösung, wobei das molare Verhältnis der beiden Kom
ponenten 1,8:1 (10 µg/ml) in 40 mmol/l Natriumphosphat
puffer, pH 7,4 bei 20°C während 18 bis 24 Stunden
betrug.
Nach Aussagen der Tubes wurde 30 Minuten bei 20°C mit
1,8 ml einer Lösung von 2% Saccharose, 0,9% Natrium
chlorid und 0,3% RSA nachbeladen. Nach Trocknung (24
Stunden bei 20°C und 40% relativer Feuchte) waren die
Tubes einsatzbereit und haltbar.
In einem mit Streptavidin-Thermo-RSA-Konjugat beschich
teten Polystyroltube wurden 1 ml des Reagenz 1 und 10 µl
Humanserum oder -plasma eine Stunde bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wurde dreimal mit Leitungswasser
gewaschen und 1 ml Reagenz 2 für eine Stunde bei Raum
temperatur inkubiert. Wieder wurde dreimal mit Lei
tungswasser gewaschen und zur Nachweisreaktion 1 ml
ABTS-Substratlösung zugegeben. Nach 60 Minuten wurde die
Extinktion bei 422 nm photometrisch gemessen.
Der Anti-HIV-Test wurde unter Verwendung einzelner HIV-
Antigene und Antigenkombinationen durchgeführt. Dabei
zeigte es sich, daß die Testführung im mit Streptavidin-
Thermo-RSA-Konjugat beschichteten Polystyroltube sowohl
für die simultane Bestimmung von mehreren Antikörpern
oder Antikörperpopulationen geeignet ist (Screeningtest;
Tabelle 1), gleichgültig, ob diese gegen denselben Virus
oder mehrere Viren bzw. interessierende Antigene ge
richtet sind.
In einer Probelösung wurden Hepatitis S-Antigen und HIV-
Antikörper in einem 2-Schritt-Sandwich-Immunoassay
bestimmt. Die verwendeten Reagenzien hatten die folgende
Zusammensetzung:
40 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0
0,1% Tween 20
0,9% NaCl
0,01% Phenol
0,2% Rinderserumalbumin
300 ng/ml eines FITC-markierten monoklonalen Antikörpers gegen HBSAg sowie je 600 ng/ml FITC-markiertes p24 und gp41-Antigen von HIV.
(FITC = Fluoresceinisothiocyanat)
0,1% Tween 20
0,9% NaCl
0,01% Phenol
0,2% Rinderserumalbumin
300 ng/ml eines FITC-markierten monoklonalen Antikörpers gegen HBSAg sowie je 600 ng/ml FITC-markiertes p24 und gp41-Antigen von HIV.
(FITC = Fluoresceinisothiocyanat)
40 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0
0,1% Tween 20
0,2 mol/l Natriumtartrat
0,01% Phenol
0,2% Rinderserumalbumin
je 5000 cpm eines ¹²⁵J markierten polyklonalen Schafantikörper gegen humane IgG-Antikörper sowie eines monoklonalen Antikörpers gegen HBSAg.
0,1% Tween 20
0,2 mol/l Natriumtartrat
0,01% Phenol
0,2% Rinderserumalbumin
je 5000 cpm eines ¹²⁵J markierten polyklonalen Schafantikörper gegen humane IgG-Antikörper sowie eines monoklonalen Antikörpers gegen HBSAg.
Polystyrolröhrchen wurden mit 1 ml Schafantikörper gegen
FITC (50 µg/ml in 0,1 mol/l Carbonatpuffer, pH 9,6) für
18 Stunden bei Raumtemperatur und mit 1 ml Rinderserum
albumin (10 mg/ml in 0,1 mol/l Phosphatpuffer) für eine
Stunde bei Raumtemperatur beschichtet.
50 µl Probe wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit
1 ml Reagenz 1 inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit
Wasser wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 1 ml
Reagenz 2 inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden die
Röhrchen im Gammazähler vermessen. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 2 dargestellt.
In einer Probelösung wurden gleichzeitig die Tumormarker
CEA und CA153 in einem 1-Schritt-Sandwich-Immunoassay
bestimmt. Das verwendete Reagenz hatte die folgende
Zusammensetzung:
120 mU/ml eines Konjugats aus POD und Fab-Fragmenten
jeweils eines monoklonalen Antikörpers gegen
die Tumormarker CEA und CA153
40 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0
0,5% Pluronic F68
0,2 mol/l Natriumtartrat
0,01% Phenol
0,2% Rinderserumalbumin
300 ng/ml jeweils eines biotinylierten monoklonalen Antikörpers gegen CEA und CA153.
40 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0
0,5% Pluronic F68
0,2 mol/l Natriumtartrat
0,01% Phenol
0,2% Rinderserumalbumin
300 ng/ml jeweils eines biotinylierten monoklonalen Antikörpers gegen CEA und CA153.
An die monoklonalen Antikörper gegen CEA und CA153
werden lediglich die Anforderungen gestellt, daß die
Fab-Fragmente im POD-Konjugat jeweils gegen ein anderes
Epitop gerichtet sind als die biotinylierten Antikör
per.
Polystyrolröhrchen wurden mit 1 ml Schaf-Anti-Maus-Fcγ-
Antikörper (50 µg/ml in 0,1 mol/l Carbonatpuffer, pH
9,6) für 18 Stunden bei Raumtemperatur und mit 1 ml
Rinderserumalbumin (10 mg/ml in 0,1 mol/l Phosphatpuf
fer) für eine Stunde bei Raumtemperatur beschichtet.
1 ml des Reagenzes und 100 µl Probe wurden 2 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde dreimal mit
Leitungswasser gewaschen. Sodann wurde zur Nachweis
reaktion 1 ml ABTSB-Substratlösung zugegeben. Nach einer
Stunde wurde die Extinktion bei 405 nm photometrisch
gemessen. Die Ergebnisse sind Tabelle 3 zu entnehmen.
Claims (13)
1. Verfahren zur Bestimmung von immunologisch nach
weisbaren Substanzen nach dem Prinzip des hetero
genen Immunoassays durch Inkubation mit mindestens
zwei Rezeptoren R1 und R2, von denen R1 die Bindung
an die feste Phase vermittelt und R2 ein Konjugat
aus einem mit einer zu bestimmenden Substanz bin
defähigen Liganden und einer Markierung ist, unter
Verwendung einer Festphase, an die eine spezifisch
bindefähige Reaktionskomponente gebunden ist,
Trennung der festen von der flüssigen Phase und
Bestimmung der Markierung in einer der beiden Pha
sen, dadurch
gekennzeichnet, daß man als
Festphase ein Material verwendet, an dessen Ober
fläche spezifisch bindefähige Partner gebunden sind
und daß man die Probelösung mit mehreren verschie
denen Rezeptoren R1 inkubiert, wobei jeder Rezeptor
R1 sowohl Bindestellen für den an der Festphase
gebundenen spezifisch bindefähigen Partner als auch
Bindestellen für eine der zu bestimmenden Substan
zen aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man als Fest
phase ein Material verwendet, an dessen Oberfläche
Partner P1 eines spezifisch bindenden Paares
gebunden sind und daß man die Probelösung mit meh
reren verschiedenen Rezeptoren R1 inkubiert, wobei
jeder Rezeptor R1 ein Konjugat aus dem Partner P2
des spezifisch bindenden Paares und jeweils einem
mit einer nachzuweisenden Substanz bindefähigen
Liganden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß man verschiedene Rezeptoren R2 verwendet, wobei
verschiedene mit zu bestimmenden Substanzen binde
fähige Liganden und verschiedene Markierungen ver
wendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Rezeptor R2 ein Konjugat verwendet wird,
das aus einem mit allen nachzuweisenden Substanzen
bindefähigen Liganden und einer Markierung
besteht.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß für
Rezeptor R2 monoklonale Antikörper verwendet wer
den.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß als spezifisch bindendes Paar P1-P2 Streptavi
din-Biotin, Avidin-Biotin, Antibiotin-Antikörper-
Biotin, Hapten-Antikörper, Lektin-Zucker oder
Antigen-Antikörper verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß in einer Probelösung gleichzeitig verschiedene
Antikörper nachgewiesen werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß in einer Probelösung gleichzeitig verschiedene
Tumormarker, Hormone, Allergene oder Krankheitser
reger nachgewiesen werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß in einer Probelösung gleichzeitig verschiedene
Antikörper und verschiedene Antigene oder Haptene
nachgewiesen werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als feste Phase ein Reaktionsgefäß verwen
det, dessen Wände an der Innenoberfläche mit
Streptavidin oder Avidin beschichtet sind.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Liganden für Rezeptor R1 jeweils monoklo
nale Antikörper verwendet werden.
12. Reagenz zur Bestimmung von immunologisch nachweis
baren Substanzen, umfassend eine feste Phase, an
deren Oberfläche spezifisch bindende Partner ge
bunden sind, verschiedene Rezeptoren R1, die je
weils Bindestellen für eine der nachzuweisenden
Substanzen und Bindestellen für den an der Fest
phase gebundenen, spezifisch bindenden Partner
haben und Rezeptoren R2, die Konjugate aus einem
mit einer zu bestimmenden Substanz bindefähigen
Liganden und einer Markierung sind.
13. Reagenz nach Anspruch 12, dadurch
gekennzeichnet, daß die Festphase
ein innen mit Streptavidin oder Avidin beschichte
tes Reaktionsgefäß, die Rezeptoren R1 jeweils Kon
jugate aus Biotin und jeweils einem mit einer zu
bestimmenden Substanz bindefähigen Liganden und R2
Konjugate aus einem mit einer zu bestimmenden Sub
stanz bindefähigen Liganden und einer Markierung
sind.
Priority Applications (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19893924239 DE3924239A1 (de) | 1989-07-21 | 1989-07-21 | Verfahren zur bestimmung von immunologisch nachweisbaren substanzen |
CA002008100A CA2008100A1 (en) | 1989-01-20 | 1990-01-18 | Method for the determination of immunologically detectable substance |
AU48582/90A AU633041B2 (en) | 1989-01-20 | 1990-01-19 | Method for the determination of immunologically detectable substances |
ES90101095T ES2055172T3 (es) | 1989-01-20 | 1990-01-19 | Procedimiento y reactivo para determinar sustancias detectables inmunologicamente. |
EP90101095A EP0379216B1 (de) | 1989-01-20 | 1990-01-19 | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von immunologisch nachweisbaren Substanzen |
DE59005973T DE59005973D1 (de) | 1989-01-20 | 1990-01-19 | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von immunologisch nachweisbaren Substanzen. |
DK90101095.9T DK0379216T3 (da) | 1989-01-20 | 1990-01-19 | Fremgangsmåde og reagens til bestemmelse af immunologisk påviselige substanser |
AT90101095T ATE107030T1 (de) | 1989-01-20 | 1990-01-19 | Verfahren und reagenz zur bestimmung von immunologisch nachweisbaren substanzen. |
JP2008556A JPH0827284B2 (ja) | 1989-01-20 | 1990-01-19 | 免疫学的に検出可能の物質を測定する方法および試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19893924239 DE3924239A1 (de) | 1989-07-21 | 1989-07-21 | Verfahren zur bestimmung von immunologisch nachweisbaren substanzen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3924239A1 true DE3924239A1 (de) | 1991-01-24 |
Family
ID=6385576
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19893924239 Withdrawn DE3924239A1 (de) | 1989-01-20 | 1989-07-21 | Verfahren zur bestimmung von immunologisch nachweisbaren substanzen |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3924239A1 (de) |
-
1989
- 1989-07-21 DE DE19893924239 patent/DE3924239A1/de not_active Withdrawn
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1143248B1 (de) | Verfahren zu Immobilisierung von Konjugaten in diagnostischen Tests | |
US5518887A (en) | Immunoassays empolying generic anti-hapten antibodies and materials for use therein | |
DE69837087T2 (de) | Analysevorrichtung mit abnehmbarem element | |
DE4037724C2 (de) | Vorrichtungen für Immunoassays und deren Materialien | |
EP0407904B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines Analyten | |
EP0298368A2 (de) | Immunoassay mit Verwendung von nichtmetallischen, kolloidalen Teilchen | |
EP0516095A2 (de) | Verfahren und Vorrichtung für spezifische Bindungsassay | |
US5270166A (en) | Immunoassays employing generic anti-hapten antibodies and materials for use therein | |
US4894347A (en) | Erythrocyte agglutination assay | |
DE3834766A1 (de) | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz | |
EP0291086B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpers in menschlichen Körperflüssigkeiten | |
US20060246522A1 (en) | C-reactive protein immunoassay and method | |
EP0356964A2 (de) | Verfahren zur Bestimmung einer spezifisch bindefähigen Substanz | |
EP0379216B1 (de) | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von immunologisch nachweisbaren Substanzen | |
DE3822750A1 (de) | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz | |
DE3624464A1 (de) | Verfahren zum nachweis eines analyten sowie hierfuer geeignetes mittel | |
EP0055868A2 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Liganden oder Rezeptoren mittels Kompetitionsreaktion, sowie Test-Kit zur Durchführung desselben und Verwendung | |
DE3819707A1 (de) | Verfahren zur bestimmung eines antikoerpertiters | |
IE903439A1 (en) | Agglutination assay | |
DE3924239A1 (de) | Verfahren zur bestimmung von immunologisch nachweisbaren substanzen | |
RU2464572C1 (ru) | Тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина i в образце цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (варианты) | |
EP0599803B1 (de) | Verfahren zum Nachweisen von Antikörpern und Antigenen | |
DE19521388C2 (de) | Technik zur Bestimmung einer spezifisch-bindefähigen Substanz | |
DE3541611A1 (de) | Verfahren zur bestimmung eines haptens nach dem prinzip des kompetitiven immunoassays | |
AT399781B (de) | Verfahren und reaktionsgemisch zum nachweisen von antikörpern und verfahren zum herstellen des reaktionsgemisches |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |