JPH0827284B2 - 免疫学的に検出可能の物質を測定する方法および試薬 - Google Patents
免疫学的に検出可能の物質を測定する方法および試薬Info
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- JPH0827284B2 JPH0827284B2 JP2008556A JP855690A JPH0827284B2 JP H0827284 B2 JPH0827284 B2 JP H0827284B2 JP 2008556 A JP2008556 A JP 2008556A JP 855690 A JP855690 A JP 855690A JP H0827284 B2 JPH0827284 B2 JP H0827284B2
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/56988—HIV or HTLV
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、免疫学的に検出可能の２種以上の物質を不
均質免疫検定法の原理により測定する方法および同方法
に適当な試薬に関する。このような方法は、少なくとも
２種類の受容体R1およびR2（このうちR1は固相への結合
を媒介し、R2は被測定物質に結合できるリガンドおよび
標識から成る抱合体である）と一緒に、特異的結合性反
応成分（例えばストレプトアビジン）がそこに結合され
ている固相を使用して、検出可能の物質をインキュベー
トし、液相から固相を分離しかつ両相の一方で標識を測
定することによって実施される。
均質免疫検定法の原理により測定する方法および同方法
に適当な試薬に関する。このような方法は、少なくとも
２種類の受容体R1およびR2（このうちR1は固相への結合
を媒介し、R2は被測定物質に結合できるリガンドおよび
標識から成る抱合体である）と一緒に、特異的結合性反
応成分（例えばストレプトアビジン）がそこに結合され
ている固相を使用して、検出可能の物質をインキュベー
トし、液相から固相を分離しかつ両相の一方で標識を測
定することによって実施される。
従来の技術 臨床的に重要な多数のパラメーターは、免疫学的検出
方法で測定される。免疫検定法の場合には、多数の均質
的および不均質的変法がある。サンドイッチ原理による
方法またはそれから誘導された変法も頻用される。通常
は、試料溶液を、被検出物質に結合することができかつ
標識を有する受容体および固相に結合された受容体また
は固相への結合を媒介し、被検出物質に特異的に結合で
きる受容体と一緒にインキュベートする。この際固相へ
の結合を媒介する受容体を介して固相に結合された、被
検物質と標識受容体との複合体が形成される。固相を液
相から分離することによって、結合された標識を、未結
合標識から容易に分離し、両相の一つで検出することが
できる。標識の量が被検出物質の含分の尺度である。
方法で測定される。免疫検定法の場合には、多数の均質
的および不均質的変法がある。サンドイッチ原理による
方法またはそれから誘導された変法も頻用される。通常
は、試料溶液を、被検出物質に結合することができかつ
標識を有する受容体および固相に結合された受容体また
は固相への結合を媒介し、被検出物質に特異的に結合で
きる受容体と一緒にインキュベートする。この際固相へ
の結合を媒介する受容体を介して固相に結合された、被
検物質と標識受容体との複合体が形成される。固相を液
相から分離することによって、結合された標識を、未結
合標識から容易に分離し、両相の一つで検出することが
できる。標識の量が被検出物質の含分の尺度である。
ところで、一つのテストのみならず、異なる幾つかの
テストを並行的に行われなければならない様々な状況が
ある。これは例えば、特定のウイルスを標的とする抗
体、例えばHIV抗体または肝炎抗原を標的とする抗体の
診断法の場合である。一般に身体の抗原またはハプテン
に対抗して多数の異なる抗体、すなわち種々のエピトー
プに結合しうる抗体が形成される。若干のウイルスは、
不断にその表面を変化させるので、信頼できる抗原の検
出を許す抗体を見出すか、または特定ウイルスに対抗し
て形成されたすべての抗体を捕捉しうるモデル物質を見
出すことが極めて困難である、という特性を有してい
る。この理由から種々のウイルス抗原と結合しうる種々
の抗体を使用するか、または検出精度を高める種々の抗
原決定基を使用して並行テストで試験を行う。また、多
くの病像の場合、例えば腫瘍診断法において腫瘍標識を
検出する場合またはアレルゲンまたは抗−アレルゲン抗
体を検出するためのアレルギー患者の診察の場合に、種
々のパラメーターを並行的に検出することも重要であ
る。また輸血用血液の検査の場合にも、血液がなんらの
危険因子、つまりHIV抗体、肝炎病原体等を含有してい
るかどうかを確認するために、種々のテストを並行して
行うことが必要である。
テストを並行的に行われなければならない様々な状況が
ある。これは例えば、特定のウイルスを標的とする抗
体、例えばHIV抗体または肝炎抗原を標的とする抗体の
診断法の場合である。一般に身体の抗原またはハプテン
に対抗して多数の異なる抗体、すなわち種々のエピトー
プに結合しうる抗体が形成される。若干のウイルスは、
不断にその表面を変化させるので、信頼できる抗原の検
出を許す抗体を見出すか、または特定ウイルスに対抗し
て形成されたすべての抗体を捕捉しうるモデル物質を見
出すことが極めて困難である、という特性を有してい
る。この理由から種々のウイルス抗原と結合しうる種々
の抗体を使用するか、または検出精度を高める種々の抗
原決定基を使用して並行テストで試験を行う。また、多
くの病像の場合、例えば腫瘍診断法において腫瘍標識を
検出する場合またはアレルゲンまたは抗−アレルゲン抗
体を検出するためのアレルギー患者の診察の場合に、種
々のパラメーターを並行的に検出することも重要であ
る。また輸血用血液の検査の場合にも、血液がなんらの
危険因子、つまりHIV抗体、肝炎病原体等を含有してい
るかどうかを確認するために、種々のテストを並行して
行うことが必要である。
従来は、種々の抗原または抗体を並行的に検出するこ
とは極めて費用がかかった。それというのも個々の各物
質に関して別個のテストを行わねばならず、これは時間
的および作業的に費用がかかるからである。またすで
に、種々の抗原を固相に固定することによって幾つかの
抗体を並行的に同時に測定することも提案された。しか
しこの方法は、一般的には満足すべき効果をもたらさな
い、それというのも一つには妨害反応が惹起するし、二
つにはこのようなテストの場合には固相の結合容量が小
さいために感度が実際の要求に追いつかないからであ
る。
とは極めて費用がかかった。それというのも個々の各物
質に関して別個のテストを行わねばならず、これは時間
的および作業的に費用がかかるからである。またすで
に、種々の抗原を固相に固定することによって幾つかの
抗体を並行的に同時に測定することも提案された。しか
しこの方法は、一般的には満足すべき効果をもたらさな
い、それというのも一つには妨害反応が惹起するし、二
つにはこのようなテストの場合には固相の結合容量が小
さいために感度が実際の要求に追いつかないからであ
る。
欧州特許第173295号明細書には試料中の第一病原体の
第一抗原または第二病原体の第一抗体の存在を検出する
方法が記載されている。この方法の場合には、 ａ） 該試料を、第一抗原に対する抗体および第一抗体
に対する抗原がそこに結合されている固体担体上に導
き、 ｂ） 第一抗原に対する第二抗体（異なる動物種のも
の）および第一抗体に対する、異なる動物種からの抗体
を、ａ）段階から得られる複合物上に導き、 ｃ） 第一抗原に対する第二抗体および第一抗体に対す
る抗体の存在を免疫学的に検出する ことから成る。しかしこの方法の場合には、被測定物質
が実際に存在しているがどうかの識別を行うことができ
ない。したがって特異的病原体、抗原、抗体または酵素
標識またはそれらの複合物の確認は、個々の各物質に対
する常法による再試験によって行わなければならない。
第一抗原または第二病原体の第一抗体の存在を検出する
方法が記載されている。この方法の場合には、 ａ） 該試料を、第一抗原に対する抗体および第一抗体
に対する抗原がそこに結合されている固体担体上に導
き、 ｂ） 第一抗原に対する第二抗体（異なる動物種のも
の）および第一抗体に対する、異なる動物種からの抗体
を、ａ）段階から得られる複合物上に導き、 ｃ） 第一抗原に対する第二抗体および第一抗体に対す
る抗体の存在を免疫学的に検出する ことから成る。しかしこの方法の場合には、被測定物質
が実際に存在しているがどうかの識別を行うことができ
ない。したがって特異的病原体、抗原、抗体または酵素
標識またはそれらの複合物の確認は、個々の各物質に対
する常法による再試験によって行わなければならない。
発明が解決しようとする課題 そこで本発明の課題は、幾つかのパラメーターを、高
い検出感度および小さい時間消費をもって同時に測定す
ることのできる方法を提供することであった。
い検出感度および小さい時間消費をもって同時に測定す
ることのできる方法を提供することであった。
課題を解決するための手段 前記課題は、免疫学的に検出可能の２種以上の物質を
不均質免疫検定法の原理により測定する方法において、
１種の被測定物質の結合位置を有する、ビオチンの結合
された２種以上の受容体R1を、アビジンまたはストレプ
トアビジンおよび500,000以上の分子量を有する可溶性
タンパク質から成る抱合体が前記タンパク質を介して結
合された固相に、結合対：ビチオン−アビジンまたはビ
オチン−ストレプトアビジンの形成下に結合し、このよ
うにして受容体R1の結合された固相を、２種以上の被測
定物質を含有する試料溶液と接触させ、これによって１
種の受容体R1、１種の被測定物質および該被測定物質に
結合できるリガンドと標識とから成る抱合体である１種
の受容体R2から成りかつ固相に結合された２種以上の複
合体を形成しかつそれぞれの標識を測定することを特徴
とする、免疫学的に検出可能の物質を測定する方法によ
って解決される。
不均質免疫検定法の原理により測定する方法において、
１種の被測定物質の結合位置を有する、ビオチンの結合
された２種以上の受容体R1を、アビジンまたはストレプ
トアビジンおよび500,000以上の分子量を有する可溶性
タンパク質から成る抱合体が前記タンパク質を介して結
合された固相に、結合対：ビチオン−アビジンまたはビ
オチン−ストレプトアビジンの形成下に結合し、このよ
うにして受容体R1の結合された固相を、２種以上の被測
定物質を含有する試料溶液と接触させ、これによって１
種の受容体R1、１種の被測定物質および該被測定物質に
結合できるリガンドと標識とから成る抱合体である１種
の受容体R2から成りかつ固相に結合された２種以上の複
合体を形成しかつそれぞれの標識を測定することを特徴
とする、免疫学的に検出可能の物質を測定する方法によ
って解決される。
また、本発明は前記測定方法を実施するために適当な
測定試薬も提供する。すなわち該試薬は、アビジンまた
はストレプトアビジンおよび500,000以上の分子量を有
する可溶性タンパク質から成る抱合体が前記タンパク質
を介してその表面に結合されている固相、ビオチンと１
種の被測定物質に結合できるリガンドとから成る抱合体
である２種以上の受容体R1および１種の被測定物質に結
合できるリガンドと標識とから成る抱合体である２種以
上の受容体R2から成る。
測定試薬も提供する。すなわち該試薬は、アビジンまた
はストレプトアビジンおよび500,000以上の分子量を有
する可溶性タンパク質から成る抱合体が前記タンパク質
を介してその表面に結合されている固相、ビオチンと１
種の被測定物質に結合できるリガンドとから成る抱合体
である２種以上の受容体R1および１種の被測定物質に結
合できるリガンドと標識とから成る抱合体である２種以
上の受容体R2から成る。
意外にも、本発明による方法を用いると、種々の物質
を同時に測定することができる。所望のパラメーターの
全スペクトルが単純にして僅かな時間消費でカバーされ
うる。
を同時に測定することができる。所望のパラメーターの
全スペクトルが単純にして僅かな時間消費でカバーされ
うる。
本発明による方法は不均質免疫検定法のすべての変法
に対して好適である。
に対して好適である。
該方法の場合、前記可溶性タンパク質を介してアビジ
ンまたはストレプトアビジン（特異的結合性パートナー
という）がその表面に結合された固相を使用する。この
結合の場合まず前記可溶性タンパク質と特異的結合パー
トナーを反応させて抱合体を形成する。次にこの抱合体
の前記タンパク質を固相表面に吸着させることによって
抱合体と固相との結合が達成される。このための方法手
段は公知である。
ンまたはストレプトアビジン（特異的結合性パートナー
という）がその表面に結合された固相を使用する。この
結合の場合まず前記可溶性タンパク質と特異的結合パー
トナーを反応させて抱合体を形成する。次にこの抱合体
の前記タンパク質を固相表面に吸着させることによって
抱合体と固相との結合が達成される。このための方法手
段は公知である。
固相としては自体公知の物質、すなわちプラスチッ
ク、ガラス、紙キャリヤー、セラミック、ラテックス、
磁気粒子等を使用する。固相は例えば、反応管、試薬担
体バンドまたは球の形で存在していてよい。有利な実施
態様の場合には、固相は反応容器の形で、極めて有利に
は、内表面が少なくとも部分的に特異的結合性パートナ
ーで被覆されている壁を有するキュベットとして存在し
ている。反応容器の材料としては公知材料が適当であっ
て、ポリスチロール、ポリスチロールコポリマー、ポリ
カーボネート、ポリアクリレートおよびポリメタクリレ
ートが有利である。
ク、ガラス、紙キャリヤー、セラミック、ラテックス、
磁気粒子等を使用する。固相は例えば、反応管、試薬担
体バンドまたは球の形で存在していてよい。有利な実施
態様の場合には、固相は反応容器の形で、極めて有利に
は、内表面が少なくとも部分的に特異的結合性パートナ
ーで被覆されている壁を有するキュベットとして存在し
ている。反応容器の材料としては公知材料が適当であっ
て、ポリスチロール、ポリスチロールコポリマー、ポリ
カーボネート、ポリアクリレートおよびポリメタクリレ
ートが有利である。
受容体R1としては、固相に結合された特異的結合性パ
ートナーP1（アビジンまたはストレプトアビジン）に相
補的な特異的結合性パートナーP2（ビオチン）および１
種の被検出物質に結合しうるリガンドから成る抱合体を
使用する。リガンドは、被検出物質に応じて、抗体、抗
体フラグメント、抗原、ハプテンまたは結合タンパク質
であってよい。抗原としては、病原体例えば細菌性抗
原、原生動物抗原、アレルゲンまたはウイルス抗原の全
部分または精製部分を使用することができる。抗原は天
然物質、組換え物質、または化学的に合成されたまたは
変性されたペプチドまたは炭水化物であってよい。すな
わち例えば、HIV抗体を検出する場合の受容体R1のリガ
ンドとしては、種々の抗原決定基（エピドープ）p24、g
p41およびgp32を使用する。例えば肝炎発症の本性およ
び経過を検証しようとする場合には、受容体R1のリガン
ドとして、種々のウイルス抗原、HBcAg、HBsAg、HBeA
g、HAV等を使用することができる。該方法をアレルギー
検出のために使用する場合には、リガンドとして種々の
アレルゲンを使用して相応の抗体の存在を検出する。腫
瘍標識を検出するためには、受容体R1として適当な種々
の抗体を使用する、例えば受容体R1としてCEA（ガン胎
児性抗原）、AFP（αフェトプロティン）、CA（ガン抗
原）15.3に対する抗体を並列的に使用することができ
る。ホルモン測定のためには、TSH、LH、FSH、コルチソ
ル、プロラクチン等に対する抗体が適当である。同様に
疾病の検出のためには、種々のウイルス−、細菌−また
は原生動物抗原に対する抗体を使用してもよい。もちろ
ん抗体の代わりに、それらのフラグメント、つまりFab
−、Fab′−またはＦ（ab′）２フラグメントを使用し
てもよい。抗体はポリクローナルまたはモノクローナル
であってもよい。
ートナーP1（アビジンまたはストレプトアビジン）に相
補的な特異的結合性パートナーP2（ビオチン）および１
種の被検出物質に結合しうるリガンドから成る抱合体を
使用する。リガンドは、被検出物質に応じて、抗体、抗
体フラグメント、抗原、ハプテンまたは結合タンパク質
であってよい。抗原としては、病原体例えば細菌性抗
原、原生動物抗原、アレルゲンまたはウイルス抗原の全
部分または精製部分を使用することができる。抗原は天
然物質、組換え物質、または化学的に合成されたまたは
変性されたペプチドまたは炭水化物であってよい。すな
わち例えば、HIV抗体を検出する場合の受容体R1のリガ
ンドとしては、種々の抗原決定基（エピドープ）p24、g
p41およびgp32を使用する。例えば肝炎発症の本性およ
び経過を検証しようとする場合には、受容体R1のリガン
ドとして、種々のウイルス抗原、HBcAg、HBsAg、HBeA
g、HAV等を使用することができる。該方法をアレルギー
検出のために使用する場合には、リガンドとして種々の
アレルゲンを使用して相応の抗体の存在を検出する。腫
瘍標識を検出するためには、受容体R1として適当な種々
の抗体を使用する、例えば受容体R1としてCEA（ガン胎
児性抗原）、AFP（αフェトプロティン）、CA（ガン抗
原）15.3に対する抗体を並列的に使用することができ
る。ホルモン測定のためには、TSH、LH、FSH、コルチソ
ル、プロラクチン等に対する抗体が適当である。同様に
疾病の検出のためには、種々のウイルス−、細菌−また
は原生動物抗原に対する抗体を使用してもよい。もちろ
ん抗体の代わりに、それらのフラグメント、つまりFab
−、Fab′−またはＦ（ab′）２フラグメントを使用し
てもよい。抗体はポリクローナルまたはモノクローナル
であってもよい。
本発明による方法で使用する第２の受容体R2は、１種
の被測定物質に結合しうるリガンドおよび標識から成る
抱合体である。標識のためには多数の手段が公知であっ
て、本発明方法にも適する。例えば、放射性同位元素:
125I、131I、51Cr、35Sおよび3H、酵素：ペルオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリ性ホスファ
ターゼ、蛍光性または化学的発光性物質または他の方式
で検出可能の物質を使用することができる。またはR2の
ために使用されるリガンドは、例えば特定の抗体、例え
ばHIVの検出のために種々の抗原を使用する場合には、
すべての被検出物質と結合できる成分であってもよい。
この場合にはまた標識もすべての受容体R2に関して同じ
である。種々のアレルゲンのIgE抗体の同時測定の場合
にも同様なことがいえる。種々のパラメーターを並列的
に測定しようとする場合には、個々の被検出物質に特異
的に結合しうる、それぞれ異なるリガンドを受容体R2に
ついて使用することができる。個々のパラメーターの並
列的測定は２種類の別法で行うことができる。
の被測定物質に結合しうるリガンドおよび標識から成る
抱合体である。標識のためには多数の手段が公知であっ
て、本発明方法にも適する。例えば、放射性同位元素:
125I、131I、51Cr、35Sおよび3H、酵素：ペルオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリ性ホスファ
ターゼ、蛍光性または化学的発光性物質または他の方式
で検出可能の物質を使用することができる。またはR2の
ために使用されるリガンドは、例えば特定の抗体、例え
ばHIVの検出のために種々の抗原を使用する場合には、
すべての被検出物質と結合できる成分であってもよい。
この場合にはまた標識もすべての受容体R2に関して同じ
である。種々のアレルゲンのIgE抗体の同時測定の場合
にも同様なことがいえる。種々のパラメーターを並列的
に測定しようとする場合には、個々の被検出物質に特異
的に結合しうる、それぞれ異なるリガンドを受容体R2に
ついて使用することができる。個々のパラメーターの並
列的測定は２種類の別法で行うことができる。
第一の別法の場合には方法を多相的に実施する。この
場合には、それぞれ同一標識を有する異なる受容体R2を
順次に加える。各受容体R2はそれぞれ１種の被検出物質
とのみ反応することができるので、受容体を加えた後そ
の都度、結合されたまたは結合されなかった標識の量を
測定することができ、この量がそれぞれの被検出物質の
尺度である。
場合には、それぞれ同一標識を有する異なる受容体R2を
順次に加える。各受容体R2はそれぞれ１種の被検出物質
とのみ反応することができるので、受容体を加えた後そ
の都度、結合されたまたは結合されなかった標識の量を
測定することができ、この量がそれぞれの被検出物質の
尺度である。
第二の別法の場合には、方法を単相的に実施する。こ
の別法は、自動分析装置でも行うことができるので優先
される。この場合には、種々の受容体R2は、同時測定を
可能にするそれぞれ異なる標識、例えば区別できる放射
能を有する異なる同位元素または異なる波長で蛍光を発
する化合物を有する。同様に種々の酵素を用いる標識も
適当である。この場合には、評価のために種々の基質を
加える。該基質はそれぞれの酵素が作用すると、種々の
波長で最大吸光度を有する色を発する。
の別法は、自動分析装置でも行うことができるので優先
される。この場合には、種々の受容体R2は、同時測定を
可能にするそれぞれ異なる標識、例えば区別できる放射
能を有する異なる同位元素または異なる波長で蛍光を発
する化合物を有する。同様に種々の酵素を用いる標識も
適当である。この場合には、評価のために種々の基質を
加える。該基質はそれぞれの酵素が作用すると、種々の
波長で最大吸光度を有する色を発する。
受容体R2のリガンドとしては、受容体R1のリガンドと
同一のものが適当である。受容体R2に関して使用したリ
ガンドは、実施すべき測定に依存して受容体R1に関して
使用したリガンドと同一であってもよいしまたは異なっ
ていてもよい。抗原を検出する場合には、リガンドとし
て該抗原を標的とする抗体またはそのフラグメントおよ
び結合タンパク質を使用することができる。
同一のものが適当である。受容体R2に関して使用したリ
ガンドは、実施すべき測定に依存して受容体R1に関して
使用したリガンドと同一であってもよいしまたは異なっ
ていてもよい。抗原を検出する場合には、リガンドとし
て該抗原を標的とする抗体またはそのフラグメントおよ
び結合タンパク質を使用することができる。
抗体を検出する場合には、例えばIgG、IgA、IgM、IgE
を標的とする抗体またはそのフラグメント、または被検
出抗体に結合しうる抗原またはハプテンを使用すること
ができる。受容体R2はハプテンを使用することができ、
受容体R2は混合物の形または架橋された生成物の形であ
ってもよい。架橋は、自体公知の方法で、例えば二宮能
性または多官能性リンカーを使用して行うことができ
る。このための方法は当業者に周知であって、詳述は不
要である。
を標的とする抗体またはそのフラグメント、または被検
出抗体に結合しうる抗原またはハプテンを使用すること
ができる。受容体R2はハプテンを使用することができ、
受容体R2は混合物の形または架橋された生成物の形であ
ってもよい。架橋は、自体公知の方法で、例えば二宮能
性または多官能性リンカーを使用して行うことができ
る。このための方法は当業者に周知であって、詳述は不
要である。
試料溶液は、全受容体と一緒に同時にインキュベート
してもよいしまたは先づ受容体R1と共にインキュベート
し、次に種々の受容体R2と共にインキュベートすること
もできる。他の別法も可能であって、当業者には知られ
ている。この場合２種の受容体R1およびR2との反応は均
質相で行われる。
してもよいしまたは先づ受容体R1と共にインキュベート
し、次に種々の受容体R2と共にインキュベートすること
もできる。他の別法も可能であって、当業者には知られ
ている。この場合２種の受容体R1およびR2との反応は均
質相で行われる。
本発明による方法を用いると多数の異なるパラメータ
ーの同時測定を行うことができる。単純な方法操作は自
動分析装置での同時測定を可能にする。
ーの同時測定を行うことができる。単純な方法操作は自
動分析装置での同時測定を可能にする。
本発明により、特異的に結合しうる対の一方のパート
ナー（例えばストレプトアビジン）で被覆された表面を
使用することによって、十分な結合容量が提供されるの
で、すべてのパラメーターを精密かつ高感度で再現可能
に検出することができる。例えば欧州特許第173295号明
細書、例２による方法（固相を受容体R1で直接被覆す
る）と本発明は方法（ストレプトアビジンで被覆）につ
いて検出感度を比較してみる。一実験例における例えば
HBsAgテストにおいては、本発明方法は前記の従来技術
の場合よりも10倍の検出感度を示した。
ナー（例えばストレプトアビジン）で被覆された表面を
使用することによって、十分な結合容量が提供されるの
で、すべてのパラメーターを精密かつ高感度で再現可能
に検出することができる。例えば欧州特許第173295号明
細書、例２による方法（固相を受容体R1で直接被覆す
る）と本発明は方法（ストレプトアビジンで被覆）につ
いて検出感度を比較してみる。一実験例における例えば
HBsAgテストにおいては、本発明方法は前記の従来技術
の場合よりも10倍の検出感度を示した。
また本発明による方法は急速診断にも好適である。HI
V抗体およびHBsAgの同時検出によって、これらの危険要
因を含有する血液試料は即時に除去することができ、よ
り精密な診断を要しない。他方急速テストで検査する場
合には、危険要因が存在するかどうかを予め調べること
ができ、次いでより精密な診断を続けてもよい。従って
本発明によれば、ある疾病に対する特定の指示が存在す
るかどうかを極めて迅速に確認することができ、この指
示によって引き続き行われる診断が簡素化される。
V抗体およびHBsAgの同時検出によって、これらの危険要
因を含有する血液試料は即時に除去することができ、よ
り精密な診断を要しない。他方急速テストで検査する場
合には、危険要因が存在するかどうかを予め調べること
ができ、次いでより精密な診断を続けてもよい。従って
本発明によれば、ある疾病に対する特定の指示が存在す
るかどうかを極めて迅速に確認することができ、この指
示によって引き続き行われる診断が簡素化される。
次に本発明を図面により説明する。
第１図は、HIV抗体およびHBsAgの同時測定方法を示す
模式図である。固相には、ストレプトアビジンおよび50
0,000以上の分子量を有する可溶性タンパク質（例えばT
hermo−RSA）から成る抱合体が固定されている。試料溶
液を、すべてのビチオンおよびHIV抗体に結合しうる少
なくとも１種のエピトープ（p24,gp41）ないしHBsAg抗
体を含む、受容体R1としての種々の抱合体と一緒にイン
キュベートする。洗浄段階後に試料を、受容体R2として
の標識したヒトIgG（Fcγ）抗体およびHBsAg抗体と共に
インキュベートとする。標識は放射性沃素である。この
場合には受容体R1、HIV抗体ないしはHBsAgおよび受容体
R2から複合体が形成され、同複合体は固定化されたスト
レプトアビジンと可溶性タンパク質から成る抱合体への
ビチオンの結合によって固相に結合される。
模式図である。固相には、ストレプトアビジンおよび50
0,000以上の分子量を有する可溶性タンパク質（例えばT
hermo−RSA）から成る抱合体が固定されている。試料溶
液を、すべてのビチオンおよびHIV抗体に結合しうる少
なくとも１種のエピトープ（p24,gp41）ないしHBsAg抗
体を含む、受容体R1としての種々の抱合体と一緒にイン
キュベートする。洗浄段階後に試料を、受容体R2として
の標識したヒトIgG（Fcγ）抗体およびHBsAg抗体と共に
インキュベートとする。標識は放射性沃素である。この
場合には受容体R1、HIV抗体ないしはHBsAgおよび受容体
R2から複合体が形成され、同複合体は固定化されたスト
レプトアビジンと可溶性タンパク質から成る抱合体への
ビチオンの結合によって固相に結合される。
第２図は腫瘍抗原の同時測定の模式図である。この場
合には固相に第１図と同様にストレプトアビジンと可溶
性タンパク質から成る抱合体が固定化される。受容体R1
としては、それぞれ腫瘍抗原（CEA、CA15.3）を標的と
する抗体使用する。受容体R2としては、腫瘍抗原を標的
とする抗体のFabフラグメントを有する架橋ペルオキシ
ダーゼを使用する。インキュベーションの際に腫瘍抗原
−抗体（CEA抗体、CA15.3抗体）が試料中に存在する腫
瘍抗原と結合する。さらに、架橋されたペルオキシダー
ゼ（POD）が相応のFab抗体を介して同様に腫瘍後原に結
合する。これによって形成される複合体の固定化は、ス
トレプトアビジン＋可溶性タンパク質−抱合体への結合
によって行われる。
合には固相に第１図と同様にストレプトアビジンと可溶
性タンパク質から成る抱合体が固定化される。受容体R1
としては、それぞれ腫瘍抗原（CEA、CA15.3）を標的と
する抗体使用する。受容体R2としては、腫瘍抗原を標的
とする抗体のFabフラグメントを有する架橋ペルオキシ
ダーゼを使用する。インキュベーションの際に腫瘍抗原
−抗体（CEA抗体、CA15.3抗体）が試料中に存在する腫
瘍抗原と結合する。さらに、架橋されたペルオキシダー
ゼ（POD）が相応のFab抗体を介して同様に腫瘍後原に結
合する。これによって形成される複合体の固定化は、ス
トレプトアビジン＋可溶性タンパク質−抱合体への結合
によって行われる。
例 １ 後HIVテスト HIV抗体は２段階サンドイッチ免疫検定法で測定す
る。検出のためには、次の組成を有する試薬を使用す
る。
る。検出のためには、次の組成を有する試薬を使用す
る。
試薬1: １種以上のビオチニル化HIV抗原各10-7mol/ 燐酸塩緩衝液（pH7.0）40mmol/ 食塩0.9重量％ ウシ血清10容量％ 抗原としては次のものを使用する： 遺伝子工学的に製造されたHIV抗原:HIV1−gp41（gp41
−rek.,CentocorTM−p121）およびHIV1−p24（p24−re
k.,CentocrTM−pg2）、化学的に合成されたペプチド:HI
V1−gp41（gp41−pep,Wand等、PNAS,83,6159,1986）お
よびHIV2−gp32−pep,Gnann,J.W等、Science、237、134
6,1987）。これらの抗原を、リアリー（Leary）等（PNA
S,80,4045,1983）によって記載されているように、ビオ
チンで標識した。
−rek.,CentocorTM−p121）およびHIV1−p24（p24−re
k.,CentocrTM−pg2）、化学的に合成されたペプチド:HI
V1−gp41（gp41−pep,Wand等、PNAS,83,6159,1986）お
よびHIV2−gp32−pep,Gnann,J.W等、Science、237、134
6,1987）。これらの抗原を、リアリー（Leary）等（PNA
S,80,4045,1983）によって記載されているように、ビオ
チンで標識した。
試薬2: ヒト免疫グロブリンに対するヒツジ抗体およびPOD（ペ
ルオキシダーゼ）から成る抱合体20mU/ml 燐酸塩干渉液（pH7.0）40mmol/ トウイーン（Tween）200.05重量％ ウシ血清アルブミン0.2％ ウシのIgG 0.2％ ポリスチロール管 熱的に凝縮したRSA（ウシ血清アルブミン）（以下に
はThermo−RSAと記載する）を次のようにして製造した:
RSAを50mmol燐酸カルシウム溶液100ml中にpH7.0で溶か
し、70℃に加熱し、軽く攪拌しながらこの温度で４時間
保った。この溶液を冷却し、濾過し、50mg/mlの濃度に
調節した。次に30倍の容積の蒸留水に対して透析した。
ルオキシダーゼ）から成る抱合体20mU/ml 燐酸塩干渉液（pH7.0）40mmol/ トウイーン（Tween）200.05重量％ ウシ血清アルブミン0.2％ ウシのIgG 0.2％ ポリスチロール管 熱的に凝縮したRSA（ウシ血清アルブミン）（以下に
はThermo−RSAと記載する）を次のようにして製造した:
RSAを50mmol燐酸カルシウム溶液100ml中にpH7.0で溶か
し、70℃に加熱し、軽く攪拌しながらこの温度で４時間
保った。この溶液を冷却し、濾過し、50mg/mlの濃度に
調節した。次に30倍の容積の蒸留水に対して透析した。
ストレプトアビジンとThermo−RSA（可溶性タンパク
質）とから成る抱合体の製造： ストレプトミセス・アビジニー（Streptomyces avidi
nii）から得られたストレプトアビシンをマレイミド−
ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシニイミドと反応
させ、このようにしてマレイミド基を有するストレプト
アビジンが得られた。Thermo−RSAをＳ−アセチルメル
カプトコハク酸無水物と反応させ、次に保護されたSH基
をヒドロキシルアミンを加えて遊離した。ストレプトア
ビジンを含むマレイミド基を次にSH基を有するThermo−
RSAと混合すると所望の抱合体が形成された。
質）とから成る抱合体の製造： ストレプトミセス・アビジニー（Streptomyces avidi
nii）から得られたストレプトアビシンをマレイミド−
ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシニイミドと反応
させ、このようにしてマレイミド基を有するストレプト
アビジンが得られた。Thermo−RSAをＳ−アセチルメル
カプトコハク酸無水物と反応させ、次に保護されたSH基
をヒドロキシルアミンを加えて遊離した。ストレプトア
ビジンを含むマレイミド基を次にSH基を有するThermo−
RSAと混合すると所望の抱合体が形成された。
次にポリスチロールから成るプラスチック管にストレ
プトアビジン−Thermo−RSA抱合体を負荷させた。この
負荷はストレプトアビジン−Thermo−RSA溶液1.5mlを用
いて行った、この際燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）40m
mol/中の両成分のモル比は、20℃で18〜24時間の間1.
8:1（11μg/ml）であった。
プトアビジン−Thermo−RSA抱合体を負荷させた。この
負荷はストレプトアビジン−Thermo−RSA溶液1.5mlを用
いて行った、この際燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）40m
mol/中の両成分のモル比は、20℃で18〜24時間の間1.
8:1（11μg/ml）であった。
次に管を吸引した後、サッカロース２％、塩化ナトリ
ウム0.9％およびRSA0.3％の溶液1.8mlを20℃で30分間負
荷させた。乾燥（20℃、相対湿度40％で24時間）後に該
管は使用状態にあり、保存可能であった。
ウム0.9％およびRSA0.3％の溶液1.8mlを20℃で30分間負
荷させた。乾燥（20℃、相対湿度40％で24時間）後に該
管は使用状態にあり、保存可能であった。
ストレプトアビジン−Thermo−RSA−抱合体の施され
たポリスチロール管で、試薬１ 1mlおよびヒト血清ま
たは−血漿10μを室温で１時間インキュベートした。
次に水道水で３回洗浄し、試薬２ 1mlを室温で１時間
インキュベートした。再び水道水で３回洗浄し、検出反
応のためにABTS基質溶液を加えた。60分後に422nmでの
吸光度を測光的に測定した。
たポリスチロール管で、試薬１ 1mlおよびヒト血清ま
たは−血漿10μを室温で１時間インキュベートした。
次に水道水で３回洗浄し、試薬２ 1mlを室温で１時間
インキュベートした。再び水道水で３回洗浄し、検出反
応のためにABTS基質溶液を加えた。60分後に422nmでの
吸光度を測光的に測定した。
抗HIVテストを、個々のHIV抗原および組合せ抗原の使
用下に行った。この際ストレプトアビジン−Thermo−RS
A−抱合体の施されたポリスチロール管でのテスト操作
が幾つかの抗体または抗体群の同時測定にとって適当で
あり（選別テスト；表１）、これらの抗体等がそれらの
ウイルスまたは数種のウイルスないしは有利な抗原を標
的としているかどうかは重要ではない。
用下に行った。この際ストレプトアビジン−Thermo−RS
A−抱合体の施されたポリスチロール管でのテスト操作
が幾つかの抗体または抗体群の同時測定にとって適当で
あり（選別テスト；表１）、これらの抗体等がそれらの
ウイルスまたは数種のウイルスないしは有利な抗原を標
的としているかどうかは重要ではない。
例 ２（参考例） 試料溶液について肝炎Ｓ抗原およびHIV抗体を、２段
階サンドイッチ免疫検定法で測定した。
階サンドイッチ免疫検定法で測定した。
試薬1: 燐酸塩緩衝液（pH7.0）40mmol/、 トウイーン20 0.1％、 NaCl 0.9％、 フェノール 0.01％、 ウシ血清アルブミン 0.2％ HBsAgに対するFITC標識モノクローナル抗体300ng/ml、 HIVのFITC標識p24およびgp41抗原各600ng/ml。
（FITC＝フルオレセインイソチオシアネート） 試薬2: 燐酸塩緩衝液（pH7.0）40mmol/、 トウイーン20 0.1％、 酒石酸ナトリウム 0.2 mol/、 フェノール 0.01％、 ウシ血清アルブミン 0.2％、 ヒトIgG対抗に対する125I標識ポリクローナルヒツジ抗
体およびHBsAgに対するモノクローナル抗体各5000cpm。
体およびHBsAgに対するモノクローナル抗体各5000cpm。
ポリスチロール管に、FITCに対するヒツジ抗体1ml
（炭酸塩緩衝液（pH9.6）0.1mol/中の50μg/ml）を室
温で18時間被覆し、ウシ血清アルブミン1ml（燐酸塩緩
衝液0.1 mol/中の10mg/ml）を室温で１時間被覆し
た。
（炭酸塩緩衝液（pH9.6）0.1mol/中の50μg/ml）を室
温で18時間被覆し、ウシ血清アルブミン1ml（燐酸塩緩
衝液0.1 mol/中の10mg/ml）を室温で１時間被覆し
た。
試料50μを、試薬１ 1mlと共に室温で２時間イン
キュベートした。水で３回洗浄した後、試薬２ 1mlと
共に室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した
後、該管をガンマー計数器で測定した。測定結果を表２
に示す。
キュベートした。水で３回洗浄した後、試薬２ 1mlと
共に室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した
後、該管をガンマー計数器で測定した。測定結果を表２
に示す。
例 ３（参考例） 試料溶液において、腫瘍標識CEAおよびCA15.3を１段階
サンドイッチ免疫検定法で同時に測定した。使用した試
薬は次の組成を有していた： PODおよび腫瘍標識CEAおよびCA15.3に対するモノクロー
ナル抗体それぞれのFabフラグメント120mU/ml、 燐酸塩緩衝液（pH7.0）40mmol/、 プルロニック（Pluronic）F68 0.5％、 酒石酸ナトリウム 0.2mol/、 フェノール 0.01％、 ウシ血清アルブミン 0.2％、 CEAおよびCA15.3に対するビオチニル化モノクローナル
抗体各300ng/ml。
サンドイッチ免疫検定法で同時に測定した。使用した試
薬は次の組成を有していた： PODおよび腫瘍標識CEAおよびCA15.3に対するモノクロー
ナル抗体それぞれのFabフラグメント120mU/ml、 燐酸塩緩衝液（pH7.0）40mmol/、 プルロニック（Pluronic）F68 0.5％、 酒石酸ナトリウム 0.2mol/、 フェノール 0.01％、 ウシ血清アルブミン 0.2％、 CEAおよびCA15.3に対するビオチニル化モノクローナル
抗体各300ng/ml。
CEAおよびCA15.3に対するビオニチル化モノクローナ
ル抗体に関しては、POD抱合体におけるFebフラグメント
がそれぞれ、ビオチニル化抗体とは異なるエピトープを
標的としていることのみが要求される。
ル抗体に関しては、POD抱合体におけるFebフラグメント
がそれぞれ、ビオチニル化抗体とは異なるエピトープを
標的としていることのみが要求される。
ポリスチロール管に、ヒツジの抗−マウスFcγ抗体1m
l（炭酸塩緩衝液（pH9.6）0.1mol/中の50μg/ml）を
室温で18時間施し、ウシ血清アルブミン1ml（燐酸塩緩
衝液0.1mol/中の10mg/ml）を室温で１時間施した。前
記試薬1mlおよび試料100μを室温で２時間インキュベ
ートした。次に水道水で３回洗浄した。次に検出反応の
ためにABTS 基質溶液1mlを加えた。１時間後に405nmで
の吸光度を測光により測定した。測定結果は表３からわ
かる。
l（炭酸塩緩衝液（pH9.6）0.1mol/中の50μg/ml）を
室温で18時間施し、ウシ血清アルブミン1ml（燐酸塩緩
衝液0.1mol/中の10mg/ml）を室温で１時間施した。前
記試薬1mlおよび試料100μを室温で２時間インキュベ
ートした。次に水道水で３回洗浄した。次に検出反応の
ためにABTS 基質溶液1mlを加えた。１時間後に405nmで
の吸光度を測光により測定した。測定結果は表３からわ
かる。
第１図はHIV抗体およびHBsAgの同時測定を示す模式図で
あり、第２図は腫瘍抗原の同時測定を示す模式図であ
る。
あり、第２図は腫瘍抗原の同時測定を示す模式図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エルハルト・コペツキ ドイツ連邦共和国ペンツベルク・ヘンレシ ユトラーセ ２ (72)発明者 クリスチアン・クライン ドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・ブリユ ーテンシユトラーセ 16 (56)参考文献 欧州特許公開173295（ＥＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】免疫学的に検出可能の２種以上の物質を不
均質免疫検定法の原理により測定する方法において、１
種の被測定物質の結合位置を有する、ビチオンの結合さ
れた２種以上の受容体R1を、アビジンまたはストレプト
アビシンおよび500,000以上の分子量を有する可溶性タ
ンパク質から成る抱合体が前記タンパク質を介して結合
された固相に、結合対：ビオチン−アビジンまたはビオ
チン−ストレプトアビジンの形成下に結合し、このよう
にして受容体R1の結合された固相を、２種以上の被測定
物質を含有する試料溶液と接触させ、これによって１種
の受容体R1、１種の被測定物質および該被測定物質に結
合できるリガンドと標識とから成る抱合体である１種の
受容体R2から成りかつ固相に結合された２種以上の複合
体を形成しかつそれぞれの標識を測定することを特徴と
する、免疫学的に検出可能の物質を測定する方法。 - 【請求項２】アビジンまたはストレプトアビジンおよび
500,000以上の分子量を有する可溶性タンパク質から成
る抱合体が前記タンパク質を介してその表面に結合され
ている固相、ビオチンと１種の被検出物質に結合できる
リガンドとから成る抱合体である２種以上の受容体R1お
よび１種の被測定物質に結合できるリガンドと標識とか
ら成る包合体である２種以上の受容体R2から成る、免疫
学的検出可能の物質の測定試薬。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3901638A DE3901638C2 (de) | 1988-05-25 | 1989-01-20 | Verfahren zur Bestimmung einer immunologisch nachweisbaren Substanz und dazu geeignetes Reaktionsgefäß |
| DE3901638.2 | 1989-01-20 | ||
| DE3924239.0 | 1989-07-21 | ||
| DE19893924239 DE3924239A1 (de) | 1989-07-21 | 1989-07-21 | Verfahren zur bestimmung von immunologisch nachweisbaren substanzen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02228561A JPH02228561A (ja) | 1990-09-11 |
| JPH0827284B2 true JPH0827284B2 (ja) | 1996-03-21 |
Family
ID=25876968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008556A Expired - Lifetime JPH0827284B2 (ja) | 1989-01-20 | 1990-01-19 | 免疫学的に検出可能の物質を測定する方法および試薬 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0379216B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0827284B2 (ja) |
| AT (1) | ATE107030T1 (ja) |
| AU (1) | AU633041B2 (ja) |
| CA (1) | CA2008100A1 (ja) |
| DE (1) | DE59005973D1 (ja) |
| DK (1) | DK0379216T3 (ja) |
| ES (1) | ES2055172T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE4211108A1 (de) * | 1992-04-03 | 1993-10-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Viruslösung zum Einsatz bei Immunoassays |
| DE4218257A1 (de) * | 1992-06-03 | 1993-12-09 | Behringwerke Ag | Verfahren zur immunchemischen Bestimmung eines Analyten |
| GB2269896B (en) * | 1992-08-03 | 1997-03-12 | Marconi Gec Ltd | Separation method |
| GB2271634B (en) * | 1992-09-18 | 1997-04-09 | Marconi Gec Ltd | Separation method |
| DE4236189A1 (de) * | 1992-10-27 | 1994-04-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur simultanen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern |
| GB2273157A (en) * | 1992-11-27 | 1994-06-08 | Marconi Gec Ltd | Immunological detection/separation using a plurality of immobilised binding agents |
| BR9404967A (pt) * | 1993-04-14 | 1999-06-15 | Int Murex Tech Corp | Imunoensaio |
| GB2282884A (en) * | 1993-04-14 | 1995-04-19 | Int Murex Tech Corp | Immunoassay |
| US6383740B2 (en) | 1999-07-30 | 2002-05-07 | Bioergonomics, Inc. | Methods for simultaneously detecting both members of a binding pair |
| JP5500423B2 (ja) * | 2009-12-24 | 2014-05-21 | 東洋紡株式会社 | アレルギー検査方法 |
| CN113125715B (zh) * | 2019-12-31 | 2023-07-28 | 科美博阳诊断技术(上海)有限公司 | 一种人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| IL55816A (en) * | 1978-10-30 | 1982-04-30 | Ames Yissum Ltd | Method for simultaneous immunoassay of several different antibodies and a kit therefor |
| US4378344A (en) * | 1979-09-28 | 1983-03-29 | Ventrex Laboratories, Inc. | Method and apparatus for performing multiple, simultaneous in vitro diagnostic tests using a solid phase system |
| ZA855031B (en) * | 1984-08-31 | 1986-02-26 | New York Blood Center Inc | Assay for simultaneous detection of antigen and antibody in given serum |
| GB2181840B (en) * | 1985-10-16 | 1989-11-29 | Farmos Group Ltd | Method for the immunoassay of a macromolecular analyte |
| US4772550A (en) * | 1986-02-10 | 1988-09-20 | Miles Inc. | Heterogeneous specific binding assay employing an aggregatable binding reagent |
| US4778751A (en) * | 1986-05-12 | 1988-10-18 | Diagnostic Products Corporation | Method for measuring antigens or antibodies in biological fluids using ligand labeled antigens or ligand labeled antibodies |
| FR2601455B1 (fr) * | 1986-07-11 | 1989-08-04 | Stallergenes Lab | Nouveaux reactifs biologiques en phase solide et leur procede d'obtention |
| DE3705686C2 (de) * | 1987-02-23 | 1995-11-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern |
-
1990
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- 1990-01-19 EP EP90101095A patent/EP0379216B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-19 ES ES90101095T patent/ES2055172T3/es not_active Expired - Lifetime
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- 1990-01-19 AU AU48582/90A patent/AU633041B2/en not_active Ceased
- 1990-01-19 DE DE59005973T patent/DE59005973D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-19 AT AT90101095T patent/ATE107030T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-19 JP JP2008556A patent/JPH0827284B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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