JPS59202064A - 抗原決定基具有物質を測定する方法 - Google Patents
抗原決定基具有物質を測定する方法Info
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- JPS59202064A JPS59202064A JP58077255A JP7725583A JPS59202064A JP S59202064 A JPS59202064 A JP S59202064A JP 58077255 A JP58077255 A JP 58077255A JP 7725583 A JP7725583 A JP 7725583A JP S59202064 A JPS59202064 A JP S59202064A
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- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
- Y10S436/817—Steroids or hormones
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は２紳の生物活性物質を場を分離して固定した固
定化物を用いて、例えば血液に含まれる薬物あるいは各
種疾患に由来する微量成分などを測定する方法に関する
ものである。
定化物を用いて、例えば血液に含まれる薬物あるいは各
種疾患に由来する微量成分などを測定する方法に関する
ものである。
患者に投与されている薬物、例えばノゴキンン、テオフ
ィリンなどの血中濃度を測定することは適正な治療を進
めるうえで重要であり、まだ、癌など各種の疾患に由来
する成分を検診者の血液から検出することは当該疾患の
早期発見を行なう点で極めて有効である。
ィリンなどの血中濃度を測定することは適正な治療を進
めるうえで重要であり、まだ、癌など各種の疾患に由来
する成分を検診者の血液から検出することは当該疾患の
早期発見を行なう点で極めて有効である。
そこで、血液のこれらの微量成分を検出する方法が種々
開発されているが、感度、特異性、大量検体の短時間処
理などの点にすぐれる酵素免疫測定法が賞月されている
。しかしながら、従来の酵素免疫測定法の場合には、未
だ感度が充分とはいえず、丑だ洗浄操作が繁雑であった
シ、チーープの移しかえが必要であったりして正確なａ
度を求めるととが容易でなかった。
開発されているが、感度、特異性、大量検体の短時間処
理などの点にすぐれる酵素免疫測定法が賞月されている
。しかしながら、従来の酵素免疫測定法の場合には、未
だ感度が充分とはいえず、丑だ洗浄操作が繁雑であった
シ、チーープの移しかえが必要であったりして正確なａ
度を求めるととが容易でなかった。
そこで本発明者らは、さらに感度を高めかつ繁雑な操作
の少ない分析方法を開発するべく検問を進めた結果、抗
原又は抗体と酵素又は酵素阻害・物 □質とを場を分
離して固定した固定化物を用いた抗原及び抗体の簡便な
測定法を案出し、その内容を既に特許出願した（特願昭
５７−７６６７８号）。
の少ない分析方法を開発するべく検問を進めた結果、抗
原又は抗体と酵素又は酵素阻害・物 □質とを場を分
離して固定した固定化物を用いた抗原及び抗体の簡便な
測定法を案出し、その内容を既に特許出願した（特願昭
５７−７６６７８号）。
本発明においては、この方、去にビオチン−アビジン系
の反応を糾込み、その低い結合定数を利用して、より一
層の高感度化と簡便化を達成した。
の反応を糾込み、その低い結合定数を利用して、より一
層の高感度化と簡便化を達成した。
すなわち本発明は、測定対象たる抗原決定基具有物質（
１）と反応する抗体又はこの抗体と反応する抗原決定基
具有物質（２）とビオチン酵素又はビオチン酵素阻害物
質とを担体に各々の固定相を分離して固定した固定化物
と、前記抗体と反応する抗原決定基具有物質（２）又は
前記抗原決定基具有物質（２）と反応する抗体と前記ビ
オチン酵素と反応するビオチン酵素阻害物質又は前記ビ
オチン酵素阻害物質と反応するビオチン酵素とを結合し
た結合物と、測定対象たる抗原決定基具有物質（１）と
を水溶液中で共存せしめ、その後膣固定化物又は水溶液
のビオチン酵素活性又はピオチン酵累ｊ岨害物仙の活性
を測定することを特徴とする抗原決定基具有物質の測定
方法に関するものである。
１）と反応する抗体又はこの抗体と反応する抗原決定基
具有物質（２）とビオチン酵素又はビオチン酵素阻害物
質とを担体に各々の固定相を分離して固定した固定化物
と、前記抗体と反応する抗原決定基具有物質（２）又は
前記抗原決定基具有物質（２）と反応する抗体と前記ビ
オチン酵素と反応するビオチン酵素阻害物質又は前記ビ
オチン酵素阻害物質と反応するビオチン酵素とを結合し
た結合物と、測定対象たる抗原決定基具有物質（１）と
を水溶液中で共存せしめ、その後膣固定化物又は水溶液
のビオチン酵素活性又はピオチン酵累ｊ岨害物仙の活性
を測定することを特徴とする抗原決定基具有物質の測定
方法に関するものである。
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
本発明の方法における測定対象は抗原決定基具有物質（
１）（以下、リガンド（１）という。）である。リガン
ド（１）は、例えば、各鍾内分泌喋に由来するホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フェリチン等の血漿
蛋白質、ＨＢ抗原等のウィルス、バクテリア、α〜フェ
トノロティ／、癌胎児性抗原等の各種臓器あるいは血中
、尿中に存するものを挙げることができる。リガ゛ノド
（１）に含捷れる抗原決定基の数はひとつであってもよ
く、二以上であってもよい。このりがノド（１）にはハ
プテン及び２抗体法における第１抗体も含１れる。
１）（以下、リガンド（１）という。）である。リガン
ド（１）は、例えば、各鍾内分泌喋に由来するホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フェリチン等の血漿
蛋白質、ＨＢ抗原等のウィルス、バクテリア、α〜フェ
トノロティ／、癌胎児性抗原等の各種臓器あるいは血中
、尿中に存するものを挙げることができる。リガ゛ノド
（１）に含捷れる抗原決定基の数はひとつであってもよ
く、二以上であってもよい。このりがノド（１）にはハ
プテン及び２抗体法における第１抗体も含１れる。
また、？Ｊｌｌｌ定対象たるすがノド（１）とは本発明
法における測定対象であることはいうまでもなく、例え
ば２抗体法においては測定の目的物である抗原と第１抗
体との結合物がｆｉｌ＋定対象たるυヵ゛ノド（１）に
なる。
法における測定対象であることはいうまでもなく、例え
ば２抗体法においては測定の目的物である抗原と第１抗
体との結合物がｆｉｌ＋定対象たるυヵ゛ノド（１）に
なる。
次に、本発明の方法に使用される固定化物は、抗体又は
抗原決定基具有物質（２）（以下、リガンド（２）とい
う。）とビオチン酵素又はビオチン酵素阻害物質とが担
体に各々の固定相が分離されて固定されているものであ
る。
抗原決定基具有物質（２）（以下、リガンド（２）とい
う。）とビオチン酵素又はビオチン酵素阻害物質とが担
体に各々の固定相が分離されて固定されているものであ
る。
抗体はりカーノド（１）と反応するものでなければなラ
ス、リカ゛ノド（２）はこの抗体と反応するものでなけ
ればならない。すなわち、リガンド（１）とリノｆノド
（２）とは少なくとも−の抗原決定基が共通していなけ
ればならず、抗体はこの共通の抗原決定基に対するもの
でなければならない。この抗体にはＦ（ａｂ′）７ 、
Ｆａｂ’ 、 Ｆａｂなどのフラグメントも含寸れる
。リガンド（２）の抗原決定基＋ｄ １以上がリガンド
（１）と共通であればよく、全てが共通であってもよい
。従って、リガンド（２）はりがノド（１）と同一であ
ってもよい。
ス、リカ゛ノド（２）はこの抗体と反応するものでなけ
ればならない。すなわち、リガンド（１）とリノｆノド
（２）とは少なくとも−の抗原決定基が共通していなけ
ればならず、抗体はこの共通の抗原決定基に対するもの
でなければならない。この抗体にはＦ（ａｂ′）７ 、
Ｆａｂ’ 、 Ｆａｂなどのフラグメントも含寸れる
。リガンド（２）の抗原決定基＋ｄ １以上がリガンド
（１）と共通であればよく、全てが共通であってもよい
。従って、リガンド（２）はりがノド（１）と同一であ
ってもよい。
リガンド（１）及びすがノド（２）に共通の抗原決定基
と反応する抗体はリガンド（１）もしくはりガント（２
）又はこれらのいずれかと蛋白との結合物を兎、山羊、
馬、モルモット、ニワトリなどの温血動物に体】ＩＩ′
Ｉｋｇめたり０３〜２ ｎｒ９を１〜数回貨中皮下、フ
ット・ぐノド、太腿筋等にアノ−バントとともに注射し
て当該動物の体内に形成させる。
と反応する抗体はリガンド（１）もしくはりガント（２
）又はこれらのいずれかと蛋白との結合物を兎、山羊、
馬、モルモット、ニワトリなどの温血動物に体】ＩＩ′
Ｉｋｇめたり０３〜２ ｎｒ９を１〜数回貨中皮下、フ
ット・ぐノド、太腿筋等にアノ−バントとともに注射し
て当該動物の体内に形成させる。
この抗体は血清をそのまま用いてもよく、血清から抗体
すなわち免疫グロブリンを採取する公知の方法によって
精製してから用いてもよい。
すなわち免疫グロブリンを採取する公知の方法によって
精製してから用いてもよい。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアノ−バントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してぼりエチレンクリコール等を用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造するととができる。
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアノ−バントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してぼりエチレンクリコール等を用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造するととができる。
ビオチン酵素は活性中心にビオチン基をもっているもの
であって、プロピオニルＣｏＡカル月ｅキノラーゼ、ア
セチルＣｏＡカル？キンラーゼ、ピルビン酸カルＪ？キ
ンラーゼ、ノチルマロニルＣｏＡカルボキンラーゼ、メ
チルマロ判ルＣｏＡ ｌ□ランスカルボキ７ラーゼ、メ
チルクロトニルＣｏＡカル、Ｉホキ／ラーゼ等種々のも
のが知られているが、そのいずれであっても用いること
ができる、。
であって、プロピオニルＣｏＡカル月ｅキノラーゼ、ア
セチルＣｏＡカル？キンラーゼ、ピルビン酸カルＪ？キ
ンラーゼ、ノチルマロニルＣｏＡカルボキンラーゼ、メ
チルマロ判ルＣｏＡ ｌ□ランスカルボキ７ラーゼ、メ
チルクロトニルＣｏＡカル、Ｉホキ／ラーゼ等種々のも
のが知られているが、そのいずれであっても用いること
ができる、。
ビオチン酵素阻害物質の例としては、アビノンストレノ
０１−アビノン及びこれらの誘導体であってビオチ／と
結合しうるものを挙げることができる。
０１−アビノン及びこれらの誘導体であってビオチ／と
結合しうるものを挙げることができる。
このような誘導体に（、寸、例えば無水酢酸でアセチル
化したものなど一般の化学修飾剤で処理したものかある
。誘導体はビオチンとの結合定数の小さいもののほうが
本発明の方法に好適でちる。
化したものなど一般の化学修飾剤で処理したものかある
。誘導体はビオチンとの結合定数の小さいもののほうが
本発明の方法に好適でちる。
本発明の固定化物はりがノド（２）又は抗体とビオチン
酵素又はビオチン酵素阻害物質とが固定されているので
あるから、リガンド（２）とビオチン酵素、りが／ド（
２）とビオチン酵素１５［１害・物質、抗体４１−ビオ
チン酵素、及び抗体とビオチン酵素阻害物質の／ｌ ７
！ｉｉの組合ぜがあることに７７る。
酵素又はビオチン酵素阻害物質とが固定されているので
あるから、リガンド（２）とビオチン酵素、りが／ド（
２）とビオチン酵素１５［１害・物質、抗体４１−ビオ
チン酵素、及び抗体とビオチン酵素阻害物質の／ｌ ７
！ｉｉの組合ぜがあることに７７る。
このような固定化物はりがノド（２）又は抗体の固定相
とビオチン酵素１だはビオチン酵素阻害物質の固定相と
が分離されているととるに特徴がある。この相分離とは
、後述するリガンド（２）又は抗体とビオチン酵素又は
ビオチン酵素阻害物質との結合物が一方の相にち・いて
反応して結合した場合にもう一方の相と更に反応しない
程度に両相が互いに分離されていることをいう。出し、
両相の境界域において両相と反応する結合物がちっても
その比率が固定化物の用途との関係にお因で問題になら
ない程度であればよいことはいうまでもない。
とビオチン酵素１だはビオチン酵素阻害物質の固定相と
が分離されているととるに特徴がある。この相分離とは
、後述するリガンド（２）又は抗体とビオチン酵素又は
ビオチン酵素阻害物質との結合物が一方の相にち・いて
反応して結合した場合にもう一方の相と更に反応しない
程度に両相が互いに分離されていることをいう。出し、
両相の境界域において両相と反応する結合物がちっても
その比率が固定化物の用途との関係にお因で問題になら
ない程度であればよいことはいうまでもない。
具体的には、担体に用いた重合体の場を分けてリガンド
（２）等とビオチン酵素等を固定したものとかりがノド
（２）等を固定した重合体とビオチン酵素等を固定した
重合体を貼合せたものなどを例として挙げることができ
る。また、担体がある程度大きな粒子、例えば直径３
ｍｍ以−Ｈの粒子であるような場合には全体の面積に対
して接触面積が問題にならなくなるので、リガンド（２
）等とビオチン酵素等をこのような大きさの別々の粒子
に固定したものであってもよい。他の例としては、一方
を管に固定し、もう一方を粒子に固定し“だような場合
を挙げることができる。
（２）等とビオチン酵素等を固定したものとかりがノド
（２）等を固定した重合体とビオチン酵素等を固定した
重合体を貼合せたものなどを例として挙げることができ
る。また、担体がある程度大きな粒子、例えば直径３
ｍｍ以−Ｈの粒子であるような場合には全体の面積に対
して接触面積が問題にならなくなるので、リガンド（２
）等とビオチン酵素等をこのような大きさの別々の粒子
に固定したものであってもよい。他の例としては、一方
を管に固定し、もう一方を粒子に固定し“だような場合
を挙げることができる。
固定化物の製法としては、重合体の場を分けて固定した
ものの場合には、例えば官能基を異にしたブロック共重
合体とかグラフト共重合体を形成して官能基の；（：異
を第１］用してリガンド（２）等とビオチン酵素■を別
々に固定すればよい。官能基（ｄ、−Ｎｌ（２、−ＣＯ
ＯＨｌ−ＣＨＯｌ−ＯＨ１−３Ｈなど通常のものでｊ：
い。これらの重合体を構成成分とするプロ。
ものの場合には、例えば官能基を異にしたブロック共重
合体とかグラフト共重合体を形成して官能基の；（：異
を第１］用してリガンド（２）等とビオチン酵素■を別
々に固定すればよい。官能基（ｄ、−Ｎｌ（２、−ＣＯ
ＯＨｌ−ＣＨＯｌ−ＯＨ１−３Ｈなど通常のものでｊ：
い。これらの重合体を構成成分とするプロ。
り共重合体、グラフト共重合体は公知の方法によって製
造すればよい。一方、固定されるものがりが／ド（２）
あるい（ｄビオチン酵素阻害物質で、固定してから共重
合体を形成しても活性が失なわれないような場合（・て
は、そうすることによって官能基が異ならなくともよい
場合がある。
造すればよい。一方、固定されるものがりが／ド（２）
あるい（ｄビオチン酵素阻害物質で、固定してから共重
合体を形成しても活性が失なわれないような場合（・て
は、そうすることによって官能基が異ならなくともよい
場合がある。
重合体を貼合わせる場合には予め貼合わせてから固定化
してもよく、その逆でもよい。貼合せは融危であっても
よく接着であってもよい。
してもよく、その逆でもよい。貼合せは融危であっても
よく接着であってもよい。
この」：つな相体の外形は特に限定されるものではなく
、例えは、球形１円盤形、長方形１円管形などでよい。
、例えは、球形１円盤形、長方形１円管形などでよい。
りがンｌ゛（２） 、抗体、ビオチン酵素、及びビオチ
アＦ＋１素阻害物質の固定化方法は公知の方法に準じて
行なえはよい。抗体、ビオチン酵素、及びすがノド（２
）、ビオチア酵素阻害物質のうち蛋白質のものについて
は、ノアゾ法、ペプチド結合法、アルキル化法等の共有
結合法、イオン結合法、物理的吸着法などの酵素等の活
性蛋白を担体に固定する公知の方法に準じて行なえばよ
く、蛋白質以外のものもリガ゛ノド（２）等と相体等の
官能基等を考慮して固定化方法を適宜選択すればよい。
アＦ＋１素阻害物質の固定化方法は公知の方法に準じて
行なえはよい。抗体、ビオチン酵素、及びすがノド（２
）、ビオチア酵素阻害物質のうち蛋白質のものについて
は、ノアゾ法、ペプチド結合法、アルキル化法等の共有
結合法、イオン結合法、物理的吸着法などの酵素等の活
性蛋白を担体に固定する公知の方法に準じて行なえばよ
く、蛋白質以外のものもリガ゛ノド（２）等と相体等の
官能基等を考慮して固定化方法を適宜選択すればよい。
この固定化されているりがノド（２）には、例えば相体
に共有結合されているりがノドに第１抗体を抗原抗体反
応させ、これにさらに第２抗体を反応させるような場合
のリガンドと第１抗体との反応物も含む。
に共有結合されているりがノドに第１抗体を抗原抗体反
応させ、これにさらに第２抗体を反応させるような場合
のリガンドと第１抗体との反応物も含む。
とのような固定化物における抗体又はりがノド（２）と
ビオチン酵素又はビオチン酵素阻害物質との比率は測定
感度及びこれらの組合せにおいて適当になるように決定
される。
ビオチン酵素又はビオチン酵素阻害物質との比率は測定
感度及びこれらの組合せにおいて適当になるように決定
される。
一方、結合物は、該固定化物に固定された抗体と反応す
るリガンド（２）又はリガンド（２）と反応する抗体と
、該固定化物に固定されたビオチン酵素と反応するビオ
チン酵素阻害物質又はビオチン酵素阻害物質と反応する
ビオチン酵素とを結合したものである。
るリガンド（２）又はリガンド（２）と反応する抗体と
、該固定化物に固定されたビオチン酵素と反応するビオ
チン酵素阻害物質又はビオチン酵素阻害物質と反応する
ビオチン酵素とを結合したものである。
結合物の絹合せはりがノド（２）とビオチン酵素、リガ
ンド（２）とビオチン酵素阻害物質、抗体とビオチン酵
素、及び抗体とビオチン酵素阻害物質の４通りあるわけ
であるが、この結合物は前記固定化物の両固定相と反応
するものでなければならないから、この組合せは固定化
物に応じて自動的に定まる。また、この結合物は固定化
物と反応させる必要があるところから水溶性が必要であ
ろう。
ンド（２）とビオチン酵素阻害物質、抗体とビオチン酵
素、及び抗体とビオチン酵素阻害物質の４通りあるわけ
であるが、この結合物は前記固定化物の両固定相と反応
するものでなければならないから、この組合せは固定化
物に応じて自動的に定まる。また、この結合物は固定化
物と反応させる必要があるところから水溶性が必要であ
ろう。
結合物の製法としては要は結合物が両方の活性を発揮し
うれば足り、例えば結合させる双方がいずれも蛋白質で
ある場合には、酵素等の活性蛋白を固定する架橋法ある
いは波ゾチド結合法などを活用できる。結合する一方捷
たけ双方が蛋白質でない場合にはそれぞれの官能基を考
慮して結合方法を適宜選択すればよい。
うれば足り、例えば結合させる双方がいずれも蛋白質で
ある場合には、酵素等の活性蛋白を固定する架橋法ある
いは波ゾチド結合法などを活用できる。結合する一方捷
たけ双方が蛋白質でない場合にはそれぞれの官能基を考
慮して結合方法を適宜選択すればよい。
結合比はモル比で１゛１に限られるものではなく、測定
榮件等によって異なるところから、それぞれの系におい
て適当になるよう決定される。
榮件等によって異なるところから、それぞれの系におい
て適当になるよう決定される。
本発明の測定方法の原理を、リガンド（２）とビオチン
酵素を固定した固定化物と、アビジンと抗体の結合物を
用いた場合を例として説明すると、まず、測定されるリ
ガンド（１）がないときには一般にリガンド−抗体間の
結合力がビオチン酵素−アビジン間の結合力より強いと
ころから、結合物は固定化リガンド（１）に結合しビオ
チン酵素部分には結合しない。従って、固定化物のビオ
チン酵素はアビノンの作用を受けず、酵素活性は減少し
ない。次に、測定されるリガンド（１）が存在するとき
は結合物の抗体が測定対象リガンド（１）と固定化リガ
ンド（２）との間で競争反応し、測定対象リガ゛ノド（
１）と結合した結合物はさらにアビノン部分が固定化物
のビオチン酵素と反応してそこに結合する。そしてこの
結合量だけ酵素活性が低下するから予め遊離のリガンド
量と酵素活性の低下量の関係を求めておけば、酵素活性
の低下量を測定することによって測定対象リガンド量を
知ることができる。
酵素を固定した固定化物と、アビジンと抗体の結合物を
用いた場合を例として説明すると、まず、測定されるリ
ガンド（１）がないときには一般にリガンド−抗体間の
結合力がビオチン酵素−アビジン間の結合力より強いと
ころから、結合物は固定化リガンド（１）に結合しビオ
チン酵素部分には結合しない。従って、固定化物のビオ
チン酵素はアビノンの作用を受けず、酵素活性は減少し
ない。次に、測定されるリガンド（１）が存在するとき
は結合物の抗体が測定対象リガンド（１）と固定化リガ
ンド（２）との間で競争反応し、測定対象リガ゛ノド（
１）と結合した結合物はさらにアビノン部分が固定化物
のビオチン酵素と反応してそこに結合する。そしてこの
結合量だけ酵素活性が低下するから予め遊離のリガンド
量と酵素活性の低下量の関係を求めておけば、酵素活性
の低下量を測定することによって測定対象リガンド量を
知ることができる。
測定方法としては、要は水溶液中に°おいて固定化物と
結合物と測定対象たるリガンド（１）の三者を共存させ
ればよく添加順序は問わない。この共存は一方の反応中
の全時間桁なわれている場合に限らず、一時的であって
もよい。例えば、リガンド（１）及びそれとビオチン酵
素との結合物を抗体固定化チューブで反応させたのちに
ビオチン酵素阻害物質固定化ビーズを投入して余剰の結
合物をスカベンゾするような場合も本発明に含捷れる。
結合物と測定対象たるリガンド（１）の三者を共存させ
ればよく添加順序は問わない。この共存は一方の反応中
の全時間桁なわれている場合に限らず、一時的であって
もよい。例えば、リガンド（１）及びそれとビオチン酵
素との結合物を抗体固定化チューブで反応させたのちに
ビオチン酵素阻害物質固定化ビーズを投入して余剰の結
合物をスカベンゾするような場合も本発明に含捷れる。
水溶液はりガント−抗体反応及びビオチン酵素−ビオチ
ン酵素阻害物質反応が反応しゃすいＰＨにするのがよく
そのためにリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液
などの緩衝液を用いるのがよい。
ン酵素阻害物質反応が反応しゃすいＰＨにするのがよく
そのためにリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液
などの緩衝液を用いるのがよい。
ＰＨはリガンド及び抗体とビオチン酵素およびビオチン
酵素阻害物質によって異なるが通例ｐＨ５〜８程度がよ
い。温度もリガンド及び抗体とビオチン酵素及びビオチ
ン酵素阻害物質によって異なるが通例は１５〜４５℃程
度である。
酵素阻害物質によって異なるが通例ｐＨ５〜８程度がよ
い。温度もリガンド及び抗体とビオチン酵素及びビオチ
ン酵素阻害物質によって異なるが通例は１５〜４５℃程
度である。
反応後は固定化物または水溶液のビオチン酵素活性を測
定する。酵素活性の測定方法は公知の方法に従って行な
えばよく、例えばプロピオニルＣｏＡカルボキ／ラーゼ
の場合には反応系で生じるＡＤＰ ヲピルビン酸キナー
ゼと乳酸デビドロケ８ナーゼにより共役させ、その際の
ＮＡＤＨの減少として活性を測定できる。
定する。酵素活性の測定方法は公知の方法に従って行な
えばよく、例えばプロピオニルＣｏＡカルボキ／ラーゼ
の場合には反応系で生じるＡＤＰ ヲピルビン酸キナー
ゼと乳酸デビドロケ８ナーゼにより共役させ、その際の
ＮＡＤＨの減少として活性を測定できる。
メチルマロニルＣＯＡトランスカルボキ７ラーゼの場合
には生成したオキザロ酢酸をリンゴ酸デヒドロケ９ナー
ゼの共役によってリンゴ酸に変え、その際のＮＡＤＨの
減少量を測定することによって活性値を求めることがで
きる。
には生成したオキザロ酢酸をリンゴ酸デヒドロケ９ナー
ゼの共役によってリンゴ酸に変え、その際のＮＡＤＨの
減少量を測定することによって活性値を求めることがで
きる。
寸だ、プロピオニルＣｏＡカルボキ／ラーゼを用いた場
合には、逆反応によってＡＴＰを生成させて、コレラル
シフェラーゼ及びルンフェリンの共存下で反応させると
生物発光する。そこで、これをフォトンカウンターで測
定するととによって１０−１５Ｍ以下のＡＴＰを定量で
きる。この方法を用いればさらに極微量のりガント（１
）を定量することが可能である。
合には、逆反応によってＡＴＰを生成させて、コレラル
シフェラーゼ及びルンフェリンの共存下で反応させると
生物発光する。そこで、これをフォトンカウンターで測
定するととによって１０−１５Ｍ以下のＡＴＰを定量で
きる。この方法を用いればさらに極微量のりガント（１
）を定量することが可能である。
本発明の方法はリガンド（１）を極めて高感度で測定で
きる。例えばビオチンそのものとアビノンそのものを用
いた場合には１０ グラムのりがノド（１）を定量す
ることが可能である。本発明の方法ｄ１、そのほかバウ
ンド（ｂｏｕｎｄ）とフリー（ｆ ｌｅｅ ）の分離が
不要であるなど操作が簡便であり、安価かつ容易にりが
ノド（１）を定量することが可能である。
きる。例えばビオチンそのものとアビノンそのものを用
いた場合には１０ グラムのりがノド（１）を定量す
ることが可能である。本発明の方法ｄ１、そのほかバウ
ンド（ｂｏｕｎｄ）とフリー（ｆ ｌｅｅ ）の分離が
不要であるなど操作が簡便であり、安価かつ容易にりが
ノド（１）を定量することが可能である。
（１）アビノン−抗体結合物の調製
アビジン５ ｍｇを０．１ Ｍリン酸緩衝液ｐｌ（６，
３１ｍｌに溶解し％ ４ （−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍ
ｅｔｈｙｌ−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏ
ｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ） ｓｕｃｃｉｍｉｄｏｅｓｔ
ｅｒ （ＣＨＭＳ）のノオキサン溶液１００μｌを加え
、室温で１時間反応させた。反応液をセファデックスＧ
−２５（０１Ｍリン酸緩衝液−１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ
６，５）カラムでケゞル濾過し、蛋白質分画をプールし
、。
３１ｍｌに溶解し％ ４ （−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍ
ｅｔｈｙｌ−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏ
ｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ） ｓｕｃｃｉｍｉｄｏｅｓｔ
ｅｒ （ＣＨＭＳ）のノオキサン溶液１００μｌを加え
、室温で１時間反応させた。反応液をセファデックスＧ
−２５（０１Ｍリン酸緩衝液−１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ
６，５）カラムでケゞル濾過し、蛋白質分画をプールし
、。
ＣＨＭＳ化−アビジンとした。
山羊抗ヒトＡＦＰ （アルファフェトプロティン）抗体
をＡＦＰアフィニティーカラムにより精製した特異抗体
ＩｇＧ １０ ｍｇをＱ、 Ｉ Ｍ ＩＪン酸緩衝液−
１ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ６，Ｏ］、、 Ｏｍｌに浴解し、
０１ｍ１の０．１ Ｍ ２−メルカゾトエチルアミン溶
液を加え、３７℃で９０分間反応させた。これをセファ
デックスＧ−２５によるケ゛ル濾過を行い、素通り分画
を集めて、これに上記ＣＴ（ＭＳ化−アビジンを加え、
ｐＨ６，８に調節し、４℃で２４時間反応させた。反応
液をＰＥＧ −２００００による濃縮後、５ｅｐｈａｃ
ｒｙｌ Ｓ −３００によるケ８ルＵ過によりアビノン
−抗ＡＦＰ ＩｇＧ結合物約７ ｍｇイしイ↓Ｉた。
をＡＦＰアフィニティーカラムにより精製した特異抗体
ＩｇＧ １０ ｍｇをＱ、 Ｉ Ｍ ＩＪン酸緩衝液−
１ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ６，Ｏ］、、 Ｏｍｌに浴解し、
０１ｍ１の０．１ Ｍ ２−メルカゾトエチルアミン溶
液を加え、３７℃で９０分間反応させた。これをセファ
デックスＧ−２５によるケ゛ル濾過を行い、素通り分画
を集めて、これに上記ＣＴ（ＭＳ化−アビジンを加え、
ｐＨ６，８に調節し、４℃で２４時間反応させた。反応
液をＰＥＧ −２００００による濃縮後、５ｅｐｈａｃ
ｒｙｌ Ｓ −３００によるケ８ルＵ過によりアビノン
−抗ＡＦＰ ＩｇＧ結合物約７ ｍｇイしイ↓Ｉた。
（２）相分離相体の製造
ナイロン製球形ビーズ（直径４酬）を３ＮＨＣ１で２４
時間処理してアミン基を遊離させ、水洗後０．１ Ｍリ
ン酸緩衝液−５ｍＭ ＥＤＴＡ Ｂ＋’１７．５中でＳ
−アセチルメル力ゾトコノ・り酸無水物のツノチルスル
ホキシド溶液（１０ｍ９／ｍｌ） ヲ］／ＬＯＶｏＡ・
加え、３７℃で３時間反応させた。
時間処理してアミン基を遊離させ、水洗後０．１ Ｍリ
ン酸緩衝液−５ｍＭ ＥＤＴＡ Ｂ＋’１７．５中でＳ
−アセチルメル力ゾトコノ・り酸無水物のツノチルスル
ホキシド溶液（１０ｍ９／ｍｌ） ヲ］／ＬＯＶｏＡ・
加え、３７℃で３時間反応させた。
これにＩＭヒドロギ／ルアミン溶液ｐＨ７，５を容量比
で１／１０加え、３７℃で１時間反応させてから上記緩
衝液で洗浄した。一方、（１）のアビノンと同様の条件
でＣ）ＩＭＳ化したゾロピオニルＣｏＡカルボキンラー
ゼ５ ｍ！７ｉ ０．１ Ｍ ’Ｊン酸緩衝液−］、
ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６，Ｏに溶解し、これを−上記ナ
イロンビーズに加え、次いでｌ）＋（を７．０として４
℃で１晩反応させた。これを上記緩衝液ｐ１（７，５で
洗浄後、１％ＢＳＡ添加した上記緩衝液中で保存した。
で１／１０加え、３７℃で１時間反応させてから上記緩
衝液で洗浄した。一方、（１）のアビノンと同様の条件
でＣ）ＩＭＳ化したゾロピオニルＣｏＡカルボキンラー
ゼ５ ｍ！７ｉ ０．１ Ｍ ’Ｊン酸緩衝液−］、
ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６，Ｏに溶解し、これを−上記ナ
イロンビーズに加え、次いでｌ）＋（を７．０として４
℃で１晩反応させた。これを上記緩衝液ｐ１（７，５で
洗浄後、１％ＢＳＡ添加した上記緩衝液中で保存した。
ポリスチレン製球形ビーズ（直径３．２１ｎＭ）を水洗
後、ＡＦＰをｏＤ２８ｏ−０１のリン酸緩衝液中で４℃
１晩ひたし、物理吸着させた。リン酸緩衝液で十分に洗
浄後、１％ＢｓＡを添加した上記緩衝液中で保存し、Ａ
ＦＰ固定化ビーズとした。
後、ＡＦＰをｏＤ２８ｏ−０１のリン酸緩衝液中で４℃
１晩ひたし、物理吸着させた。リン酸緩衝液で十分に洗
浄後、１％ＢｓＡを添加した上記緩衝液中で保存し、Ａ
ＦＰ固定化ビーズとした。
（３） ＡＦＰの測定
試験管にプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ固定化ビ
ーズとＡＦＰ固定化ビーズ各１個ずつ取り、５０ ｍＭ
トリス緩衝液−０，１４Ｍ ＮａＣｔ−０２％ＢＳＡ
ｐＨ７，８を８００ μｌｌ加えた。これに、ＡＦＰ
溶液を８００ｎｇ／ｆｎｌ Ｊ：Ｉ） ４ ｎ希釈吻合
１００μβずつ加え、次いで（１）の抗ＡＦＰＩｇＧ−
アビノン結合物を１００μｌ加えて、室温で１時間放置
した。
ーズとＡＦＰ固定化ビーズ各１個ずつ取り、５０ ｍＭ
トリス緩衝液−０，１４Ｍ ＮａＣｔ−０２％ＢＳＡ
ｐＨ７，８を８００ μｌｌ加えた。これに、ＡＦＰ
溶液を８００ｎｇ／ｆｎｌ Ｊ：Ｉ） ４ ｎ希釈吻合
１００μβずつ加え、次いで（１）の抗ＡＦＰＩｇＧ−
アビノン結合物を１００μｌ加えて、室温で１時間放置
した。
この各試験管に酵素基質液（０，１Ｍ Ｋｃｔ−５０ｍ
Ｍ ＫＨＣＯ３−４ｍＭ ＭｇＣｔ２−２ ｍＭ還元型
グルタチオン−２ｍＭ ＡＴＰ −１ｍＭホスホエノー
ルピルビン酸−２５００Ｕ／ｌピルピア酸キナーゼ−３
５００Ｕ＃乳酸デヒドロゲナーゼ−０，１５ｍＭＮＡＤ
Ｈ−２ｍＭプロピオ＝ ／ｌ／ ＣｏＡ ）をｌ ｍｌ
づつ加え、３７℃波長３４０ ｎｍにおける吸光度を測
定シてＡＦＰ量と７０ロピオニルＣｏＡカルぎキノラー
ゼの活性との関係を求めた。
Ｍ ＫＨＣＯ３−４ｍＭ ＭｇＣｔ２−２ ｍＭ還元型
グルタチオン−２ｍＭ ＡＴＰ −１ｍＭホスホエノー
ルピルビン酸−２５００Ｕ／ｌピルピア酸キナーゼ−３
５００Ｕ＃乳酸デヒドロゲナーゼ−０，１５ｍＭＮＡＤ
Ｈ−２ｍＭプロピオ＝ ／ｌ／ ＣｏＡ ）をｌ ｍｌ
づつ加え、３７℃波長３４０ ｎｍにおける吸光度を測
定シてＡＦＰ量と７０ロピオニルＣｏＡカルぎキノラー
ゼの活性との関係を求めた。
得られた結果を第１図に示す。
血清はあらかじめアビノン固定化がラスビーズと３０分
間反応させてその上清を用いた。
間反応させてその上清を用いた。
各種ヒト血清をいずれも１０倍希釈しその１００μｌづ
つを用いて上記と同様に測定を行ない、第１図を検量線
としてＡＦＰの濃度を測定した。一方これと並行して従
来法であるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ ）を用いて
同じヒト血７ｆｔのＡＦＰ濃度を測定した。得られた結
果を下表に示す。
つを用いて上記と同様に測定を行ない、第１図を検量線
としてＡＦＰの濃度を測定した。一方これと並行して従
来法であるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ ）を用いて
同じヒト血７ｆｔのＡＦＰ濃度を測定した。得られた結
果を下表に示す。
ＡＦＰ濃度
血清 本発明法 ＲＩＡ法
Ａ １５．８ ｍ９７４ｎｌ １７．５
ｍＬ；ｊＡｒＬｌ。
ｍＬ；ｊＡｒＬｌ。
Ｂ ４５０ ４３２Ｃ
１４２１５８ Ｄ ６．３ ６．９Ｅ
７４８ ７８０Ｆ
２１０ ２００実施例２ （１）ピルビン酸カルボキシラーゼ−抗体結合物の作製 ピルビン酸カルボキシラーゼ５ｍ９に０．１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ６３１ｍｌにとかし、これにＣＨＭＳ ｏノオ
キサン溶液１００ ｔｔｌ （２ｍｑ／ｍｌ） を加え
室温で９０分間反応させた。反応＠液を０．１Ｍリン酸
１ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ６，５）で平衡化したセフ
アゾ、ラスＧ−２５カラムでケ゛ル濾過し、素通り分画
を集めた。この分画をＰＥＧ２００００を用いてｌ ｍ
ｇまで濃縮し、ＣＩ（Ｍ化ピルビン酸カルボキシラーゼ
を得た。抗ジコゞキンンウサギＩｇＧ５１１１９を０．
１ Ｍリン酸５ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ’ ７．５ ）緩
衝液にとかし５．これに１００μｌの無水アセチルメル
カプトコノ・り酸溶液（９ｍｇ／ｍ、ｌジメチルスルホ
キシド）を加え、３７℃で１時間反応させた。さらに、
１Ｍヒドロキノアミン液１１０μｌを加えて３７℃で３
０分間反応させ１．上記と同様のセファデックスＧ−２
５でケゝル濾過し素通９分画を集めた。これに、さきに
調製したＣＨＭ化ピルビン酸カルボキ７ラ−ゼを加え、
４℃で一夜放置後、この反応液をセフアクリルＳ−３０
０でケゝル濾過した。これにより抗ノゴキノンＩｇＧ−
ピルビン酸カルボキノラーゼの１：１結合分画をプール
した。
１４２１５８ Ｄ ６．３ ６．９Ｅ
７４８ ７８０Ｆ
２１０ ２００実施例２ （１）ピルビン酸カルボキシラーゼ−抗体結合物の作製 ピルビン酸カルボキシラーゼ５ｍ９に０．１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ６３１ｍｌにとかし、これにＣＨＭＳ ｏノオ
キサン溶液１００ ｔｔｌ （２ｍｑ／ｍｌ） を加え
室温で９０分間反応させた。反応＠液を０．１Ｍリン酸
１ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ６，５）で平衡化したセフ
アゾ、ラスＧ−２５カラムでケ゛ル濾過し、素通り分画
を集めた。この分画をＰＥＧ２００００を用いてｌ ｍ
ｇまで濃縮し、ＣＩ（Ｍ化ピルビン酸カルボキシラーゼ
を得た。抗ジコゞキンンウサギＩｇＧ５１１１９を０．
１ Ｍリン酸５ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ’ ７．５ ）緩
衝液にとかし５．これに１００μｌの無水アセチルメル
カプトコノ・り酸溶液（９ｍｇ／ｍ、ｌジメチルスルホ
キシド）を加え、３７℃で１時間反応させた。さらに、
１Ｍヒドロキノアミン液１１０μｌを加えて３７℃で３
０分間反応させ１．上記と同様のセファデックスＧ−２
５でケゝル濾過し素通９分画を集めた。これに、さきに
調製したＣＨＭ化ピルビン酸カルボキ７ラ−ゼを加え、
４℃で一夜放置後、この反応液をセフアクリルＳ−３０
０でケゝル濾過した。これにより抗ノゴキノンＩｇＧ−
ピルビン酸カルボキノラーゼの１：１結合分画をプール
した。
（２）相分離同相の作製
ポリスチレンチー−ブ（８叫Ｘ ’５０ ｃｍ ）にア
ビノア俗液（１００μｇ／ｍｅ、 ２０ｍＨＰＢＳ ｐ
Ｈ７，８）２ ｍｌを加え、４℃で１６時間放置した。
ビノア俗液（１００μｇ／ｍｅ、 ２０ｍＨＰＢＳ ｐ
Ｈ７，８）２ ｍｌを加え、４℃で１６時間放置した。
このチーーブを生理食塩水で４回洗浄した後５％ＢＳＡ
水溶液を加え、室温にて３時間放置し。
水溶液を加え、室温にて３時間放置し。
アビジン感作チューブを作製した。
次ニ、ノゴキンンをＮ ａ Ｉｏ ４で酸化してＢＳＡ
に結合させた。ＢＳＡノゴキ／ン結合物２０〜９を１０
０ｍｅの０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８，０に溶かし、
これに直径４ ｍｍの、＋Ｑ ＩＪスチレンボール６０
個を加えて４℃で１６時間放置し、ノコ゛キ７ン感作ポ
リスチレンビーズを作製した。
に結合させた。ＢＳＡノゴキ／ン結合物２０〜９を１０
０ｍｅの０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８，０に溶かし、
これに直径４ ｍｍの、＋Ｑ ＩＪスチレンボール６０
個を加えて４℃で１６時間放置し、ノコ゛キ７ン感作ポ
リスチレンビーズを作製した。
（３）ノゴキ／ンの定量
（２）で作製したアビノン感作チー−ブにノゴキシンー
ＢＳＡ感作ピース１個を加え、２０ｍＭトリス緩衝液−
０，１４Ｍ ＮａＣｔ −０，２％ＢＳＡ（ｐＨ８，０
）を４００μｌ加えた。これにノコゞキシン希釈液（０
〜５ ｎｇ ７ｍ１． ）を１００ μｌｌづつ加え、
さらに（１）で作製したピルビン酸カルボキンラーゼ−
抗ノゴキシンＩｇＧ結合物１００μｌを加え、３０℃で
１時間放置した。
ＢＳＡ感作ピース１個を加え、２０ｍＭトリス緩衝液−
０，１４Ｍ ＮａＣｔ −０，２％ＢＳＡ（ｐＨ８，０
）を４００μｌ加えた。これにノコゞキシン希釈液（０
〜５ ｎｇ ７ｍ１． ）を１００ μｌｌづつ加え、
さらに（１）で作製したピルビン酸カルボキンラーゼ−
抗ノゴキシンＩｇＧ結合物１００μｌを加え、３０℃で
１時間放置した。
次に、この試験管に酵素基質液（０，１Ｍ ＫＣｌ、５
０ｍＭＫＨＣＯ３４ｍＭＭｇＣｔ２．２ ｍＭ ＡＴＰ
、 ２ｍ Ｍ還元型グルタチオン４ｍＭピルビン４
ｉ 、０．２３ｍＭ ＮＡＤＨ、マレートデ／％イドト
グナーゼ（３０００Ｕ／ｌ ）、ｐＨ７，５） ’ｆ：
１ ｍｇ加え、３７℃で波長３４０ ｎｍにおける吸
光度の減少をレートアッセイし、吸光度変化量（１分間
当り）とジゴキンン量との関係を第２図に７０ロツトし
た。
０ｍＭＫＨＣＯ３４ｍＭＭｇＣｔ２．２ ｍＭ ＡＴＰ
、 ２ｍ Ｍ還元型グルタチオン４ｍＭピルビン４
ｉ 、０．２３ｍＭ ＮＡＤＨ、マレートデ／％イドト
グナーゼ（３０００Ｕ／ｌ ）、ｐＨ７，５） ’ｆ：
１ ｍｇ加え、３７℃で波長３４０ ｎｍにおける吸
光度の減少をレートアッセイし、吸光度変化量（１分間
当り）とジゴキンン量との関係を第２図に７０ロツトし
た。
血清はあらかじめ、アビノン固定化ガラスピーズで３０
分間反応させ、この上清を用いた。
分間反応させ、この上清を用いた。
この血清を工希釈したもの１００μＡｋ用い０
て」二記と同様に測定した。下表はその結果である。
ノゴキ／ン量（ｎ ｇ／ｍｌ ）
本法 ＲＩＡ法
Ａ １．５ １．３
Ｂ ２．２ ２．６
Ｃ４，１４，０
Ｄ Ｏ，８１，１
Ｅ １１ １．３実施例３
（］） ］ＣＡ−ＤＡ化抗ンエリチンヤギＩｇの作製抗
フェリチンヤギＩｇＧ ５ ｍ９を０．１ Ｍリン酸緩
衝液（１ｍＭＥＤＴＡ含有ｐＨ６，３１ｍｇに溶かし、
これに併ＴＭＳのノオキサン溶液１００μｌ（２ｍ！７
７ｍｅ）を加えた。室温で９０分間反応させたのち、Ｏ
，ｉＭリン酸緩衝液ＰＨ６，５で平衡化したセファデッ
クスＧ−２５でケゝル漣過し、素通り分画を分取した。
フェリチンヤギＩｇＧ ５ ｍ９を０．１ Ｍリン酸緩
衝液（１ｍＭＥＤＴＡ含有ｐＨ６，３１ｍｇに溶かし、
これに併ＴＭＳのノオキサン溶液１００μｌ（２ｍ！７
７ｍｅ）を加えた。室温で９０分間反応させたのち、Ｏ
，ｉＭリン酸緩衝液ＰＨ６，５で平衡化したセファデッ
クスＧ−２５でケゝル漣過し、素通り分画を分取した。
（２）フェリチン−アビノン結合物の作製フェリチン５
ｍ９とアビシソ１ ｍ９を０．１Ｍ緩衝＊ ｐＨ６，
８１ｍｌに溶かし、これに１％グルタルアルデヒド水溶
液１００μｌを加えて３０℃で３時間反応させた。これ
をセフアクリルＳ−３００でケ゛ル濾過し、フェリチン
とアビジンの１：１結合物の分画を分取して凍結乾燥し
た。こうして、目的のフェリチン−アビジン結合物３ｍ
９を得た。
ｍ９とアビシソ１ ｍ９を０．１Ｍ緩衝＊ ｐＨ６，
８１ｍｌに溶かし、これに１％グルタルアルデヒド水溶
液１００μｌを加えて３０℃で３時間反応させた。これ
をセフアクリルＳ−３００でケ゛ル濾過し、フェリチン
とアビジンの１：１結合物の分画を分取して凍結乾燥し
た。こうして、目的のフェリチン−アビジン結合物３ｍ
９を得た。
（３）相分離固相の作製
担体固相はポリスチレンを基板として公知のポリマーブ
レンド法に従って作製した。ポリルーシスティン及びポ
リＬ−リジン各１０ｍ９ヲジメチルスルホキンドーエー
テル混合溶媒に溶解し、ポリスチレンポリマー基板上に
塗布して減圧下溶媒を除去した。これらの各ポリマーは
凝集エネルギーが異なるためアミノ基層と−ＳＨ基層と
のミクロ相分離が形成された。ＳＨ基含量はジチオピリ
ドン法により、また表面アミノ基はニンヒドリン法によ
り検定したところ、ＳＨ基とアミン基の比はほぼ１：１
であった。このポリスチレン基板をＯ８釧角に裁断し担
体固相として用いた。この相分加担［本をアセチルＣｏ
Ａ力ルデキシラービ水府）液に浸し、次に水溶性カルボ
ッイミド１００ｍ９／ １０ｍｅになるように加え、０
． Ｉ Ｎ ＮａＯＨＫ ｊ ’）ｐｉｔを５５に＜、
ｆ）：持した。４℃で１６時間放置後、２０ ｒｎＭ
’）ン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７，０で十分洗浄した。
レンド法に従って作製した。ポリルーシスティン及びポ
リＬ−リジン各１０ｍ９ヲジメチルスルホキンドーエー
テル混合溶媒に溶解し、ポリスチレンポリマー基板上に
塗布して減圧下溶媒を除去した。これらの各ポリマーは
凝集エネルギーが異なるためアミノ基層と−ＳＨ基層と
のミクロ相分離が形成された。ＳＨ基含量はジチオピリ
ドン法により、また表面アミノ基はニンヒドリン法によ
り検定したところ、ＳＨ基とアミン基の比はほぼ１：１
であった。このポリスチレン基板をＯ８釧角に裁断し担
体固相として用いた。この相分加担［本をアセチルＣｏ
Ａ力ルデキシラービ水府）液に浸し、次に水溶性カルボ
ッイミド１００ｍ９／ １０ｍｅになるように加え、０
． Ｉ Ｎ ＮａＯＨＫ ｊ ’）ｐｉｔを５５に＜、
ｆ）：持した。４℃で１６時間放置後、２０ ｒｎＭ
’）ン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７，０で十分洗浄した。
この担体をさらに０．１Ｍリン酸−１ｍＭＥＤＴＡの緩
衝液（ｐＨ６，５）に浸し、これに（１）で作製したＣ
Ｉ−ＩＭ化抗フェリチンヤギＩｇＧ−（Ｈ加え（２ｍＶ
ｎＩｅ） ３０℃で２時間反応させ、コレ’１２０ ｍ
Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７，０で十分洗浄した。
衝液（ｐＨ６，５）に浸し、これに（１）で作製したＣ
Ｉ−ＩＭ化抗フェリチンヤギＩｇＧ−（Ｈ加え（２ｍＶ
ｎＩｅ） ３０℃で２時間反応させ、コレ’１２０ ｍ
Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７，０で十分洗浄した。
（４）フェリチンの定量
ガラスチー−プに（３）で作製した相分離担体１枚を入
れ１．コれに２０ ｍＭ トリス−０，１４ＭＮａＣ／
−−０，２％ ＢＳＡ （ｐＨ８，０）を４００ ｐＨ
加えた。次に、フェリチン希釈液を５０μβづつ加え、
さらに（２）で作製したフェリチン−アビジン結合物５
０ ／ｌｌを加えた。３０℃で１時間加ｉｎ ？Ｌ、基
質液（０１ＭＫｃｔ１アセチルｃｏＡ：１０ＸＩＯＭ、
０．３ Ｍ ＫＨＣＯ３３ｍＭ ＡＴＰ 、 ０．
２３ｎ＋Ｍ ＮＡＤＨ、２ｍＭ還元壓グルタチオン、１
５ｍＭホスホエノールピルビン酸、２５００ Ｕ、＃ピ
ルビン酸キナーゼ、３５０ｏＵ／ｌ乳酸デヒドロケ゛ナ
ーゼ（ｐＨ７，８））をｌ ｍ、ｌ加え３７℃、波長３
４− Ｏｎｍにおける吸光度の減少をレートアッセイし
た。第３図はフェリチンの量と吸光度の変化量をプロッ
トしたものである。
れ１．コれに２０ ｍＭ トリス−０，１４ＭＮａＣ／
−−０，２％ ＢＳＡ （ｐＨ８，０）を４００ ｐＨ
加えた。次に、フェリチン希釈液を５０μβづつ加え、
さらに（２）で作製したフェリチン−アビジン結合物５
０ ／ｌｌを加えた。３０℃で１時間加ｉｎ ？Ｌ、基
質液（０１ＭＫｃｔ１アセチルｃｏＡ：１０ＸＩＯＭ、
０．３ Ｍ ＫＨＣＯ３３ｍＭ ＡＴＰ 、 ０．
２３ｎ＋Ｍ ＮＡＤＨ、２ｍＭ還元壓グルタチオン、１
５ｍＭホスホエノールピルビン酸、２５００ Ｕ、＃ピ
ルビン酸キナーゼ、３５０ｏＵ／ｌ乳酸デヒドロケ゛ナ
ーゼ（ｐＨ７，８））をｌ ｍ、ｌ加え３７℃、波長３
４− Ｏｎｍにおける吸光度の減少をレートアッセイし
た。第３図はフェリチンの量と吸光度の変化量をプロッ
トしたものである。
人血清にはあらかじめ、アビジン結合ガラスビーズで３
０分間反応させた」二清を用いた。
０分間反応させた」二清を用いた。
試 料ｉ＃に）
本法ｙ１２７−Ｊｌ、 Ｅ Ｉ Ａ法ｎｇ／ｍｌＡ
１９ ２１Ｂ １６９
１７６ Ｃ１４５１４６ Ｄ ３８ ３３Ｅ ３９
５ ４００ 実施例４ （］）フフェリ結合物フ０ロピオニルＣｏＡカルボキシ
ラーゼ合物 フェリチン５ ｍｇトプロピオニルＣｏＡカルボキ／ラ
ーゼ１ｏｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）１
ｍｌに溶かし、これに１％グルタルアルデヒド水溶液を
１００μを加えて３０℃で４時間反応させた。この反応
液を２０ ｍＭ ’）ン酸緩衝（ｐ１１７．０ ）化セ
ファロース４Ｂでケゞルｒ過し、１：１結合分画を分取
して目的の結合物を５ ｎｉり得た。
１９ ２１Ｂ １６９
１７６ Ｃ１４５１４６ Ｄ ３８ ３３Ｅ ３９
５ ４００ 実施例４ （］）フフェリ結合物フ０ロピオニルＣｏＡカルボキシ
ラーゼ合物 フェリチン５ ｍｇトプロピオニルＣｏＡカルボキ／ラ
ーゼ１ｏｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）１
ｍｌに溶かし、これに１％グルタルアルデヒド水溶液を
１００μを加えて３０℃で４時間反応させた。この反応
液を２０ ｍＭ ’）ン酸緩衝（ｐ１１７．０ ）化セ
ファロース４Ｂでケゞルｒ過し、１：１結合分画を分取
して目的の結合物を５ ｎｉり得た。
（２）実施例３で作製した固相担体を用い、実施例３と
同様の操作て抗フェリチンヤギＩｇＧ及びアビジン結合
相分離担体を得た。
同様の操作て抗フェリチンヤギＩｇＧ及びアビジン結合
相分離担体を得た。
（３）フェリチンの定量
（１）の担体一枚をチーープにとり、これに５０ｍＭ）
リス緩衝液−０，１４Ｍ ＮａＣＡ−０，２％ ＢＳＡ
（ＰＩＩ ７． ｓ ）を８００μを力口えた。これに
フェリチン溶液を１０００ｎ！Ｊよシ４ｎ希釈物各１０
０μｔづつ加えた。次いで、（１）のフェリチンプロピ
オニルＣｏＡカルボキシラーゼ’結合物１００μｔを加
え、室温で１時間放置した。
リス緩衝液−０，１４Ｍ ＮａＣＡ−０，２％ ＢＳＡ
（ＰＩＩ ７． ｓ ）を８００μを力口えた。これに
フェリチン溶液を１０００ｎ！Ｊよシ４ｎ希釈物各１０
０μｔづつ加えた。次いで、（１）のフェリチンプロピ
オニルＣｏＡカルボキシラーゼ’結合物１００μｔを加
え、室温で１時間放置した。
この試験管に酵素基質液（実施例１と同じ）ｌ ｍｌづ
つ加え、３７℃で３４０ｎｍＫおける吸光度の減少をレ
ートアッセイし、プロビオニーズで３０分処理した上清
を１０倍希釈しその１００μｔを用いて上記と同様に測
定した。
つ加え、３７℃で３４０ｎｍＫおける吸光度の減少をレ
ートアッセイし、プロビオニーズで３０分処理した上清
を１０倍希釈しその１００μｔを用いて上記と同様に測
定した。
得られた結果を下記に示す。
血清 本発明ｎｇ／ｍ１３ ＥＩＡ法ｎ９／ｒ
ｎｌ。
ｎｌ。
Ａ ２０．０ ’２１Ｂ １８
０ １７６ Ｃ１５０１４６ ０３５３３ Ｅ ３９１ ４ｏ。
０ １７６ Ｃ１５０１４６ ０３５３３ Ｅ ３９１ ４ｏ。
第１〜４図はいずれも、各種の抗原決定基具有物質の濃
厚と酵素活性との関係を示すものである。 第１図 第３図 １３７ｍ１ 第２図 Ｏ□Ｓ １，５ ３ ５ ｎｑ／ｍｌ 第４図 ｎｇ／ｍｌ
厚と酵素活性との関係を示すものである。 第１図 第３図 １３７ｍ１ 第２図 Ｏ□Ｓ １，５ ３ ５ ｎｑ／ｍｌ 第４図 ｎｇ／ｍｌ
Claims (1)
- ｉｌｌ、１１定対象たる抗原決定基具有物質（１）と反
応する抗体又はこの抗体と反応する抗原決定基具有物質
（２）とビオチン酵素又はビオチン酵素阻害物質とを４
１１体に各々の固定相を分離して固定した固定化物と、
前記抗体と反応する抗原決定革具物質（２）又は前記抗
原決定基具有物質（２）と反応する抗体と前記ビオグツ
酵素と反応するビオチン酵素阻害物質又は前記ビオチン
酵素阻害物質と反応するビオグツ酵素とを結合した結合
物と、測定対象たる抗原決定基具有物質（１）とを水溶
液中で共存せしめ、その後膣固定化物又は水溶液のビオ
チンＩ・１４素活例又はビオチン酵素阻害物質の活性を
測定することを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方
法
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58077255A JPS59202064A (ja) | 1983-04-30 | 1983-04-30 | 抗原決定基具有物質を測定する方法 |
| US06/603,499 US4649105A (en) | 1983-04-30 | 1984-04-24 | Method of measuring biological ligand |
| DE8484302853T DE3485215D1 (de) | 1983-04-30 | 1984-04-27 | Verfahren zur bestimmung von biologischen liganden. |
| ES531979A ES8507265A1 (es) | 1983-04-30 | 1984-04-27 | Un metodo de medir un ligando biologico |
| EP84302853A EP0124366B1 (en) | 1983-04-30 | 1984-04-27 | Method of measuring biological ligands |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58077255A JPS59202064A (ja) | 1983-04-30 | 1983-04-30 | 抗原決定基具有物質を測定する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59202064A true JPS59202064A (ja) | 1984-11-15 |
| JPH0340830B2 JPH0340830B2 (ja) | 1991-06-20 |
Family
ID=13628742
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58077255A Granted JPS59202064A (ja) | 1983-04-30 | 1983-04-30 | 抗原決定基具有物質を測定する方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4649105A (ja) |
| EP (1) | EP0124366B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59202064A (ja) |
| DE (1) | DE3485215D1 (ja) |
| ES (1) | ES8507265A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61277061A (ja) * | 1984-12-03 | 1986-12-08 | ヘキスト・セラニ−ズ・コ−ポレイション | リガンドの測定方法 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5206144A (en) * | 1985-03-29 | 1993-04-27 | Novo Industri A/S | Determination of glycated (glycosylated) hemoglobin in blood |
| DK145385D0 (da) * | 1985-03-29 | 1985-04-01 | Novo Industri As | Monoklonalt antistof til immunkemisk analyse |
| WO1987006006A1 (en) * | 1986-03-26 | 1987-10-08 | Murex Corporation | Anti-enzyme antibody immunoassay |
| US5206136A (en) * | 1986-11-19 | 1993-04-27 | Genetic Systems Corporation | Rapid membrane affinity concentration assays |
| US5206178A (en) * | 1986-11-19 | 1993-04-27 | Genetic Systems Corporation | Membrane affinity concentration immunoassay |
| US4904583A (en) * | 1987-05-26 | 1990-02-27 | Becton, Dickinson And Company | Cascade immunoassay by multiple binding reactions |
| EP0310940B1 (en) * | 1987-09-30 | 1994-11-23 | Fujirebio Kabushiki Kaisha | Analytical element for enzyme immunoassays |
| US5362624A (en) * | 1988-05-25 | 1994-11-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the determination of an immunologically detectable substance and a suitable reaction vessel therefor |
| US5279937A (en) * | 1992-04-30 | 1994-01-18 | Detechnology Canada | Use of macroglobulins to improve the signal-to-background ratio in affinity binding assays |
| US5624813A (en) * | 1994-04-21 | 1997-04-29 | Mahant; Vijay K. | NAD(P)+ /NAD(P)H based chemiluminescent diagnostics |
| US5916757A (en) * | 1994-05-31 | 1999-06-29 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Specific binding assay using enzyme inhibitor and anti-inhibitor antibodies |
| US5705353A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Beckman Instruments, Inc. | Method of reducing interferences in assays |
| EP1079231A4 (en) * | 1998-05-15 | 2003-07-23 | Sekisui Chemical Co Ltd | IMMUNOREACTIVES AND IMMUNOASSAY METHOD |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4208479A (en) * | 1977-07-14 | 1980-06-17 | Syva Company | Label modified immunoassays |
| GB2013211B (en) * | 1978-01-26 | 1982-06-30 | Technicon Instr | Immunoassays using f(ab')2 fragments |
| US4228237A (en) * | 1978-09-21 | 1980-10-14 | Calbiochem-Behring Corp. | Methods for the detection and determination of ligands |
| AU8594382A (en) * | 1981-08-05 | 1983-02-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Immunoassay using biotin-avidin-enzyme complex |
| JPS58209994A (ja) * | 1982-05-10 | 1983-12-07 | Fujirebio Inc | 活性蛋白等固定化物を用いた抗原の測定方法 |
-
1983
- 1983-04-30 JP JP58077255A patent/JPS59202064A/ja active Granted
-
1984
- 1984-04-24 US US06/603,499 patent/US4649105A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-04-27 DE DE8484302853T patent/DE3485215D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-04-27 EP EP84302853A patent/EP0124366B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-27 ES ES531979A patent/ES8507265A1/es not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61277061A (ja) * | 1984-12-03 | 1986-12-08 | ヘキスト・セラニ−ズ・コ−ポレイション | リガンドの測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0124366A3 (en) | 1988-01-13 |
| ES531979A0 (es) | 1985-08-16 |
| US4649105A (en) | 1987-03-10 |
| EP0124366B1 (en) | 1991-10-30 |
| ES8507265A1 (es) | 1985-08-16 |
| JPH0340830B2 (ja) | 1991-06-20 |
| DE3485215D1 (de) | 1991-12-05 |
| EP0124366A2 (en) | 1984-11-07 |
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