JP2021189174A - Ｌ−サイロキシン特異的イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

【課題】免疫測定方法において、Ｌ−Ｔ４を特異的に測定する方法を提供する。【解決手段】抗サイロキシン抗体および抗イムノコンプレックス抗体を用いた、Ｌ−サイロキシンを特異的に認識する免疫測定方法。【選択図】図２

Description

本発明は、Ｌ−サイロキシンを特異的に認識するイムノアッセイに関するものである。

Ｌ−サイロキシンは甲状腺ホルモンの１つであり、生体内で糖の代謝や蛋白質の合成など、エネルギー代謝を行うために分泌される。また、化学合成物としてはサイロキシン製剤が、甲状腺機能低下症のホルモン補充剤や甲状腺腫瘍の発育阻止を目的として使用される。

Ｌ−サイロキシンは、アミノ酸のチロシン２分子が縮合して生合成されるホルモンであるため、アミノ酸に由来する不斉炭素を一つ有する。Ｄ−サイロキシンはＬ−サイロキシンの鏡像異性体であるが、代謝には影響を与えず、血中コレステロールを低下させることが知られている（非特許文献１）。このようにサイロキシンはＤ体、Ｌ体で生理活性の異なる化合物である。

しかし、検体中のサイロキシン濃度測定の目的で行われる競合型のイムノアッセイでは、Ｄ体、Ｌ体を区別することは困難であった。

サイロキシンのＤ体、Ｌ体を識別する方法としては、非特許文献２に記載のようなＨＰＬＣを基本とした方法があるが、ＨＰＬＣの特性上、高いスループットや高感度化に対しては課題があった。

Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ， １２１７ （２０１０） ４２５５−４２６６ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． ２００５ Ａｐｒ；２２（４）：６６７−７５．２００５ Ａｐｒ ７．

本発明の目的は、Ｌ−サイロキシンを特異的に認識するイムノアッセイ方法を提供することである。

上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）抗サイロキシン抗体および抗イムノコンプレックス抗体を用いた、Ｌ−サイロキシンを特異的に認識する免疫測定方法。
（２）３，３’，５，５’−テトラヨードチロ酢酸との交叉反応率が５％以下であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）抗サイロキシン抗体がウサギモノクローナル抗体であることを特徴とする（１）または（２）に記載の方法。
（４）抗イムノコンプレックス抗体がマウスモノクローナル抗体であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。

以下、本発明を詳細に説明する。
（１）Ｌ−サイロキシン
Ｌ−サイロキシン（以下、「Ｌ−Ｔ４」と言うことがある。）は、甲状腺ホルモンの一種であり、チロキシン（Ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ）と表記されることもある。医薬品としては、レボチロキシン（Ｌｅｖｏｔｈｙｒｏｘｉｎｅ）が用いられる。本発明において、イムノアッセイの測定対象となるＬ−Ｔ４はレボチロキシンナトリウム（レボチロキシンＮａ）などの塩化物であってもよく、水溶液中でＬ−Ｔ４の構造をとり得る物質であればよく、特に限定されない。
（２）測定対象溶液
測定対象溶液としては、Ｌ−Ｔ４を含有するものであれば特に限定されるものではない。例えば人の血液（全血、血漿、血清等）、尿などの体液などが例示可能である。
（３）抗イムノコンプレックス抗体
抗イムノコンプレックス抗体は、Ｌ−Ｔ４に対する抗体ではなく、Ｌ−Ｔ４に対する抗体への抗体でもなく、Ｌ−Ｔ４とそれに対する抗体との複合体に対する抗体である。抗イムノコンプレックス抗体を得るために用いられる免疫動物種は特に限定されない。動物種としてはマウス、ラット、ヤギ、ヒツジなどを例示できる。本発明においては特に、マウス由来の抗イムノコンプレックスモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
（４）抗サイロキシン抗体
抗サイロキシン抗体（以下、「抗Ｔ４抗体」と言うことがある。）は高い親和性を有することが好ましく、モノクローナル抗体であることが望ましい。高い親和性を有するモノクローナル抗体が取得可能な動物種として、ヤギ、ヒツジ、ウサギなどを例示可能であるが、特にウサギ由来のモノクローナル抗体が好ましい。親和性としては解離定数（ＫＤ）が１０^−１０（Ｍ）以下であることが好ましく、更には１０^−１１（Ｍ）以下であることが好ましい。
（５）水不溶性担体
水不溶性担体は特に限定されるものではないが、例えば、樹脂、ガラス、ポリスチレンなどの微粒子、粒子、ビーズ、プレート等が用いられる。水不溶性担体は、抗Ｔ４抗体または抗イムノコンプレックス抗体が固定化される。固定化の方法には特に限定はなく、直接または間接的に（例えばアビジン−ビオチン結合等を介して）固定化してもよい。
（６）標識
標識は特に限定されるものではないが、例えば酵素、放射性同位元素、色素等が用いられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ等が使用できる。標識は、抗Ｔ４抗体または抗イムノコンプレックス抗体に結合される。標識の方法には特に限定はなく、直接または間接的に（例えばアビジン−ビオチン結合等を介して）標識してもよい。
（７）測定方法
生物試料分析 Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ４（２０１６）に示されるような、全自動免疫測定装置を用いることが好ましい。例えば図１に示すような２つのセルを有する試薬カップを用いて以下のような自動測定を行うことが好ましい。
１）２セルカップの一方のセルに抗Ｔ４抗体を固定化した水不溶性担体を分注し、他方のセルに酵素標識抗イムノコンプレックス抗体を分注し、試薬カップとする。
２）試薬カップ、測定対象溶液を自動免疫測定装置にセットする。
３）自動免疫測定装置において、ハプテンを含む測定対象溶液を試薬カップの水不溶性担体側のセルに分注し、反応させる。
４）反応終了後、抗Ｔ４抗体を固定化した水不溶性担体に未吸着の成分を洗浄する。
５）試薬カップの酵素標識抗イムノコンプレックス抗体を、水不溶性担体側のセルへ移す。
６）反応終了後、抗Ｔ４抗体を固定化した水不溶性担体に未吸着の成分を洗浄する。
７）酵素の基質を添加して、酵素反応に由来する生成物の発光強度などを測定する。
（８）特異的
本発明において特異的とは、交叉反応物質との交叉反応率が低いことを指す。交叉反応率が５％以下であれば十分であり１％以下であればより好ましい。

本発明の測定方法では、抗Ｔ４抗体と抗イムノコンプレックス抗体を用いた二重の分子認識を行うことで、サイロキシンの鏡像異性体を識別し、Ｌ体を特異的に測定することが可能である。

本発明で使用できる試薬カップの一例を示す図である。 実施例１でＬ−Ｔ４測定時の検量線を示す図である。 比較例２での試薬カップを示す図である。

以下、本発明の実施例を抗Ｔ４ウサギモノクローナル抗体と、抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体に関して詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］
（１）抗Ｔ４ウサギモノクローナル抗体
抗Ｔ４ウサギモノクローナル抗体は特許第５６６３８３４号公報に記載の方法で取得した。
（２）抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体
Ｌ−Ｔ４と抗Ｔ４ウサギモノクローナル抗体の免疫複合体に対する抗体（抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体）は特許第６０３１９４４号公報に記載の方法で取得した。
（３）測定
自動分析は全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー（株）製）を用いて以下の方法で行った。
１）試薬カップの作製
図１に示す２つのセルを有するカップを用いて、自動分析に用いる試薬カップを作製した。カップの一方のセルを微粒子側のセル、他方のセルをコンジュゲート側のセルと呼ぶ。

抗Ｔ４ウサギモノクローナル抗体を固定化した微粒子を含む溶液を、微粒子側のセルに分注した。コンジュゲート側のセルには、アルカリホスファターゼ標識した抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体を分注した。溶液を凍結乾燥し、アルミシールで封止し、Ｌ−Ｔ４測定用試薬カップとした。
２）測定
全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー（株）製）に１）で作製したＬ−Ｔ４測定用試薬カップをセットし、Ｌ−Ｔ４濃度既知のサンプル６種（ｃａｌ１〜ｃａｌ６）の測定を行い、検量線を作成した。測定は５μＬの濃度既知サンプル（血清ベース）と４５μＬの希釈液をＬ−Ｔ４測定用試薬カップの微粒子側のセルに分注し、５分間反応（一次反応）させた後、洗浄液による洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行い、次に希釈液で溶解したコンジュゲート側のセルの試薬（５０μＬ）を微粒子側のセルに移し反応させた（二次反応、３分間）。二次反応の終了後、二回目の洗浄液による洗浄を行った。その後、酵素の基質を添加し、発光強度を測定した。測定結果を表１および図２に示す。Ｌ−Ｔ４の濃度に応じて発光強度が大きくなることが確認され、抗イムノコンプレックス抗体を用いたＬ−Ｔ４の測定系を構築できたことを確認した。

（４）交叉反応率評価
交叉反応率の評価は、ゼロ濃度サンプルに表２に記載した交叉反応物質をそれぞれ１００，０００ｎｇ／ｄＬまたは１０，０００ｎｇ／ｄＬになるように添加し、測定することで行った。Ｐｈａｒｍａｃｅｕｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４、２００５、６６７に記載のように、交叉反応率評価に用いる各物質は血清中のアルブミンやサイロキシン結合グロブリンと結合するため、添加濃度とサンプル溶液中の遊離物質濃度が一致しない。このため、Ｌ−Ｔ４を添加した際の反応率が１００％として各物質の交叉反応率を算出した。具体的には、次式に示す計算式で交叉反応率を計算した。
交叉反応率（％）＝［（交叉反応性物質添加時の検量線からの算出濃度）／（交叉反応物質の分子量）］／［（同量のＬ−Ｔ４添加時の検量線からの算出濃度）／（Ｌ−Ｔ４の分子量）］×１００
［比較例１］
（１）測定試薬
競合型のイムノアッセイ試薬であるＡＩＡ−パックＣＬ ＦＴ４（東ソー（株）製）を用いた。ＡＩＡ−パックＣＬ ＦＴ４は、微粒子側のセルに抗Ｔ４ウサギポリクローナル抗体を固定化した微粒子を含む溶液を分注し、コンジュゲート側のセルにアルカリホスファターゼ標識Ｔ４を含む溶液を分注し、凍結乾燥後、アルミシールで封止したものである。
（２）測定
全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー（株）製）にＡＩＡ−パックＣＬ ＦＴ４（東ソー（株）製）をセットし、Ｌ−Ｔ４濃度既知のサンプル６種（ｃａｌ１〜ｃａｌ６）の測定を行い、検量線を作成した。測定は５μＬの濃度既知サンプル（血清ベース）と４５μＬの希釈液をＡＩＡ−パックＣＬ ＦＴ４カップの微粒子側のセルに分注し、６分間反応（一次反応）させた後、希釈液で溶解したコンジュゲート側のセルの試薬（５０μＬ）を微粒子側のセルに移し反応させた（二次反応、３分間）。二次反応の終了後、洗浄液による洗浄を行った。その後、酵素の基質を添加し、発光強度を測定した。また、実施例１（４）の交叉反応率評価に用いたサンプルと同一のサンプルを使用して交叉反応率を算出した。

実施例１および比較例１で算出した交叉反応率を表２に示す。この結果から本発明の測定方法では、競合法（比較例１）で８０％以上の交叉反応率を示すＤ−Ｔ４に対しても交叉反応せず、Ｌ−Ｔ４を特異的に測定可能であることが確認された。また、比較例１において２０％以上の交叉反応率を示す３，３’，５，５’−テトラヨードチロ酢酸に対しても交叉反応率を示さないことが確認された。

［比較例２］
実施例１で用いた抗Ｔ４ウサギモノクローナル抗体を用いて、競合法による評価を行った際の比較例を以下に示す。
（１）抗Ｔ４ウサギモノクローナル抗体
抗Ｔ４ウサギモノクローナル抗体は実施例１で用いた抗体と同じ抗体を用いた。
（２）測定
自動分析は全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー（株）製）を用いて以下の方法で行った。

１）試薬カップの作製
図３に示す２つのセルを有するカップを用いて、自動分析に用いる試薬カップを作製した。カップの一方のセルを微粒子側のセル、他方のセルをコンジュゲート側のセルと呼ぶ。

抗Ｔ４ウサギモノクローナル抗体を固定化した微粒子を含む溶液を、微粒子側のセルに分注した。コンジュゲート側のセルには、アルカリホスファターゼ標識したＴ４を含む溶液を分注した。溶液を凍結乾燥し、アルミシールで封止し、測定用試薬カップとした。
２）測定
全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー（株）製）に１）で作製した測定用試薬カップをセットし、Ｌ−Ｔ４濃度既知のサンプル６種（ｃａｌ１〜ｃａｌ６）の測定を行い、検量線を作成した。測定は５μＬの濃度既知サンプル（血清ベース）と４５μＬの希釈液を微粒子側のセルに分注し、６分間反応（一次反応）させた後、希釈液で溶解したコンジュゲート側のセルの試薬（５０μＬ）を微粒子側のセルに移し反応させた（二次反応、３分間）。二次反応の終了後、洗浄液による洗浄を行った。その後、酵素の基質を添加し、発光強度を測定した。また、実施例１（４）の交叉反応率評価に用いたサンプルと同一のサンプルを使用して交叉反応率を算出した。

実施例１、比較例１および比較例２で算出した交叉反応率を表３に示す。この結果から本発明の測定方法では、同じ抗体を用いた場合に競合法で１００％以上の交叉反応率を示すＤ−Ｔ４に対しても交叉反応せず（比較例２）、Ｌ−Ｔ４を特異的に測定可能であることが確認された。また、比較例２において２５％以上の交叉反応率を示す３，３’，５，５’−テトラヨードチロ酢酸に対しても交叉反応率を示さないことが確認された。

以上の結果から、抗Ｔ４抗体および抗イムノコンプレックス抗体を用いて、Ｌ−Ｔ４を特異的に測定可能であることが確認された。

Claims (4)

1. 抗サイロキシン抗体および抗イムノコンプレックス抗体を用いた、Ｌ−サイロキシンを特異的に認識する免疫測定方法。
2. ３，３’，５，５’−テトラヨードチロ酢酸との交叉反応率が５％以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 抗サイロキシン抗体がウサギモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 抗イムノコンプレックス抗体がマウスモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

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