JPS58111754A - クレアチニンの免疫学的測定法及びそのための試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫学をペースとしたクレアチニンの測定法
及びそれに好適である試薬に関する。

臨床化学においてはクレアチニンの測定は腎機能を診断
するための最も重要な方法の１つである。尿素測定に比
してその測定は、血清中のクレアチニン濃度が栄養摂取
法、特に蛋白質に富んだ食餌の供給に実際に影響されな
いという決定的な利点を有する。

勿論、尿素に比較して血清中のクレアチニン濃度は決定
範囲において（正常値の上限は男子で１．１０■／　ｄ
ｉ　、女子で０．９０■／ｄｔ）著しく低い。それ故、
クレアチニン試薬の感度及び特異性に対して高い要求が
なされている。

クレアチニン試薬は臨床実験室における標準試験法とし
て重要であるので、この試験は同時にできる限り低い作
業経費で実施可能でありかつ特に自動分析装置での利用
に好適であること（９） が必要である。

従来最も一般的に使われているクレアチニンの測定法は
Ｍ、ヤツフエにより見出された、アルカリ性媒体中での
クレアチニンとピクリン酸との呈色反応に基いている。

この場合、試料の酸性脱蛋白（例えばトリクロル酢酸又
はピクリン酸で）の後上澄み中にピクリン酸の添加及び
アルカリ性化後に赤色の呈色が発現し、それを光度測定
する。しかしこの簡単な方法は一連の基本的な欠点を有
する。

ヤツフエ反応が５０種以上の同様に色属性の物質、特に
当然血清中に産生ずるグルコース。

ピルベート、アセトアセテート及びアセトン。

従ってクレアチニンに対して特異的ではないような成分
により影響を受けることが明らかになった〔文献二％（
ｌＩｉｎ、＋ｃ１．ｈａｍ、　’　、　２６巻、１１１
９〜１１２６頁（１９８０年）〕。なかんずく、低いク
レアチニン濃度１〈１・ｒｒｑ　／　ｄｔ　）ではこれ
らの１非りレアチニン色原体ｌは妨害作用をし、このこ
とはクレアチニンの検出下限の制限をも（１０） たらす（％クレアチニンブラインド範囲〃：０ｒｅａｔ
ｉｎｉｎｂｌｉｎｄｅｒ　Ｂｅｒｅムｃｈ）。

また、反応媒体中（７’　ｐＨ値の僅かな移動も色の深
みの変化をもたらす。最後に、部分的に腐食性で毒性の
試薬の使用もまた取扱いの際の危険の原因となる。ヤツ
フエ反応の一連の変更は精度及び実施１１能性を改良す
るが、これらの基本的な欠陥は完全には除去されてい／
ｒい。

他の公知の方法はクレアチニン全０−ニトロベンズアル
デヒドの添加下にメチルグアニジンに変換し、これ全坂
口反応後に測定する。クレアチニンとカリウム水銀チオ
シアネートとの呈色反応も公知でおる。しかし両方の反
応は臨床笑験至には不適当であることが明らかになった
。

更に、ヤツフエ反応を酵素の部分工程と組合わせること
により非特異性色原体による妨害を回避することが知ら
れている。この場合、ヤッフエ反応においてフレア≠二
□ンアミドヒドロラーゼ／クレアチニンキナーゼ／ＡＴ
Ｐで処理する前とその後で血清試料により得られた色相
を測定しかつクレアチニン含量の吸光度の差から計算す
る（　”１Ａｒｃｈ、Ｐｈａｒｍ、　’　、　３巻、８
９３〜８９６頁（１９８０年）〕。この方法は特異的で
はあるが、その実施は煩雑であυがっ自動化が困難であ
る。

更に、クレアチニンからクレアチニン−イミノヒドロラ
ーゼの作用により遊離したアンモニアをアンモニア選択
性電極を用いて（’Ａｎａｌ。

Ｏｈｅｍ、　’　、　４６巻、２４６〜２４９頁（１９
７６年）〕又は後続のグルタメートデヒドロゲナーゼ反
応におけるＮＡＤＨ消費量を螢光測定により［％０１１
ｎ、Ｏｈｉｍ、Ａｃｔａ’　、　１００巻、２１〜２３
頁（１９８０年）〕測定するクレアチニン測定法が公知
である。しかし、試料中には比較的多址の遊離アンモニ
アが存在する可能性があるので、この種の測定が十分に
妨害されずに実施でき、それ故定期診断に普及し得るか
どうが疑わしい。

最近、完全酵素的なりレアチニン試験が記載された。こ
の試験ではクレアチニンをクレアチンに変換し、これ１
ＡＴＰと反応させてクレアチンホスフェートに変換し、
その際に生成するＡＤＰ’ｉピルベートキナーゼ及びラ
クテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）との結合反応にお
いて反応溶液中のＮＡＤ）ｌ含量の低下について光度測
定する［ｌＮ５ｃａｎｄ、Ｊｍｃｌｉｎ、Ｌａｂ、Ｉｎ
ｖｅｓｔ、、　Ｉ’補遺２９巻、１２６頁（１９７２年
）］。

この方法は血清試料の脱蛋白を必要とせずかつクレアチ
ニンに特異的である。しかし大容量の試料を使用した場
合でも測定シグナルが比・較的低いため試験の感度は低
いクレアチニン濃度範囲において限定され、更に試料盲
検値を測定する必要があるのでこの方法を自動分析装置
に適用するのは非常に困難である。

それ故、簡便で自動化可能であり、同時に非常に特異的
でかつ前記の理由から特にクレアチニンの濃度範囲〈１
■／ｄｉ（％クレアチニンブラインド範囲〃）で非常に
敏感なりレアチニン試験が求められている。

本発明はこの課題をクレアチニンの免役学的測定方法に
より解決し、本方法は試料からのり（１３） レアチニンを初めにメチルヒダントインに、有利には酵
素的にクレアチニン−イミノヒドロラーゼ（Ｅ　ｏ　、
　３．５．４．２１　）を用いて変換しかつ生成した１
−メチルヒダントインにより、一般式Ｉ： 薯 〔式中Ｂｌ　、　Ｈ，２、Ｒ，３及びＦＬ４はそれぞれ
独立にＨ原子、Ｏ原子１〜３個を有するアルキル基又は
フェニル基を表わす〕のヒダントインとハシテン担体と
の接合体と、更に一般式Ｉの他のヒダントインと同じハ
プテン担体、しかし有利には他のハシテン担体との接合
体に対抗して作用する、例えば抗血清もしくはそれから
得られる免疫グロブリンフラクションの形の抗体との間
の結合反応を濃度に相応して阻害することに基いている
。

優れた実施形では結合阻害試験に関してもま（１４） た抗体形成に関してもハシテン担体と１−メチルヒダン
トイン（Ｒ”＝ＯＨｓ　、　Ｒ”〜ＦＬ４＝Ｈ）との接
合体を使用する。

抗体とヒダントイン接合体との間の結合の阻害は、クレ
アチニン、それ故１−メチルヒダントインがヒダントイ
ン接合体との混合前に抗体に多量に添加されている程強
い。この阻止効果は測定すべき試料溶液中のクレアチニ
ンの濃度範囲が１■／ｄｉより低くても、つまり公知の
クレアチニン測定法の利用可能性が者しく限定されてし
まう範囲において非常に顕著である。

長い間、簡便で特異的な、特に低い濃度範囲において良
好であるクレアチニン測定法が求められかつ免疫学的試
験法が４０年来知られていたにもかかわらず、従来はク
レアチニンの免疫学的測定法を開示し得なかった。

就中このことは、クレアチニンが抗体を形成するすべて
の生物の生体中に広く分布している抗体形成を開始し得
ない物質であり、分子の大きさが低くかつ血清濃度が比
較的高いためにクレアチニンとハプテン担体との接合体
が、クレアチニンと構造的に緊密に類縁の化合物、例え
ばクレアチニンとすらも交叉反応しない抗体を形成する
ことができかつそれ故クレアチニンの特異的な測定法を
構成し得ることを予測し得なかったことに帰因する。

本発明ではこの課題は、クレアチニンから初めに蟻異種
化叉応（Ｖｇｒｆｒｅｍｄｕｎｇｓｒｅａｋｔｉｏｎ）
＃で低分子でもあるが生体異種化合物でもあるヒダント
イン全形成し、この化付物に対して好適なヒダントイン
接合体、特に１−メチルヒダントイン−ハプテン担体接
合体により抗体を生成することができ、この抗体は意想
外にも非常に特異的であり、それは例えばクレアチニン
、クレアチン及び尿素のような基本的な構造的特徴がヒ
ダントインのそれと共通している生体固有の化合物と有
意には交叉反応せず、それ故前記の異種化反応の適用に
より特異的で敏感なりレアチニン試験を構成するのに好
適である。

抗体形成に好適なノ・ブテン担体としては免疫学でその
ものとして知られている物質が好適である。その例は原
則的には、抗体形成に使われる宿主動物では産生じない
すべての種類の異なる蛋白質、例えば種々の由来の血清
アルブミン。

キーホールリンフオシアニン、（リボ）−ポリサツカリ
ド、アガロース、活性炭、ウィルスである。公知の他の
ハプテン担体の例は猶ハンドブック・オブｅエクスペリ
メンタル・イムノロジー（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）〃、
第第３版、１〜１１頁ジブラックウェルサイアンティフ
ィック・ノぐブリヶーションズ（Ｂ−Ｉａｃｋｗｌｅｌ
ｌ　　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ）、１９７８年に記載されている。該文献には担体と
ハプテンとの好適な納会法も挙げられている。本発明範
囲の優れているハプテン担体は例えば牛−又はヒト血清
アルブミン等のような種々の由来の血清アルブミン並び
にエデスチンである。

抗体形成に使用した接合体が結分阻害試験に使用した接
合体と同じハプテン担体を含有する場合、ハシテン担体
に対する交叉反応は試験に（１７） おいて、本来重要なハプテンとの結合反応の測定前にハ
プテン担体に対抗して作用する抗体の沈澱に必要な濃度
のハプテン担体を抗体フラクションに添加することによ
り選択的に遮幣することができ、この場合混濁形成の測
定（ＴＩＮＩＡ、ＮＩＮＩ人）による試験を実施する際
に初めにヒダントイン−接合体抗体とハプテン担体との
交叉反応により生じる沈澱を例えば遠心分離又はｐ過に
より除去する。

免疫化にもしくは結合阻害試験に使用するヒダントイン
−接合体は、ヒダントインを脂肪族又は芳香脂肪族のカ
ルボン酸に結合させ、カルボン酸に由来する部分のカル
ボキシル基ｔハプテン担体と結合させることにより製造
すると優れている。このためには炭素原子少なくとも２
個、殊に炭素原子４〜１６個を有する脂肪酸並びにアル
キル側鎖基を有する芳香族カルボン酸が好適であること
が明らかになった。芳香族環に炭氷原子１〜４個のアル
キル基を有する安息香酸誘導体が特に好適である。代表
的な例はメ（１８） チル安息香酸、エチル安息香酸及びプロピル安息香酸で
ある。これらの芳香脂肪族カルボン酸のオリツマ−９例
えばメチルベンゾエート−メチル安息香酸も同様に好適
である。

本発明の場合免疫学的にハシテンであるヒダントインと
カルボン酸との間の結合は公知方法で活性カルボン酸誘
導体の使用下に生ぜしめることができる。ハロゲン化カ
ルボン酸、特に水性アルコール性媒体中のω−ゾロムカ
ルダン酸を使用し又は相応するハロゲン化カルボン酸エ
ステルの場合には無水媒体中で使用し、次いでけん化す
ると優れている。最高の結果はω−プロムカルゼン酸エ
ステルを使い、次いでけん化することにより達成され、
この場合には５０％までの収率が得られた。水性アルコ
ール性媒体中のヒダントインとの反応は高められた温度
。

有利には沸点で行なう。カルゼン酸エステルを使用する
場合、溶剤としヤ有利に極性の有機化付物、例えばジメ
チルホルムアミド、ホルムアミド、テトラヒドロフラン
等を使用する。反応をメタノラードとの反応により得ら
れるヒダントインのナトリウム塩から行なうと有利であ
る。

生成物のけん化は水性アルカリ性媒体中で穏やかに加温
しながら行なうことができる。結合はヒダントインの３
位の窒素（未置換）以外に５位の炭素（Ｂ３及びＲ４＝
Ｈ）を介してｐ−安息香酸ジアゾニウム塩によるジアゾ
化により行なうことができる。免疫化並びに結合阻害試
験には３位の窒素を介して架橋されたヒダントイン接合
体が優れている。

有利に、ハプテン担体との結合は水性有機媒体中でアミ
ン及びクロル蟻酸エステルの存在において又はカル吋ｚ
ン酸のヒドロキシスクシンイミドエステルの製造により
、次いでこのエステルを蛋白質又は他の担体とｐＨ７〜
９で反応させることにより行なう。反応媒体としては水
／ジオキサンが特に好適であることが明らかになった。

このようにして得られたヒダントイン接合体は抗血清を
形成するための免疫原としであるいは直接結合阻害試験
に使用する。

抗血清の形成に当Ｄｆｉ業者に公知の方法により選択し
た動物種に接合体を投与する。免疫原を７０イントアジ
ユノ々ントと一緒に使用して免疫応答を強化する。

一般に、抗体の形成には抗体形成するすべての生物を使
用することができる。羊を使うと優れている。細胞培養
から得られるモノクローン抗体もまた該当する、 本発明の範囲において抗体という用語は精製抗体も抗血
清も包含し、後者から得られる免疫グロブリンフラクシ
ョン並びに抗体フラグメント、例えばＦ　（ａｂ２　）
、Ｆａｂ及びＦｖ−７ラグメントである。

ヒダントイン接合体とヒダントイン接合体抗体との間の
結合反応に対する１−メチルヒダントインの阻害作用は
公知の免疫学的方法により直接測定することができる。

標識化した抗体もしくは抗原を使用する方法、例えばＲ
ＩＡ又はＥＩＡ（この場合は実施形１１ｓＡ又はＥＭＩ
Ｔ）、接合（２１） 体と抗体鵡の間の免疫沈澱の阻害の濁り測定（ＴＩＮＩ
Ａ原理）もしくは相応する比濁分析法（ＮＩＮＩ人原理
）等が例として挙げられる。

更に、凝集阻止試験（ＰＡＯＩＡ＝Ｐａｒ日ａｌｅＯｏ
ｕｎｔ　ｉｎｇ　Ｉｍｍｕｎｏ　−Ａｓ５ａｙ　）及び
補体結合反応を適用することができる。これらすべての
方法は当業者に公知であり１本明細書では詳説しない。

ＥＩＡの実施形に関しては蟻クリニカル・キミカ・アク
タ（ＯＩｉｎ、Ｏｈｉｍ、Ａｃｔａ）’　１８１巻、１
〜３６頁（１９７７年）及び＃Ｊ、０１　ｉｎｅｏｈｅ
ｍ、０１１ｎ、Ｂ　−１ｏｃｈｅｍ、　’、　１８巻、
１９７〜２０８頁（１９８０年）に記載されている。

酵素標識化の場合、有効に使用される酵素。

例えばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アル
カリ性ホスファターゼ、グルコースオキシ／　　４’ｌ
、グルコース−６−ホスフニートーデヒドロゲナーゼ及
びルシフェラーゼが挙げられる。補酵累による標識化に
は例えばＮＡＤ。

ＮＡＤＰもしくはそれらの還元型が該当する。抗体もハ
シテンも標識化することができる。

（２２） 前記の方法のうち優れている方法は、免疫沈澱を所定の
時間間隔で濁り測定することにより結合反応の阻害を測
定することである。

他の優れている方法は、非結廿のハプテン担体−ヒダン
トイン接合体を標識化抗体、特に有利に酵素標識化した
抗体で逆滴定することにより、標識化物質の結θ分又は
非結会分を測定することにより結合反応の阻害を測定す
るものである。この際には、例えば放射性物質（ＦｔＩ
Ａ）、酵素もしくは補酵素（ＥＩＡ）、螢光（ＥＩＡ）
、スピン標識化［５Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ’、　２３６巻。

９３〜９４頁（１９７２年）〕による標識化が好適であ
る。標識化抗体としては標識化した拮抗体も使用するこ
とができる（二重抗体法）。

本発明の他の目的は、クレアチニンを免疫学的に測定す
るための試薬であり、これはクレアチニン−イミノヒド
ロラーゼ１１．ヒダントイン。

殊に１−メチルヒダントインと第１ハシテン担体との接
合体に対する抗体、ヒダントイン、殊に１−メチルヒダ
ントインと、第１ハプテン担体とは基本的に交叉反応し
ない第２ハプテン担体との接合体及び緩衝物質を含有す
ることを特徴とする。

本発明による試薬は免疫沈澱を促進する物質を含有して
いてもよい、、それにはポリエチレングリコール単独で
又は表面活性物質と一緒のそれが特に好適である。ポリ
エチレングリコールとしては分子量２００〜２００００
のものが好適であり、分子量６０００±２０００が優れ
ている。試薬中のポリエチレングリコールの好適な濃度
は０〜８％、殊に］〜４％である。

抗体成分及び適用した標識化に関しては前記の記載が本
発明による試薬にも該当する。

濁り測定法に関しては本発明ではクレアチニン−イミノ
ヒドロラーゼ０．０５〜１００Ｕ／ゴ。

１−メチル−ヒダントイン：血清アルブミン＝２：１〜
３０：１．のモル比の、ｐ−メチル安息香酸のような芳
香脂肪族カルデン酸を介して架橋された１−メチルヒダ
ントインとヒト−又は牛血清アルブミンとからの接合体
０．５〜５００μｔ／ｒｘｉ、ハプテン接合体結合部位
に対してモル比０．１〜１０の、酪酸のような脂肪族カ
ルデン酸を介して架橋した１−メチルヒダントインとエ
デスチンとの接合体に対する抗体、ポリエチレングリコ
ールＯ〜８％並びに緩衝物質（ｐＨ４〜１０）Ｏ１０５
〜１１０５ル１ が優れている。

ｇＭｘ４法の場合、本発明による試薬は活性レセプタ一
部位に関して１−メチルヒダントイン−ハプテン担体接
合体に対する抗体１０−４〜１０−１４モル／１．１ー
メチルヒダントイン−マレ−トチヒドロゲナーゼ接合体
】０−４〜１０−１４モル／Ｌ，クレアチニンーイミノ
ヒドロラーゼ０、０５〜１００Ｕ／ＩＩＬｌ，オキサル
酢酸０．０５〜５０ミリモル／１，ホスフェート緩衝剤
（　ｐＷ　６〜８．５）５〜２００ミリモル／！及びＮ
ＡＤＨ　０．　０　５〜０．４ミリモル／ｌを含有する
と有利である。

本発明範囲では緩衝物質としてはｐＨ範囲４〜１０、殊
に６〜９で有効な公知のものを使用することができる。

溶解した試薬中の緩衝剤濃度（２５） は帆００５〜１．０モル／１．殊ＫＯ．０１〜０．２モ
ル／ｌである。範囲０．０　３〜０．０　７モル／ｌが
特に優れている。

試験における抗体濃度は約１０−４〜１０−１４モル／
１，殊に１０−６〜１０−１２モル／ｌであると有利で
あり、その際モル／ｌとは活性レセプタ一部位である。

本発明方法を実施するに当９分析すべき溶液を直接試薬
に添加することができる。クレアチニンが高い濃度で存
在する場合、予め試料と水で稀釈すると有利である。

一般に、測定上温度１０〜５０℃，殊に１５〜４０℃で
実施することができる。

ヒダントイン接合体の製造は公九方法で、例えば囁ジャ
ーナル・オブ拳ノ々イオロジカル・ケミストリー（　Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｏｈｅｍ．）”、　２　２　８巻．７１３
〜・７２７頁（１９５７年ンに記載された混合無水物の
操作法で行なうことができる。酵素による標識化も同様
である。

次に本発明を実施例により詳説する。その際（２６） に使った略語は次の通りである： ａｓＡ　　　　牛血清アルブミン Ｈｌｌｌ　　　　　ヒト血清アルブミンａＩＡ　　　　
　ラジオイムノアッセイＢＭＩＴ　　　　エンチーム・
マルチプライＦ＠イムノアッセイ・テクニック （Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ　ｉｍｍｕｎｏ
ａ３ｓ　−ａｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ） ＥＬＩＳＡ　　　　エンチーム・リンクド・イムノソル
ベント・アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ 目ｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ
）ＴＩＮＩＡ　　　　タービジテイーインヒビジョン・
イムノアッセイ（Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙｉｎｈｉｂｉｔｉ
ｏｎ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）ＮＩＮＩＡ　　　　ネ
フェロメトリック・インヒビジョン・イムノアッセイ（
Ｎｅｐｈｅ−１ｏｍｅｔｒｉｃ　１ｎｌｌＩｉｂｉｔｉ
ｏｎ　ｉｍｍｕｎｏ　−ａｓｓａｙ） ＢＰ　　　　　塗布用緩衝剤 ＩＰ　　　　　恒温保持用緩衝剤 Ｔｗｅｅｎ　２０　　　ポリオキシエチレン−ソルビタ
ンモノラウレート ＤＭＦ　　　　　ジメチルホルムアミドＷＰ　　　　　
洗浄用緩衝剤 ｓｐ　　　　　基質用緩衝剤 ＰＮＰＰ−Ｎａ　　　ｐ−ニトロフェニルホスフェ−）
−Ｎａ ＦＬＴ　　　　　室温 ＡＰ　　　　　アルカリ性ホスファターゼＡＰ−Ｔｏ　
　　アルカリ性ホスファターゼ−試験組成物 チナクアント（Ｔｉｎａｑｕａｎｔ　）　−Ｆ　Ｎ−緩
衝剤：Ｎａ　、に−ホスフェート ６６ミリ七ル／ｌ ｐＨ８，０ ＢＤＴＡ　　　　　１０ミリモル／１ Ｂｒｉｊ■−３５０，４％ ＮａＮ３　　　　　　　　　　０．１　％ポリエチレン
グリコール ６０００　　　　　　　３．０％ ＤＩム　　　酵素イムノアッセイ Ａ）ヒダントイン接合体の製造 １−メチルヒダントイン１１．４９　（１００ミリモル
）を熱い無水メタノール中に溶解しかつ当量のナトリウ
ムメチラートを加える。その後メタノールを留去させ、
残る残渣を真空中で乾燥させ、次いでＤＭＦ　２００−
中に採る。８０〜１００℃に加熱する、この溶液に攪拌
下に徐々Ｋｒ−１０ム酪酸エチルエステル又はｐ−ブロ
ムメチル安息香酸１２０ミリモル／ｌを添加する。その
後、爽に５時間１００℃で攪拌し、冷却しかつ生成した
臭化す）　ＩＪウムを戸別する。

戸数を濃縮しかつインプロノぐノール１００ゴ中に採る
。その後、新たに沈澱した臭化す）　ＩＪウムを炉別す
る。Ｆ液をしに濃縮しかつ４℃に冷却すると、１色物質
が晶出する。結晶を水／メタノール（１：１）から再結
晶させる。生成したエステル’ｅ　Ｉ　Ｎ　−ＮａＯＨ
でけん化する。遊離酸をイソゾロパノールから再結晶さ
せる。

１．１−メチル−３−カルポキシブチリルーヒ（２９） ダントイン、融点１０２〜１０４℃、収率６１チ ２１−メチル−３−（ｐ−カルゼキシフェニル）−メチ
ル−ヒダントイン、融点１６７〜１７０℃、収率６７チ 牛血清アルブミンとの結合には、牛血清アルブミン３．
６２を水／ジオキサン（１：　１　）２５０−中に溶解
し、ｌ　Ｎ　−Ｎ　ａ　ＯＨ５−６−を加え、それによ
り溶解を開始し、次いで４℃に冷却する。

この溶液にジオキサン６０−及びＤＭＰ　３−中の１−
メチル−３−（ｐ−カルゼキシフェニル）−メチル−ヒ
ダントイン１．７　ｆ　、　）リブチルアミン１．７−
及びクロル蟻酸インブチルエステル０．９５−の溶液を
滴加する。このノ々ツチを４℃で２４時間攪拌し、その
後流動する脱塩水に対して３６時間透析する。その後で
溶液を凍結乾燥させる。

エデスチンとＭ合させるに当り、前記の方法ト同様に、
だが牛血清アルブミンの代りにエデスチンを及び１−メ
チル−３−（ｐ−カルゼキ（３０） ジフェニル）−メチル−ヒダントインの代すニ１−メチ
ルー３−カルゼキシブチルーヒダントインを使用する。

Ｂ）抗血清の製造 抗血清を取得するために使用した動物の免疫化は次のよ
うに実施する： 動物種：　羊 免疫原：　１−メチル−３−カルデキシブチリルーヒダ
ントインーエデスチン 接置体 免疫化ニ ア皮下　筋肉内　　　　１ツ　　　　　　　　　　　＋
１４日目皮下下　　　　１ツ　　　　　　　　　　　＋
３０日目皮下肉内　　　１ツ　　　　　　　　　　　＋
６０日目皮下　　　１ツ　　　　　　　　＋以降　　皮
下　　　１ツ　　　　　　　　＋第１回試料採血＝４５
日目 ０）抗血清の後処理 羊抗血清に室温でアエロ、ジル（無定形珪酸）１％を加
え、約２時間攪拌し、遠心分離しかつ沈澱を廃棄する。

上澄みに徐々に固体の硫酸アンモニウムを１．８モル／
ｌまで添加し、かつ４℃で数時間攪拌する。混合物を遠
心分離１−かつ上澄みを廃棄する。沈澱を出発容量の７
５％に調節しくＫ−ホスフェ−）　（ｐＨ７，０）５０
ミリモル／１゜Ｎａ０２１００　　ミリモル／　Ｌ　、
　ＮａＮａ　Ｏ−０５％）、その後約２４時間０．１５
モル／　Ｌ　Ｎａ１ｌに対して透析し、次いで場合によ
り遠心分離する。

上澄みを約８〜１０時間３ミリモル／１−Ｈｏｔに対し
て透析し、その際透析溶液を交換する（容量比１：１０
０）。生成した沈澱を遠心分離しかつ廃棄する。

次いで、１０ミリモル／ｌ−に−ホスフェ−）　（ｐＨ
７，０）、１５　、Ｏミリモル／　ｔ　−Ｎａ（Ｍ　に
対して約１２時間にｂｉつて逆透析する。（容量比１：
１００）。生成した沈澱を遠心分離しかつ廃棄する。

例　　Ｉ ＴＩＮＩＡ原理 ａ）試薬： クレアチニン溶液：チナクアン）−ＦＮ−緩衝剤１ｄ蹄
シ０．２−１０００■の濃度 クレアチニン−イミノヒドロラーゼ １−メチル−３−カルボキシブチリルーヒダントインー
エデスチン接合体に対する抗血清。

チナクアン）−ＦＮ−緩衝剤で１＝５に稀釈。

濁りを遠心分離により除去 １−メチル−３−（ｐ−カルボキシフェニル）−メチル
ーヒダントインーＲ８Ａ接合体（２１１ＩＩ／ｌ−チナ
クアントーＦＮ−緩衝剤） ｂ）試験パッチ： キュベツト（ｄ＝１ｃｍ）中に、１本当９クレアチニン
ーイミノヒドロラーゼＩＯＵ、１１々の濃度のクレアチ
ニン溶液１０μｔあるいは盲検用のチナクアントーＦＮ
−緩衝剤１０μｔを含有する稀釈抗血ｆｆ、１ｄ’ｅピ
ペツト添加しかつ２５℃で１０分間恒温保持する。

（３３） 次いで、それぞれメチルヒダントイン−ａＳＳ接接合体
溶液１０μｔピペット添加しかつ混濁の増加をメチルヒ
ダントイン−ＦＬＳＡ接合体の添加後に３６６ｎｍで測
光法により測定する（Ｅｌ開始前＊　Ｅ２１ｍ始して５
分後）。第１図はそのようにして測定した検量線であり
、クレアチニン濃度に対する吸光度差をプロットした。

例　　２ １５４８〜１５５０頁（１９７９ 年ンからの方法により〕 ａ）試薬： 塗布用緩衝剤（ＢＰ） Ｎａ（：ＪＯｓ　（ｐＨ９，３〜９．５　）　、　０−
２モル／を恒温保持用緩衝剤（ＩＰ） Ｋ−ホスフェ−）　（ｐＨ７，２）、０．０５％ル／１
ＮａＯＬ、０４モル／ｌ グリ′シントチ Ｔｗｅｅｎ２００．０５　Ｔ。

ＮａＮ１　　０−０２　％ （３４） 洗浄用緩衝剤（ｗｐ） ＮａＯＬ、　　Ｏ−１５モル／ｌ Ｔｗｅｅｎ　２０　０．０５％ ＮａＮ３　　　　０．０２　％ 基質用緩衝剤（ｓｐ） ＡＰ試験 錠剤１個／緩衝剤７６−又はＰＮＰＰ−Ｎａ１７ツ／緩
衝剤１０ｍ１２３８５４からＡＰとウサギ−抗羊ＩｇＧ
からのｉｆ体クレアチニン−イミノヒドロラーゼ ｂ）試験ノ々ツチ： 微量滴定板全メチルヒダントイン−ＦＬＥＡ接合体（０
，５０μｆ／ＢＰｍもしくは盲検用のａｓＡｏ、５０μ
ｆ／ＢＰｄ）で塗布し、Ｒ’ｒで約１６時間恒温保持し
、十分に吸引する。その後、ＩＰ３００μｔｋ加え、恒
温保持しく１時間）、再度十分に吸引し、その後痺浄緩
衝剤３００μｔを加え、十分に吸引する。次いで、メチ
ルヒダントイン抗血清を負荷する。そのため、クレアチ
ニン−イミノヒドロラーゼＩＯＵ／ｄを含有する抗血清
１０００μｔ（ＩＰＰＩ３：　２００〜１：２０００に
稀釈）全クレアチニン試料１０μｔあるいはＩＰＩ　Ｏ
μｔ（盲検用）とＲＴで３０分間恒温保持し、このよう
にして得られた抗血清稀釈１２００μｔを前記の塗布し
た微量滴定板上に加え、６０分間密封して（プラスチッ
ク製袋）放置し２、十分に吸引し、ＷＰ３００μｔを加
えかつ再度十分に吸引する。

接曾体塗布のため、Ａ　Ｐ　１５０ｒＩＬＵ／ＩＰ＋＋
＋ｔｆｉ−含有するウサギ−抗羊ＩｇＧ−ＡＰ接会体２
００μｔを処理した微量滴定板に加え、３７℃に２時間
保持し、その後十分に吸引しかつＷＦ２回当り３００μ
ｔで２回洗浄する。

発色させるために基質用緩衝剤２００μｔを加えかつ混
会物を３０〜６０分間恒温保持する。微量滴定板からの
試験溶液１５０μｔをＮａ０Ｈ（０，１モル／１）５０
０−と共に盲検値に対して４０５１ｍで測定して評価を
行なうユ第２図は異なる濃度のクレアチニンで得られる
検量線である。

例　　３ ＥＭＩＴ原理 １０Ｕ／ｍ／クレアチニンーイミノヒドロラーゼｙ含有
する５０ばリモル／　ｔ　−Ｋ−ホスフェート緩衝液（
ｐＨ７，５）　２．１１０ゴに次のものを混合する： 試料（又は盲検用にＨ２Ｏ）　　　　　　０．０２づ緩
衝溶液（５０ミリモル／１− ホスフェ−）　（ｐＨ７，５）　０．０１ｄ）中の０．
７ミリモル／ｌ−オ キサル酢酸　　　　　　　　　　　１．００ｍ／メチル
ヒダントインーエデスチン抗血清（結合部位濃度）　　
　　　４１０−’モル／１１．４・１０−２モル／　ｔ
−Ｎ人ＤＨ０，０４ｍ７３０℃で２０〜３０分間恒温保
持した後で１・１０−８モル／ｌ−１メチルヒダントイ
ン−マレートデヒドロゲナーゼ接会体帆０５−を加えか
つ酵素活性’ｒ　３４０Ｈｍ及び３０℃で分光測光法に
より６８７分として測定する。

【図面の簡単な説明】

（３７） 第１図はＴＩＮＩＡ原理に基いて測定したクレアチニン
濃度と吸光度差との相関関係を示す検量線、第２図はＢ
Ｔ、ＩＳＡ原理に基いて測定したクレアチニン濃度と吸
光度差との相関関係を示す検量線である。 （３８） 第１頁の続き ０発　明　者　ハンスーゲオルク・バッツドイツ連邦共
和国トウツイング ・トラウビンガー・シュトラ− セロ３ ０発　明　者　へルムート・レンツ ドイツ連邦共和国トウライング ・ヴアルトシュミットシュトラ ーセ７ ０発　明　者　ブリギツテ・パウツ ドイツ連邦共和国へルシング・ キーンタールシュトラーセ２７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　クレアチニンを１−メチルヒダントインに変換し
   、形成された１−メチルヒダントインを、一般式Ｉ： １ 〔式中Ｂｌ　、　Ｒ２、Ｂ３及びＲ４は相互に関係なく
   それぞれＨｉ子、０原子１〜３個を有するアルキル基又
   はフェニル基ヲ表わす〕の第１ヒダントインと抗体形成
   に好適な第１ノ１ゾテン担体との接合体に対抗して作用
   する抗体と水性媒体中で恒温保持し、一般式Ｉの第２ヒ
   ダントインと第２ノ１ゾテン担体との接合体と反応させ
   かつ抗体と第２ノ１ブテン担体を含有するヒダントイン
   接合体との間の結合反応の阻害を測定し、この際前記の
   抗体と接合体の一万の成分は固相又は溶解形であり、他
   方の成分は溶解形であること’ｔ％徴とするクレアチニ
   ンの免疫学的測定法。 ２、　クレアチニンの１−メチルヒダントインへの変換
   は水溶液中で抗体との恒温保持の前又はその間に行なう
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　クレアチニンを酵素的に１−メチルヒダントイン
   に変換する特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法
   。 ４、　クレアチニンをクレアチニン−イミノヒドロラー
   ゼ（Ｋ　Ｏ，３，５，４，２１）で１−メチルヒダント
   インに変換する特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、第１ヒダントインが第２ヒダントインと同一である
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、　第１及び第２ヒダントインとして１−メチルヒダ
   ントイｙ　（ＦＬ”　＝ＯＨｓ　＋　ａｌ−４’＝Ｈ）
   　ｆ使用する特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７．　ハプテン担体として蛋白質、ポリサッカリＰ、リ
   ボポリサツカリド、ラテックス粒子。 活性炭、ポリリシン又はウィルスを使用する特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ８　蛋白質としてビ）Ｊｆｌｌ清アルブミン、牛血清ア
   ルブミン、β−ガラクトシダーゼ又はエデスチンを使用
   する特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、　第１ハシテン担体と第２ハプテン担体が異々つて
   いる特許請求の範囲第７項又は第８項記載の方法。 １０、　　第１ハシテン担体としてエデスチンを使用す
   る特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１　　第２ハプテン担体としてヒト血清アルブミン、
   牛血清アルブミン、β−ガラクトシダーゼ又はラテック
   スを特徴する特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、ハプテン担体への架橋員としての脂肪族又は芳香
   脂肪族カルボン酸を介して結合しているヒダントインを
   使用する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３、カルデン酸架橋員が炭素原子少なくとも２個を含
   有する接合体全使用する特許請求の範囲第１２項記載の
   方法。 １４、’９橋員としてアルキルフェニルカルセン酸又は
   そのオリゴマーを含有する接合体を使用する特許請求の
   範囲第１３項記載の方法。 １５、抗体形成に使用したヒダントイン接合体の架橋員
   が結合阻害試験に使用したヒダントイン接合体のそれと
   異なる特許請求の範囲第１項ないし第１２項〜第１４項
   のいずれか１項に記載の方法。 １６、抗体形成に使用したヒダントイン接合体の架橋員
   として脂肪族カルボン酸を使用する特許請求の範囲第１
   項ないし第１２項〜第１５項のいずれか１′項に記載の
   、方法。 １７　納会１塊害試験に使用したヒダントイン接合体の
   架橋員としてアルキルフェニルカルセン酸を使用する特
   許請求の範囲第１項ないし第１２項〜第１５項のいずれ
   か１項に記載の方法。　　　□ １８　　ハシテン担体１分子当りヒダントイン１〜５０
   分子を含有する接合体を使用する特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 １９、抗体を抗血清、それから得られる免疫グロブリン
   フラクションの形で、モノクローン抗体として又は抗体
   フラグメントとして使用する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ２０、Ｈ合反応の阻害を所定の時間間隔で免疫沈澱全比
   濁分析測定又は濁り測定により測定する特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ２１、結合反応の阻害の測定を非結付のハプテン担体−
   ヒダントイン接合体を標識化抗体で逆滴足して、Ｓ識化
   物質の結曾割汁と非結合割曾ヲ測定することにより行な
   う特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２２、酵素−又は補酵素標識化した抗体を使用する特許
   請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３　放射性又は螢光標識の抗体を使用する特許（５） 請求の範囲第２１項記載の方法。 ２４、羊抗体を使用する特許請求の範囲第１項〜第２３
   項のいずれか１項に記載の方法。 ２５、接合体をフロイントアジュノ々ントと一緒に投与
   して取得した抗体を使用する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ２６、抗体生成に当り、抗体生成に使用したハプテン担
   体と交叉反応するハプテン担体を含有するヒダントイン
   接合体を使用し、遊離ハブテン担体を抗体溶液と混合し
   、その際に形成する沈澱を分離しかつ得られた上澄みを
   抗体溶液として試験に使用する特許請求の範囲第１項〜
   第２５項のいずれか１項に記載の方法。 ２７、クレアチニン−イミノヒドロラーゼ、一般式Ｉ： （６） 〔式中ＦＬｌ　、　Ｂ２　、　ＦＬａ及びＲ４は相互に
   関係なくそれぞれＨ原子、０原子１〜３個を有するアル
   キル基又はフェニル基を表わす〕のヒダントインと第１
   ハシテン担体との接合体に対抗して作用する抗体、一般
   式Ｉのヒダントインと、基本的に第１ハプテン担体と交
   叉反応しない第２ハプテン担体との接合体及び緩衝物質
   を含有することを特徴とするクレアチニンの免疫学的測
   定用試薬。 ２８１−メチルヒダントインに対する抗体及び１−メチ
   ルヒダントインとハシテン担体との接合体を含有する特
   許請求の範囲第２７項記載の試薬。 ２９、ポリエチレングリコールを含有する特許請求の範
   囲第２７項又は第２８項記載の試薬。 ３０、抗体が抗血清、免疫グロブリンフラクション、抗
   体フラグメント又はモノクローン抗体として存在する特
   許請求の範囲第２７項〜第３０項のいずれか１項に記載
   の試薬。 ３１、抗体が標識化されている特許請求の範囲第３０項
   記載の試薬。 ３２、クレアチニン−イミノヒドロラーゼ０００５〜１
   ００Ｕ／ｍＡ、１−メチルヒダントイン：血清アルブミ
   ン２：１〜３０：１のモル比の接仕体帆５〜５００μ？
   廁、ハプテン結合部位濃度に対してモル比０．１〜１０
   の１−メチルヒダントイン接合体に対する抗体、ポリエ
   チレングリコール０．１〜８重量％及びイオン濃度０．
   ０３〜０．４の緩衝物質（ｐＨ４〜１０　）’を含有す
   る特許請求の範囲第２８項〜第３１項のいずれか１項に
   記載の試薬。 ３３、クレアチニン−イミノヒドロラーゼ帆０５〜１０
   ０　Ｕ／／ｎｔ、活性ハプテンレセプタ一部位に対して
   １−メチルヒダントイン−ハプテン担体接合体に対する
   抗体１０−４〜１０−１４モル／ｌ、１−メチルヒダン
   トイン−マレ−トチヒドロゲナーゼ接合体１０−４〜１
   ０−１４モル／１゜オキサル酢酸帆０．５〜５０ミリモ
   ル／ｌ、ホスフェート緩衝剤（ｐＨ６〜８．５　）　５
   〜２００ミリモル／を及びＮＡＤＨＯ，０５〜０．４ミ
   リモル／ｌを含有する特許請求の範囲第２８項〜第３１
   項のいずれか１項に記載の試薬。